Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Published: August 25, 2020 doi: 10.3791/61622
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1George & Anne Ryan Institute for Neuroscience, College of Pharmacy, Department of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, University of Rhode Island, 2Department of Neuroscience, Biomedicum, Karolinska Institutet

Summary

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Abstract

La inmunohistoquímica es una técnica ampliamente utilizada para visualizar estructuras tisulares específicas, así como la expresión y localización de proteínas. Dos enfoques alternativos son ampliamente utilizados para manejar las secciones de tejido durante el procedimiento de tinción, un enfoque consiste en montar las secciones directamente en portaobjetos de vidrio, mientras que un segundo enfoque, el de flotación libre, permite mantener y teñir secciones fijas mientras están suspendidas en solución. Aunque los enfoques montados en diapositivas y flotantes libres pueden producir resultados similares, la técnica de flotación libre permite una mejor penetración de anticuerpos y, por lo tanto, debe ser el método de elección cuando se van a utilizar secciones más gruesas para la reconstrucción 3D de los tejidos, por ejemplo, cuando el enfoque del experimento es obtener información sobre proyecciones dendríticas y axonales en regiones cerebrales. Además, dado que las secciones se mantienen en solución, una sola alícuota puede acomodar fácilmente de 30 a 40 secciones, cuyo manejo es menos laborioso, particularmente en estudios biomédicos a gran escala. Aquí, ilustramos cómo aplicar el método de flotación libre a la tinción inmunohistoquímica fluorescente, con un enfoque principal en las secciones del cerebro. También discutiremos cómo la técnica de flotación libre puede modificarse fácilmente para adaptarse a las necesidades individuales de los investigadores y adaptarse a otros tejidos, así como a otras tinciones basadas en histoquímica, como hematoxilina y eosina y violeta de cresil, siempre que las muestras de tejido se fijen correctamente, generalmente con paraformaldehído o formalina.

Introduction

La inmunotinción es una práctica de investigación popular que comenzó hace 130 años con el descubrimiento de los anticuerpos séricos en 1890 por Von Behring1. A principios delsiglo XX, los colorantes se unieron a antígenos y más tarde a anticuerpos como una forma de cuantificar y visualizar reacciones1, y en 1941 Albert Coons desarrolló las primeras etiquetas de anticuerpos fluorescentes, un descubrimiento que revolucionó la microscopía de luz 2,3. El término "inmunotinción" abarca muchas técnicas que han sido desarrolladas utilizando este principio, incluyendo Western blot, citometría de flujo, ELISA, inmunocitoquímica e inmunohistoquímica 3,4. Western blot detecta la presencia de proteínas específicas de extractos de tejidos o células5. Las proteínas se separan por tamaño mediante electroforesis en gel, se transfieren a una membrana y se sondean con anticuerpos. Esta técnica indica la presencia de proteína y cuánta proteína está presente; Sin embargo, no revela ninguna información sobre la localización de la proteína dentro de las células o tejidos. Otro método, la inmunocitoquímica (ICC), marca proteínas dentro de las células, típicamente células cultivadas in vitro. ICC muestra tanto la expresión de proteínas como la localización dentro de los compartimentos celulares6. Para detectar y visualizar una proteína específica a nivel tisular, se utiliza la inmunohistoquímica (IHC).

La IHQ es un método que los investigadores utilizan para atacar antígenos específicos dentro del tejido, aprovechando las propiedades químicas del sistema inmune 7,8. Al generar anticuerpos primarios y secundarios específicos vinculados a una enzima o a un colorante fluorescente, los antígenos de interés pueden ser marcados y revelados en la mayoría de los tejidos (como se revisó en Mepham y Britten)9. El término "inmunohistoquímica" por sí mismo no especifica el método de etiquetado que se utiliza para revelar el antígeno de interés; por lo tanto, esta terminología a menudo se combina con la técnica de detección para delinear claramente el método de etiquetado: inmunohistoquímica cromogénica (CIH) para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con una enzima, como la peroxidasa; o IHQ fluorescente para indicar cuándo el anticuerpo secundario se conjuga con un fluoróforo, como el isotiocianato de fluoresceína (FITC) o la tetrametilrodamina (TRITC). La selectividad de IHQ permite a los médicos e investigadores visualizar la expresión y distribución de proteínas a través de los tejidos, a través de varios estados de salud y enfermedad10. En el ámbito clínico, la IHQ se usa comúnmente para diagnosticar el cáncer, así como para determinar las diferencias en varios tipos de cáncer. IHQ también se ha utilizado para confirmar diferentes tipos de infecciones microbianas dentro del cuerpo, como la hepatitis B o C11. En la investigación biomédica, la IHQ se utiliza a menudo para mapear la expresión de proteínas en los tejidos y es importante para identificar proteínas anormales observadas en estados de enfermedad. Por ejemplo, la neurodegeneración a menudo se acompaña de la acumulación de proteínas anormales en el cerebro, como placas Αβ y ovillos neurofibrilares en la enfermedad de Alzheimer. Los modelos animales a menudo se desarrollan para imitar estos estados patológicos, y la IHQ es un método que los investigadores utilizan para localizar y cuantificar las proteínas de interés10,12,13. A su vez, podemos aprender más sobre las causas de estas enfermedades y las complicaciones que surgen con ellas.

Hay muchos pasos involucrados en la realización de IHC. Primero, el tejido de interés se recolecta y se prepara para la tinción. Podría decirse que la mayoría de los investigadores preparan muestras de tejido fijas, siendo óptima la perfusión del fijador a través del sistema circulatorio ya que preserva la morfología14,15. También se puede utilizar la fijación posterior de muestras de tejido, pero puede producir resultados inferiores a los ideales16. Los fijadores de reticulación, como el formaldehído, actúan creando enlaces químicos entre las proteínas en el tejido17. Luego, el tejido fijo se corta en capas o secciones muy delgadas con un micrótomo, y muchos investigadores prefieren recolectar secciones congeladas con un criostato. A partir de ahí, el tejido se recoge y se monta directamente en un portaobjetos de microscopio (método montado en portaobjetos) o se suspende en una solución (método de flotación libre), como la solución salina tamponada con fosfato (PBS)18. El método de recolección utilizado está predeterminado en función de las necesidades del investigador, y cada uno de estos dos métodos presenta sus propias ventajas y desventajas.

El método montado en portaobjetos es, con mucho, el más utilizado, con un beneficio importante que es que se pueden preparar secciones muy delgadas (10-14 μm), lo cual es importante, por ejemplo, para investigar las interacciones proteína-proteína. También hay un manejo mínimo de la muestra, lo que disminuye el daño potencial a la integridad estructural del tejido19. Los investigadores a menudo usan esta técnica con tejido fresco congelado (tejido que se congela inmediatamente con hielo seco, isopentano, etc.), que es muy delicado en comparación con el tejido fijo y se debe tener mucho cuidado para evitar la descongelación de la muestra. Otra ventaja del uso de secciones montadas en guías es que generalmente no se requieren grandes volúmenes de soluciones para teñir4. Por lo tanto, los investigadores pueden usar una cantidad menor de anticuerpos costosos u otros productos químicos para completar la mancha. Además, es posible montar secciones de varios grupos experimentales diferentes en la misma diapositiva, lo que puede ser ventajoso, especialmente durante la adquisición de imágenes. Por otro lado, hay algunas desventajas de usar secciones montadas en portaobjetos, sobre todo que la sección de tejido se adhiere al portaobjetos, lo que restringe la penetración de anticuerpos a un lado de la sección, lo que limita el grosor de la sección y la representación 3D del tejido. También puede suceder que durante los lavados, los bordes del tejido y secciones enteras se desprendan del portaobjetos, haciendo inútil todo el experimento. Además, la IHQ generalmente debe realizarse con relativa rapidez cuando se utiliza el enfoque montado en portaobjetos para evitar la degradación del epítopo del antígeno 20,21 con portaobjetos sin procesar almacenados típicamente a -20 o -80 °C, a menudo cubiertos y almacenados horizontalmente o en cajas portaobjetos, lo que resulta en una huella de almacenamiento relativamente grande. Por último, la técnica montada en portaobjetos también puede llevar mucho tiempo si los investigadores deben manejar un gran número de portaobjetos para procesar un gran número de secciones de tejido.

Debido a algunos de estos desafíos utilizando el método montado en deslizamiento, una modificación llamada método de flotación libre se ha convertido en una alternativa popular. Esta técnica entró en la literatura en los años 1960-70 22,23,24, ganando popularidad en la década de 1980 25,26,27,28,29, y ahora es un método bien establecido que consiste en realizar la tinción en las secciones recogidas en suspensión en lugar de adherirse a una diapositiva 12,30,31 . No se recomienda el método de flotación libre cuando las secciones de tejido son inferiores a 20 μm; Sin embargo, en nuestra experiencia, es el enfoque de elección cuando se van a teñir secciones más gruesas (40-50 μm). Un beneficio distintivo es que los anticuerpos pueden penetrar secciones flotantes desde todos los ángulos y generar menos tinción de fondo debido a un lavado más efectivo, todo lo que resulta en una mejor señalización al obtener imágenes. Además, las secciones se montan en los portaobjetos después del procesamiento, eliminando así la posibilidad de desprendimiento de tejido y disminuyendo el tiempo que ocupa el criostato. El método de flotación libre también puede ser mucho menos intensivo en mano de obra, especialmente para estudios biomédicos a gran escala. Por ejemplo, es posible teñir muchas secciones (18-40) de la misma muestra juntas en el mismo pocillo, lo que ahorra tiempo al realizar los pasos de lavado e incubación de anticuerpos. Además, dado que se puede montar un número mayor (12-16) de secciones por diapositiva utilizando este enfoque, a menudo es más conveniente y más rápido para el investigador ver e imaginar secciones. En particular, durante el montaje de rodajas de tejido en los portaobjetos, las secciones se pueden unir y separar hasta obtener la orientación deseada. Los investigadores también suelen utilizar concentraciones ligeramente más bajas de anticuerpos utilizando el método de flotación libre, y dado que las incubaciones se realizan en tubos de microcentrífuga, los anticuerpos se pueden recolectar y conservar fácilmente con azida de sodio para su reutilización (véase el Paso 5.1). Otra ventaja es que las secciones pueden almacenarse directamente a -80 °C en pequeños tubos de microcentrífuga con solución crioprotectora32, minimizando así el espacio de almacenamiento y maximizando la longevidad de las muestras33. Una desventaja de usar esta técnica es que las secciones se manejan mucho y, por lo tanto, son propensas a dañarse. Esto, sin embargo, se puede mitigar mediante el uso de bajas velocidades de agitación y rotación, así como la capacitación adecuada de los investigadores sobre cómo transferir las muestras y montar las secciones en las diapositivas.

En conjunto, IHQ es una herramienta establecida y esencial para visualizar y localizar la expresión de proteínas en los campos de investigación clínica y biomédica. La IHQ de flotación libre es un método eficiente, flexible y económico, especialmente cuando se realizan estudios histológicos a gran escala. Aquí, presentamos un protocolo confiable de IHQ fluorescente de flotación libre para la comunidad científica que se puede adaptar en consecuencia para IHC cromogénica y otras tinciones como hematoxilina y eosina o tinción de violeta de cresil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Preparación del tejido para criosección

  1. Incruste tejidos fijos en un molde de incrustación apropiado (consulte la Tabla de materiales) para crear un bloque de muestra utilizando una matriz de muestra apropiada (consulte la Tabla de materiales) y congele en hielo seco. Almacene los bloques de muestras a -80 °C hasta que estén listos para seccionar.
    NOTA: Los tejidos fijos se preparan típicamente perfundiendo roedores machos o hembras adultos (aprox. 2,5 – 30 meses de edad) (ratón o rata)34, de acuerdo con el permiso ético disponible, con un fijador apropiado (por ejemplo, formalina al 10%), seguido de pañuelos posfijación en el mismo fijador durante 12 h a 4 °C, lavando los tejidos tres veces con 1x PBS, y colocar los tejidos en 15% y luego 30% de sacarosa en 1x PBS durante la noche o hasta que los tejidos se hundan35. Los investigadores pueden tratar de adaptar este protocolo general a diferentes etapas de desarrollo.

2. Criosección

  1. Cuando esté listo para seccionar, aclimatar las muestras en el criostato durante al menos 1-2 h antes de la sección para evitar la rotura del tejido.
  2. Usando un criostato, corte el tejido en secciones (20-50 μm) y recoja en insertos de 6 o 12 pocillos (consulte la Tabla de materiales) llenos con 1x solución de PBS.
    NOTA: Dependiendo del grosor de la sección, la cantidad de tejido que se recolectará y el número de insertos de pozo utilizados, cada pocillo contendrá un número variable de secciones que abarcan aproximadamente 10 a 40 rebanadas para el pozo. Por ejemplo, si se secciona un cerebro entero a 40 μm, se recolectarán aproximadamente 18-24 secciones en cada pocillo utilizando insertos de 12 pocillos. Además, las secciones de 20 μm pueden ser algo difíciles de manejar, por lo que se recomienda 40 μm para la tinción a granel (ver Discusión).

3. Almacenamiento de secciones

  1. Una vez recogidos, lavar las secciones con 1x PBS recién preparado durante 5 min. Repita 3 veces.
  2. Transfiera las secciones en tubos de microcentrífuga de 2 ml llenos de 1-1.5 ml de solución de almacenamiento (para 250 ml, mezcle 70 g de sacarosa, 75 ml de etilenglicol y lleve al volumen con tampón fosfato 0.1 M).
  3. Conservar a -80 °C hasta que esté listo para la tinción.

4. Día de tinción I

  1. Retire las muestras del congelador y equilibre a temperatura ambiente (RT) durante 10 - 20 min.
  2. Vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar la solución de almacenamiento de las secciones.
  3. Mueva el inserto del pozo a otro pocillo que contenga aproximadamente 6 ml de 1x TBS. Lave 3 veces con 1x TBS durante 5 minutos cada una en un agitador orbital usando baja velocidad a RT.
  4. Mientras se lavan las secciones, prepare 7 ml (por muestra) de una solución de obstrucción-permeabilización que consista en 1x TBS con 0,3% de Triton X-100 y 3% de suero normal (por ejemplo, suero de caballo normal). Bloquee secciones durante 30 min a RT en agitador orbital, usando baja velocidad.
    NOTA: El bloqueo con sueros evita la unión no específica de anticuerpos a tejidos o receptores Fc no específicos: se recomienda un suero que coincida con la especie del anticuerpo secundario, pero si no está disponible, se puede usar cualquier suero normal de una especie diferente del animal huésped de anticuerpos primario. El detergente Triton X-100 permite una mejor penetración de anticuerpos al permeabilizar el tejido.
  5. Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos primarios que consista en anticuerpos primarios seleccionados (diluidos adecuadamente) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (ver Paso 4.4 Nota). Transfiera secciones del inserto de pozo a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga solución de anticuerpos primarios para unirse al antígeno (s) de interés.
    NOTA: Se pueden usar múltiples anticuerpos primarios (generados en diferentes especies hospedadoras).
  6. Colocar un tubo de microcentrífuga de 2 ml con secciones en un mezclador giratorio a baja velocidad (por ejemplo, velocidad de 7 rpm) e incubar durante la noche durante 12-16 h a 4 °C.

5. Día de tinción II

  1. Al día siguiente, vierta las secciones en un inserto de pozo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos primarios.
    NOTA: La solución de anticuerpos se puede recolectar y reutilizar; Agregue azida de sodio al 0,02% (p/v) para inhibir el crecimiento microbiano.
  2. Lave las secciones 3 veces con 1x TBS en RT (30 s para los primeros 2 lavados y 10 minutos para el lavado final).
  3. Preparar 1 ml por muestra de solución de anticuerpos secundarios que consista en anticuerpos secundarios apropiados (diluidos en consecuencia) en 1x TBS con Triton X-100 al 0,3% y suero normal al 1% (solución protectora contra la luz).
    NOTA: El marcado indirecto con un anticuerpo secundario conjugado amplifica la señal y permite la visualización colorimétrica o fluorescente de la proteína diana.
  4. Transfiera las secciones a un tubo de microcentrífuga de 2 ml que contenga una solución de anticuerpos secundaria. Incubar durante 2 h a RT en un agitador orbital a baja velocidad (solución de protección de la luz).
  5. Vierta las secciones en un inserto de pocillo en una placa de 6 pocillos para separar las secciones de la solución de anticuerpos secundaria.
  6. Continuando protegiendo las muestras de la luz, lave 2 veces con 1x TBS durante 30 s en RT. Luego lavar durante 15 minutos en 1x TBS, agregue DAPI (1-0.1 μg / ml) si lo desea.

6. Montaje

  1. Verter secciones en una cámara histológica rectangular de vidrio llena tres cuartos con 1x TBS.
  2. Sumerja una diapositiva de vidrio en el 1x TBS y use un pincel fino para convencer a las secciones hacia la diapositiva.
  3. Golpee suavemente las secciones en la diapositiva, asegurándose de que no haya arrugas ni pliegues.
  4. Repita hasta que todas las secciones estén montadas en la(s) diapositiva(s).
    NOTA: Cuando un cerebro entero, por ejemplo, se secciona a 40 μm, se recoge en insertos de 12 pocillos con una alícuota que contiene 18-24 secciones; Los sectores generalmente se montan en 1-2 diapositivas, pero también se pueden montar menos secciones por diapositiva según las preferencias del investigador.

7. Cubreción

  1. Después de que las secciones se sequen en la(s) diapositiva(s), aproximadamente 10-15 minutos en RT o hasta que las secciones se vean opacas (recuerde proteger las diapositivas de la luz), aplique un medio de montaje acuoso apropiado (endurecimiento o no endurecimiento). Se prefiere el antidecolorante si se utiliza un anticuerpo secundario conjugado fluorescente.
    NOTA: La calidad de fluorescencia puede ser menor cuando se utiliza un medio de montaje de endurecimiento, pero las guías deben durar más tiempo.
  2. Usando pinzas, coloque un cubreobjetos encima del medio. Cubra con papel de filtro y presione firmemente hacia abajo para eliminar el exceso de medio de montaje.
    NOTA: Si utiliza un soporte no endurecedor, pinte los bordes de la corredera deslizada con esmalte de uñas transparente para sellar.
  3. Secciones de imágenes usando un microscopio apropiado. Conservar en una caja deslizante oscura a 4 °C.
    NOTA: Las secciones se pueden obtener imágenes utilizando una variedad de microscopios, como el escaneo láser confocal y fluorescencia de campo amplio invertida o vertical, con aumentos (por ejemplo, 10x, 20x, 40x) según las necesidades del investigador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

El esquema general del uso del método de flotación libre para realizar un ensayo inmunohistoquímico fluorescente se ilustra en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo representativo de IHQ fluorescente utilizando el método de flotación libre en cerebro de ratón que examina la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) con un aumento menor y más alto para ilustrar la calidad general de la tinción. Este enfoque también es apropiado para revelar proteínas de baja expresión, con un ejemplo de un cerebro de ratón transgénico de baja expresión de GFP que se muestra en la Figura 3. El método de flotación libre también se puede utilizar en otros protocolos de tinción histoquímica, como el violeta de cresil, como se muestra en la Figura 4, siguiendo los pasos 1 a 4.3 del protocolo y luego montando las secciones como se indica en el paso 6. A partir de entonces, las secciones se pueden procesar utilizando cualquier tinción que requiera secciones montadas en diapositivas. Cuando utilice este protocolo para IHQ cromogénica, siga el protocolo de los pasos 1 a 5.6 (no agregue DAPI al último lavado), ajustando en consecuencia si usa un paso de amplificación (por ejemplo, complejo avidina-biotina). Reemplace el tampón con reactivo de cromógeno / sustrato, incubando 5-20 min hasta que el tejido adquiera el color deseado. La reacción se puede monitorear revisando el tejido periódicamente con un microscopio de baja potencia. Termine la reacción moviendo el inserto del pozo con las secciones al tampón fresco, lavándolas tres veces, al menos 5 minutos cada una. Proceda con el Paso 6 para montar las secciones en portaobjetos de vidrio, dejando que las secciones se sequen en un calentador de portaobjetos durante al menos 3-4 h. Deshidrate los portaobjetos con concentraciones crecientes de etanol (es decir, 70%, 90%, 95%, 99.5%, 2-5 min cada uno) seguido de xileno (5-10 min) y luego cubra con un medio de montaje duro (por ejemplo, Entellan), permitiendo que los portaobjetos se sequen al menos 1-2 h en un área ventilada. Si el fondo es demasiado alto, apagar la actividad peroxidasa endógena durante 15 min a RT con 3% deH2O2en 1x TBS seguido de tres lavados tampón, 15-20 min cada uno, antes del bloqueo (Paso 4.4). Varios tejidos periféricos también son susceptibles de usar esta técnica sin modificaciones del protocolo requeridas, con un ejemplo de secciones hepáticas de un ratón que expresa GFP que se muestra en la Figura 5.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo del ensayo inmunohistoquímico fluorescente de flotación libre. Diseccionar el órgano de interés (preferiblemente tejido fijo) e incrustar tejido en moldes de incrustación (ver Tabla de materiales) usando una matriz de muestra (ver Tabla de materiales), y luego congelar en hielo seco y almacenar a -80 °C. Seccionar el tejido utilizando un criostato a 20-50 μm y recoger rodajas en insertos de pocillos (ver Tabla de materiales) llenos con 1x PBS. Usando un agitador orbital a baja velocidad, lave las secciones 3x durante 5 minutos cada una en 1x PBS. En este punto, almacene las secciones adicionales en el búfer de almacenamiento a -80 °C hasta que sea necesario. Lave las secciones restantes 3 veces durante 5 minutos con 1 TBS. Bloquee las secciones durante 30 minutos a RT agitando a baja velocidad. Preparar la solución de anticuerpos primarios e incubar secciones durante la noche en tubos de microcentrífuga a 4 °C (12-14 h). Al día siguiente, lavar las secciones con 1x TBS 3x, los dos primeros lavados durante 30 s, con el tercer lavado durante 10 min. Incubar secciones en solución de anticuerpos secundarios en tubo(s) de microcentrífuga durante 2 h a RT, asegurándose de proteger las secciones de la luz cuando sea posible a partir de este paso adelante. Luego lavar 3x con 1x TBS, los dos primeros lavados durante 30 s y el tercer lavado durante 15 min. Agregue DAPI al último lavado si lo desea y si no está presente en el medio de montaje. Vierta las secciones en una caja de cámara, tres cuartos llena de 1x TBS, y use un pincel para adherir secciones en la(s) diapositiva(s). Deje que las guías se sequen (~ 10-15 min) antes de cubrirlas con el medio de montaje de su elección. Secciones de imágenes usando un microscopio apropiado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Inmunohistoquímica fluorescente utilizando secciones cerebrales que flotan libremente. Las regiones cerebrales del hipocampo que examinan la expresión de GFAP en ratones adultos se muestran y se etiquetaron utilizando un anticuerpo primario anti-GFAP criado en conejo y un anticuerpo secundario anti-conejo Alexa568 criado en burro. DAPI se utilizó en el último lavado para etiquetar los núcleos. El tejido se seccionó a 40 μm utilizando un criostato. Las imágenes se tomaron con un aumento de 10x (superior) y 40x (inferior) utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser. Barra de escala de imagen 10x = 400 μm. Barra de escala de imagen 40x = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Inmunohistoquímica fluorescente en proteínas de menor expresión utilizando el método de flotación libre. Se muestran las regiones cerebrales del hipocampo de un ratón adulto transgénico GFP de baja expresión. Las neuronas que expresan GFP se marcaron utilizando un anticuerpo primario anti-GFP criado en cabra y un anticuerpo secundario anti-cabra Alexa488 criado en burro. DAPI se utilizó en el último lavado para etiquetar los núcleos. El tejido se seccionó a 40 μm utilizando un criostato. Las imágenes se tomaron con un aumento de 40x utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Tinción de violeta de cresilo usando secciones cerebrales que flotan libremente. Usando un criostato, se recolectaron secciones de 40 μm desde el bulbo olfativo del ratón adulto hasta el cerebelo, se lavaron, se montaron en portaobjetos, se tiñeron con violeta cresyl y se cubrieron. Las imágenes se tomaron con un aumento de 10x utilizando un microscopio de campo amplio invertido. Barra de escala = 1 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Inmunohistoquímica fluorescente utilizando secciones hepáticas flotantes. Se muestran secciones de hígado tomadas a 40 μm utilizando un criostato de un ratón adulto transgénico que expresa bajos niveles de GFP. Se utilizó un anticuerpo primario anti-GFP criado en cabra con un anticuerpo secundario anti-cabra Alexa488 criado en burro para etiquetar células que expresan GFP. DAPI se agregó al último lavado para etiquetar los núcleos. Las imágenes se obtuvieron utilizando un microscopio confocal de barrido de punto láser con un aumento de 40x. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

La inmunohistoquímica (IHC) es una técnica versátil que se ha vuelto crucial para identificar la expresión y localización de proteínas dentro de las secciones de tejido. Este ensayo se utiliza en toda la comunidad científica para comprender mejor las características del tejido a través de las etapas de la función normal a los estados de enfermedad. La IHQ se emplea en una variedad de campos, desde el diagnóstico clínico de enfermedades como el cáncer hasta los descubrimientos iniciales en la investigación preclínica10,36.

La técnica más comúnmente utilizada para realizar IHQ es el método montado en la diapositiva en el que las secciones se adhieren inmediatamente a la diapositiva después de ser cortadas. Algunas ventajas de usar esta técnica es que los investigadores pueden manejar secciones muy delgadas necesarias para estudios de colocalización de proteínas y usar poca solución para teñir las secciones por portaobjetos. Los anticuerpos suelen ser caros; Por lo tanto, este enfoque puede ser una opción económica si se van a procesar pocas secciones. Este es también el método de elección para los investigadores que utilizan muestras frescas congeladas porque el manejo del tejido es mínimo, por lo que se protegerá la integridad estructural del tejido. El uso del enfoque montado en portaobjetos también sería apropiado si solo se van a recolectar unas pocas secciones y teñirlas inmediatamente, como es el caso en patología clínica. Por otro lado, existen algunas desventajas, como que solo se accede al lado expuesto del tejido durante la tinción, lo que limita el grosor de la sección debido a la mala penetración de anticuerpos y al lavado efectivo. Otro inconveniente es que una vez que el tejido se secciona y se recoge en portaobjetos, IHC normalmente debe completarse con bastante rapidez con el almacenamiento de portaobjetos sin procesar que ocupan mucho espacio en el congelador. Además, cuando se procesan experimentos más grandes (por ejemplo, varias regiones del cerebro con múltiples niveles representativos para teñir), este enfoque puede usar más reactivos, llevar bastante tiempo y, a menudo, puede limitar el número de portaobjetos que se procesarán por experimento.

Algunas limitaciones asociadas con el método montado en portaobjetos pueden superarse mediante la técnica de tinción flotante que se ha convertido en una alternativa cada vez más popular cuando se trabaja con secciones más gruesas. Aunque este método no es un enfoque novedoso, en nuestra experiencia, ha sido un enfoque confiable, reproducible y flexible, especialmente para teñir muestras de tejido a granel, lo que permite el procesamiento de estudios a mayor escala de manera eficiente. Los investigadores también pueden ejecutar de manera efectiva múltiples experimentos grandes de IHQ al mismo tiempo con este método. Además, las muestras se tiñen en suspensión, por lo que las soluciones pueden penetrar en las secciones desde todos los ángulos, particularmente importante para secciones más gruesas, lo que a menudo conduce a una tinción de mayor calidad (Figura 2, Figura 3 y Figura 5). Las secciones flotantes se pueden cortar en cualquier lugar de 20-50 μm de espesor37, con secciones más gruesas útiles para que los investigadores vean estructuras o células en diferentes planos de visión. Por ejemplo, en el tejido cerebral, las secciones más gruesas permiten a los investigadores ver la estructura de las dendritas y los axones a lo largo de sus muestras. La capacidad de recolectar rodajas más delgadas (20 μm) amplía aún más el espectro de aplicaciones; Sin embargo, las rodajas más delgadas pueden ser difíciles de manejar y, a menudo, requieren más tiempo y esfuerzo para minimizar el daño, por lo que las secciones no deben ser más delgadas que 40 μm para la tinción a granel. Un beneficio clave del método de flotación libre es que los investigadores pueden seccionar rápidamente cerebros enteros (u otro tejido), recolectando todas las secciones en pequeños tubos con cada alícuota que tiene un corte representativo para todas las diferentes regiones del cerebro, lo que permite a los investigadores teñir rápidamente todo el cerebro. Los tubos que contienen rodajas pueden almacenarse en crioprotector a -80 °C durante varios años33, sin que las alícuotas ocupen mucho espacio en el congelador, lo que permite a los investigadores generar una "biblioteca de tejidos". Este método también reduce la cantidad de materiales desperdiciados, incluidos portaobjetos, cubreobjetos y especialmente anticuerpos, que pueden recuperarse y conservarse fácilmente para su reutilización, así como tejidos animales preciosos, ya que las secciones se pueden almacenar y guardar durante el tiempo que los usuarios elijan.

El enfoque de flotación libre y el protocolo presentado aquí también brindan a los investigadores la opción de modificar fácilmente el protocolo o reutilizar los recursos. Por ejemplo, las secciones recolectadas se pueden usar para muchas tinciones histoquímicas diferentes además de la inmunofluorescencia con modificaciones simples del protocolo, como IHC cromogénica, hematoxilina y eosina (H&E), violeta de cresilo (Figura 4) y RNAscope38. La IHQ cromogénica permite la visualización de la expresión de antígenos cuando un sustrato soluble es convertido por una enzima conjugada en un anticuerpo secundario a un producto cromogénico insoluble. Las dos enzimas más utilizadas son la peroxidasa de rábano picante (HRP), que convierte la 3,3' diaminobencidina (DAB) en un producto final de color marrón oscuro, y la fosfatasa alcalina (AP), que convierte el sustrato de 3-amino-9-etilcarbazol (AEC) en un producto rojo39. Realizamos rutinariamente tinción de violeta cresil y utilizamos secciones flotantes para examinar la organización y morfología del cerebro grueso40. También hemos aplicado con éxito este protocolo a muchos tejidos diferentes, incluyendo cerebro, hígado, corazón, riñón y bazo (Figura 5). Otros investigadores también han utilizado con éxito esta técnica para tejidos periféricos como hígado, riñón y ovario22,23,24.

Una preocupación importante cuando se utiliza la técnica de flotación libre es el potencial de daño estructural a las secciones de tejido, especialmente a los cortes cerebrales, porque a lo largo del protocolo, las muestras están en agitadores y rotadores durante casi todos los pasos para garantizar que se laven, bloqueen y manchen uniformemente. Ocasionalmente, regiones específicas del cerebro pueden desprenderse, especialmente en los niveles cerebelosos; Sin embargo, usar un atlas cerebral y una forma de aumento, como una lámpara de joyero, durante el proceso de montaje puede ser útil para unir secciones. Este desafío generalmente se puede prevenir mediante un manejo suave de las muestras y manteniendo las máquinas giratorias en el ajuste correcto y bajo.

En conclusión, presentamos una técnica IHC de flotación libre establecida que ha demostrado ser una modalidad indispensable, confiable, flexible y eficiente que utilizamos regularmente para visualizar la expresión y localización de proteínas, así como la estructura del tejido en una variedad de tejidos. El protocolo aquí incluido se puede modificar fácilmente para adaptarse a las necesidades de investigación individuales, lo que lo hace valioso para la comunidad científica.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nada que revelar

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer al Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (K99 / R00 AG055683 a JMR), el Instituto George y Anne Ryan de Neurociencia (EP, GC, JMR), la Facultad de Farmacia de la Universidad de Rhode Island (EP, GC, JMR) y Konung Gustaf V: s och Drottning Victorias Frimurarestiftelse (JMR). Agradecemos a la estudiante de doctorado Rebecca Senft, que se formó con la profesora Susan Dymecki, del Departamento de Genética de la Escuela de Medicina de Harvard, por presentarnos el método de flotación libre. Algunas imágenes utilizadas en la Figura 1 se obtuvieron de fuentes "gratuitas de usar, compartir o modificar, incluso comercialmente": tubo de ratón y microcentrífuga (Pixabay), cerebro de ratón (Jonas Töle, Wikimedia Commons), sección de criostato y cerebro de ratón (DataBase Center for Life Science, Wikimedia Commons), recipiente de vidrio (OpenClipart, FreeSvg.org) y microscopio (Theresa Knott, Open Clip Art Library).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-well plates Corning 3513
6-well plates Corning 3516
Clear nail polish User preference N/A
DAPI Sigma-Aldrich D9542
Embedding molds Thermo Scientific 1841
Ethylene glycol User preference N/A
Formalin solution Fisher Scientific SF98-4
Horse serum, heat inactivated Gibco 26050088
Microscope slide boxes Electron Microscopy Services 71370
PBS User preference N/A
Primary antibody User preference N/A
Rectangular Coverslips VWR 48393-081 24 x 50 mm
Rectangular staining dish Electron Microscopy Services 70312
Round artist paintbrush #2 Princeton Select Series 3750R Brand not important
Secondary antibody User preference N/A
Specimen matrix for embedding OCT Tissue-Tek, Sakura 4583
Stain tray – slide staining system Electron Microscopy Services 71396-B Use dark lid
Sucrose User preference N/A
Superfrost Plus Micro Slides VWR 48311-703
TBS User preference N/A
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100
Vectashield antifade mounting medium Vector Laboratories H-1000 Non-hardening
Well inserts for 12-well plates Corning Netwells 3477
Well inserts for 6-well plates Corning Netwells 3479
Whatman filter paper Millapore-Sigma WHA1440042

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Childs, G. V. Pathobiology of Human Disease. Part IV: Techniques in Experimental Pathology. Journal of Experimental Medicine. 381923, 3775-3796 (2014).
  2. Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group. Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
  3. Goldman, R. Antibodies: indispensable tools for biomedical research. Trends in Biochemical Sciences. 25 (12), 593-595 (2000).
  4. Taylor, S. N. Using Antibodies: A Laboratory Manual. The Quarterly Review of Biology. Harlow, E. D., Lane, D. 74 (3), 374 (1999).
  5. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  6. Hermersdörfer, H. Immunocytochemistry. A Practical Approach. Beesley, J. E. 38 (3), IRL Press at Oxford University Press. Oxford, New York, Tokyo. 348-348 (1994).
  7. Schacht, V., Kern, J. S. Basics of Immunohistochemistry. Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
  8. Coons, A. H. International Review of Cytology. International Review of Cytology. 5, 1-23 (1956).
  9. Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining Methods for Frozen and Paraffin Sections. Lymphoproliferative Diseases. , 187-211 (1990).
  10. Duraiyan, J., Govindarajan, R., Kaliyappan, K., Palanisamy, M. Applications of immunohistochemistry. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4, Suppl 2 307-309 (2012).
  11. Li, A., Yang, D. H. Methods in Molecular Biology. Methods in Molecular Biology. 2108, Clifton, N.J. 43-55 (2020).
  12. Hökfelt, T., Fuxe, K., Goldstein, M. Applications of Immunohistochemistry to Studies on Monoamine Cell Systems with Special Reference To Nervous Tissues. Annals of the New York Academy of Sciences. 254, 407-432 (1975).
  13. Okaty, B. W., et al. A single-cell transcriptomic and anatomic atlas of mouse dorsal raphe Pet1 neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Koenig, H., Groat, R. A., Windle, W. F. A Physiological Approach to Perfusion-Flxation of Tissues with Formalin. Stain Technology. 20 (1), 13-22 (1945).
  15. Jamur, M. C., Oliver, C. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, Clifton, N.J. 55-61 (2010).
  16. van der Loos, C. A focus on fixation. Biotechnic & Histochemistry. 82 (3), 141-154 (2007).
  17. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
  18. Bachman, J. Immunohistochemistry on freely floating fixed tissue sections. Methods in Enzymology. 533, 207-215 (2013).
  19. Sundquist, S. J., Nisenbaum, L. K. Fast Fos: rapid protocols for single- and double-labeling c-Fos immunohistochemistry in fresh frozen brain sections. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 9-20 (2005).
  20. Bertheau, P., et al. Variability of immunohistochemical reactivity on stored paraffin slides. Journal of Clinical Pathology. 51 (5), 370-374 (1998).
  21. Blind, C., et al. Antigenicity testing by immunohistochemistry after tissue oxidation. Journal ofClinical Pathology. 61 (1), 79-83 (2007).
  22. Desmet, V. J., Krstulović, B., Damme, B. V. Histochemical study of rat liver in alpha-naphthyl isothiocyanate (ANIT) induced cholestasis. The American Journal of Pathology. 52 (2), 401-421 (1968).
  23. Bulmer, D. The Histochemistry of Ovarian Macrophages in the Rat. Journal of Anatomy. 98, 313-319 (1964).
  24. Lönnerholm, G. Histochemical Demonstration of Carbonic Anhydrase Activity in the Human Kidney. Acta Physiologica Scandinavica. 88 (4), 455-468 (1973).
  25. Ronnekleiv, O. K., Naylor, B. R., Bond, C. T., Adelman, J. P. Combined Immunohistochemistry for Gonadotropin-Releasing Hormone (GnRH) and Pro-GnRH, and in Situ Hybridization for GnRH Messenger Ribonucleic Acid in Rat Brain. Molecular Endocrinology. 3 (2), 363-371 (1989).
  26. Nadelhaft, I. The sessile drop method for immunohistochemical processing of unmounted sections of nervous tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (12), 1344-1346 (1984).
  27. Wainer, B. H., Rye, D. B. Retrograde horseradish peroxidase tracing combined with localization of choline acetyltransferase immunoreactivity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 32 (4), 439-443 (1984).
  28. Piekut, D. T., Casey, S. M. Penetration of immunoreagents in Vibratome-sectioned brain: a light and electron microscopic study. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 31 (5), 669-674 (1983).
  29. Cowan, R. L., Wilson, C. J., Emson, P. C., Heizmann, C. W. Parvalbumin-containing gabaergic interneurons in the rat neostriatum. The Journal of Comparative Neurology. 302 (2), 197-205 (1990).
  30. Kjell, J., et al. Delayed Imatinib Treatment for Acute Spinal Cord Injury: Functional Recovery and Serum Biomarkers. Journal of Neurotrauma. 32 (21), 1645-1657 (2015).
  31. Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (31), 12937-12942 (2011).
  32. Watson, R. E., Wiegand, S. J., Clough, R. W., Hoffman, G. E. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 7 (1), 155-159 (1986).
  33. Estrada, L. I., et al. Evaluation of Long-Term Cryostorage of Brain Tissue Sections for Quantitative Histochemistry. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 65 (3), 153-171 (2017).
  34. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  35. Griffiths, G., McDowall, A., Back, R., Dubochet, J. On the preparation of cryosections for immunocytochemistry. Journal of Ultrastructure Research. 89 (1), 65-78 (1984).
  36. Capelozzi, V. L. Papel da imuno-histoquímica no diagnóstico do câncer de pulmão. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 35 (4), 375-382 (2009).
  37. Burry, R. W. Immunocytochemistry. , 65-77 (2009).
  38. Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures. PloS one. 10 (3), 0120120 (2015).
  39. Warr, W. B., de Olmos, J. S., Heimer, L. Neuroanatomical Tract-Tracing Methods. , Springer. 207-262 (1981).
  40. Alvarez-Buylla, A., Ling, C. Y., Kirn, J. R. Cresyl violet: A red fluorescent Nissl stain. Journal of Neuroscience Methods. 33 (23), 129-133 (1990).

Tags

Biología Número 162 histoquímica inmunofluorescencia inmunohistoquímica flotación libre cerebro envejecimiento neurodegeneración expresión de proteínas visualización de proteínas etiquetado de anticuerpos
Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross,… More

Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-Based Stainings Using Free-Floating Tissue Sections. J. Vis. Exp. (162), e61622, doi:10.3791/61622 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter