Detta dokument beskriver ett halvautomatiskt, mikroskalat ChIP-Seq-protokoll av DNA-regioner associerade med en specifik histonmodifiering (H3K27ac) med hjälp av en ChIP vätskehanterare plattform, följt av bibliotek förberedelse med tagmentation. Förfarandet omfattar kontrollbedömning för kvalitets- och kvantitetsändamål och kan antas till andra histonändringar eller transkriptionsfaktorer.
Kromatin immunoprecipitation följt av sekvensering (ChIP-Seq) är en kraftfull och allmänt använd metod för att profilera kromatin DNA i samband med specifika histon modifieringar, såsom H3K27ac, för att identifiera cis-reglerande DNA-element. Den manuella processen för att slutföra en ChIP-Seq är arbetsintensiv, tekniskt utmanande och kräver ofta stora celltal (>100 000 celler). Metoden som beskrivs här hjälper till att övervinna dessa utmaningar. En komplett halvautomatisk, mikroskalad H3K27ac ChIP-Seq förfarande inklusive cellfixering, kromatin klippning, immunoprecipitation och sekvensering bibliotek förberedelse, för batch av 48 prover för cellnummer indata mindre än 100,000 celler beskrivs i detalj. Den semiautonomiska plattformen minskar den tekniska variabiliteten, förbättrar signal-till-brus-förhållanden och minskar drastiskt arbetet. Systemet kan därmed minska kostnaderna genom att möjliggöra minskade reaktionsvolymer, vilket begränsar antalet dyra reagenser som enzymer, magnetiska pärlor, antikroppar och praktisk tid som krävs. Dessa förbättringar av ChIP-Seq-metoden passar perfekt för storskaliga epigenetiska studier av kliniska prover med begränsat antal celler på ett mycket reproducerbart sätt.
Den breda användningen av ChIP-Seq-analyser för att bestämma fragment av DNA i samband med specifika histonmodifieringar beror delvis på dess förmåga att identifiera cis-regulatoriska DNA-element, inklusive aktiva förstärkare, promotorer, ljuddämpare, heterokromatin och andra1,2,3,4. Identifiering av icke-kodande regleringsregioner i hela genomet har visat värdefull insikt för att bättre förstå genreglering vid hälsa och sjukdomar4. Tidigare arbete från labbet har använt ChIP-Seq för att visa att cis–regulatoriska element kan spela viktiga roller i olika celltyper5. Transkriptionsfaktor (TF) ChIP-analyser har använts för att visa sjukdomsassocierad risk enstaka nukleotidpolymorfismer6.
Användningen av ChIP-Seq med kliniska prover från människa är utmanande, främst på grund av begränsningen av cellantalet eller det önskade vävnadsprovet. Som ett resultat har det gjorts en samlad ansträngning på fältet för att förbättra och mikroskala dessa tekniker och som ett resultat har flera analyser dykt upp, såsom CUT&TAG5,7,8,9,10,11,12. Denna analys använder en transponas för att märka och isolera genomiska regioner som är bundna av en specifik antikropp9. Denna teknik har kunnat minska celltalen ner till 1000-talet och i vissa fall till en enda cell, men användningen av denna teknik i translationell forskning och klinisk uppsättning har visat begränsningar på grund av kraven på att använda levande celler för denna metod9,12. Kravet på levande celler gör kliniska prover logistiskt svåra att hantera och kan införa batcheffekter om proverna inte bearbetas samtidigt. Andra har optimerade mikroskalade tekniker för formaldehyd-fasta celler, inklusive utvecklingen av ChIPmentation11, som är anpassad här på ett sätt med hög genomströmning. Användningen av fasta celler gör det möjligt att lagra prover fram till insamling och efterföljande bearbetning av alla prover tillsammans för att minimera batcheffekter.
Här beskrivs en halvautomatisk mikroskalad ChIP-Seq-analys som minskar experimentell praktisk tid för att profilera histonändringar10. Den halvautomatiska metoden möjliggör chIP-seq-analyser med hög genomströmning, vilket gör det möjligt att bearbeta upp till 48 prover fullt ut och vara klara för sekvensering på så lite som 5 dagar, för så få som 10 000 celler per prov med en ChIP vätskehanterare. Hanteraren slutför immunoprecipitationen (IP) och efterföljande tvättar på ett autonomt sätt, vilket bidrar till att minska variationen mellan proverna. Den halvautomatiska metoden sänker både den praktiska tiden med över 15 timmar för 48 prover och den tekniska variationen, vilket gör det möjligt att genomföra storskaliga epigenetiska studier på ett reproducerbart och snabbt sätt för antingen primära eller odlade celler. Protokollet förklarar processen från början till slut för högkvalitativ ChIP-Seq. Om de specifika datorerna inte är tillgängliga kommer protokollet fortfarande att vara en användbar resurs för att konfigurera och fel-skjuta ChIP-Seq-experiment manuellt.
Analysen utfördes med tre olika primära mänskliga immuncelltyper och en odlad cellinje (HUT78 – ATCC: TIB-161). För tydlighetens skull har protokollet delats in i sju sektioner: cellfixering, kromatinspjuvning via ultraljudsbehandling, automatiserad kromatinimmunprecipitation, biblioteksberedning genom DNA-fragmenttagmentering, biblioteksförstärkning, biblioteksrening, följt av DNA-kvantifiering. För buffertrecept se tilläggstabell 1.
Metoden som beskrivs här expanderar på ChIPmentation procedure11, som implementerar ett förberedelseprotokoll för tagmentationsbibliotek före DNA-rening, genom att automatisera och mikrokalka protokollet. Sedan chip-seq började har de erforderliga cellnumren minskat drastiskt, från cirka 20 miljoner celler för histoner ner till hundratals och till och med encelliga1,7,10,12,18,19,20,21. Dessa nyutvecklade metoder har möjliggjort en djupare förståelse för hur cis-reglerandemekanismer fungerar i celler genom att öka känsligheten och möjliggöra att sällsynta kliniska cellpopulationer testas5,6,12,17. Till exempel ett av de nyare och populärare förfarandet, kallat CUT&TAG, som robust och känslig ChIP-Seq alternativ9. Det ger ett utmärkt signal-till-brus-förhållande eftersom Tn5-enzymet är kovalent bundet till protein A och känner igen Fc-kedjan av ChIP-antikroppen med hög specificitet9. Bakgrundsaktiviteten hos Tn5-enzymet reduceras eftersom enzymet inte fungerar innan det binds till målantikroppen9. Genomförandet av denna metod i ett kliniskt sammanhang är dock begränsat eftersom det kräver icke-fasta, levande celler. Avlägsnandet av DNA-fragment från hypotonkärnan kan också ha negativa effekter på kromatinet eftersom det avlägsnas från under analysen. Det nödvändiga kravet att arbeta med färska och levande celler är en källa till problem för sällsynta kliniska prover och för stora kohorter av prover, eftersom stora kohorter kan ta många år att samlain 5. En annan typ av metod, drop-ChIP, använder elegant en mikrofluidikenhet för att generera droppbaserad taggning innan chip19bearbetas . Den använder dock en högspecialiserad mikrofluidisk enhet och även om det är möjligt att slutföra encellig ChIP-Seq, är den också begränsad till användningen av levande celler7,8,9,18,19. Nyare metoder som förlitar sig på ChIP-Seq, till exempel PLAC-Seq eller HiChIP, försöker förstå 3D-interaktioner (3D) mellan ChIP-Seq-topparna22,23. Dessa 3D-metoder är spännande eftersom de identifierar cis-regulatoriskaeller TF-medierade interaktioner över genomet och bättre förståelsen av regleringen av genuttryck i celltyper av intresse, i friska vävnader och i samband med sjukdom.
Det finns några kritiska steg att tänka på för att protokollet ska bli framgångsrikt, såsom kvaliteten på det sonicated kromatinet och kvaliteten på antikroppen. Skjuvningseffektivitet är avgörande, om kromatin inte soniceras väl, minskar analysens effektivitet drastiskt24. Ultraljudsbehandling är en utmanande aspekt av ChIP-Seq på grund av de cellnummer som krävs. På ljudbehandlingsatorn som används i protokollet minskade effektiviteten drastiskt under 300 000 celler. Detta är en utmanande aspekt i ChIP-Seq när det gäller sonikering under den nivån skulle ofta kräva enzymatisk fragmentering, vilket är mindre opartiskt. Som ett resultat är ultraljudsbehandling en stor begränsad faktor för sant microscaled ChIP-Seq. Andra ultraljudsbehandling plattformar och kommersiellt tillgängliga kit testades för ultraljudsbehandling kromatin, men sonicator används här hade de mest robusta och reproducerbara resultaten. En annan fördel med ultraljudsbehandling är att inte behöva köpa specialiserade rör för att köra ultraljudsbehandling, vilket minskar kostnaderna när man hanterar ett stort antal prover. För optimal ultraljudsbehandling, för det första är det viktigt att förvärma ultraljudsbehandlingen som beskrivs ovan. För det andra, för att lysera pelleten, rekommenderas att pipettens spets vidrör botten av röret medan du lysar för att bryta upp cellerna med mer fysiska begränsningar. För det tredje hindrar varje bubbla bildning före ultraljudsbehandling förmågan hos provet att ultraljudsbehandling jämnt. Om det bildas några bubblor under lysen är det viktigt att ta bort dem med en pipett. Detta kan vara utmanande utan att ta bort mycket prov, men om spetsen trycks lätt mot bubblan kan den långsamt dras upp utan förlust av mycket prov. Slutligen, när du bestämmer antalet cykler, slutför en tidskurs där var tredje cykler, provet avlägsnas, renas och drivs på en agarose gel. Undvik över/under ultraljudsbehandling av prover eftersom detta minskar ChIP-effektiviteten. Om provet är under sonicated kan de stora fragmenten ha en negativ effekt på ChIP-Seq-kvaliteten24. Å andra sidan, om provet är överljudererat, finns det risk för att mål epitopen går vilse i processen.
En annan viktig del av ChIP-Seq är antikroppens kvalitet. Innan någon storskalig studie genomförs är det nödvändigt att optimera den antikropp som kommer att användas. Målet är att uppnå ett signifikant högt signal-brusförhållande mellan kända regioner i genomet och en annan är reproducerbarheten. Om antikroppen drar mycket bakgrundssignal kan det rekommenderas att använda en större ingång eller prova en annan lott/leverantör. Detta kommer att lägga till tid innan du startar ett storskaligt experiment, men det är ett viktigt steg. För att testa signal-till-brus rekommenderas att använda qPCR med regioner som är kända för att vara ett mål för din antikropp och en annan region som är känd för att vara frånvarande. Det har märkts histonändringar är mer robusta och lättare att optimera än TFs.
Protokollet som beskrivs ovan ger en robust metod för histonmodifiering med hög genomströmning ChIP-Seq på ett semiautonomiskt, mikroskalat sätt. Metoden begränsar mängden praktisk tid och ökar reproducerbarheten över manuell ChIP-Seq. Tidigare studier som genomförts i labbet använde manuell ChIP på tekniska replikat och erhöll ett Spearman-korrelationsmedelvärde på 0,505, men med det halvautomatiska systemet, Spearman-korrelationen mellan olika givare med ett NK-cellgenomsnitt på 0,66(tilläggstabell 2). Detta slutfördes också med cirka 40% mindre praktisk tid. Metoden som beskrivs här har optimerats för histonmodifieringar (H3K27ac visas här, men protokollet bör inte behöva någon ändring för andra) och skulle bara kräva mindre ändringar för att genomföras för TF ChIP-Seq. Trots kvaliteten på antikroppen, skulle den viktigaste modifieringen vara för ultraljudsbehandling tid och potentiellt de buffertar som används under IP. Vanligtvis, för TF ChIP-analyser, metoden kan fungera bättre med något längre fragment av kromatin (med ett intervall på cirka 350-800 bp) eftersom TF: DNA-komplex sannolikt är mindre kapabla att upprätthållas genom rigorös ultraljudsbehandling6. Buffertarna kan också behöva ändras till en anpassad blandning eller andra tillgängliga branschsatser, eftersom TFs kan bete sig annorlunda än histonändringar.
Även om den automatiserade ChIP vätskehanteraren testades för så få som 10 000 celler, fanns det en märkbar minskning av reproducerbarheten vid lägre kromatinkoncentrationer. På grund av detta rekommenderades protokollet inte till mindre än 10 000 celler, med 100 000 celler som de optimala förhållandena. Protokollet slutfördes också med hjälp av chip-buffertar från industrin, vilket var en extra kostnad men gav data av högre kvalitet. Protokollet kan ändras med avseende på ultraljudsbehandlingsförhållandena (så länge det skjuvade kromatinet hålls inom samma intervall), buffertar kan anpassas för immunoprecipitation (IP; optimering kan krävas), eller ChIP vätskehanteraren får inte användas. En begränsning av protokollet är användningen av ChIP-vätskehanteraren, vilket kan vara en dyr investering och kan bara köra 16 prover samtidigt. ChIP vätskehanterare är begränsad till småskaliga reaktioner och cellnummer större än en miljon rekommenderas inte. Protokollet kan dock slutföras utan det, genom att slutföra IP och tvätta stegen manuellt. Om IP och tvättar slutfördes för hand kommer tiden att slutföra analysen att öka och reproducerbarheten kan minska, men den här guiden kommer fortfarande att vara användbar när du kör ett högkvalitativt ChIP-Seq-experiment. Observera att andra vätskehanterare kan anpassas för att köra halvautomatiska ChIP-reaktioner.
Sammanfattningsvis är de stora fördelarna med detta system den höga genomströmningskaraktären, eftersom IP- och tvättstegen slutförs autonomt. Som sådan kan sekventiella rundor av ChIP-experiment slutföras, vilket gör att upp till 48 prover kan bearbetas helt och vara klara för sekvensering på 5 dagar, med begränsad praktisk tid jämfört med manuella ChIP-Seq-experiment. En annan fördel är den ökade reproducerbarheten eftersom ChIP-Seq kan vara svårt att få mycket reproducerbara resultat. Andra metoder kräver antingen levande celler, komplexa mikropipettingsystem eller att arbetet slutförs helt för hand. Detta system måste optimeras för låginmatningsprover (< 10 000 celler), vilket i slutändan tillåter encelliga ChIP-reaktioner. Systemet kan också anpassas för de nyare ChIP-metoderna, såsom PLAC-Seq och HiChIP22,23.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Vijayanand-labbmedlemmarna för teknisk hjälp och konstruktiva diskussioner och Dr. Sharron Squazzo och Mr. Geoffrey Berguet från Diagenode för teknisk hjälp med sonicator och ChIP vätskehanterare maskin och protokoll. Detta arbete stöddes av NIH-bidrag AI108564, R01HL114093, S10RR027366 (BD FACSAria II) och S10OD016262 (Illumina HiSeq 2500).
200 µl tube strips (8 tubes/strip) + cap strips | Diagenode | C30020002 | Strip tubes for use on the IP Star; ChIP 8-tube strip |
AMPure XP for PCR Purification | Beckman Coulter | A63880 | SPRI beads |
Axygen 0.6 mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube | Corning | MCT-060-C | 0.65 mL low binding tube |
Bioruptor Pico Sonicator | Diagenode | B01060010 | Sonicator used in the lab but others can be used |
ChIP DNA Clean & Concentrator (Capped Columns) | Zymo Research | D5205 | DNA clean-up kit |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | ThermoFisher | 10001D | |
EDTA (0.5 M), pH 8.0, RNase-free | ThermoFisher | AM9260G | |
EGTA pH 8.0 | Millipore Sigma | E3889-25G | |
Eppendorf ThermoMixer C | Eppendorf | 2231000667 | |
Formaldehyde solution | Millipore Sigma | 252549-1L | |
Glycine | Millipore Sigma | 50046-250G | |
H3K27ac polyclonal antibody – Premium | Diagenode | C15410196 | |
HEPES (1 M) pH 7.5 | ThermoFisher | 15630080 | |
IDT for Illumina Nextera DNA Unique Dual Indexes | Illumina | 20027213 | |
Illumina Tagment DNA Enzyme and Buffer Small Kit | Illumina | 20034197 | |
IP-Star Compact Automated System | Diagenode | B03000002 | Automated system for ChIP-Seq studies; ChIP liquid handler |
KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Roche | KK2601 | PCR mix |
Medium reagent container for SX-8G IP-Star Compact | Diagenode | C30020003 | |
MgCl2 (magnesium chloride) (25 mM) | ThermoFisher | R0971 | |
N,N-Dimethylformamide | Millipore Sigma | D4551-250ML | CAUTION – low flash point |
NaCl (5 M), RNase-free | ThermoFisher | AM9760G | |
PBS (10X), pH 7.4 | ThermoFisher | 70011044 | |
PCR Flex-free 8-tube stripes, attached individual optical caps | USA Scientific | 1402-4700 | 8 strip tubes, 0.2 mL 8-tube strip |
Proteinase Inhibitor Cocktail | Millipore Sigma | P8340 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | ThermoFisher | 25530049 | |
PureLink RNase A (20 mg/mL) | ThermoFisher | 12091021 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | ThermoFisher | P7581 | Used in the flourescence quantification |
QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | ThermoFisher | 4485699 | qPCR |
ROX Reference Dye | ThermoFisher | 12223012 | |
Sodium butyrate | Millipore Sigma | 303410-100G | |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO) | ThermoFisher | S11494 | nucleic acid dye |
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain – 10,000X concentrate in DMSO | ThermoFisher | S7563 | |
TE Buffer | ThermoFisher | 12090015 | |
Tips (bulk) | Diagenode | C30040020 | Tips for the IP Star |
True MicroChIP Kit | Diagenode | C01010130 | Contains all the buffers for the IP; ChIP kit |
UltraPure 1M Tris-HCI, pH 8.0 | ThermoFisher | 15568025 | |
UltraPure SDS Solution, 10% | ThermoFisher | 24730020 |