Summary
우리는 발달의 초기 단계에서 난소 여포에서 성장 난모세포의 분리절차뿐만 아니라 완전히 자란 단계까지 성장과 차별화를 지원할 수있는 체외 문화 시스템의 설정에 대해 설명합니다.
Abstract
성숙하고 열렬한 난모세포의 제한된 예비는 포유류에서 보조 번식의 성공을위한 주요 장벽을 나타냅니다. 생식 수명이 성숙하고 배란되는 난소세포의 약 1%에 불과하다는 점을 고려할 때, 난소 보호구역의 착취를 비배란 여포의 인구증가로 증가시키는 몇 가지 기술이 개발되었다. 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기에 처한 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그러나 난소 보호구역의 광대한 잠재력은 여전히 크게 악용되지 않습니다. 예를 들어, 소에서는 특정 발달 단계에서 난모세포의 체외 문화를 지원하기 위한 시도가 있었지만 효율적이고 신뢰할 수 있는 프로토콜은 아직 개발되지 않았습니다. 여기서 우리는 생체 내의 중간 개성적인 여포에 대응하는 소 초기 개량 여포에서 완전히 자란 단계로 소 초기 개량 여포에서 수집된 체외 성장 난모를 개발하기 위해 정의된 해당 여포 단계의 생리적 조건을 재현하는 배양 시스템을 설명합니다. 호르몬과 인포디세아제 3 억제제의 조합은 불시의 메이오틱 재개를 방지하고 난소 세포의 분화를 안내하는 데 사용되었다.
Introduction
생식 수명 동안 난소에 존재하는 난소의 극히 일부만 성숙하고 배란 시 나팔관에서 방출되며, 수정되어 실행 가능한 배아1로발전할 수 있다. 다른 한편으로는, 난소 내의 난모세포의 대부분은 atresia를 겪고 결코 배란되지 않습니다. 시험관 내 배아 생산(IVP) 기술은 난소예비2,,3의착취를 증가시키려 고 시도했다. 지금까지 이러한 기술은 불임 보존, 가축 의 선택 프로그램 및 멸종 위기 종의 보존에 대한 개입을 허용했습니다. 그럼에도 불구 하 고, 대부분의 프로토콜 은 기본적으로 개소 난소 여포 내에서 성장 단계를 완료 한 난모 세포를 사용 하 여, 따라서 완전히 성장 된 난모 세포로 언급. IVP 기술이 널리 사용되는 가축에서는 완전히 자란 난모세포가 약 120 μm의 최종 직경에 도달하고 직경 2~8mm(중간 개미 여포)1에이르는 여포로부터 채취된다. 여포에서 격리되면, 이러한 난모세포는 체외에서 성숙하고 수정됩니다. 그런 다음 zygotes는 배아세포 단계까지 배양되고 수령인 또는 냉동 보존으로 옮겨갑니다. 가축에서뿐만 아니라 다른 많은 종에서, IVP에 의해 제공 된 잠재력에도 불구하고, 소 당 생체 외 생산 배아의 수는 크게 지난 40 년 동안 개선되지 않았다. 이는 주어진 시간에 난소를 채우는 완전히 자란 난소의 수가 제한되어 있기 때문에 부분적으로 표준 IVP 기술4,,5,,6을회수하고 복종할 수 있다.
초기 개미 여포 내에서 동봉된 난초, 즉 직경이 2mm 미만인 여포는 불임 보존 프로그램7에서 사용할 수 있는 잠재적인 근원을 나타내며, 난소는 대략 중간 개미8보다10배 더 이른 개량여제를 함유하고 있다. 그러나, 이러한 난모세포는 여전히 성장 단계에 있으며 아직 완전히 성장 한단계 9에도달하지 않았습니다. 이와 같이, 그들은 여전히 전사 활성, 나중에 발달 단계에 저장됩니다 mRNA를 생산, 아직 자발적으로 재개하고 meiosis를 완료의 능력으로 난모를 부여하는 데 필요한 모든 분화 과정을 겪지 않은 나는 한 번 여포 구획에서 분리10,,11. 따라서 표준 시험관 성숙(IVM) 프로토콜에 직접 제출할 수는 없지만 성장 단계를 완료하고 적절하게 차별화할 수 있는 추가 문화 기간이 필요합니다.
여포가 초기 개랑자에서 중간 개소 단계로 발전할 때 발생하는 완전히 자란 단계로의 전환은 난모세포 발달 중 중요한 단계 중 하나입니다. 가축에서, 몇몇 연구 결과는 시험관 외2,,,,12,13,14,,15,,16,17,,18,,19에서이 사건을 재구성하는 것을 시도했습니다., 그러나 현재까지 신뢰할 수 있는 프로토콜이 개발되지 않았으며 제한된 성공만 보고되었습니다. 이전 연구에 따르면20,이러한 성장 난모세포는 균일 한 인구를 구성. 전사활성 외에도, 그들의 크로마틴은 GV02,21이라는구성으로 발아 소포(GV)에2분산된다. 반대로, 중형 개포로부터 수득된 완전히 자란 난모세포의 인구는 이질적이며,20을관찰할 수 있는 크로마틴 다짐(GV1, GV2 및 GV3)의 다양한 정도에 의해 미러되는 상태이다. 이들 중, 이전 데이터는 GV2 와 GV3 난모세포가 전반적으로 더 나은 품질과 더 높은 배아 발달 능력(20,,21,,22, 23,,,24)을특징으로하는 것으로 나타났습니다.23
위의 관찰부터 시작하여, 우리는 초기 개울 여포에서 적혈구 -oocyte 복합체 (COC)로 격리 된 난모 세포의 분화를 허용하는 5 일 간의 긴 배양 시스템을 설명합니다. 이러한 배양 전략은 실험실에서 10년 동안 진행된 연구에서 진화하여 이전에 개발된 시험관 내분비 배양(IVCO)2,선조 시스템23,25 및난소 배양 시 아연 보충제에 뿌리를 두고 있다. 여포 자극 호르몬(FSH)과 인포디스세라제-3(PDE3) 억제제의 조합으로, 적정성-난낭화통신2를향상시킬 수 있고, 불시의 메이오틱 재개2를방지하고, 난낭 성장2를 지원하였다.
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Protocol
난소는 4세에서 8세까지 의 현지 아바토이르(INALCA S.p.A., 오스페달레토 로디가노, LO, IT 2270M CE, 이탈리아)에서 회수되었습니다.
1. 미디어 준비
참고: 모든 미디어는 사용하기 최소 4시간 전에 준비해야 합니다. 중탄산나트륨 완충매체는 공기 중 38.5°C, 최대 습도 5%CO2로 배양됩니다. HEPES 버퍼링 된 매체는 온도성 오븐에서 38.5 °C에서 유지됩니다.
- 나분피 (L-IVCO) 매체의 긴 체외 배양
- 기본 배양 매체(M199-B) 15mL 준비: 2mM 글루타민을 곁들인 M199 보충제, 0.4% 지방산 프리 소 세럼 알부민 (BSA), 0.2 mM 나트륨 피루바테, 25 mM 나트륨 중탄산염, 0.1 mM 사이스팀신, 페놀 레드의 21.3 μg/mL, 가나마이신 75 μg/mL 및 4% 폴리피비닐(PVPoli)..
- 보유 매체(M199-H)의 3mL을 준비: M199-B에 5 μM 시로스타미드를 넣고 35mm 페트리 접시에 붓습니다.
- L-IVCO 배지 준비 (M199-L): 보충 M199-B 와 0.15 μg/mL Zn 황산염,10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL 프로게스테론 및 5M μ Cilost
- M199-L 배지 200μL을 96개의 웰에 배치합니다. 증발을 보완하고 문화 동안 적절한 습도를 유지하기 위해 멸균 배양물로 플레이트의 네 가장자리에 우물을 채웁니다.
- 인큐베이터에서 96웰 플레이트및 M199-H 배지를 공기 중 38.5°C 및 5%CO2로 배양하여 최대 습도를 발휘한다.
- 해부 매체
- 해부 매체(M199-D): 0.4% BSA 분획 V, 0.164 mM 페니실린, 0.048 mM 연쇄상 구균, 1790대/L 헤파린을 갖춘 보충 M199. M199-D는 대량으로 제조하고, 20mL 알리쿼트에 분배하고 6개월 동안 4°C로 보관할 수 있다. 필요할 때 따뜻하고 1 개의 알리쿼트를 보충하십시오.
- 5 μM 시로사미드 (M199-D 시로사미드)로 보충 M199-D의 20 mL을 준비합니다.
2. 난소 수집 및 처리
참고: 달리 명시되지 않는 한 모든 절차는 실온(26°C)에서 수행됩니다.
- 소에서 아바토이르에서 난소를 복구합니다.
- 난소를 멸균 식염수(NaCl, 9g/L)에 26-28°C에 페니실린 100 U/mL 및 연쇄상 구균0.1 mg/mL로 넣습니다.
- 4 시간 이내에 따뜻한 멸균 식염수로 실험실로 장기를 운반하십시오.
- 난소를 멸균 식염수로 4배 세척하여 26°C로 유지합니다.
- -28 mmHg에 설정된 진공 압력펌프에 연결된 18G 바늘을 사용하여 직경 2mm 이상의 모든 여포를 제거하고 26°C에서 멸균 식염수로 비커에 흡인난소를 놓습니다.
참고: 여포의 함량을 제거 > 2mm는 실험을 '오염'할 완전히 자란 난모세포의 근원을 가능한 한 많이 제거하는 중요한 단계입니다. - 수평 라미나르 플로우 후드 아래에 멸균 폴리테트라플루오로틸렌 도마에 한 난소를 놓습니다. 메스 손잡이에 장착된 수술블레이드 22번을 사용하여 난소 피질(여포를 포함하는 난소의 바깥부분)의 슬라이스를 1.5~2mm 두께로 장기의 주요 축과 평행하게 절단합니다.
- 난소 피질의 조각을 멸균 유리 페트리 접시에 넣고 38.5 °C의 따뜻한 접시에 해부 매체로 덮여 놓습니다.
참고 : 지금부터 모든 절차는 따뜻한 접시를 사용하여 38.5 °C에서 수행됩니다.
3. 여포의 선택과 고립과 COC의 검색
- M199-D 의 2-3 mL와 60mm 유리 페트리 접시에 하나의 난소 피질 슬라이스를 배치합니다.
- 해부 현미경을 사용하여 마이크로미터가 장착된 접면을 사용하여 0.5~ 2mm 사이의 여포를 선택합니다.
- 스테레오현미경의 밑에 건강한, 비 과인성 여포를 확인합니다. 매우 명확한 반투명 외관과 같은 형태학적 매개 변수를 관찰하여 여포 atresia를 평가합니다. 폐여모를 버리고 다른 모든 것을 처리합니다.
- 메스 손잡이에 장착된 수술블레이드 22호를 사용하여 여포가 한쪽 가장자리에 노출될 때까지 한쪽의 여포를 둘러싼 난소 조직을 제거한다.
- 주사기에 장착된 26G 바늘을 사용하여 노출된 여포 벽에 슬릿을 조심스럽게 만듭니다. 이러한 작용은 COC, 여포액 및 세포의 덩어리를 포함하는 여포 함량을 방출할 것이다.
- 현미경의 밑에 COC를 확인하고 적정한 무결성, zona pellucida 무결성 및 세포질의 균질성에 대해 검사합니다. 이러한 기준이 충족되면 P20 파이펫을 사용하여 COC를 흡인합니다.
- M199-D 시로다미드에 고립된 COC를 배치합니다.
- 격리 절차를 30분 동안 계속합니다.
4. 체외 문화를 받을 코크 선택
- 해부 현미경하에서 3.6단계의 기준에 따라 건강한 COC를 선택하십시오.
- 60mm 페트리 접시에 M199-D 시로스타미드 20 μL 16방울을 준비하고 한 방울당 건강한 COC1개를 놓습니다(그림 1A).
- 카메라에 부착된 반전 된 현미경을 사용하여 카메라와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 조나 펠루시다를 제외한 오사이클 직경을 측정합니다.
- 난미세포의 명확한 시각화를 통해, 조나 펠루시다(도1B)를제외한 2개의 수직 측정을 한다.
- 조나 펠루시다를 제외한 두 난마세포의 측정값이 100 ~ 110 μm 범위 내에 있는지 확인하십시오. 둥근 모양의 난모세포 또는 측정 할 수없는 난모세포로 COC를 폐기하십시오.
- 선택한 COC를 M199-H 배지를 함유한 35mm 접시에 옮기고 38.5°C및 5%CO2의 공기 중의 인큐베이터에 보관하고, 5.1단계까지 최대 습도를 유지한다.
- 3단계와 4단계최대 4배를 반복합니다. 전체 작업 시간은 2h를 초과해서는 안됩니다.
5. 난모세포의 긴 체외 문화 (L-IVCO)
- 1.1.5 단계에서 준비될 수 있는 96웰 플레이트의 우물 중앙에 잘 COC 1개를 전달한다.
- 플레이트를 38.5°C에서 5일 동안 배양하고 공기 중의 CO25%, 최대 습도를 발휘합니다.
- 격일(2일차 및 4일)은 1단계에서 설명한 대로 신선한 M199-L을 준비한다.
- 중간 크기의 100 μL을 제거하고 갓 준비된 M199-L의 100 μL로 교체하여 매체의 절반을 갱신합니다. 스테레오현미경하에서 중간 재생을 수행하고 COC를 우물로 옮기는 것을 피하십시오.
6. 문화 후 COC 분류
- L-IVCO의 끝에서, 해부 현미경의 밑에 COCs의 형태를 분석합니다.
- 그림 2에묘사된 대로 분류합니다.
- COC가 적정 팽창 및 세포 변성의 흔적없이 컴팩트 한 적혈구 투자를 보여주는 경우 클래스 1로 분류합니다.
- COC가 적혈구 팽창 및 세포 변성의 흔적없이 적혈구 세포 투자와 적혈구 질량의 antrum 과 같은 형성을 보이는 경우 클래스 2로 분류합니다.
- COC가 적혈구 팽창의 흔적없이 적혈구 세포의 여러 층과 적혈구 세포의 외부 층과 antrum 같은 형성이없는 일부 분해 된 세포를 표시하는 경우 클래스 3로 분류합니다.
- COC가 난구 표면의 50% 이상연장된 적혈구의 풍부한 손실과 세포 변성 및 세포 이물질의 징후를 보이는 경우 클래스 4로 분류한다.
7. 문화 후 메이오틱 진보에 대한 평가
- 오사이클 비하
- 각 COC를 우물당 400 μL의 400 μL을 포함하는 4웰 플레이트의 단일 웰에 놓습니다.
- 해부 현미경하에서 130-140 μL에 설정된 파이펫을 사용하여 반복된 파이펫팅을 사용하여 적수 세포를 기계적으로 부드럽게 제거합니다.
- 난모세포가 적분 투자가 없는 후, 199D를 포함하는 다른 우물로 이체하십시오.
- 모든 난모세포가 완전히 제거될 때까지 프로세스를 반복합니다.
- 오사이클 핵 염색
참고: 지금부터 모든 절차는 실온에서 수행됩니다. 시약은 실온에 있습니다.- 인산염 완충식식염(PBS)에서 4%의 파격식포름을 1시간 동안 수정한다.
주의: 파라포름알데히드를 취급할 때 개인 보호 장비를 착용하고 유해 폐기물 처리 지침에 따라 오염된 물질을 폐기하십시오. - 1% 폴리비닐알코올(PVA)을 함유한 PBS에서 각 5분 동안 난미를 3배 씩 씻으시다.
참고: 샘플을 즉시 처리하거나 최대 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있습니다. - 0.1% 트리톤 X를 함유한 난미를 PBS에 10분 동안 놓습니다.
- 1% PVA를 함유한 PBS에서 오미드 3x를 각각 5분 동안 세척합니다.
- 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI) 딜락테이트(1 μg/mL)로 보충된 안티페이드 배지 5μL 방울에 난모세포를 단독으로 놓습니다.
- 커버 슬립을 위에 놓을 때 난모세포의 과도한 평평화를 피하기 위해 슬라이드의 긴 면을 따라 양면 테이프 두 스트립을 놓습니다.
- 커버 슬립을 위에 놓고 테이프를 부착하고 모든 샘플을 처리하는 동안 어둠 속에서 유지합니다.
- 다피 필터(흥분/방출: 358⁄461)가 장착된 기존의 피광성 현미경을 사용하여 난소세포를 분석하여 난모세포의 메이오틱 진행을 평가한다.
- 그들의 메이오틱 진행에 따라 난모세포를 분류 : GV - GV 내에서 크로마틴 응축의 다른 학위를 가진 난모세포; MI – GV에서 메타상 I로 분해되는 난모세포; 및 퇴화 – 이전 단계에 있는 것으로 식별 될 수 없는 난모세포.
- 인산염 완충식식염(PBS)에서 4%의 파격식포름을 1시간 동안 수정한다.
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Representative Results
L-IVCO의 끝에서, COC의 총 형태는 도 2에도시된 바와 같이 적수 세포의 외관에 기초하여 4개의 클래스가 변경되고 4개의 클래스를 확인하였다. 건강한 COC11,,26,27,클래스1,2 및 3을 선택하기 위해 일반적으로 채택된 형태학적 기준에 기초하여 건강한 것으로 판단되었으며, 난미세포를 둘러싼 적혈구의 완전한 층부재와 같은 변성의 명확한 징후를 보인 4등급은, IVP 설정에서 다운스트림 시술을 중시하고 부적절한 것으로 간주되었다. 전반적으로, 5개의 생물학 복제에 있는 74개의 난낭을 분석하였고, 그 중 9.45%는 4급에 있었고 추가 평가에서 폐기되었다.
도 3 및 도 4에도시된 바와 같이, L-IVCO 의 끝에 있는 메이오틱 단계의 평가는 난모세포의 상당히 높은 비율(78.57 ± 4.43%)을 나타냈다. 미숙한 단계에서 체포된 채로, 크로마틴은 여전히 GV 내에 둘러싸여 있습니다(따라서 GV 단계라고도 함). 그 중 59.43%는 GV2/3 구성에 있었다. 작은 비율은 메타 단계 I 단계에 도달 meiosis 재개 (13.76 ± 5.85%) 또는 퇴화(7.67 ± 4.61%). 전반적으로, 5개의 생물학적 복제에서 67개의 난모세포가 분석되었다. 이러한 데이터는 L-IVCO 배양이 5일 동안 메이오틱 재개를 방지하면서 난소세포 생존가능성을 지원한다는 것을 나타낸다.
그림 1: COC의 오피테 직경 및 대표 이미지를 측정하는 데 사용되는 접시의 개요입니다. (A)M199-D의 20 μL 16방울을 가진 60mm 페트리 접시의 회로도 표현, 각각 하나의 COC를 함유하고 있습니다. (B)직경 측정에 사용되는 축을 가진 COC의 대표적인 이미지. 조나 펠루치다는 포함되어 있지 않습니다. 배율 막대 50 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 컬렉션 시점과 L-IVCO 이후의 CO의 대표적인 이미지입니다. (A, B, C, D) 위쪽 행(컬렉션)은 검색 시 CO를 나타냅니다. (A', B', C', D') 같은 COC는 5 일 후, L-IVCO의 끝에 그림과 단계 6.1에 보고된 대로 분류됩니다. 하부 행(5일)은 로 분류된 COC를 나타내며, 확장 및 세포 변성의 흔적이 없는 소형 적혈구 투자를 보여주는 클래스 1;A'); 클래스 2, 확장 및 세포 변성의 흔적없이 적혈구 세포를 보여주는 (화살표) 적혈구 질량 (B');; 클래스 3, 적수 확장의 흔적과 적혈구 세포의 흔적과 적운 세포의 여러 층을 보여주는 (C'); 클래스 4, 난낭 표면의 50 % 이상에 적혈구의 풍부한 손실과 세포 변성 및 세포 파편 (D')의 징후를 나타낸다. 스케일 바 40 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 메이오틱 진행의 대표적인 이미지. 상부행(DNA 염색)은(A)GV0 단계및(B)GV2 유사 구성,(C)MI 단계 및(D)퇴화 된 난모세포,(A)수집 시 및(B, C, D)의대표적인 난낭의 DNA(파란색)를 L-IVCO 5일 후 나타낸다. 아래 쪽 행은 위줄의 난모세포의 밝은 필드에 있는 해당 이미지입니다. 화살표는 GV를 나타냅니다. 스케일 바 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 문화가 끝날 때 난모세포의 Meiotic 진행. 막대 그래프는 GV 및 MI 단계에서 난모세포의 분포를 나타내며 L-IVCO 끝에 퇴화된 난모세포가 있습니다. 이전에 클래스 4에서 분류된 난모세포는 제외되었습니다. 데이터는 1방향 ANOVA로 분석되었고 Tukey의 다중 비교 테스트가 ± SEM(N=5; P&0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
여기서 우리는 그들의 생존력을 지원하고 메이오틱 재개를 방지하여 5 일 동안 난낭 개발을 촉진하는 난모세포 재배를위한 문화 시스템을 설명합니다. 이러한 후자의 측면은 메이오능 및 배아 발달 능력2,,20과난낭을 부여하는 데 필요한 지속적인 성장과 분화를 허용하는 것이 가장 중요합니다.
이 배양 시스템을 개발할 때, 우리는 여포에서 발생하는 생리적 성장과 분화의 몇 가지 특성을 고려했다. 이 섹션에서는 이 전략을 개발할 때 고려한 주요 측면에 대한 개요를 제공합니다.
첫째, 소 초기 개낭에서 난모세포를 재배하는 데 약 5일이 소요되어 성장에서 완전히 성장된 단계로의 전환을 거쳐8,,19에서완전히 성장한 단계로 전환한다. 따라서, 배양의 길이는 최대 24h2에대한 양문화된 우리의 실험실에서 의 이전 시도와 는 반대로 5일로 증가했습니다.
L-IVCO에 포함된 또 다른 요인은 COC가 여포액의 생리적 점도를 모방하기 위해 배양되는 매체의 점도증가하였다. 이는 4% PVP를 추가하여 재현되었으며, 콜라겐 I 코팅 배양 표면의 사용과 함께, 이전 연구에 보고된 바와 같이 문화와 같은 3D의 형성을촉진하였다(13).
PDE3 억제제인 시로스타미드는 GV 단계에서 meiotically 체포된 난소세포를 유지하기 위해 첨가되어, 난소 세포2,19,,,25,,28,,29내의 순환 뉴클레오티드 수준을 유지함으로써 조숙한 메이오틱 재개를 방지했다. 우리의 결과는 cilostamide를 가진 5 일 간의 처리가 COC 건강에 총 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내지 않으며, 단지의 단지 작은 부분만이 퇴화하기 때문에, 또한 Alam et al.19에의해 얻은 결과와 일치합니다.
Zn 황산염의 포함, 그리고 그 농도는, 이 미량 요소가 문화에서 성장하는 소의 분화 및 전사 활성을 지원하는 역할을 한다는 것을 보여주는 최근 결과에 의해 입증된다(30)
마지막으로, 호르몬의,조합은 초기 개항 여포31,,32,33의전형적인 생리 호르몬 밀리유를 밀접하게 모방하기 위해 도입되었다. 예를 들어 estradiol은,난낭성장(16,,17,19) 및 과립세포(17)의 연결을 지원하는 한편, 메이오틱능력(34)의인수를 촉진하는 한편, 공지적인 성장을 지원하는 활동을 공지하고 있다.17 유사 하 게, 테 스토 스 테, estradiol의 선구자 인 게다가, 또한 여포 성장 및 개발을 자극35,프로게스테론은 주로 그것의 항석화 활동에 대 한 추가 하는 동안36.
중요하게도, 이전 연구2와합의하여, FSH의 농도는 성장 단계에 대한 생리학적 인 농도로 유지되었다. 실제로, 낮은 FSH 농도는 오낭세포와 동반자 적혈구 사이의 갭-정션 매개 통신을 유지함으로써 난소세포 발달을 촉진하고 메이오틱 재개2를유도하지 않고 전사 활성 및 난구 분화 분화를 촉진한다.
우리의 경험에서, L-IVCO의 성공을위한 열쇠 중 하나는 초기 개목 여포에서 오는 건강한 COC의 균일 한 인구의 선택입니다. 문헌의 데이터에 따르면, 초기 개미 여포로부터 채취한 난모세포의 80%는 GV020이라는구성으로 조직된 크로마틴을 특징으로 한다. 이러한 균질성은 원칙적으로 세포가 배양 환경에 노출될 때 유사하게 행동할 수 있도록 하는 것처럼 체외 배양에 대한 이점을 나타낸다. 이를 염두에 두고 COC 수집은 보다 적게 또는 더 진보된 차별화 단계에서 오는 COC의 '오염'을 최소화하기 위해 수행해야 합니다. 그러나, 사실로 인해, 피질 조각의 처리는 매우 시간이 많이 걸리고 상대적으로 짧은 시간에 수행되어야한다, 컬렉션 / 선택 단계는 아마 L-IVCO의 가장 중요한 통로를 나타냅니다. 이를 위해서는 수염을 염두에 두어야 합니다.
예를 들면, 연구원/기술자는 여포 관증의 표시를 가진 여포를 인식하고 폐기하기 위하여 훈련될 필요가 있습니다. 이 단계에서는 매우 명확한 반투명 외관과 같은 폐색 여포와 내부에 어두운 COC의 존재를 인식하는 데 형태 학적 매개 변수만 사용할 수 있습니다. 증충 징후를 명확하게 구별할 수 없는 다른 모든 여포는, 개방되어야 하며, 고립된 COC의 형태에 기초하여 추가 선택이 수행되어야 하며건강한것들을 식별하기 위해 수행되어야 한다2,33,37,,38,,39. 이것은 적혈구 세포의 적어도 4 층의 존재, 심하게 구형 모양, 그대로 oolemma 및 균질적이고 미세하게 과립 된 ooplasm11,,26,,27과같은 형태학적 관찰에 의해 다시 달성된다.
COC 격리 및 조작은 스테레오현미경과 난낭 직경의 정확한 결정하에 미세 해부에 숙련된 인력과 적절한 장비를 필요로 하는 추가적인 기술적 과제를 나타냅니다. 이 마지막 단계는 난모세포의 균일한 인구를 선택하는 데 필수적이므로 다른 여포 단계에서 오는 COC로 가능한 오염 원을 제외합니다. 이러한 이유로, 회수된 COC에 동봉된 난모세포가 100에서 110 μm2,,40사이의 직경을 가지고 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
L-IVCO는 난낭 의 생존가능성을 지원하고 메이오스틱 재개를 방지하는 것 외에도 크로마틴 구성의 전환을 GV0에서 점진적으로 더 응축된 GV2 및 GV3로 전환하여 난동세포의 59%를 촉진했습니다. 특히 GV 내의 크로마틴 응축은 기본적으로 지금까지20까지연구된 모든 포유류 난우세포에서 메이오틱 및 발달 능력의 '게인'의 표식이다. 이 결과는 특히 이전 24시간 IVCO 시스템과 비교할 때 매우 유망합니다. 그 연구에서는, GV 내의 크로마틴 다짐의 가장 높은 정도에 도달하지 않았고, 난모세포의 22%는 GV1 구성2로발견되었으며, 이는 완전한 메이오틱 능력과 관련된 단계이지만 여전히 개발 능력이 부족하여20. 이러한 조건에서도, 그렇지 않으면 무능한 성장 난모세포는 성숙하고 배아를 생산할 수 있었다, 제한된 양에도 불구하고. L-IVCO에서 관찰되는 GV2/3 단계의 일관된 증가는 따라서 실행 가능한 배아를 생성하기 위하여 더 높은 잠재력과 호환됩니다. 우리는 L-IVCO에서 파생된 COC를 IVP의 다음 단계(체외 성숙, 수정 및 배아 배아 배양까지 발아 단계까지)에 제출하여 실험적으로 이 가설을 시험하는 과정에 있습니다. 확인되면 L-IVCO는 난소 보호구역의 아직 악용되지 않은 잠재력 중 일부를 방출할 것이며, 이는 여성 불임 보존에 대한 여러 분야에 중요한 영향을 미칩니다. 예를 들어, 그것은 높은 유전 장점 브리더의 보존 프로그램에 사용 되는 열성 gametes의 소스를 증가 시킬 것 이다. 우리가 예측하는 또 다른 응용 프로그램은 bovid 가족의 위협 종의 유전 적 인 구출뿐만 아니라 멸종 위기에 처한 지역 품종의 또는 우주 예의 광범위한 확산으로 인해 유전 침식의 위험이 있습니다. 마지막으로, L-IVCO는 유능한 게임테의 형성을 조절하는 세포 및 분자 공정을 해부하는 데 관심이 있는 모든 과학자들을 위한 도구를 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 지역 롬바르디아 PSR INNOVA n.201801061529 및 UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01 의해 지원되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
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