Summary
Vi beskriver prosedyrene for isolering av voksende oocytter fra ovariefollikler i tidlige utviklingsstadier, samt oppsettet av et in vitro kultursystem som kan støtte vekst og differensiering opp til det fullvoksne stadiet.
Abstract
Den begrensede reserven av modne, befruktbare oocytter representerer en stor barriere for suksessen til assistert reproduksjon hos pattedyr. Tatt i forhold til at i løpet av reproduktiv levetid bare ca 1% av oocytes i en eggstokk modne og eggløsning, flere teknikker har blitt utviklet for å øke utnyttelsen av ovarian reserve til den voksende befolkningen av ikke-ovulatory follikler. Slike teknologier har tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Imidlertid er det enorme potensialet i ovariereserven fortsatt i stor grad uutnyttet. Hos kyr, for eksempel, noen forsøk har blitt gjort for å støtte in vitro kultur av oocytes på bestemte utviklingsstadier, men effektive og pålitelige protokoller har ennå ikke blitt utviklet. Her beskriver vi et kultursystem som reproduserer de fysiologiske forholdene i det tilsvarende follikulære stadiet, definert for å utvikle in vitro voksende oocytter samlet fra storfe tidlig antrale follikler til det fullvoksne stadiet, tilsvarende den middels antral follikkel in vivo. En kombinasjon av hormoner og en fosfodiesterase 3-hemmer ble brukt til å forhindre tidlig meiotisk gjenopptakelse og for å veilede oocytes differensiering.
Introduction
I løpet av den reproduktive levetiden frigjøres bare en minimal brøkdel av oocytter som er tilstede i eggstokken, i egglederne ved eggløsning, og er tilgjengelige for å bli befruktet og utvikle seg til et levedyktig embryo1. På den annen side gjennomgår de fleste oocytes i en eggstokk atresi og blir aldri eggløsning. In vitro embryoproduksjon (IVP) teknologier har forsøkt å øke utnyttelsen av ovarian reserve2,3. Så langt har slike teknologier tillatt intervensjoner av fruktbarhet bevaring, utvalg programmer i husdyr, og bevaring av truede arter. Likevel bruker de fleste protokoller oocytes som i utgangspunktet har fullført vekstfasen i antral ovariefollikelen, og dermed kalles fullvoksne oocytter. I storfe, hvor IVP-teknologier er mye brukt, når fullvoksne oocytter en endelig diameter på ca. 120 μm og samles inn fra follikler som strekker seg fra 2 til 8 mm i diameter (middels antral follikler)1. Ved isolasjon fra folliklene blir slike oocytter in vitro modnet og befruktet. Zygotene blir deretter dyrket opp til blastocyst scenen og enten overført til en mottaker eller kryopreservert. Hos storfe, så vel som i mange andre arter, til tross for potensialet som tilbys av IVP, ble antall in vitro produsert embryo per ku ikke i stor grad bedre de siste 40 årene. Dette skyldes delvis det begrensede antallet fullvoksne oocytter som fyller en eggstokk på et gitt tidspunkt som kan hentes og utsettes for standard IVPteknikker 4,5,6.
Oocytes omsluttet i tidlig antral follikler, det vil si de folliklene som er mindre enn 2 mm i diameter, representerer en potensiell kilde som skal brukes i fruktbarhet bevaring programmer7 , som en eggstokk omtrent inneholder 10 ganger mer tidlig antral follikler enn middels antral8. Imidlertid er disse oocytes fortsatt i vekstfasen og har ennå ikke nådd den fullvoksne scenen9. Som sådan er de fortsatt transkripsjonelt aktive, produserer mRNAs som vil bli lagret for senere utviklingstrinn, og har ennå ikke gjennomgått all differensieringsprosessen som kreves for å overdra oocytter med evnen til spontant å gjenoppta og fullføre meiose jeg en gang isolert fra follikulærtrom 10,11. Derfor kan de ikke sendes direkte til standard IN vitro modningsprotokoller (IVM), men de krever en ekstra periode med kultur som ville tillate dem å fullføre vekstfasen og skille riktig.
Overgangen fra den voksende til det fullvoksne scenen, som hos storfe oppstår når follikkelen utvikler seg fra tidlig antral til middels antralstadium, er et av de kritiske trinnene under oocyteutvikling. I storfe, flere studier forsøkte å rekafulere disse hendelsene in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Men til dags dato ingen pålitelige protokoller har blitt utviklet og bare begrenset suksess har blitt rapportert. Ifølge tidligere studier20utgjør disse voksende oocytes en homogen befolkning. Foruten å være transkripsjonelt aktiv, er deres kromatin spredt i germinal vesikkelen (GV), i en konfigurasjon som heter GV02,21. Omvendt er befolkningen av fullvoksne oocytter hentet fra middels antrale follikler mer heterogen, en tilstand som speiles av de ulike gradene av kromatinkomprimering (GV1, GV2 og GV3) som kan observeres20. Blant disse har tidligere data vist at GV2 og GV3 oocytes er samlet preget av en bedre kvalitet og høyere embryonisk utviklingskompetanse20,,21,,22,,23,,24.
Fra de ovennevnte observasjonene beskriver vi her et 5-dagers langt kultursystem av oocytter (L-IVCO) som tillater differensiering av oocytter isolert som cumulus-oocyte komplekser (COCer) fra tidlige antral follikler. Denne kulturstrategien har utviklet seg fra 10 år lange studier utført i vårt laboratorium og røtter sin grunn på den tidligere utviklede 24-48 timer in vitro oocyte kultur (IVCO)2,premetningssystemer23,,25 og sink tilskudd under oocyte kultur . En kombinasjon av follikkelstimulerende hormon (FSH) og en fosfodiesterase-3 (PDE3) hemmer, i stand til å forbedre cumulus-oocytekommunikasjon 2, hindre tidlig meiotisk gjenopptakelse2, og støtte oocyte vekst2 ble brukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eggstokkene ble samlet inn fra 4 til 8 år gamle Holstein melkekyr gjenvunnet ved det lokale slakteriet (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italia).
1. Forberedelse av medier
MERK: Alle medier må være forberedt minst fire timer før bruk. Natriumbikarbonatbufret media inkuberes ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal luftfuktighet. HEPES-bufret media opprettholdes ved 38,5 °C i termostatovn.
- Lang in vitro kultur av oocytes (L-IVCO) medium
- Forbered 15 ml av det grunnleggende kulturmediet (M199-B): Supplement M199 med 2 mM glutamin, 0,4% fettsyrefri storfe serumalbumin (BSA), 0,2 mM natriumpyuvat, 25 mM natriumbikarbonat, 0,1 mM cysteamin, 21,3 μg/ml fenolrød, 75 μg/ml kanamycin og 4 % polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 k molekylvekt).
- Forbered 3 ml av holdemediet (M199-H): Til M199-B tilsett 5 μM cilostamid og hell den i en 35 mm petriskål.
- Forbered L-IVCO-mediet (M199-L): Supplement M199-B med 0,15 μg/ml Zn-sulfat, 10-4 IE/ml FSH, 10 ng/ml østradiol, 50 ng/ml testosteron, 50 ng/ml progesteron og 5 μM Cilostamide.
- Plasser 200 μL M199-L medium i hver brønn av den 96 godt bestrøkede platen. Fyll brønnene i de fire kantene av platen med sterilt kulturvann for å kompensere for fordampning og for å opprettholde passende fuktighet under kulturen.
- Inkuber 96-brønnplaten og M199-H-mediet i inkubatoren ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal fuktighet.
- Disseksjonsmedium
- Forbered disseksjonsmediet (M199-D): Supplement M199 med 0,4% BSA fraksjon V, 0,164 mM penicillin, 0,048 mM streptomycin, 1790 enheter / L heparin. M199-D kan tilberedes i bulk, dispenseres i 20 ml aliquots og lagres ved 4 °C i 6 måneder. Når det trengs, varm og supplere 1 aliquot.
- Forbered 20 ml M199-D supplert med 5 μM cilostamid (M199-D cilostamid).
2. Eggstokk innsamling og behandling
MERK: Alle prosedyrer utføres ved romtemperatur (26 °C) med mindre annet er angitt.
- Gjenopprett eggstokkene ved slakteriet fra kyr.
- Plasser eggstokkene i steril saltvann (NaCl, 9 g/L) ved 26 – 28 °C tilsatt med penicillin 100 E/ml og streptomycin 0,1 mg/ml.
- Transporter organene til laboratoriet i varm steril saltvann innen 4 timer.
- Vask eggstokkene 4x i steril saltvann opprettholdt ved 26 °C.
- Fjern alle mellom-til-store antral follikler ved å aspirere alle follikler mer enn 2 mm i diameter ved hjelp av en 18 G nål koblet til en aspirasjonspumpe med vakuumtrykk satt til -28 mmHg og plasser de aspirerte eggstokkene i et beger med steril saltvann ved 26 °C.
MERK: Fjerning av innholdet i follikler > 2 mm er et kritisk skritt for å fjerne så mye som mulig kilden til fullvoksne oocytter som ville "forurense" eksperimentet. - Under en horisontal laminær strømningshette plasserer du en eggstokk på den tiden på et sterilt polytetrafluoretylenskjærebrett. Ved hjelp av et kirurgisk blad Nr. 22 montert på et skalpellhåndtak, kutt skiver av eggstokkbark (den ytre delen av eggstokken, som inneholder folliklene), 1,5 – 2 mm tykke og parallelt med organets hovedakse.
- Legg skiver av ovariebark i et sterilt glass Petriskål dekket med dissekeringsmedium på en varm tallerken ved 38,5 °C.
MERK: Fra nå av utføres alle prosedyrene ved 38,5 °C ved hjelp av en varm plate.
3. Valg og isolering av folliklene og gjenfinning av COC-ene
- Legg en ovariebarkskive i en petriskål i 60 mm glass med 2-3 ml M199-D.
- Bruk et disseksjonsmikroskop til å velge folliklene mellom 0,5 – 2 mm ved hjelp av et mikrometerutstyrt okular.
- Identifiser de sunne, ikke-atretiske folliklene under stereomikroskopet. Vurder follikkelatresi ved å observere morfologiske parametere, for eksempel veldig klart gjennomsiktig utseende, med en mørk COC inni. Kast atretikafollikler og behandle alle de andre.
- Ved hjelp av et kirurgisk blad Nr. 22 montert på et skalpellhåndtak fjerne eggstokkvevet rundt follikkelen på den ene siden til follikkelen er utsatt på den ene kanten.
- Bruk en 26G kanyle montert på en sprøyte, gjør forsiktig en spalte i den eksponerte follikkelveggen. Denne handlingen vil frigjøre follikulært innhold, bestående av COC, follikulær væske og klumper av celler.
- Identifiser COC under mikroskopet og undersøke for cumulus integritet, zona pellucida integritet og homogenitet av cytoplasma. Hvis disse kriteriene er oppfylt, aspirerer COC ved hjelp av en P20-pipette.
- Plasser den isolerte COC i M199-D cilostamid.
- Fortsett isolasjonsprosedyren i 30 min.
4. Valg av COCer som skal utsettes for in vitro-kultur
- Under disseksjonsmikroskopet velger du sunne COCer basert på kriteriene i trinn 3.6.
- I en 60 mm petriskål, forberede 16 dråper av 20 μL M199-D cilostamide og plassere en sunn COC per dråpe (Figur 1A).
- Ved hjelp av et omvendt mikroskop festet til et kamera måle oocyte diameter, unntatt zona pellucida, ved hjelp av programvaren som følger med kameraet.
- Med en klar visualisering av oocyte, gjør to vinkelrett målinger unntatt zona pellucida (figur 1B).
- Forsikre om gjennomsnittet av de to oocyte måling, unntatt zona pellucida, er innenfor et område på 100 – 110 μm. Kast COCer med ikke-avrundede formede oocyte eller med oocytes som ikke er målbare.
- Overfør de valgte COCene i en 35 mm fat rett som inneholder M199-H medium og oppbevar dem i inkubatoren ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal fuktighet til trinn 5.1.
- Gjenta trinn 3 og 4 opptil 4x. Den totale arbeidstiden må ikke overstige 2 timer.
5. Lang in vitro kultur av oocytes (L-IVCO)
- Overfør en COC per brønn i midten av en brønn på 96-brønnplaten som skal tilberedes i trinn 1.1.5.
- Inkuber platen i 5 dager ved 38,5 °C og 5 % CO2 i luft, maksimal fuktighet.
- Annenhver dag (dag 2 og dag 4) tilbereder frisk M199-L som beskrevet i trinn 1.
- Forny halvparten av mediet ved å fjerne 100 μL medium og erstatte med 100 μL nylaget M199-L. Utfør medium fornyelse under stereomikroskopet og unngå å flytte COCene inn i brønnen.
6. COC-klassifisering etter kulturen
- På slutten av L-IVCO analyserer du COCs morfologi under disseksjonsmikroskopet.
- Klassifiser som avbildet i figur 2.
- Klassifiser som klasse 1 hvis COCer viser en kompakt cumulus celleinvestering uten tegn til cumulus ekspansjon og celledegenerasjon.
- Klassifiser som klasse 2 hvis COCer viser en kompakt cumulus celleinvestering uten tegn til cumulus ekspansjon og celledegenerasjon og med antrum-lignende formasjon i cumulus-massen.
- Klassifisere som klasse 3 hvis COCer viser flere lag med cumulus celle uten tegn til cumulus ekspansjon og noen disaggregated celler i det ytre laget av cumulus celler og ingen antrum-lignende formasjon.
- Klassifisere som klasse 4 hvis COCer viser rikelig tap av cumulus celler som strekker seg for mer enn 50% av oocyte overflaten, og tegn på celle degenerasjon og celle rusk.
7. Evaluering av middelmådig progresjon etter kultur
- Oocyte denudasjon
- Plasser hver COC i en enkelt brønn av en firebrønns plate som inneholder 400 μL μL på 199D per brønn.
- Under et disseksjonsmikroskop fjerner du forsiktig cumuluscellene mekanisk ved gjentatt pipettering ved hjelp av et pipettesett på 130-140 μL.
- Når oocytes er fri for cumulus investering, overføre dem til en annen brønn som inneholder 199D.
- Gjenta prosessen til alle oocytes er helt denuded.
- Oocyte kjernefysisk farging
MERK: Fra nå av utføres alle prosedyrene ved romtemperatur. Reagenser er ved romtemperatur.- Fest oocytter i paraformaldehyd 4% i fosfat buffer saltvann (PBS) for 1 time.
FORSIKTIG: Bruk personlig verneutstyr ved håndtering av paraformaldehyd og kast forurensede materialer i henhold til retningslinjer for farlig avfallshåndtering. - Vask oocytter 3x i 5 min hver i PBS som inneholder 1% polyvinylalkohol (PVA).
MERK: Prøvene kan behandles med en gang eller lagres ved 4 °C i maksimalt én uke. - Plasser oocytes i PBS som inneholder 0,1% Triton X i 10 min.
- Vask oocytter 3x i 5 min hver i PBS som inneholder 1% PVA.
- Plasser oocytter enestående i dråper på 5 μL antifade medium supplert med 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) dilaktat (1 μg / ml) over et lysbilde.
- Plasser to strimler med dobbeltsidig tape langs langsiden av lysbildet, for å unngå overdreven utflating av oocytes når du setter dekselet slip på toppen.
- Plasser dekselet slip på toppen, gjør det holde seg til båndet og holde i mørket mens du behandler alle prøvene.
- Analyser oocytter ved hjelp av et konvensjonelt epifluorescencemikroskop utstyrt med DAPI-filtre (Eksitasjon/utslipp: 358/461) for å vurdere den meiotiske progresjonen av oocytene.
- Klassifisere oocytes i henhold til deres meiotiske progresjon: GV - oocytes med ulike grader av kromatin kondens i GV; MI – oocytes fra GV bryte ned til metaphase I; og degenerere – oocytes som ikke kunne identifiseres som å være på noen av de tidligere stadiene.
- Fest oocytter i paraformaldehyd 4% i fosfat buffer saltvann (PBS) for 1 time.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På slutten av L-IVCO ble bruttomorfologien til COCene endret og 4 klasser ble identifisert basert på utseendet til cumulus-cellene, som vist i figur 2. Basert på de morfologiske kriteriene som vanligvis ble vedtatt for å velge sunne COCer11,26,27,ble klasse 1, 2 og 3 dømt sunn, mens klasse 4, som viste klare tegn på degenerasjon som fravær av komplette lag av cumulus celler rundt oocytes, ble ansett som alvorlig kompromittert og uegnet til å gjennomgå nedstrøms prosedyrer i en potensiell IVP-innstilling. Totalt ble 74 oocytter i 5 biologiske repliker analysert, hvorav 9,45% var i klasse 4 og ble forkastet fra videre evaluering.
Som vist i figur 3 og figur 4viste vurderingen av det middelmådige stadiet på slutten av L-IVCO at en signifikant høyere prosentandel av oocytene (78,57 ± 4,43 %) forble arrestert på umoden stadium, med kromatin fortsatt vedlagt i GV (derfor også referert til som GV stadium), uten degenerating. Blant dem var 59,43% i en GV2/3-konfigurasjon. En liten prosentandel gjenopptok meiose som nådde metafase I-scenen (13,76 ± 5,85 %) eller degenerere (7,67 ± 4,61 %). Totalt ble 67 oocytes i 5 biologiske replikeringer analysert. Til sammen indikerer disse dataene at L-IVCO-kulturen støtter oocyte levedyktigheten samtidig som de forhindrer meiotisk gjenopptakelse i 5 dager.
Figur 1: Omriss av retten som brukes til å måle oocytediameteren og representativt bilde av en COC. (A)Skjematisk representasjon av en 60 mm petriskål med 16 dråper 20 μL M199-D, hver og en som inneholder en enkelt COC. (B) Representativt bilde av en COC med aksen som brukes til å måle diameteren. Vær oppmerksom på at zona pellucida ikke er inkludert. Skala bar 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av COCer på tidspunktet for samlingen og etter L-IVCO. (A, B, C, D) Den øvre raden (Samling) representerer COCer på tidspunktet for henting. (A', B', C', D') Samme COC er avbildet 5 dager senere, på slutten av L-IVCO og klassifisert som rapportert i trinn 6.1. Den nedre raden (5 dager) representerer COCer klassifisert som: Klasse 1, som viser en kompakt cumulus celleinvestering uten tegn til ekspansjon og celledegenerasjon (A'); Klasse 2, som viser en kompakt cumulus celle investering uten tegn til ekspansjon og celle degenerasjon og med antrum-lignende formasjon (piler) i cumulus masse (B'); Klasse 3, som viser flere lag med cumulus celle uten tegn til cumulus ekspansjon og noen disaggregated celler i det ytre laget av cumulus celler (C'); Klasse 4, som viser rikelig tap av cumulus celler på mer enn 50% av oocyte overflaten og tegn på celle degenerasjon og celle rusk (D'). Skala bar 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Representative bilder av den middelmådige progresjonen. Den øvre raden (DNA farging) viser DNA (blå) av representative oocytes på (A) GV0 scenen og (B) GV2-lignende konfigurasjon, (C) MI stadium og (D) degenerert oocytes, (A) på tidspunktet for samlingen og (B, C, D) etter 5 dager med L-IVCO. Den nedre raden er det tilsvarende bildet i lyst felt av oocyte i den øvre raden. Pilen angir GV. Skala bar 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Meiotisk progresjon av oocytes på slutten av kulturen. Søylediagrammet representerer fordelingen av oocytter på GV- og MI-scenen og degenererte oocytter på slutten av L-IVCO. Oocytes tidligere klassifisert i klasse 4 ble ekskludert. Data ble analysert av 1-veis ANOVA etterfulgt av Tukeys flere sammenligningstest og verdier er ± SEM (N = 5; P<0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her beskriver vi et kultursystem for voksende oocytter som fremmer oocyteutvikling i 5 dager ved å støtte deres levedyktighet og forhindre meiotisk gjenopptakelse. Dette siste aspektet er av største betydning for å tillate fortsatt vekst og differensiering som er nødvendig for å overdra oocytten med meiotisk og embryonisk utviklingskompetanse2,20, som ellers ville bli blokkert av en for tidlig gjenopptakelse av den meiotiske divisjonen.
Når vi utvikler dette kultursystemet, tok vi hensyn til flere egenskaper ved fysiologisk vekst og differensiering som oppstår i follikkelen. I denne delen gir vi en oversikt over de viktigste aspektene som vi vurderte ved utvikling av denne strategien.
For det første tar voksende oocytter i storfe tidlig antral follikler ca 5 dager å gjennomgå overgangen fra den voksende til den fullvoksne scenen in vivo8,19. Derfor ble lengden på kulturen økt til 5 dager i motsetning til tidligere forsøk gjort i vårt laboratorium hvor oocytes ble dyrket i opptil 24 t2.
En annen faktor som vi inkluderte i L-IVCO var den økte viskositeten til mediet der COCene er kultivert for å etterligne follikulær viskositet av follikulær væske. Dette ble gjenskapt ved å legge til 4% PVP og, sammen med bruk av kollagen jeg belagt kulturoverflate, det fremmet dannelsen av en 3D lignende kultur, som rapportert av tidligerestudier 13.
Cilostamide, en PDE3-hemmer, ble lagt til for å opprettholde oocytter meiotically arrestert på GV-scenen, og forhindret precocious meiotisk gjenopptakelse ved å holde høye nivåer av sykliske nukleotider innenfor oocytter2,19,25,28,29. Våre resultater tyder på at en 5-dagers lang behandling med cilostamid ikke har en grov innvirkning på COCs helse, som bare en liten brøkdel av komplekser degenerert, også i samsvar med resultatene oppnådd av Alam et al.19.
Inkluderingen av Zn sulfat, og dens konsentrasjon, underbygges av nylige resultater som viser at dette sporelementet har en rolle i å støtte differensiering og transkripsjonsaktivitet av storfe voksende oocytes i kultur30.
Til slutt ble en kombinasjon av hormoner introdusert for å etterligne det fysiologiske hormonelle miljøet som er typisk for tidlig antralfollikkel 31,32,33. For eksempel har østradiol kjent aktiviteter i å støtte oocyte vekst16,17,19 og forbindelsene mellom granulosa celler17, samtidig fremme oppkjøpet av meiotisk kompetanse34. Tilsvarende, testosteron, foruten å være en forløper for østradiol, stimulerer også follikulær vekstog utvikling 35, mens progesteron ble hovedsakelig lagt til for sin antiapoptotiske aktivitet36.
Viktigere og i samsvar med vår forrige studie2ble konsentrasjonen av FSH holdt i en konsentrasjon som er fysiologisk for vekstfasen. Faktisk fremmer en lav FSH-konsentrasjon oocyteutvikling ved å opprettholde gap-junction mediert kommunikasjon mellom oocyte og følgesvenn cumulus celler og fremmer transkripsjonsaktivitet og oocyte differensiering uten å indusere meiotisk gjenopptakelse2.
I vår erfaring er en av nøklene til suksessen til L-IVCO valget av en homogen populasjon av sunne COCer som kommer fra tidlige antral follikler. Ifølge data i litteraturen er 80% av oocytter samlet inn fra tidlige antral follikler preget av kromatin organisert i en konfigurasjon som besamled GV020. Denne homogeniteten representerer en fordel for in vitro kultur, som i prinsippet sikrer det at cellene vil oppføre seg på samme måte når de utsettes for kulturmiljøet. Med dette i tankene må COC-innsamling utføres for å prøve å minimere "forurensningen" med COCer som kommer fra mindre eller mer avanserte stadier av differensiering. Men på grunn av det faktum, at behandling av kortikale skiver er ganske tidkrevende og bør utføres på relativt kort tid, samlingen / utvalg trinnet representerer trolig den mest kritiske passasjen av L-IVCO. For å oppnå det, bør noen viktige hensyn være skjegg i tankene.
For eksempel må forskeren/teknikeren trenes til å gjenkjenne og kaste follikler med tegn på follikulær atresi. På dette stadiet kan bare morfologiske parametere brukes til å gjenkjenne atretiske follikler, for eksempel veldig klart gjennomsiktig utseende, og tilstedeværelsen av en mørk COC inne. Alle de andre folliklene, der atretiske tegn ikke kan skilles tydelig, bør åpnes og videre utvelgelse basert på morfologien til de isolerte COCene skal utføres for å identifisere de sunne2,3,37,38,39. Dette oppnås igjen ved morfologiske observasjoner som tilstedeværelsen av minst fire lag med cumulus celler, grovt sfærisk form, intakt oolemma og homogen og fint granulert ooplasm11,26,27.
COCs isolasjon og manipulasjon representerer en ekstra teknisk utfordring, som krever dyktig personell og riktig utstyr for mikro-disseksjon under stereomikroskopet og nøyaktig bestemmelse av oocyte diameter. Dette siste trinnet er avgjørende for å velge en jevn populasjon av oocytter, og dermed ekskludere enhver mulig forurensningskilde med COCer som kommer fra andre follikulære stadier. Av denne grunn er det viktig å sørge for at oocytes vedlagt i de hentede COCene har en diameter mellom 100 og 110 μm2,,40.
Foruten å støtte oocyte levedyktighet og hindre meiotisk gjenopptakelse, L-IVCO fremmet overgangen av kromatin konfigurasjonen fra GV0 til gradvis mer kondensert GV2 og GV3 i 59% av oocytes. Spesielt kromatin kondens i GV er en markør for "gevinst" av meiotisk og utviklingskompetanse i utgangspunktet alle pattedyr oocytes studert så langt20. Dette resultatet er svært lovende, spesielt sammenlignet med vårt tidligere 24-timers IVCO-system. I denne studien ble den høyeste graden av kromatinkomprimering innen GV ikke nådd, og 22% av oocytter ble funnet med en GV1-konfigurasjon2,et stadium forbundet med full meiotisk kompetanse, men fortsatt knapp utviklingskompetanse20. Selv under disse forholdene var de ellers inkompetent voksende oocytter i stand til å modnes og produsere embryoer, men i begrenset mengde. Den konsekvente økningen i GV2/3-stadier observert i L-IVCO er derfor kompatibel med et høyere potensial for å produsere levedyktige embryoer. Vi er i ferd med å teste denne hypotesen eksperimentelt ved å sende coCer avledet fra L-IVCO til følgende trinn av IVP (in vitro modning, befruktning og embryokultur opp til blastocyst stadium). Hvis bekreftet, L-IVCO vil slippe løs noen av ennå uutnyttet potensialet i ovarian reserve, med viktige implikasjoner på flere områder av interesse for kvinnelig fruktbarhet bevaring. For eksempel vil det øke kilden til befruktbare gametes som skal brukes i bevaringsprogrammer av høy genetisk fortjeneste oppdrettere. Et annet program som vi forutser er for genetisk berging av truede arter av bovid familien samt av lokale raser som er truet eller i fare for genetisk erosjon på grunn av utbredt diffusjon av kosmopolite raser. Sist men ikke minst representerer L-IVCO et verktøy for alle forskerne som er interessert i å dissekere cellulære og molekylære prosesser som regulerer dannelsen av en kompetent gamete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 og UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J.
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
