Summary
Descrevemos os procedimentos para o isolamento dos oócitos em crescimento dos folículos ovarianos nos estágios iniciais de desenvolvimento, bem como a criação de um sistema de cultura in vitro que possa apoiar o crescimento e a diferenciação até o estágio totalmente crescido.
Abstract
A reserva limitada de oócitos maduros e fertilizantes representa uma grande barreira para o sucesso da reprodução assistida em mamíferos. Considerando que durante a vida reprodutiva apenas cerca de 1% dos oócitos em um ovário maduro e ovulado, várias técnicas foram desenvolvidas para aumentar a exploração da reserva ovariana para a crescente população de folículos não ovulatórios. Tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, o vasto potencial da reserva ovariana ainda é em grande parte inexplorado. Nas vacas, por exemplo, algumas tentativas foram feitas para apoiar a cultura in vitro de oócitos em estágios específicos de desenvolvimento, mas protocolos eficientes e confiáveis ainda não foram desenvolvidos. Aqui descrevemos um sistema cultural que reproduz as condições fisiológicas do estágio folicular correspondente, definido para desenvolver oócitos in vitro de crescimento coletados de folículos antral bovinos precoces para o estágio totalmente crescido, correspondente ao folículo antral médio in vivo. Uma combinação de hormônios e um inibidor de fosfodiesterase 3 foi usada para evitar a retomada meiotica prematura e para orientar a diferenciação do oócito.
Introduction
Durante a vida reprodutiva, apenas uma fração mínima dos oócitos que estão presentes em um ovário maduro, são liberados nos tubos de falópio após a ovulação, e estão disponíveis para serem fertilizados e se desenvolverem em um embrião viável1. Por outro lado, a maioria dos oócitos dentro de um ovário sofre atresia e nunca são ovulados. As tecnologias de produção de embriões in vitro (IVP) têm tentado aumentar a exploração da reserva ovariana2,3. Até agora, tais tecnologias permitiram intervenções de preservação da fertilidade, programas de seleção na pecuária e conservação de espécies ameaçadas de extinção. No entanto, a maioria dos protocolos usa oócitos que basicamente completaram a fase de crescimento dentro do folículo ovariano antral, e, portanto, são referidos como oócitos totalmente cultivados. No gado, onde as tecnologias IVP são amplamente utilizadas, os oócitos totalmente cultivados atingem um diâmetro final de aproximadamente 120 μm e são coletados de folículos que se estendem de 2 a 8 mm de diâmetro (folículos antral médios)1. Após o isolamento dos folículos, tais oócitos são in vitro amadurecidos e fertilizados. Os zigotes são então cultivados até o estágio blastocisto e ou transferidos para um destinatário ou criopreservados. No gado, assim como em muitas outras espécies, apesar do potencial oferecido pelo IVP, o número de embriões produzidos in vitro por vaca não melhorou em grande parte nos últimos 40 anos. Isso se deve, em parte, ao número limitado de oócitos totalmente cultivados que povoam um ovário em um determinado momento que pode ser recuperado e submetido às técnicas padrão IVP4,,5,,6.
Os oócitos fechados dentro dos folículos antrais primitivos, ou seja, aqueles folículos com menos de 2 mm de diâmetro, representam uma fonte potencial a ser usada nos programas de preservação da fertilidade7, pois um ovário contém aproximadamente 10 vezes mais folículos antral mais precoces do que os antralmédios 8. No entanto, esses oócitos ainda estão em fase de crescimento e ainda não atingiram o estágio9completo . Como tal, eles ainda estão transcricionalmente ativos, produzindo mRNAs que serão armazenados para etapas posteriores de desenvolvimento, e ainda não passaram por todo o processo de diferenciação necessário para conferir aos oócitos a capacidade de retomar e completar espontaneamente a meiose que uma vez isolei do compartimento folicular10,11. Portanto, eles não podem ser submetidos diretamente a protocolos de maturação in vitro padrão (IVM), mas exigem um período adicional de cultura que lhes permitiria completar a fase de crescimento e diferenciar adequadamente.
A transição do crescimento para o estágio totalmente cultivado, que no gado ocorre quando o folículo se desenvolve desde o início da antral até a fase antral média, é um dos passos críticos durante o desenvolvimento do oócito. No gado, diversos estudos tentaram recapitular esses eventos in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. No entanto, até o momento nenhum protocolo confiável foi desenvolvido e apenas o sucesso limitado foi relatado. De acordo com estudos anteriores20, esses oócitos em crescimento constituem uma população homogênea. Além de ser transcriticamente ativo, sua cromatina é dispersada na vesícula germinal (GV), em uma configuração chamada GV02,21. Por outro lado, a população de oócitos totalmente cultivados obtidos a partir de folículos antrais médios é mais heterogênea, condição espelhada pelos diversos graus de compactação de cromatina (GV1, GV2 e GV3) que podem ser observados20. Entre estes, dados anteriores mostraram que os oócitos GV2 e GV3 são, emgeral,caracterizados por uma melhor qualidade e maior competência de desenvolvimento embrionário20,21,,22,,23,24.
A partir das observações acima, descrevemos aqui um sistema cultural de 5 dias de duração de oócitos (L-IVCO) que permite a diferenciação de oócitos isolados como complexos cumulus-oócitos (COCs) dos folículos antral primitivos. Essa estratégia cultural evoluiu a partir de 10 anos de estudos realizados em nosso laboratório e enraiza seu terreno na cultura oócida in vitro (IVCO)2, sistemas de prematuração23,,25 e suplementação de zinco durante a cultura oócito. Uma combinação de hormônio estimulante folículo (FSH) e um inibidor de fosfodiesterase-3 (PDE3), capaz de melhorar a comunicação cumulus-oocyte2,prevenir a retomada meiotic intempescional2, e apoiar o crescimento do oócito2 foi usado.
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Protocol
Os ovários foram coletados de vacas leiteiras Holstein de 4 a 8 anos recuperadas no matadouro local (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, TI 2270M CE, Itália).
1. Preparação da mídia
NOTA: Todos os meios de comunicação devem ser preparados pelo menos quatro horas antes do uso. As mídias tamponadas de bicarbonato de sódio são incubadas a 38,5 °C e 5% de CO2 no ar, umidade máxima. As mídias tamponadas com HEPES são mantidas a 38,5 °C em forno termostático.
- Longa cultura in vitro de oócitos (L-IVCO) média
- Preparar 15 mL do meio de cultura básica (M199-B): Suplemento M199 com glutamina de 2 mM, 0,4% de gárbio bovino livre de ácido graxo albumina (BSA), piruvato de sódio de 0,2 mM, 25 mM de bicarbonato de sódio, 0,1 mM de cisteamina, 21,3 μg/mL de vermelho fenol, 75 μg/mL de kanamicina e 4% polivinylpyrrolidone (PVP; 360 mil peso molecular).
- Prepare 3 mL do meio de retenção (M199-H): Para M199-B adicione 5 μM de cilostamida e despeje-o em uma placa de Petri de 35 mm.
- Prepare o meio L-IVCO (M199-L): Suplemento M199-B com 0,15 μg/mL Zn sulfato, 10-4 UI/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosterona, 50 ng/mL progesterona e 5 μM Cilostiloamide.
- Coloque 200 μL de M199-L médio em cada poço da placa 96 bem revestida. Encha os poços nas quatro bordas da placa com água de cultura estéril para compensar a evaporação e manter a umidade adequada durante a cultura.
- Incubar a placa 96 e o m199-H médio na incubadora a 38,5 °C e 5% de CO2 no ar, umidade máxima.
- Meio de dissecação
- Preparar o meio de dissecção (M199-D): Suplemento M199 com 0,4% fração BSA V, penicilina de 0,164 mM, estreptomicina de 0,048 mM, 1790 unidades/L heparina. M199-D pode ser preparado a granel, dispensado em alíquotas de 20 mL e armazenado a 4 °C por 6 meses. Quando necessário, aqueça e suplemente 1 aliquot.
- Prepare 20 mL de M199-D suplementado com cilostamida de 5 μM (Cilostamida M199-D).
2. Coleta e processamento de ovários
NOTA: Todos os procedimentos são realizados à temperatura ambiente (26 °C) a menos que indicado de outra forma.
- Recupere os ovários do matadouro das vacas.
- Coloque os ovários em soro fisiológico estéril (NaCl, 9 g/L) a 26 – 28 °C adicionados com penicilina 100 U/mL e estreptomicina 0,1 mg/mL.
- Transporte os órgãos para o laboratório em soro fisiológico quente estéril dentro de 4h.
- Lave os ovários 4x em soro fisiológico estéril mantido a 26 °C.
- Remova todos os folículos antrais médios a grandes aspirando todos os folículos com mais de 2 mm de diâmetro usando uma agulha de 18 G conectada a uma bomba de aspiração com conjunto de pressão de vácuo a -28 mmHg e coloque os ovários aspirados em um béquer com soro fisiológico estéril a 26 °C.
NOTA: A remoção do conteúdo dos folículos > 2 mm é um passo crítico para remover, tanto quanto possível, a fonte de oócitos totalmente cultivados que "contaminariam" o experimento. - Sob uma capa de fluxo laminar horizontal, coloque um ovário no momento em uma placa de corte de politefluoroetileno estéril. Utilizando uma lâmina cirúrgica nº 22 montada em uma alça de bisturi, corte fatias de córtex ovariano (a porção externa do ovário, que contém os folículos), 1,5 – 2 mm de espessura e paralela ao eixo principal do órgão.
- Coloque as fatias do córtex ovariano em uma placa de vidro estéril de Petri coberta com meio de dissecação em uma placa quente a 38,5 °C.
NOTA: A partir de agora todos os procedimentos são realizados a 38,5 °C usando uma placa quente.
3. Seleção e isolamento dos folículos e recuperação dos COCs
- Coloque uma fatia de córtex ovariano em uma placa de Petri de vidro de 60 mm com 2-3 mL de M199-D.
- Usando um microscópio de dissecção, selecione os folículos entre 0,5 e 2 mm usando uma ocular equipada com micrômetros.
- Identifique os folículos saudáveis e não atreóticos sob o estereóscópio. Avalie a atresia folículo observando parâmetros morfológicos, como aparência translúcida muito clara, com um COC escuro dentro. Descarte os folículos atreóticos e processe todos os outros.
- Usando uma lâmina cirúrgica nº 22 montada em uma alça de bisturi, remova o tecido ovariano ao redor do folículo de um lado até que o folículo seja exposto em uma borda.
- Usando uma agulha 26G montada em uma seringa, faça cuidadosamente uma fenda na parede do folículo exposto. Esta ação liberará o conteúdo folicular, compreendendo o COC, fluido folicular e aglomerados de células.
- Identifique o COC sob o microscópio e examine para integridade cumulus, integridade zona pellucida e homogeneidade do citoplasma. Se esses critérios forem preenchidos, aspire o COC usando uma pipeta P20.
- Coloque o COC isolado em Cilostamida M199-D.
- Continue o procedimento de isolamento por 30 minutos.
4. Seleção de COCs a serem submetidos à cultura in vitro
- Sob o microscópio de dissecção, selecione COCs saudáveis com base nos critérios da etapa 3.6.
- Em uma placa de Petri de 60 mm, prepare 16 gotas de 20 μL de cilostamida M199-D e coloque um COC saudável por gota(Figura 1A).
- Utilizando um microscópio invertido ligado a uma câmera medida o diâmetro do oócito, excluindo a zona pellucida, utilizando o software fornecido com a câmera.
- Com uma visualização clara do oócito, faça duas medições perpendiculares excluindo a zona pellucida (Figura 1B).
- Assegurar se a média da medição dos dois oócitos, excluindo a zona pellucida, está dentro de uma faixa de 100 a 110 μm. Descarte COCs com oócito em forma não arredondada ou com oócitos que não sejam mensuráveis.
- Transfira os COCs selecionados em um prato de 35 mm contendo m199-H médio e mantenha-os na incubadora a 38,5 °C e 5% de CO2 no ar, umidade máxima até o passo 5.1.
- Repita as etapas 3 e 4 até 4x. O tempo de trabalho total não deve exceder 2 h.
5. Longa cultura in vitro dos oócitos (L-IVCO)
- Transfira um COC por poço no centro de um poço da placa 96 para ser preparado na etapa 1.1.5.
- Incubar a placa por 5 dias a 38,5 °C e 5% de CO2 no ar, umidade máxima.
- Dia sim, dia 2 e dia 4) prepare m199-L fresco como descrito na etapa 1.
- Renove metade do meio removendo 100 μL de médio e substituindo por 100 μL de M199-L recém-preparado. Realize a renovação média sob o estereóscópio e evite mover os COCs para o poço.
6. Classificação coc após a cultura
- No final do L-IVCO, analise a morfologia dos COCs sob o microscópio de dissecção.
- Classifique como descrito na Figura 2.
- Class 1 se os COCs mostrarem um investimento compacto de células cumulus sem nenhum sinal de expansão cumulus e degeneração celular.
- Class 2 se os COCs mostrarem um investimento compacto de células cumulus sem sinal de expansão cumulus e degeneração celular e com formação semelhante a antrum na massa cumulus.
- Class 3 se os COCs mostrarem várias camadas de célula cumulus sem sinal de expansão cumulus e algumas células desagregadas na camada externa de células cumulus e nenhuma formação semelhante a anão.
- Classificar como Classe 4 se os COCs mostrarem perda abundante de células cumulus estendendo-se por mais de 50% da superfície oócito, e sinais de degeneração celular e detritos celulares.
7. Avaliação da progressão meiotic após cultura
- Desnudação de oócito
- Coloque cada COC em um único poço de uma placa de quatro poços contendo 400 μL de 199D por poço.
- Sob um microscópio de dissecção, remova suavemente as células cumulus mecanicamente por pipetação repetida usando um conjunto de pipeta a 130-140 μL.
- Uma vez que os oócitos estejam livres do investimento cumulus, transfira-os para outro poço contendo 199D.
- Repita o processo até que todos os oócitos estejam completamente desnudos.
- Oócito mancha nuclear
NOTA: A partir de agora todos os procedimentos são realizados em temperatura ambiente. Os reagentes estão em temperatura ambiente.- Fixar os oócitos em paraformaldeído 4% em soro fisiológico tampão fosfato (PBS) por 1 h.
ATENÇÃO: Use equipamentos de proteção individual ao manusear paraformaldeído e descarte de materiais contaminados de acordo com as diretrizes de descarte de resíduos perigosos. - Lave os oócitos 3x por 5 min cada em PBS contendo 1% de polivinalcohol (PVA).
NOTA: As amostras podem ser processadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C durante o máximo de uma semana. - Coloque os oócitos em PBS contendo 0,1% Triton X por 10 min.
- Lave os oócitos 3x por 5 min cada em PBS contendo 1% de PVA.
- Coloque os oócitos singularmente em gotas de 5 μL de antifado médio suplementado com dilatato de 4',6-diamidino-2-fenilôle (DAPI) (1 μg/mL) sobre um slide.
- Coloque duas tiras de fita dupla face ao longo das laterais longas do slide, para evitar o achatamento excessivo dos oócitos ao colocar o deslizamento da tampa em cima.
- Coloque o deslizamento da tampa em cima, faça com que adera à fita e mantenha no escuro enquanto processa todas as amostras.
- Analise os oócitos utilizando um microscópio de epifluorescência convencional equipado com filtros DAPI (Excitação/Emissão: 358⁄461) para avaliar a progressão meiotic dos oócitos.
- Classificar os oócitos de acordo com sua progressão meiotic: GV - oócitos com diferentes graus de condensação de cromatina dentro do GV; MI – oócitos de GV quebrando para metafase I; e degenerados – oócitos que não poderiam ser identificados como estando em qualquer uma das etapas anteriores.
- Fixar os oócitos em paraformaldeído 4% em soro fisiológico tampão fosfato (PBS) por 1 h.
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Representative Results
Ao final do L-IVCO, a morfologia bruta dos COCs mudou e 4 classes foram identificadas com base no aparecimento das células cumulus, como mostra a Figura 2. Com base nos critérios morfológicos comumente adotados para selecionar COCs saudáveis11,,26,,27, as classes 1, 2 e 3 foram julgadas saudáveis, enquanto a classe 4, que apresentava sinais claros de degeneração, como a ausência de camadas completas de células cumulus em torno dos oócitos, foram consideradas severamente comprometidas e inadequadas para serem submetidas a procedimentos a jusante em um possível ajuste ivp. No total, foram analisados 74 oócitos em 5 réplicas biológicas, das quais 9,45% estavam na classe 4 e foram descartadas de uma avaliação posterior.
Como mostrado na Figura 3 e Figura 4,a avaliação da fase meiotic no final do L-IVCO mostrou que um percentual significativamente maior dos oócitos (78,57 ± 4,43%) permaneceu preso na fase imatura, com a cromatina ainda fechada dentro do GV (portanto, também referida como estágio GV), sem degenerar. Entre eles, 59,43% estavam em uma configuração GV2/3. Um pequeno percentual retomou a médiase atingindo a fase metafásico I (13,76 ± 5,85%) ou degenerado (7,67 ± 4,61%). Ao todo, foram analisados 67 oócitos em 5 réplicas biológicas. Ao todo, esses dados indicam que a cultura L-IVCO suporta a viabilidade do oócito, evitando a retomada do meiotico por 5 dias.
Figura 1: Contorno do prato utilizado para medir o diâmetro do oócito e imagem representativa de um COC. (A) Representação esquemática de uma placa de Petri de 60 mm com 16 gotas de 20 μL de M199-D, cada uma contendo um único COC. (B) Imagem representativa de um COC com o eixo utilizado para medir o diâmetro. Note que a zona pellucida não está incluída. Barra de escala 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens representativas de COCs no momento da coleta e depois do L-IVCO. (A, B, C, D) A linha superior (Coleção) representa COCs no momento da recuperação. (A', B', C', D') O mesmo COC é retratado 5 dias depois, no final do L-IVCO e classificado como relatado na etapa 6.1. A linha inferior (5 dias) representa COCs classificados como: Classe 1, mostrando um investimento compacto de células cumulus sem nenhum sinal de expansão e degeneração celular (A'); Classe 2, mostrando um investimento compacto de células cumulus sem sinal de expansão e degeneração celular e com formação semelhante a antrum (flechas) na massa cumulus (B'); Classe 3, mostrando várias camadas de célula cumulus sem sinal de expansão cumulus e algumas células desagregadas na camada externa de células cumulus (C'); Classe 4, mostrando perda abundante de células cumulus em mais de 50% da superfície oócito e sinais de degeneração celular e detritos celulares (D'). Barra de escala 40 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagens representativas da progressão meiotic. A linha superior (coloração de DNA) mostra o DNA (azul) de oócitos representativos em (A) o estágio GV0 e (B) GV2-like configuração, (C) estágio MI e (D) oócitos degenerados, (A) no momento da coleta e (B, C, D) após 5 dias de L-IVCO. A linha inferior é a imagem correspondente no campo brilhante do oócito na linha superior. A seta indica o GV. Barra de escala 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Mprogressão eiotica dos oócitos no final da cultura. O gráfico da barra representa a distribuição de oócitos no estágio GV e MI e oócitos degenerados no final do L-IVCO. Foram excluídos os oócitos previamente classificados na Classe 4. Os dados foram analisados pela ANOVA de 1 via, seguidos pelo teste de comparação múltipla de Tukey e os valores são meios ± SEM (N=5; P<0,05). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui descrevemos um sistema cultural para o crescimento de oócitos que promove o desenvolvimento de oócitos por 5 dias, apoiando sua viabilidade e impedindo a retomada do meiotico. Este último aspecto é de extrema importância para permitir o crescimento contínuo e a diferenciação necessários para conferir o oócito com competência de desenvolvimento meiotic e embrionário2,20, que seria bloqueado de outra forma por uma retomada prematura da divisão meiotic.
Ao desenvolver esse sistema cultural, levamos em consideração diversas características do crescimento fisiológico e diferenciação que ocorre no folículo. Nesta seção, fornecemos uma visão geral dos principais aspectos que consideramos ao desenvolver essa estratégia.
Primeiro, o crescimento de oócitos em folículos antral bovinos leva aproximadamente 5 dias para passar pela transição do crescimento para o estágio totalmente crescido in vivo8,19. Portanto, a duração da cultura foi aumentada para 5 dias em oposição às tentativas anteriores feitas em nosso laboratório, onde os oócitos foram cultivados por até 24 h2.
Outro fator que incluímos no L-IVCO foi o aumento da viscosidade do meio em que os COCs são cultivados para imitar a viscosidade fisiológica do fluido folicular. Isso foi recriado adicionando 4% PVP e, juntamente com o uso de superfície de cultura revestida de colágeno I, promoveu a formação de uma cultura 3D semelhante, conforme relatado por estudos anteriores13.
Cilostamida, inibidor de PDE3, foi adicionado para manter oócitos presos no estágio GV, impedindo a retomada precoce do meiotic mantendo altos níveis de nucleotídeos cíclicos dentro dos oócitos2,,19,,25,,28,,29. Nossos resultados indicam que um tratamento de 5 dias com cilostamida não tem impacto bruto na saúde dos COCs, pois apenas uma pequena fração de complexos degenerados, também de acordo com os resultados obtidos por Alam et al.19.
A inclusão do sulfato ZN, e sua concentração, é comprovada por resultados recentes que mostram que esse elemento de rastreamento tem um papel no apoio à diferenciação e atividade transcricional dos oócitos bovinos na cultura30.
Finalmente, uma combinação de hormônios foi introduzida para imitar de perto o meio hormonal fisiológico típico do folículo antral primitivo31,,32,33. Por exemplo, a estradiol tem conhecido as atividades de apoio ao crescimento do oócito16,,17,19 e as conexões entre as células granulosa17,ao mesmo tempo em que promove a aquisição da competência meiotic34. Da mesma forma, a testosterona, além de ser precursora do estradiol, também estimula o crescimento folicular e o desenvolvimento35,enquanto a progesterona foi adicionada principalmente para sua atividade antipoptótica36.
Importante e de acordo com nosso estudo anterior2,a concentração de FSH foi mantida em uma concentração fisiológica para a fase de crescimento. De fato, uma baixa concentração de FSH promove o desenvolvimento de oócito sustentando a comunicação mediada entre o oócito e as células cumulus companheiras e promove a atividade transcricional e a diferenciação de oócitos sem induzir a retomada meiotica2.
Em nossa experiência, uma das chaves para o sucesso do L-IVCO é a seleção de uma população homogênea de COCs saudáveis provenientes de folículos antral primitivos. Segundo dados da literatura, 80% dos oócitos coletados dos folículos antral primitivos são caracterizados por cromatina organizada em uma configuração denominada GV020. Essa homogeneidade representa uma vantagem para a cultura in vitro, pois em princípio garante que as células se comportem da mesma forma quando expostas ao ambiente cultural. Com isso em mente, a coleta de COCs deve ser realizada tentando minimizar a "contaminação" com COCs provenientes de estágios menos ou mais avançados de diferenciação. No entanto, devido ao fato de que o processamento das fatias corticais é bastante demorado e deve ser realizado em um tempo relativamente curto, a etapa de coleta/seleção provavelmente representa a passagem mais crítica do L-IVCO. Para conseguir isso, algumas considerações-chave devem ser a barba em mente.
Por exemplo, o pesquisador/técnico precisa ser treinado para reconhecer e descartar folículos com sinais de atresia folicular. Nesta fase, apenas parâmetros morfológicos podem ser usados para reconhecer folículos atreóticos, como aparência translúcida muito clara, e a presença de um COC escuro no interior. Todos os outros folículos, nos quais os sinais atreéticos não podem ser claramente distinguidos, devem ser abertos e uma nova seleção com base na morfologia dos COCs isolados deve ser realizada para identificar os saudáveis2,,3,,37,,38,39. Isso é conseguido novamente por observações morfológicas como a presença de pelo menos quatro camadas de células cumulus, forma grosseiramente esférica, oolema intacto e ooplasmo homogêneo e finamente granulado11,,26,27.
O isolamento e a manipulação dos COCs representam um desafio técnico adicional, que requer pessoal qualificado e equipamentos adequados para microdiscção sob o estereomicroscope e determinação precisa do diâmetro do oócito. Esta última etapa é essencial para selecionar uma população uniforme de oócitos, excluindo assim qualquer possível fonte de contaminação com COCs provenientes de outras etapas foliculares. Por essa razão, é importante garantir que os oócitos fechados nos COCs recuperados tenham um diâmetro entre 100 e 110 μm2,40.
Além de apoiar a viabilidade do oócito e impedir a retomada meiotica, o L-IVCO promoveu a transição da configuração de cromatina de GV0 para o GV2 e GV3 progressivamente mais condensados em 59% dos oócitos. Notavelmente a condensação da cromatina dentro do GV é um marcador de "ganho" de competência meiotic e de desenvolvimento em basicamente todos os oócitos mamíferos estudados até agora20. Este resultado é muito promissor, especialmente quando comparado com o nosso sistema IVCO de 24 horas anterior. Nesse estudo, o maior grau de compactação de cromatina dentro do VG não foi atingido e 22% dos oócitos foram encontrados com uma configuração GV12, estágio associado à competência integral, mas ainda escassa competência de desenvolvimento20. Mesmo nessas condições, os oócitos em crescimento incompetentes foram capazes de amadurecer e produzir embriões, embora em quantidade limitada. O aumento consistente dos estágios GV2/3 observados no L-IVCO é, portanto, compatível com um maior potencial para produzir embriões viáveis. Estamos em processo de testar essa hipótese experimentalmente submetendo COCs derivados de L-IVCO para as seguintes etapas de IVP (maturação in vitro, fertilização e cultura de embriões até o estágio blastocisto). Se confirmado, o L-IVCO desencadeará parte do potencial ainda não explorado da reserva ovariana, com implicações importantes em várias áreas de interesse para a preservação da fertilidade feminina. Por exemplo, aumentará a fonte de gametas fertilizantes a serem usados em programas de preservação de criadores de alto mérito genético. Outra aplicação que prevemos é para o salvamento genético de espécies ameaçadas da família bovid, bem como de raças locais que estão ameaçadas ou em risco de erosão genética devido à difusão generalizada das raças cosmopolíticas. Por último, mas não menos importante, o L-IVCO representa uma ferramenta para todos os cientistas interessados em dissecar os processos celulares e moleculares que regulam a formação de um gamete competente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 e unimi n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T.
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