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Developmental Biology

पशुओं में अर्ली एंट्रल कूप से Oocytes के लिए विट्रो संस्कृति रणनीति

Published: July 8, 2020 doi: 10.3791/61625
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Reproductive and Developmental Biology Laboratory, Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan

Summary

हम विकास के प्रारंभिक चरणों में अंडाशय के रोम से बढ़ते ओसाइट्स के अलगाव के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं, साथ ही एक इन विट्रो संस्कृति प्रणाली की स्थापना जो पूरी तरह से विकसित चरण तक विकास और भेदभाव का समर्थन कर सकती है।

Abstract

परिपक्व, उर्वरक ओसाइट्स का सीमित भंडार स्तनधारियों में सहायता प्राप्त प्रजनन की सफलता के लिए एक प्रमुख बाधा का प्रतिनिधित्व करता है। यह देखते हुए कि प्रजनन जीवन काल के दौरान अंडाशय परिपक्व और अंडाशय में केवल 1% ओसाइट्स के बारे में, अंडाशय के भंडार के शोषण को गैर-अंडाशय रोम की बढ़ती आबादी तक बढ़ाने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया है। ऐसी प्रौद्योगिकियों ने प्रजनन संरक्षण, पशुधन में चयन कार्यक्रमों और लुप्तप्राय प्रजातियों के संरक्षण के हस्तक्षेप की अनुमति दी है । हालांकि, अंडाशय रिजर्व की विशाल क्षमता अभी भी काफी हद तक अनशोषित है । उदाहरण के लिए, गायों में, विशिष्ट विकासात्मक चरणों में ओसाइट्स की विट्रो संस्कृति में समर्थन करने के लिए कुछ प्रयास किए गए हैं, लेकिन कुशल और विश्वसनीय प्रोटोकॉल अभी तक विकसित नहीं किए गए हैं । यहां हम एक संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जो इसी कूप चरण की शारीरिक स्थितियों को पुन: उत्पन्न करता है, जिसे गोजातीय प्रारंभिक एंट्रल रोम से पूरी तरह से विकसित चरण तक एकत्र किए गए विट्रो बढ़ते ओसाइट्स को विकसित करने के लिए परिभाषित किया गया है, जो वीवो में मध्यम एंट्रल कूप के अनुरूप है। हार्मोन और फॉस्फोडिस्टेरेस 3 अवरोधक का एक संयोजन असामयिक मेइटिक बहाली को रोकने और ओसाइट के भेदभाव का मार्गदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

Introduction

प्रजनन जीवन काल के दौरान, अंडाशय परिपक्व में मौजूद ओसाइट्स का केवल एक न्यूनतम अंश, अंडाशय पर फैलोपियन ट्यूबों में जारी किया जाता है, और निषेचित होने और एक व्यवहार्य भ्रूण1में विकसित होने के लिए उपलब्ध हैं। दूसरी ओर, एक अंडाशय के भीतर अधिकांश ओसाइट्स अट्रेसिया से गुजरते हैं और कभी भी अंडाशय नहीं होते हैं। इन विट्रो भ्रूण उत्पादन (आईवीपी) प्रौद्योगिकियों ने ओवेरियन रिजर्व2,3के शोषण को बढ़ाने का प्रयास किया है। इस प्रकार अब तक, ऐसी प्रौद्योगिकियों ने प्रजनन संरक्षण, पशुधन में चयन कार्यक्रमों और लुप्तप्राय प्रजातियों के संरक्षण के हस्तक्षेप की अनुमति दी है । फिर भी, अधिकांश प्रोटोकॉल ओसाइट्स का उपयोग करते हैं जिन्होंने मूल रूप से एंट्रल ओवेरियन कूप के भीतर विकास चरण पूरा कर लिया है, और इसलिए इसे पूरी तरह से विकसित ओसाइट्स के रूप में जाना जाता है। मवेशियों में, जहां आईवीपी प्रौद्योगिकियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, पूरी तरह से विकसित ओसाइट्स लगभग 120 माइक्रोन के अंतिम व्यास तक पहुंचते हैं और रोम से एकत्र किए जाते हैं जो व्यास (मध्यम अंत्येय रोम) 1 में 2 से 8 मिमी तक फैलेहोतेहैं। रोम से अलगाव पर, इस तरह के ओसाइट्स विट्रो परिपक्व और निषेचित में हैं। ज़िगोट्स को तब ब्लास्टोसिस्ट चरण तक सुसंस्कृत किया जाता है और या तो प्राप्तकर्ता या क्रायोप्रीड्योर में स्थानांतरित कर दिया जाता है। मवेशियों के साथ-साथ कई अन्य प्रजातियों में, IVP द्वारा पेश की गई क्षमता के बावजूद, प्रति गाय इन विट्रो उत्पादित भ्रूण की संख्या में पिछले ४० वर्षों से काफी हद तक सुधार नहीं हुआ । यह सीमित संख्या में पूरी तरह से विकसित ओसाइट्स के कारण होता है जो एक ऐसे समय में अंडाशय को आबाद करता है जिसे वापस लाया जा सकता है और मानक आईवीपीतकनीकों केअधीन किया जा सकता है 4,5,6.

शुरुआती एंट्रल रोम के भीतर संलग्न ओसाइट्स, यानी, उन रोम जो व्यास में 2 मिमी से कम हैं, प्रजनन संरक्षण कार्यक्रमों में उपयोग किए जाने वाले संभावित स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं7, क्योंकि एक अंडाशय में मोटे तौर पर मध्यम एंट्रल8की तुलना में 10 गुना अधिक प्रारंभिक एंट्रल रोम होते हैं। हालांकि, ये ओसाइट्स अभी भी ग्रोथ फेज में हैं और अभी पूरी तरह से विकसित स्टेज9तक नहीं पहुंचे हैं । जैसे, वे अभी भी ट्रांसक्रिप्शन रूप से सक्रिय हैं, जो बाद में विकासात्मक कदमों के लिए संग्रहीत किए जाएंगे, और अभी तक सभी भेदभाव प्रक्रिया से नहीं गुजरे हैं, जो अनायास शुरू करने और मीनोसिस को पूरा करने की क्षमता के साथ oocytes प्रदान करने के लिए आवश्यक है, मैं एक बार कूप डिब्बे10, 11,11से अलग हो गया था। इसलिए, उन्हें सीधे मानक इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम) प्रोटोकॉल में प्रस्तुत नहीं किया जा सकता है, लेकिन उन्हें संस्कृति की एक अतिरिक्त अवधि की आवश्यकता होती है जो उन्हें विकास चरण को पूरा करने और उचित अंतर करने की अनुमति देगी।

बढ़ती से पूरी तरह से विकसित चरण में संक्रमण, जो मवेशियों में तब होता है जब कूप प्रारंभिक अंत से मध्यम अंत्येय चरण तक विकसित होता है, ओसाइट विकास के दौरान महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। पशुओं में, कई अध्ययनों ने इन घटनाओं को विट्रो 2,,12, 13,14,15,16, 17,,18,14,,,19में पुनः प्राप्त करने का प्रयास किया ।1719 हालांकि, आज तक कोई विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित नहीं किया गया है और केवल सीमित सफलता की सूचना दी गई है । पिछले अध्ययनों के अनुसार20,ये बढ़ते ओसाइट्स एक सजातीय आबादी का गठन करते हैं। ट्रांसक्रिप्शनल रूप से सक्रिय होने के अलावा, उनका क्रोमेटिन जर्मिनल वेसिकल (जीवी) में फैलाया जाता है, एक विन्यास में जिसे जीवी0 2, 21,नाम दियागयाहै। इसके विपरीत, मध्यम एंट्रल रोम से प्राप्त पूरी तरह से विकसित ओसाइट्स की आबादी अधिक विषम है, एक ऐसी स्थिति जो क्रोमेटिन कॉम्पैक्टेशन (जीवी 1, जीवी 2 और जीवी 3) की विभिन्न डिग्री से प्रतिबिंबित होती है जिसे20देखा जा सकता है। इनमें से, पिछले आंकड़ों से पता चला है कि जीवी 2 और जीवी 3 ओसाइट्स को समग्र रूप से बेहतर गुणवत्ता और उच्च भ्रूणीय विकास क्षमता20,21, 22,,,23,,23,24की विशेषता है।

उपरोक्त टिप्पणियों से शुरू, यहां हम ओसाइट्स (एल-आईवीसीओ) की 5 दिनों की लंबी संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जो शुरुआती अंत्येष्कों से क्यूमुलस-ओसाइट परिसरों (सीओसी) के रूप में अलग-थलग पड़े ओसाइट्स के भेदभाव की अनुमति देता है। यह संस्कृति रणनीति हमारी प्रयोगशाला में किए गए 10 वर्षों के लंबे अध्ययनों से विकसित हुई है और ओसाइट संस्कृति के दौरान विट्रो ओसाइट संस्कृति (आईवीसीओ) 2, प्रीमैचुरेशन सिस्टम23, 25,और जिंक सप्लीमेंट में पहले से विकसित24-48 घंटे पर इसकी जमीन को जड़ों ।2 कूप उत्तेजक हार्मोन (एफएसएच) और एक फॉस्फोडिस्टेरेस-3 (पीडीई 3) अवरोधक का एक संयोजन, क्यूमुलस-ओसाइट संचार2को बढ़ाने में सक्षम, असामयिक मेयोटिक बहाली2को रोकने, और समर्थन ओसाइट विकास2 का उपयोग किया गया था।

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Protocol

अंडाशय 4 से 8 साल पुराने होल्स्टीन डेयरी गायों से एकत्र किए गए थे जो स्थानीय बूचड़खाने (INALCA S.P.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, इटली) में बरामद किए गए थे।

1. मीडिया की तैयारी

नोट: सभी मीडिया का उपयोग करने से पहले कम से कम चार घंटे पहले तैयार किया जाना चाहिए। सोडियम बाइकार्बोनेट बफर मीडिया को 38.5 डिग्री सेल्सियस और हवा में 5% सीओ2, अधिकतम आर्द्रता पर इनक्यूबेटेड किया जाता है। थर्मोस्टैटिक ओवन में हेपी-बफर मीडिया को 38.5 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है।

  1. ओसाइट्स (एल-आईवीसीओ) माध्यम की लंबी इन विट्रो संस्कृति
    1. बुनियादी संस्कृति माध्यम (M199-B) के 15 एमएल तैयार करें: 2 एमएमएम ग्लूटामाइन के साथ पूरक M199, 0.4% फैटी एसिड मुक्त गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), 0.2 m सोडियम पायरुवेट, 25 एमएम सोडियम बाइकार्बोनेट, 0.1 एमएम सिस्टेमाइन, 21.3 माइक्रोन/एमएल ऑफ फिनोल रेड, 75 माइक्रोग्राम/एमएल ऑफ कानमाइसिन और 4% पॉलीविनाइलपाइरोलिडोन (पीवीपी; 360 k आणविक वजन)।
    2. होल्डिंग माध्यम (M199-H) के 3 mL तैयार करें: M199-B में 5 माइक्रोन सिलोस्टामाइड जोड़ें और इसे 35 मिमी पेट्री डिश में डालें।
    3. एल-आईवीसीओ माध्यम (M199-L): पूरक M199-बी के साथ ०.१५ μg/mL Zn सल्फेट,10-4 IU/mL FSH, 10 एनजी/एमएल estradiol, ५० एनजी/एमएल टेस्टोस्टेरोन, ५० एनजी/एमएलए प्रोजेस्टरवन और 5 μM Ciltamide ।
    4. 96 अच्छी तरह से लेपित प्लेट के प्रत्येक कुएं में M199-L माध्यम के 200 μL रखें। वाष्पीकरण की भरपाई और संस्कृति के दौरान उचित आर्द्रता बनाए रखने के लिए बाँझ संस्कृति के पानी के साथ थाली के चार किनारों में कुओं को भरें ।
    5. इनक्यूबेटर में 96 वेल प्लेट और एम199-एच मीडियम को 38.5 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 को हवा में, अधिकतम आर्द्रता में इनक्यूबेट करें।
  2. विच्छेदन माध्यम
    1. विच्छेदन माध्यम (M199-D): पूरक M199 0.4% बीएसए अंश V, 0.164 mm पेनिसिलिन, 0.048 m M streptomycin, 1790 इकाइयों/ M199-D थोक में तैयार किया जा सकता है, 20 एमएल aliquots में तिरस्कृत और 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत। जब जरूरत हो, गर्म और पूरक 1 aliquot।
    2. M199-D के 20 एमएल तैयार करें 5 माइक्रोन सिलोस्टामाइड (M199-D cilostamide) के साथ पूरक।

2. अंडाशय संग्रह और प्रसंस्करण

नोट: सभी प्रक्रियाएं कमरे के तापमान (26 डिग्री सेल्सियस) पर आयोजित की जाती हैं जब तक कि अन्यथा संकेत न दिया जाए।

  1. गायों से बूचड़खाने में अंडाशय को ठीक करें।
  2. अंडाशय को बाँझ खारा (एनएसीएल, 9 जी/एल) में 26-28 डिग्री सेल्सियस पर पेनिसिलिन १०० यू/एमएल और स्ट्रेप्टोमाइसिन ०.१ मिलीग्राम/एमएल के साथ जोड़ा जाता है ।
  3. अंगों को 4 घंटे के भीतर गर्म बाँझ नमकीन में प्रयोगशाला में ले जाना।
  4. अंडाशय को 26 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा बाँझ खारा में 4x धोएं।
  5. -28 एमएमजीएच पर निर्धारित वैक्यूम दबाव के साथ एक आकांक्षा पंप से जुड़े 18 जी सुई का उपयोग करके व्यास में 2 मिमी से अधिक सभी मध्य-से-बड़े एंट्रल रोम को हटा दें और एस्पिरेटेड अंडाशय को 26 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ नमकीन के साथ एक बीकर में रखें।
    नोट: रोम और जीटी; 2 मिमी की सामग्री को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है जो प्रयोग को पूरी तरह से विकसित oocytes के स्रोत को जितना संभव हो सके हटाने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
  6. एक क्षैतिज लैमिनार प्रवाह हुड के तहत, एक अंडाशय को उस समय बाँझ पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कटिंग बोर्ड पर रखें। एक स्केलपेल हैंडल पर चढ़कर सर्जिकल ब्लेड नंबर 22 का उपयोग करना, अंडाशय प्रांतस्था (अंडाशय का बाहरी हिस्सा, जिसमें रोम शामिल है), 1.5 - 2 मिमी मोटी और अंग की प्रमुख धुरी के समानांतर के स्लाइस काटते हैं।
  7. ओवेरियन कॉर्टेक्स के स्लाइस को एक बाँझ ग्लास पेट्री डिश में रखें जो गर्म प्लेट पर विच्छेदन माध्यम से 38.5 डिग्री सेल्सियस पर कवर किया जाता है।
    नोट: अब से सभी प्रक्रियाओं पर एक गर्म थाली का उपयोग कर 38.5 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन कर रहे हैं।

3. चयन और रोम के अलगाव और COCs की पुनः प्राप्ति

  1. एम199-डी के 2-3 एमएल के साथ 60 एमएम ग्लास पेट्री डिश में एक ओवेरियन कॉर्टेक्स स्लाइस रखें।
  2. विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, माइक्रोमीटर से लैस आईपीस का उपयोग करके 0.5 - 2 मिमी के बीच रोम का चयन करें।
  3. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत स्वस्थ, गैर-अतीक रोम की पहचान करें। रूपात्मक मापदंडों को देखकर कूप atresia का आकलन करें, जैसे बहुत स्पष्ट पारदर्शी उपस्थिति, अंदर एक अंधेरे COC के साथ। अतीक रोम को त्यागें और अन्य सभी को संसाधित करें।
  4. एक शल्य ब्लेड नंबर 22 का उपयोग करना एक स्केलपेल हैंडल पर चढ़कर एक तरफ कूप के आसपास के अंडाशय के ऊतकों को हटा दें जब तक कि कूप एक किनारे पर उजागर न हो जाए।
  5. एक सिरिंज पर घुड़सवार एक 26G सुई का उपयोग करना, ध्यान से उजागर कूप दीवार में एक भट्ठा बनाते हैं । यह कार्रवाई कूप सामग्री जारी करेगी, जिसमें सीओसी, कूप तरल पदार्थ और कोशिकाओं के झुरमुट शामिल हैं।
  6. माइक्रोस्कोप के तहत सीओसी की पहचान करें और क्यूमुलस अखंडता, जोना पेलुसिडा अखंडता और साइटोप्लाज्म की एकरूपता की जांच करें। यदि इन मानदंडों को पूरा कर रहे हैं, एक P20 पिपेट का उपयोग कर COC आकांक्षी ।
  7. एम199-डी सिलोस्टामाइड में अलग सीओसी रखें।
  8. 30 मिनट के लिए अलगाव की प्रक्रिया जारी रखें।

4. कोसी का चयन इन विट्रो संस्कृति के अधीन किया जाएगा

  1. विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, चरण 3.6 में मानदंडों के आधार पर स्वस्थ COCs का चयन करें।
  2. एक 60 मिमी पेट्री डिश में, M199-D cilostamide के 20 माइक्रोन की 16 बूंद तैयार करें और एक स्वस्थ सीओसी प्रति बूंद(चित्रा 1A) रखें।
  3. कैमरे से जुड़े एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कैमरे के साथ प्रदान किए गए सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, जोना पेलुसिडा को छोड़कर, ओसाइट व्यास को मापता है।
  4. ओसाइट के स्पष्ट दृश्य के साथ, जोना पेलुकिडा(चित्रा 1 B)को छोड़कर दो लंबवत माप बनाएं।
  5. विश्वास दिलाता हूं कि क्या दो oocyte माप का मतलब है, zona pellucida को छोड़कर, १०० की सीमा के भीतर है-११० μm । सीओसी को गोल आकार के ओसाइट के साथ या ओसाइट्स के साथ त्यागें जो मापने योग्य नहीं हैं।
  6. चयनित COCs को M199-H माध्यम वाले 35 मिमी पकवान में स्थानांतरित करें और उन्हें इनक्यूबेटर में 38.5 डिग्री सेल्सियस और हवा में 5% सीओ2, अधिकतम आर्द्रता 5.1 तक रखें।
  7. 4x तक चरण 3 और 4 दोहराएं। कुल मिलाकर काम करने का समय 2 घंटे से अधिक नहीं होना चाहिए।

5. ओसाइट्स (एल-आईवीसीओ) की लॉन्ग इन विट्रो संस्कृति

  1. 96 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के केंद्र में एक सीओसी प्रति अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए कदम 1.1.5 में तैयार किया जाएगा।
  2. थाली को 5 दिनों के लिए 38.5 डिग्री सेल्सियस और हवा में 5% सीओ2, अधिकतम आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
  3. हर दूसरे दिन (दिन 2 और दिन 4) ताजा M199-L तैयार के रूप में 1 कदम में वर्णित है ।
  4. माध्यम के 100 माइक्रोन को हटाकर और 100 माइक्रोल के साथ बदलकर माध्यम के आधे हिस्से को नवीनीकृत करें जो हौसले से तैयार M199-L के 100 माइक्रोन के साथ है। स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत मध्यम नवीकरण करें और सीओसी को कुएं में ले जाने से बचें।

6. संस्कृति के बाद COC वर्गीकरण

  1. एल-आईवीसीओ के अंत में, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत सीओसी की आकृति विज्ञान का विश्लेषण करें।
  2. चित्रा 2में चित्रित के रूप में वर्गीकृत ।
    1. कक्षा 1 के रूप में वर्गीकृत करें यदि सीओसी एक कॉम्पैक्ट क्यूमुलस सेल निवेश दिखाते हैं जिसमें क्यूमुलस विस्तार और सेल अध: पतन का कोई संकेत नहीं है।
    2. कक्षा 2 के रूप में वर्गीकृत करें यदि सीओसी एक कॉम्पैक्ट क्यूमुलस सेल निवेश दिखाते हैं जिसमें क्यूमुलस विस्तार और सेल अध: पतन का कोई संकेत नहीं है और क्यूमुलस द्रव्यमान में एंट्रम जैसे गठन के साथ।
    3. कक्षा 3 के रूप में वर्गीकृत करें यदि सीओसी क्यूमुलस विस्तार का कोई संकेत नहीं है और क्यूमुलस कोशिकाओं की बाहरी परत में कुछ अलग कोशिकाओं और कोई एंट्रम जैसी गठन के साथ क्यूमुलस सेल की कई परतों को दिखाते हैं।
    4. कक्षा 4 के रूप में वर्गीकृत अगर COCs oocyte सतह के ५०% से अधिक के लिए विस्तार cumulus कोशिकाओं की प्रचुर मात्रा में नुकसान से पता चलता है, और सेल पतन और सेल मलबे के संकेत ।

7. संस्कृति के बाद मेयोटिक प्रगति का मूल्यांकन

  1. ऊसाइट डेनडेशन
    1. प्रत्येक सीओसी को चार-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में रखें जिसमें 199D के 400 माइक्रोन शामिल हैं।
    2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत धीरे से 130-140 माइक्रोन पर सेट एक पिपेट सेट का उपयोग करके दोहराया पाइपिंग द्वारा यंत्रवत् cumulus कोशिकाओं को हटा दें ।
    3. एक बार जब ओसाइट्स क्यूमुलस निवेश से मुक्त हो जाते हैं, तो उन्हें 199D युक्त किसी अन्य अच्छी तरह से स्थानांतरित करें।
    4. इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि सभी ओसाइट्स पूरी तरह से कम न हो जाएं।
  2. ऊसाइट परमाणु धुंधला
    नोट: अब से सभी प्रक्रियाओं पर कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं । रिएजेंट्स कमरे के तापमान पर हैं।
    1. 1 घंटे के लिए फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस) में पैराफॉर्मलडिहाइड 4% में ओसाइट्स को ठीक करें।
      सावधानी: पैराफॉर्मल्डिहाइड को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें और खतरनाक अपशिष्ट निपटान दिशानिर्देशों के अनुसार दूषित सामग्रियों का निपटान करें।
    2. 1% पॉलीविनीलालकोहोल (PVA) वाले पीबीएस में प्रत्येक 5 मिनट के लिए ओसाइट्स 3x धोएं।
      नोट: नमूनों को तुरंत संसाधित किया जा सकता है या अधिकतम एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स वाले पीबीएस में ओसाइट्स रखें।
    4. 1% PVA युक्त PBS में प्रत्येक 5 मिनट के लिए oocytes 3x धोएं।
    5. एक स्लाइड पर 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनीलिंडोल (DAPI) डिलेक्टेट (1 μg/एमएल) के साथ पूरक एंटीफैड माध्यम के 5 माइक्रोन की बूंदों में अकेले oocytes रखें ।
    6. शीर्ष पर कवर स्लिप डालते समय ओसाइट्स के अत्यधिक सपाट होने से बचने के लिए स्लाइड के लंबे किनारों के साथ दो तरफा टेप की दो स्ट्रिप्स रखें।
    7. कवर स्लिप को ऊपर रखें, इसे टेप का पालन करें और सभी नमूनों को प्रोसेस करते समय अंधेरे में रखें।
    8. ओसाइट्स की मेइटिक प्रगति का आकलन करने के लिए दापी फिल्टर (उत्तेजन/उत्सर्जन: 358/461) से लैस पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ओसाइट्स का विश्लेषण करें।
    9. ओसाइट्स को उनकी मेयोटिक प्रगति के अनुसार वर्गीकृत करें: जीवी - जीवी के भीतर क्रोमेटिन संघनन की विभिन्न डिग्री के साथ ओसाइट्स; एमआई - जीवी से oocytes मेटाफेज मैं को तोड़ने; और पतित - oocytes कि पिछले चरणों में से किसी पर होने के रूप में पहचाना नहीं जा सकता है।

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Representative Results

एल-आईवीसीओ के अंत में, सीओसी की सकल आकृति विज्ञान बदल गई और 4 वर्गों की पहचान क्यूमुलस कोशिकाओं की उपस्थिति के आधार पर की गई, जैसा कि चित्र 2में दिखाया गया है। आमतौर पर स्वस्थ,COCs11,26,27,कक्षा1,2 और 3 का चयन करने के लिए अपनाए गए रूपात्मक मानदंडों के आधार पर, कक्षा 4, जिसने ओसाइट्स के आसपास के क्यूमुलस कोशिकाओं की पूरी परतों की अनुपस्थिति जैसे पतन के स्पष्ट संकेत दिखाए, को गंभीर रूप से समझौता माना गया और संभावित आईवीपी सेटिंग में डाउनस्ट्रीम प्रक्रियाओं से गुजरना उचित था। कुल मिलाकर, 5 जैविक प्रतिकृति में 74 ओसाइट्स का विश्लेषण किया गया, जिनमें से 9.45% कक्षा 4 में थे और आगे के मूल्यांकन से त्याग दिए गए थे।

जैसा कि चित्र 3 और चित्रा 4में दिखाया गया है, एल-आईवीसीओ के अंत में मेइओटिक चरण के आकलन से पता चला है कि ओसाइट्स (78.57 ± 4.43% का काफी अधिक प्रतिशत) अपरिपक्व चरण में गिरफ्तार किए गए, क्रोमेटिन अभी भी जीवी के भीतर संलग्न हैं (इसलिए, जीवी चरण के रूप में भी जाना जाता है), बिना किसी सामान्यीकृत के। उनमें से 59.43% एक GV2/3 विन्यास में थे. मेटाफेज I स्टेज (13.76 ± 5.85%) तक पहुंचने वाले एक छोटे से प्रतिशत ने मेयोसिस को फिर से शुरू किया या पतित (7.67 ± 4.61%)। कुल मिलाकर, 5 जैविक प्रतिकृति में 67 ओसाइट्स का विश्लेषण किया गया। कुल मिलाकर इन आंकड़ों से संकेत मिलता है कि एल-आईवीसीओ संस्कृति 5 दिनों के लिए मेइटिक बहाली को रोकते हुए ओसाइट व्यवहार्यता का समर्थन करती है।

Figure 1
चित्रा 1: ओसाइट व्यास और सीओसी की प्रतिनिधि छवि को मापने के लिए उपयोग किए जाने वाले पकवान की रूपरेखा। (क)M199-D के 20 माइक्रोन की 16 बूंदों के साथ 60 मिमी पेट्री डिश का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व, प्रत्येक एक ही सीओसी युक्त। (ख)व्यास को मापने के लिए उपयोग की जाने वाली धुरी के साथ सीओसी की प्रतिनिधि छवि। ध्यान दें कि जोना पेलुसिडा शामिल नहीं है। स्केल बार 50 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: संग्रह के समय और एल-IVCO के बाद COCs की प्रतिनिधि छवियां। (ए, बी, सी, डी) ऊपरी पंक्ति (संग्रह) पुनर्प्राप्ति के समय सीओसी का प्रतिनिधित्व करता है। (A', B', C', D') एक ही COC 5 दिन बाद चित्र है, एल IVCO के अंत में और वर्गीकृत के रूप में कदम ६.१ में रिपोर्ट । निचली पंक्ति (5 दिन) सीओसी का प्रतिनिधित्व करती है: कक्षा 1, विस्तार और सेल अध: पतन (ए)) का कोई संकेत नहीं के साथ एक कॉम्पैक्ट क्यूमुलस सेल निवेश दिखाता है; कक्षा 2, विस्तार और सेल अध: पतन का कोई संकेत नहीं के साथ और क्यूमुलस द्रव्यमान (बी') में एंट्रम जैसे गठन (तीर) के साथ एक कॉम्पैक्ट क्यूमुलस सेल निवेश दिखा रहा है; कक्षा 3, क्यूमुलस कोशिकाओं की कई परतों को दिखाता है जिसमें क्यूमुलस विस्तार का कोई संकेत नहीं है और क्यूमुलस कोशिकाओं (सी') की बाहरी परत में कुछ अलग कोशिकाएं हैं; कक्षा 4, ओसाइट सतह के 50% से अधिक पर क्यूमुलस कोशिकाओं की प्रचुर मात्रा में नुकसान और सेल अध: पतन और सेल मलबे (डी') के संकेत दिखा रहा है। स्केल बार 40 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: मेयोटिक प्रगति के प्रतिनिधि चित्र। ऊपरी पंक्ति (डीएनए धुंधला)(ए)जीवी0 चरण और(बी)GV2-जैसे विन्यास,(सी)एमआई चरण और(डी)डी जनित oocytes,(ए)पर एल-IVCO के 5 दिनों के बाद प्रतिनिधि oocytes के डीएनए(नीला)से पता चलता है । निचली पंक्ति ऊपरी पंक्ति में ओसाइट के उज्ज्वल क्षेत्र में संबंधित छवि है। तीर जीवी को इंगित करता है। स्केल बार 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: संस्कृति के अंत में ओसाइट्स की एमईोटिक प्रगति। बार ग्राफ जीवी और एमआई चरण में ओसाइट्स के वितरण का प्रतिनिधित्व करता है और एल-आईवीसीओ के अंत में ओसाइट्स को विकृत करता है। कक्षा 4 में पहले वर्गीकृत oocytes को बाहर रखा गया था । डेटा का विश्लेषण 1-तरह से एनोवा द्वारा किया गया था जिसके बाद तुकी के कई तुलना परीक्षण और मूल्य एसईएम (एन = 5) ± साधन हैं; पीएंडटी;0.05) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

यहां हम बढ़ते ओसाइट्स के लिए एक संस्कृति प्रणाली का वर्णन करते हैं जो उनकी व्यवहार्यता का समर्थन करके और मेइटिक बहाली को रोककर 5 दिनों के लिए ओसाइट विकास को बढ़ावा देता है। यह उत्तरार्द्ध पहलू सबसे अधिक महत्वपूर्ण है कि मौजूदा विकास और भेदभाव को मेइओटिक और भ्रूणीय विकासात्मक क्षमता2, 20,20के साथ प्रदान करने के लिए आवश्यक है, जिसे अन्यथा मेयोटिक डिवीजन की समय से पहले बहाली से अवरुद्ध कर दिया जाएगा।

इस संस्कृति प्रणाली को विकसित करते समय, हमने शारीरिक विकास और भेदभाव की कई विशेषताओं को ध्यान में रखा जो कूप में होता है। इस खंड में हम मुख्य पहलुओं का अवलोकन प्रदान करते हैं जिन्हें हमने इस रणनीति को विकसित करते समय माना था।

सबसे पहले, गोजातीय प्रारंभिक एंट्रल रोम में बढ़ते ओसाइट्स को वीवो8,,19में पूरी तरह से विकसित चरण में बढ़ने से संक्रमण से गुजरने में लगभग 5 दिन लग जाते हैं। इसलिए, संस्कृति की लंबाई बढ़ाकर 5 दिनों तक कर दी गई थी, जैसा कि हमारी प्रयोगशाला में किए गए पिछले प्रयासों के विपरीत था, जहां ऊसाइट्स को 24घंटेतक सुसंस्कृत किया गया था।

एक अन्य कारक जिसे हमने एल-आईवीसीओ में शामिल किया था, वह उस माध्यम की बढ़ी हुई चिपचिपाहट थी जिसमें कूप तरल पदार्थ की शारीरिक चिपचिपाहट की नकल करने के लिए सीओसी को सुसंस्कृत किया जाता है। यह 4% पीवीपी जोड़कर बनाया गया था और, कोलेजन आई कोटेड संस्कृति सतह के उपयोग के साथ, इसने संस्कृति की तरह 3 डी के गठन को बढ़ावा दिया, जैसा कि पिछले अध्ययनों द्वारा13था।

जीवी चरण में गिरफ्तार किए गए ओसाइट्स को बनाए रखने के लिए एक पीडीई3 अवरोधक सिलोस्टामाइड को जोड़ा गया था, जो ओसाइट्स25,2,,19, 25,28,,,2829के भीतर चक्रीय न्यूक्लियोटाइड के उच्च स्तर को रखकर असामयिक मेइओटिक बहाली को रोकता था।29 हमारे परिणामों से संकेत मिलता है कि सिलोस्टामाइड के साथ 5 दिन तक चलने वाले उपचार का सीओसी स्वास्थ्य पर सकल प्रभाव नहीं पड़ता है, क्योंकि केवल परिसरों का एक छोटा सा अंश विकृत होताहै,जो आलम एट अल द्वारा प्राप्त परिणामों के साथ समझौते में भी है ।

जेडएन सल्फेट और इसकी एकाग्रता को शामिल करना हाल के परिणामों से प्रमाणित होता है, जिसमें यह दर्शाया गया है कि संस्कृति30में गोजातीय बढ़ते ओसाइट्स के भेदभाव और प्रतिलेखन गतिविधि का समर्थन करने में इस ट्रेस तत्व की भूमिका है।

अंत में , हार्मोन का एक संयोजन प्रारंभिक अंत्येल कूप 31 ,32 , 33,32,की विशिष्ट शारीरिक हार्मोनल परिवेश की बारीकी से नकल करने के लिए पेश किया गयाथा। उदाहरण के लिए एस्ट्रडिओल ने16 , 17,19,और ग्रेनुलोसा कोशिकाओं के बीच कनेक्शन17के बीच के ऊसाइट वृद्धि को समर्थन देने में गतिविधियों को जाना है, जबकि मेइटोट क्षमता34के अधिग्रहण को भी बढ़ावा दिया है ।19 इसी तरह, टेस्टोस्टेरोन, एस्ट्राडिओल का अग्रदूत होने के अलावा, कूप विकास और विकास35को भी उत्तेजित करता है, जबकि प्रोजेस्टेरोन को मुख्य रूप से इसकी एंटीएपॉप्टोटिक गतिविधि36के लिए जोड़ा गया था।

महत्वपूर्ण बात और हमारे पिछले अध्ययन 2 के साथ समझौते में,FSHकी एकाग्रता एक एकाग्रता है कि बढ़ते चरण के लिए शारीरिक है पर रखा गया था । दरअसल, एक कम एफएसएच एकाग्रता ओसाइट और साथी क्यूमुलस कोशिकाओं के बीच गैप-जंक्शन मध्यस्थता संचार को बनाए रखते हुए ओसाइट विकास को बढ़ावा देती है और मेइटिक बहाली2को प्रेरित किए बिना ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि और ओसाइट भेदभाव को बढ़ावा देती है।

हमारे अनुभव में, एल-आईवीसीओ की सफलता के लिए चाबियों में से एक स्वस्थ COCs की एक सजातीय आबादी का चयन जल्दी एंट्रल रोम से आ रहा है । साहित्य में आंकड़ों के अनुसार, प्रारंभिक एंट्रल रोम से एकत्र किए गए ओसाइट्स का 80% जीवी 020कहा जाता है कि एक विन्यास में आयोजित क्रोमेटिन की विशेषता है। यह एकरूपता इन विट्रो संस्कृति के लिए एक लाभ का प्रतिनिधित्व करती है, क्योंकि सिद्धांत रूप में यह सुनिश्चित करता है कि संस्कृति पर्यावरण के संपर्क में आने पर कोशिकाएं इसी तरह व्यवहार करेंगी। इस बात को ध्यान में रखते हुए, सीओसी संग्रह को भेदभाव के कम या अधिक उन्नत चरणों से आने वाले COCs के साथ 'संदूषण' को कम करने की कोशिश करते हुए किया जाना चाहिए। हालांकि, इस तथ्य के कारण, कॉर्टिकल स्लाइस का प्रसंस्करण काफी समय लेने वाला है और अपेक्षाकृत कम समय में किया जाना चाहिए, संग्रह/चयन कदम शायद एल-आईवीसीओ के सबसे महत्वपूर्ण मार्ग का प्रतिनिधित्व करता है । उसे हासिल करने के लिए कुछ अहम बातें मन में दाढ़ी होनी चाहिए ।

उदाहरण के लिए, शोधकर्ता/तकनीशियन को कूप atresia के संकेत के साथ रोम को पहचानने और त्यागने के लिए प्रशिक्षित किया जाना चाहिए । इस स्तर पर, अत्रेतिक रोम को पहचानने के लिए केवल रूपात्मक मापदंडों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि बहुत स्पष्ट पारदर्शी उपस्थिति, और अंदर एक अंधेरे सीओसी की उपस्थिति। अन्य सभी रोम, जिनमें अत्रेयिक संकेतों को स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित नहीं किया जा सकता है, को खोला जाना चाहिए और स्वस्थ लोगों की पहचान करने के लिए अलग-थलग पड़े COCs की आकृति विज्ञान के आधार पर आगे चयन किया जाना चाहिए2,,3, 37,,38,,,39।38 यह रूपात्मक टिप्पणियों द्वारा फिर से प्राप्त किया जाता है जैसे कि कम से कम चार परतों क्यूमुलस कोशिकाओं की उपस्थिति, घोर गोलाकार आकार, अक्षुण्ण ऊलम्मा और सजातीय और पतले दानेदार ओप्लोजम11,26,,,27।

COCs अलगाव और हेरफेर एक अतिरिक्त तकनीकी चुनौती है, जो कुशल कर्मियों और स्टीरियोमाइक्रोस्कोप और oocyte व्यास के सटीक निर्धारण के तहत सूक्ष्म विच्छेदन के लिए उचित उपकरण की आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह अंतिम कदम ओसाइट्स की एक समान आबादी का चयन करने के लिए आवश्यक है, इस प्रकार अन्य कूप चरणों से आने वाले COCs के साथ संदूषण के किसी भी संभावित स्रोत को छोड़कर। इस कारण से, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पुनः प्राप्त COCs में संलग्न ओसाइट्स का व्यास 100 और 110 माइक्रोन2,,40के बीच है।

ओसाइट व्यवहार्यता का समर्थन करने और मेइटिक बहाली को रोकने के अलावा, एल-आईवीसीओ ने जीवी0 से क्रोमेटिन विन्यास के संक्रमण को उत्तरोत्तर अधिक संघनित जीवी 2 और जीवी 3 में 59% ओसाइट्स में बढ़ावा दिया। विशेष रूप से जीवी के भीतर क्रोमेटिन संघनन मूल रूप से सभी स्तनधारी ओसाइट्स में मेइओटिक और विकासात्मक क्षमता के 'लाभ' का एक मार्कर है, इस प्रकार अब तक20का अध्ययन किया गया। यह परिणाम बहुत आशाजनक है, खासकर जब हमारे पिछले 24 घंटे IVCO प्रणाली की तुलना में । उस अध्ययन में, जीवी के भीतर क्रोमेटिन कॉम्पिटिशन की उच्चतम डिग्री तक नहीं पहुंचा गया था और 22% ओसाइट्स जीवी 1विन्यास 2के साथ पाए गए थे, जो पूर्ण मेयोटिक क्षमता से जुड़ा एक चरण था, लेकिन अभी भी विकासात्मक क्षमता20दुर्लभ है। यहां तक कि उन स्थितियों में, अंयथा अक्षम बढ़ती oocytes परिपक्व और भ्रूण का उत्पादन करने में सक्षम थे, हालांकि सीमित राशि में । इसलिए एल-आईवीसीओ में मनाए गए GV2/3 चरणों में लगातार वृद्धि व्यवहार्य भ्रूण का उत्पादन करने की उच्च क्षमता के साथ संगत है । हम एल-आईवीसीओ से प्राप्त सीओसी को आईवीपी (इन विट्रो परिपक्वता, निषेचन और भ्रूण संस्कृति में ब्लास्टोसिस्ट चरण तक) के निम्नलिखित चरणों में प्रस्तुत करके इस परिकल्पना का प्रायोगिक परीक्षण करने की प्रक्रिया में हैं। यदि पुष्टि की जाती है, तो एल-आईवीसीओ अंडाशय रिजर्व की अभी तक अनशोषित क्षमता में से कुछ को उजागर करेगा, जिसमें महिला प्रजनन संरक्षण के लिए ब्याज के कई क्षेत्रों पर महत्वपूर्ण निहितार्थ होंगे । उदाहरण के लिए, यह उच्च आनुवंशिक योग्यता प्रजनकों के संरक्षण कार्यक्रमों में उपयोग किए जाने वाले उर्वरक गेमेस के स्रोत में वृद्धि करेगा। एक और आवेदन है कि हम उंमीद bovid परिवार की संकटग्रस्त प्रजातियों के आनुवंशिक उबार के लिए है और साथ ही स्थानीय नस्लों कि खतरे में है या कॉस्मोपॉलिटन नस्लों के व्यापक प्रसार के कारण आनुवंशिक कटाव का खतरा है । अंतिम लेकिन कम से कम नहीं, एल-आईवीसीओ उन सभी वैज्ञानिकों के लिए एक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है जो एक सक्षम गेमे के गठन को विनियमित करने वाली सेलुलर और आणविक प्रक्रियाओं को विच्छेदन करने में रुचि रखते हैं।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को रीजनल लोम्बार्डिया पीएसआर इनोवा एन 201801061529 और यूएनआईएमआई एन पीएसआर 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-well dishes Nunclon 179830
96-well dish Becton Dickinson Biosciences 356649 BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) Sigma A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Sigma A3311
Cell culture water Sigma W3500
Cilostamide Sigma C7971
Cysteamine Sigma M9768
Digital camera Nikon Corp Camera DS-5M
Disodium phosphate Sigma S5136
Estradiol Sigma E2758
Glutamax Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061
Gonal F Merck Serono
Heparin Sigma H3149
HEPES Sigma H3784
Vacuum pump Cook-IVF KMAR-5100
Incubator Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma K1377
Medium 199 Sigma M3769 Powder for bicarbonate-buffered media
Medium 199 Sigma M2520 Powder for HEPES-buffered media
Microscope Nikon Corp Nikon Diaphot
Microscope Nikon Corp Eclipse E 600
Monopotassium phosphate Sigma P5655
Paraformaldehyde Sigma 158127
Penicilin Sigma P3032
Phenol Red Sigma P5530
Polyvinyl alcohol Sigma P8137
Polyvinylpyrrolidone Sigma P5288 360k molecular weight
Potassium chloride Sigma P5405
Progesterone Sigma P8783
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium choride Sigma P5886
Sodium pyruvate Sigma P4562
Streptomycin Sigma S9137
Testosterone Sigma 86500
Triton X Sigma T9284
Vectashield with DAPI Vector Laboratories H1200
Water Sigma W3500
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Z0251

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 161 बढ़ते ओसाइट्स प्रारंभिक एंट्रल रोम ओसाइट विभेदन ओसाइट आइसोलेशन गोविन कूपोजेनेसिस इन विट्रो ओवेरियन रिजर्व प्रजनन संरक्षण एट्रेसिया इन विट्रो भ्रूण उत्पादन आईवीपी कूप उत्तेजक हार्मोन एफएसएच
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Barros, R. G., Lodde, V., Franciosi, F., Luciano, A. M. In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle. J. Vis. Exp. (161), e61625, doi:10.3791/61625 (2020).

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