Summary
Vi beskriver de förfaranden för isolering av växande oocytes från äggstockscancer folliklar i tidiga skeden av utvecklingen, samt inställning av en in vitro-kultur system som kan stödja tillväxt och differentiering upp till fullvuxen skede.
Abstract
Den begränsade reserven av mogna, fruktbara äggceller utgör en stor barriär för framgång assisterad reproduktion hos däggdjur. Med tanke på att under den reproduktiva livslängden endast cirka 1% av äggceller i en äggstock mogna och ägglossning, har flera tekniker utvecklats för att öka exploatering av äggstocksreserven till den växande befolkningen av icke-ägglossning folliklar. Sådan teknik har tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Men den stora potentialen i äggstocksreserven är fortfarande i stort sett outnyttjad. Hos kor har till exempel vissa försök gjorts att stödja in vitro-kulturen av oocyter i specifika utvecklingsstadier, men effektiva och tillförlitliga protokoll har ännu inte utvecklats. Här beskriver vi ett kultursystem som återger de fysiologiska villkoren för motsvarande follikulära skede, definieras för att utveckla in vitro växande oocyter som samlats in från nötkreatur tidiga antrala folliklar till fullvuxen skede, motsvarande den medelstora antral follicle in vivo. En kombination av hormoner och en phosphodiesterase 3-hämmare användes för att förhindra untimely meiotic återupptagande och att vägleda äggcells differentiering.
Introduction
Under den reproduktiva livslängden, endast en minimal fraktion av de äggceller som är närvarande i en äggstock mogna, frigörs i äggledarna vid ägglossningen, och är tillgängliga för att befruktas och utvecklas till en livskraftig embryo1. Å andra sidan, de flesta av äggceller inom en äggstock genomgår atresia och är aldrig ägglossning. In vitro embryo produktion (IVP) teknik har försökt att öka utnyttjandet av äggstocksreserven2,3. Hittills har sådan teknik tillåtit insatser av fertilitet bevarande, urvalsprogram i boskap, och bevarande av utrotningshotade arter. Ändå, de flesta protokoll använder oocyter som i princip har avslutat tillväxtfasen inom antral ovariefolicle, och därmed kallas fullvuxna äggceller. Hos nötkreatur, där IVP-teknik används i stor utsträckning, når fullvuxna äggceller en slutlig diameter på cirka 120 μm och samlas in från folliklar som sträcker sig från 2 till 8 mm i diameter (medelstora antrala folliklar)1. Vid isolering från folliklaren, är sådana äggceller in vitro mognat och befruktas. Zygoterna odlas sedan upp till blastocyststadiet och antingen överförs till en mottagare eller cryopreserved. Hos nötkreatur, liksom i många andra arter, trots den potential som ivp erbjuder, förbättrades inte i hög grad antalet in vitro-producerade embryon per ko under de senaste 40 åren. Detta beror delvis på det begränsade antalet fullvuxna äggceller som fyller en äggstock vid en viss tidpunkt som kan hämtas och utsättas för standard IVP-tekniker4,5,6.
De oocyter inneslutna inom tidiga antral folliklar, dvs de folliklar som är mindre än 2 mm i diameter, utgör en potentiell källa som ska användas i fertilitet bevarande program7 , som en äggstock ungefär innehåller 10 gånger mer tidiga antral folliklar än medium en8. Dessa oocyter befinner sig dock fortfarande i tillväxtfasen och har ännu inte nått det fullvuxna stadiet9. Som sådan, de är fortfarande transkriptionellt aktiva, producerar mRNAs som kommer att lagras för senare utvecklingsmässiga steg, och har ännu inte genomgått alla de differentieringsprocess som krävs för att förläna oocyterna med förmåga att spontant återuppta och slutföra meios jag en gång isolerade från follikulära fack10,11. Därför kan de inte direkt överlämnas till standardprotokoll för in vitro-mognad (IVM), men de kräver ytterligare en period av kultur som skulle göra det möjligt för dem att slutföra tillväxtfasen och korrekt differentiera.
Övergången från det växande till det fullvuxna stadiet, som hos nötkreatur sker när follikeln utvecklas från den tidiga antral till det medelstora antralstadiet, är ett av de kritiska stegen under oocyteutvecklingen. Hos nötkreatur, flera studier försökt att rekapitulera dessa händelser in vitro2,12,13,14,15,16,17,18,19. Hittills har dock inga tillförlitliga protokoll utvecklats och endast begränsad framgång har rapporterats. Enligt tidigare studier20, dessa växande oocyter utgör en homogen population. Förutom att vara transkriptionellt aktiv, är deras kromatin spridda i germinal vesikel (GV), i en konfiguration som heter GV02,21. Omvänt är befolkningen i fullvuxna oocyter som erhålls från medelstora antrala folliklar mer heterogena, ett tillstånd som speglas av de olika grader av kromatin kompaktering (GV1, GV2 och GV3) som kan observeras20. Bland dessa har tidigare uppgifter visat att GV2 och GV3 oocyter är övergripande kännetecknas av en bättre kvalitet och högre embryonal utvecklingskompetens20,21,22,23,24.
Med utgångspunkt från ovanstående iakttagelser, här beskriver vi en 5-dagars lång kultur system av äggceller (L-IVCO) som gör det möjligt att differentiera oocytes isoleras som cumulus-oocyte komplex (COCs) från tidiga antrala folliklar. Denna kultur strategi har utvecklats från 10 år långa studier som genomförts i vårt labb och rötter sin grund på de tidigare utvecklade 24-48 timmar in vitro-oocyte kultur (IVCO)2, prematuration system23,25 och zink tillskott under äggcell kultur . En kombination av follikelstimulerande hormon (FSH) och en phosphodiesterase-3 (PDE3) hämmare, kunna förstärka cumulus-oocyte kommunikation2, förhindra untimely meiotisk återupptagande2, och stöd oocyte tillväxt2 användes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Äggstockar samlades in från 4 till 8 år gamla Holstein mjölkkor som återvunnits på det lokala slakteriet (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Italien).
1. Förberedelse av media
OBS: Alla medier måste förberedas minst fyra timmar före användning. Natriumbikarbonatbuffrade medier inkuberas vid 38,5 °C och 5 % CO2 i luft, maximal fuktighet. HEPES-buffrade medier underhålls vid 38,5 °C i termostatugn.
- Lång in vitro-odling av oocyter (L-IVCO) medium
- Förbered 15 mL av det grundläggande odlingsmediet (M199-B): Tillägg M199 med 2 mM glutamin, 0,4% fettsyrafritt bovint serumalbumin (BSA), 0,2 mM natriumpyuvat, 25 mM natriumbikarbonat, 0,1 mM cysteamin, 21,3 μg/mL av fenolröd, 75 μg/mL kanamycin och 4% Polyvinylpyrrolidon (PVP; 360 k molekylvikt).
- Förbered 3 mL av holdingmediet (M199-H): Till M199-B tillsätt 5 μM cilostamid och häll den i en 35 mm Petriskål.
- Förbered L-IVCO-mediet (M199-L): Tillägg M199-B med 0,15 μg/mL Zn sulfat, 10-4 IU/mL FSH, 10 ng/mL estradiol, 50 ng/mL testosteron, 50 ng/mL progesteron och 5 μM Cilostamide.
- Placera 200 μL M199-L-medium i varje brunn av den 96 välbeklädda plattan. Fyll brunnarna i de fyra kanterna på plattan med steril odling vatten för att kompensera för avdunstning och för att upprätthålla lämplig fuktighet under kultur.
- Inkubera 96 brunnsplattan och M199-H-mediet i inkubatorn vid 38,5 °C och 5% CO2 i luft, maximal fuktighet.
- Dissektion medel
- Förbered dissektionsmediet (M199-D): Tillägg M199 med 0,4 % BSA-fraktion V, 0,164 mM penicillin, 0,048 mM streptomycin, 1790 enheter/L heparin. M199-D kan beredas i bulk, dispenseras i 20 mL alikvoter och förvaras vid 4 °C i 6 månader. När det behövs, varm och komplettera 1 alikvot.
- Förbered 20 mL M199-D kompletterat med 5 μM cilostamid (M199-D cilostamid).
2. Insamling och bearbetning av äggstockar
OBS: Alla procedurer förs i rumstemperatur (26 °C) om inte annat anges.
- Bär igen äggstockarna på slakteriet från kor.
- Placera äggstockarna i steril saltlösning (NaCl, 9 g/L) vid 26 – 28 °C tillsatt med penicillin 100 U/mL och streptomycin 0,1 mg/mL.
- Transportera organen till laboratoriet i varm steril koksaltlösning inom 4 h.
- Tvätta äggstockarna 4x i steril saltlösning som bibehålls vid 26 °C.
- Avlägsna alla mellan-till-stora antrala folliklar genom att aspirera alla folliklar mer än 2 mm i diameter med hjälp av en 18 G-nål som är ansluten till en aspirationspump med vakuumtryck inställt vid -28 mmHg och placera de aspirerade äggstockarna i en bägare med steril saltlösning vid 26 °C.
OBS: Borttagande av innehållet av folliklar > 2 mm är ett kritiskt steg för att så mycket som möjligt avlägsna källan till fullvuxna oocyter som skulle 'förorena' försöket. - Under en horisontell laminär flödeshuva, placera en äggstock vid den tiden på en steril polytetrafluoreten skärbräda. Med hjälp av ett kirurgiskt blad nr 22 monterad på en skalpell handtag, skär skivor av äggstocks cortex (den yttre delen av äggstocken, som innehåller folliklar), 1,5 – 2 mm tjock och parallellt med den stora axeln av organet.
- Placera skivorna av äggstocks cortex i en steril glas Petriskål täckt med dissekerande medium på en varm tallrik vid 38,5 °C.
OBS: Från och med nu alla förfaranden utförs vid 38,5 °C med hjälp av en varm tallrik.
3. Urval och isolering av folliklar och hämtning av COCs
- Placera en äggstocks cortex skiva i en 60 mm glas Petriskål med 2-3 mL av M199-D.
- Med hjälp av ett dissekeringsmikroskop väljer du folliklarna mellan 0,5 – 2 mm med hjälp av ett mikrometerutrustat okular.
- Identifiera de friska, icke-atreetiska folliklarna under stereomikroskopet. Bedöma follikel atresi genom att observera morfologiska parametrar, såsom mycket tydligt genomskinligt utseende, med en mörk COC inuti. Kassera de atreetiska folliklarna och bearbeta alla de andra.
- Med hjälp av ett kirurgiskt blad nr 22 monterad på en skalpell handtag ta bort äggstocksvävnaden som omger follikeln på ena sidan tills follikeln är utsatt på ena kanten.
- Med hjälp av en 26G nål monterad på en spruta, gör försiktigt en slits i den exponerade follikeln väggen. Denna åtgärd kommer att släppa follikulära innehållet, bestående av COC, follikulär vätska och klumpar av celler.
- Identifiera COC under mikroskopet och undersöka för cumulus integritet, zona pellucida integritet och homogenitet av cytoplasman. Om dessa kriterier är uppfyllda, aspirera COC med hjälp av en P20-pipett.
- Placera den isolerade COC i M199-D cilostamid.
- Fortsätt isoleringsproceduren i 30 min.
4. Val av KOL som skall utsättas för in vitro-kultur
- Under dissekeringsmikroskopet väljer du friska COCs baserat på kriterierna i steg 3.6.
- I en 60 mm Petriskål, tillred 16 droppar av 20 μL av M199-D cilostamid och placera en hälsosam COC per droppe (Figur 1A).
- Med hjälp av ett inverterat mikroskop som är fäst vid en kamera mäter oocytediametern, exklusive zona pellucida, med hjälp av den programvara som medföljer kameran.
- Med en tydlig visualisering av äggcellen, gör två vinkelräta mätningar exklusive zona pellucida (Figur 1B).
- Försäkra om medelvärdet av de två oocytes mätning, exklusive zona pellucida, ligger inom ett intervall på 100 – 110 μm. Kassera COCs med ej rundad formad oocyte eller med oocyter som inte är mätbara.
- Överför de utvalda COCsna i en 35 mm maträtt som innehåller M199-H-medium och håll dem i inkubatorn vid 38,5 °C och 5 % CO2 i luft, maximal fuktighet fram till steg 5.1.
- Upprepa steg 3 och 4 upp till 4x. Den totala arbetstiden får inte överstiga 2 h.
5. Lång in vitro-kultur av oocyterna (L-IVCO)
- Överför en COC per brunn i mitten av en brunn av 96 väl plattan som skall förberedas i steg 1.1.5.
- Inkubera plattan i 5 dagar vid 38,5 °C och 5% CO2 i luft, maximal fuktighet.
- Varannan dag (dag 2 och dag 4) tillred färsk M199-L enligt beskrivningen i steg 1.
- Förnya hälften av mediet genom att ta bort 100 μL medium och ersätta med 100 μL nyberedda M199-L. Utför medelförnyelsen under stereomikroskopet och undvik att flytta COCs i brunnen.
6. COC-klassifikation efter kulturen
- I slutet av L-IVCO, analysera COCs morfologi under dissekering mikroskop.
- Klassificera som avbildas i figur 2.
- Klassificera som klass 1 om COCs visar en kompakt cumulus cell investering utan tecken på cumulus expansion och cell degeneration.
- Klassificera som klass 2 om COCs uppvisar en kompakt cumuluscellinvestering utan tecken på cumulusexpansion och celldegeneration och med antrumliknande formation i cumulusmassan.
- Klassificera som klass 3 om COCs visar flera lager av cumulus cell utan tecken på cumulus expansion och några disaggregerade celler i det yttre lagret av cumulus celler och ingen antrum-liknande bildning.
- Klassificera som klass 4 om COCs visar riklig förlust av cumulus celler som sträcker sig för mer än 50% av äggcellsytan, och tecken på celldegeneration och cellskräp.
7. Utvärdering av meiotisk progression efter kultur
- Oocyte denudation
- Placera varje COC i en enda brunn av en fyr-brunnsplatta som innehåller 400 μL av 199D per brunn.
- Under ett dissekeringsmikroskop avlägsna försiktigt cumuluscellerna mekaniskt genom upprepad pipettering med hjälp av en pipettset som är 130-140 μL.
- När äggcellerna är fria från cumulus investeringen, överföra dem till en annan brunn som innehåller 199D.
- Upprepa processen tills alla oocyter är helt denuded.
- Oocyte kärnfärgning
OBS: Från och med nu alla de förfaranden som utförs i rumstemperatur. Reagenser är i rumstemperatur.- Fixera oocyterna i paraformaldehyd 4% i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) i 1 h.
VAR FÖRSIKTIG: Använd personlig skyddsutrustning vid hantering av paraformaldehyd och kassera kontaminerade material i enlighet med riktlinjer för bortskaffande av farligt avfall. - Tvätta oocyterna 3x i 5 min vardera i PBS innehållande 1% polyvinylalkohol (PVA).
OBS: Proverna kan bearbetas direkt eller förvaras vid 4 °C i högst en vecka. - Placera oocyterna i PBS innehållande 0,1% Triton X i 10 min.
- Tvätta oocyterna 3x i 5 min vardera i PBS innehållande 1% PVA.
- Placera oocyterna singularly i droppar av 5 μL antifade medium kompletterat med 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) dilaktate (1 μg/mL) över en bild.
- Placera två remsor av dubbelsidig tejp längs långsidorna av bilden, för att undvika överdriven tillplattad av äggcellerna när du sätter locket glida på toppen.
- Placera locket slip på toppen, gör det följa bandet och hålla i mörkret medan bearbetning av alla prover.
- Analysera oocyterna med hjälp av ett konventionellt epifluorescensmikroskop utrustat med DAPI-filter (Excitation/Emission: 358,461) för att bedöma oocyternas meiotiska progression.
- Klassificera oocyterna enligt deras meiotiska progression: GV - oocytes med olika grader av kromatinkondensation inom GV; MI – oocyter från GV bryter ner till metafas I; och degenererade – oocyter som inte kunde identifieras som att vara på någon av de tidigare stadierna.
- Fixera oocyterna i paraformaldehyd 4% i fosfatbuffertsaltlösning (PBS) i 1 h.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I slutet av L-IVCO ändrades KOL:nas bruttomorfologi och 4 klasser identifierades utifrån cumuluscellernas utseende, vilket visas i figur 2. Baserat på de morfologiska kriterier som vanligen antagits för att välja friska COCs11,26,27, klass 1, 2 och 3 bedömdes friska, medan klassen 4, som visade tydliga tecken på degeneration såsom avsaknad av kompletta lager av cumulus celler som omger äggcellerna, ansågs allvarligt äventyras och olämpliga att genomgå nedströms förfaranden i en blivande IVP inställning. Totalt sett analyserades 74 oocytes i 5 biologiska replikat, varav 9,45% var i klass 4 och kasserades från ytterligare utvärdering.
Som framgår av figur 3 och figur 4visade bedömning av meiotiskt stadium i slutet av L-IVCO att en betydligt högre andel av oocyterna (78,57 ± 4,43 %) förblev arresterad på det omogna stadiet, med kromatinen fortfarande innesluten inom GV (därför, även kallad GV-stadium), utan att urarta. Bland dem 59,43% var i en GV2 / 3 konfiguration. En liten andel återupptogs meios når metafasen I-stadium (13,76 ± 5,85%) eller degenererade (7,67 ± 4,61 %). Totalt sett analyserades 67 oocytes i 5 biologiska replikat. Sammantaget dessa uppgifter tyder på att L-IVCO kulturen stöder oocyten livskraft samtidigt förhindra meiotiska återupptagande i 5 dagar.
Figur 1: Kontur för den maträtt som används för mätning av oocytediametern och representativ bild av en COC. (A) Schematisk återgivning av en 60 mm Petriskål med 16 droppar på 20 μL av M199-D, var och en innehållande en enda COC. (B) Representativ bild av en COC med den axel som används för mätning av diametern. Observera att zona pellucida inte ingår. Skala bar 50 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 2: Representativa bilder av COCs vid insamlings tidpunkten och efter L-IVCO. (A, B, C, D) Den övre raden (Collection) representerar COCs vid tiden för hämtning. (A', B', C', D') Samma COC avbildas 5 dagar senare, i slutet av L-IVCO och klassificeras som rapporterats i steg 6.1. Den nedre raden (5 dagar) representerar COCs klassificerade som: klass 1, som visar en kompakt cumulus cell investering utan tecken på expansion och celldegeneration (A'); Klass 2, som visar en kompakt cumuluscellinvestering utan tecken på expansion och celldegeneration och med antrumliknande bildning (pilar) i cumulusmassan (B'); Klass 3, som visar flera lager cumuluscell utan tecken på cumulusexpansion och vissa uppdelade celler i det yttre lagret av cumulusceller (C'); Klass 4, som visar riklig förlust av cumulusceller på mer än 50% av äggcellsytan och tecken på celldegeneration och cellspillsk (D'). Skala bar 40 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Bild 3: Representativa bilder av den meiotiska progressionen. Den övre raden (DNA-färgning) visar DNA (blå) av representativa oocyter vid (A) GV0-stadiet och (B) GV2-liknande konfiguration, (C) MI-stadium och (D) urartade oocyter, (A) vid tidpunkten för insamling och (B, C, D) efter 5 dagar av L-IVCO. Den nedre raden är motsvarande bild i ljusa fältet av äggcellen i den övre raden. Pilen indikerar GV: n. Skala bar 20 μm. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Figur 4: Meiotisk progression av oocyterna vid slutet av kulturen. Stapeldiagrammet representerar fördelningen av oocyter vid GV- och MI-stadium och degenererade oocyter i slutet av L-IVCO. De oocyter som tidigare klassificerats i klass 4 uteslöts. Data analyserades av 1-vägs ANOVA följt av Tukeys multipeljämförelsetest och värden är ± SEM (N=5; P<0,05). Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett kultursystem för växande oocyter som främjar oocyte utveckling i 5 dagar genom att stödja deras livskraft och förhindra meiotiska återupptagande. Denna senare aspekt är av yttersta vikt att tillåta fortsatt tillväxt och differentiering som är nödvändig för att förläna oocyten med meiotisk och embryonal utvecklingskompetens2,20, som annars skulle blockeras av ett förtidigt återupptagande av meiotiska divisionen.
När vi utvecklade detta kultursystem tog vi hänsyn till flera egenskaper hos den fysiologiska tillväxt och differentiering som sker i follikeln. I detta avsnitt ger vi en översikt över de viktigaste aspekterna som vi ansåg när vi utvecklar denna strategi.
Först, växande oocyter i nötkreatur tidiga antral folliklar tar cirka 5 dagar att genomgå övergången från den växande till fullvuxen skede in vivo8,19. Därför höjdes kulturens längd till 5 dagar i motsats till tidigare försök som gjorts i vårt labb där oocyterna var odlade i upp till 24 h2.
En annan faktor som vi ingår i L-IVCO var den ökade viskositeten i det medium där COCs odlas för att efterlikna fysiologiska viskositet av follicular vätska. Detta återskapades genom att lägga till 4% PVP och, tillsammans med användningen av Kollagen jag belagda kultur yta, det främjas bildandet av en 3D-liknande kultur, som rapporterats av tidigare studier13.
Cilostamide, en PDE3-hämmare, lades till för att upprätthålla oocyter meiotically greps på GV-stadiet, förhindra brådmogen meiotiska återupptagande genom att hålla höga halter av cykliska nukleotider inom oocyterna2,19,25,28,29. Våra resultat tyder på att en 5-dagarslång behandling med cilostamid inte har en bruttopåverkan på COCs hälsa, eftersom endast en liten del av komplex degenererade, också i samförstånd med de resultat som erhållits genom Alam et al.19.
Införandet av Zn sulfat, och dess koncentration, är underbyggd av färska resultat som visar att detta spårämne har en roll i att stödja differentiering och transkriptionell verksamhet av nötkreatur växande äggceller i kultur30.
Slutligen infördes en kombination av hormoner för att nära efterlikna den fysiologiska hormonella milieu typiska för den tidiga antral follikeln31,32,33. Till exempel estradiol har kända aktiviteter för att stödja äggcelltillväxten16,17,19 och sambanden mellan granulosaceller17, samtidigt som man också främjar förvärvet av meiotisk kompetens34. På samma sätt, testosteron, förutom att vara en föregångare till estradiol, också stimulerar follikulärtillväxt och utveckling 35, medan progesteron främst tillsattes för sin antiapoptotiska aktivitet36.
Viktigt och i samförstånd med vår tidigare studie2, koncentrationen av FSH hölls vid en koncentration som är fysiologisk för den växande fasen. Faktum är att en låg FSH-koncentration främjar oocyteutveckling genom att upprätthålla gap-junction medierad kommunikation mellan äggcellen och följeslagare cumulus celler och främjar transkriptionell aktivitet och oocyte differentiering utan att inducera meiotisk återupptagande2.
Enligt vår erfarenhet är en av nycklarna för framgång för L-IVCO valet av en homogen population av friska COCs som kommer från tidiga antral folliklar. Enligt uppgifter i litteraturen, 80% av de oocyter som samlats in från tidiga antrala folliklar kännetecknas av kromatin organiserade i en konfiguration som betecknas GV020. Denna homogenitet utgör en fördel för in vitro-kulturen, eftersom den i princip säkerställer att cellerna kommer att bete sig på liknande sätt när de utsätts för kulturmiljön. Med detta i åtanke måste COCs insamling utföras försöker minimera "kontaminering" med COCs kommer från mindre eller mer avancerade stadier av differentiering. Men på grund av det faktum, att bearbetning av kortikala skivor är ganska tidskrävande och bör utföras på relativt kort tid, insamling / urval steg förmodligen representerar den mest kritiska passagen av L-IVCO. För att uppnå detta bör vissa viktiga överväganden vara skägg i åtanke.
Till exempel, forskaren / teknikern måste utbildas för att känna igen och kasta folliklar med tecken på follikulär atresia. I detta skede kan endast morfologiska parametrar användas för att känna igen atreetiska folliklar, såsom mycket tydligt genomskinligt utseende, och närvaron av en mörk COC inuti. Alla de andra folliklar, där atretic tecken inte tydligt kan särskiljas, bör öppnas och ytterligare urval baserat på morfologi av de isolerade COCs bör utföras för att identifiera de friska2,3,37,38,39. Detta uppnås igen genom morfologiska observationer som förekomsten av minst fyra lager av cumulusceller, grovt sfärisk form, intakt oolemma och homogena och fint granulerade ooplasm11,26,27.
COCs isolering och manipulation utgör en ytterligare teknisk utmaning, som kräver skicklig personal och korrekt utrustning för mikro-dissekering under stereomikroskop och noggrann bestämning av äggcellsdiameter. Detta sista steg är viktigt att välja en enhetlig population av äggceller, vilket utesluter alla möjliga föroreningskällor med COCs som kommer från andra follikulära stadier. Av denna anledning är det viktigt att se till att de oocyter som är inneslutna i de hämtade COC-enheterna har en diameter mellan 100 och 110 μm2,40.
Förutom stödjande oocyte livskraft och förhindra meiotiska återupptas, L-IVCO främjas övergången av kromatin konfigurationen från GV0 till successivt mer kondenserad GV2 och GV3 i 59% av oocyterna. Noterbart kromatin kondensation inom GV är en markör för "vinst" av meiotiska och utvecklingsmässiga kompetens i princip alla däggdjur äggceller studerade hittills20. Detta resultat är mycket lovande, särskilt när man jämför med våra tidigare 24 timmar IVCO system. I den studien, den högsta graden av kromatin kompaktering inom GV nåddes inte och 22% av äggceller hittades med en GV1 konfiguration2, ett stadium i samband med full meiotisk kompetens men fortfarande knappa utvecklingsmässiga kompetens20. Även under dessa förhållanden kunde de annars inkompetenta växande äggcellerna mogna och producera embryon, om än i begränsad mängd. Den konsekventa ökning av GV2/3-stadier som observerats i L-IVCO är därför förenlig med en högre potential att producera livskraftiga embryon. Vi är i färd med att testa denna hypotes experimentellt genom att skicka cocs som härrör från L-IVCO till följande steg i IVP (in vitro-mognad, befruktning och embryo kultur upp till blastocyst scenen). Om det bekräftas, L-IVCO kommer att släppa lös några av de ännu outnyttjade potential äggstockscancer reserv, med viktiga konsekvenser på flera områden av intresse för kvinnlig fertilitet. Till exempel, Det kommer att öka källan till fertilizable gametes som ska användas i bevarande program av hög genetiska meriter uppfödare. En annan applikation som vi förutser är för den genetiska bärgningen av hotade arter av bovidfamiljen samt av lokala raser som är hotade eller riskerar genetisk erosion på grund av den utbredda diffusionen av kosmosraser. Sist men inte minst representerar L-IVCO ett verktyg för alla forskare som är intresserade av att dissekera de cellulära och molekylära processer som reglerar bildandet av en kompetent gamete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Regione Lombardia PSR INNOVA n.201801061529 och UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-well dishes | Nunclon | 179830 | |
| 96-well dish | Becton Dickinson Biosciences | 356649 | BioCoat™ Collagen I |
| Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) | Sigma | A8806 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Sigma | A3311 | |
| Cell culture water | Sigma | W3500 | |
| Cilostamide | Sigma | C7971 | |
| Cysteamine | Sigma | M9768 | |
| Digital camera | Nikon Corp | Camera DS-5M | |
| Disodium phosphate | Sigma | S5136 | |
| Estradiol | Sigma | E2758 | |
| Glutamax Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Gonal F | Merck Serono | ||
| Heparin | Sigma | H3149 | |
| HEPES | Sigma | H3784 | |
| Vacuum pump | Cook-IVF | KMAR-5100 | |
| Incubator | Sanyo | ||
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma | K1377 | |
| Medium 199 | Sigma | M3769 | Powder for bicarbonate-buffered media |
| Medium 199 | Sigma | M2520 | Powder for HEPES-buffered media |
| Microscope | Nikon Corp | Nikon Diaphot | |
| Microscope | Nikon Corp | Eclipse E 600 | |
| Monopotassium phosphate | Sigma | P5655 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicilin | Sigma | P3032 | |
| Phenol Red | Sigma | P5530 | |
| Polyvinyl alcohol | Sigma | P8137 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma | P5288 | 360k molecular weight |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Sodium choride | Sigma | P5886 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Testosterone | Sigma | 86500 | |
| Triton X | Sigma | T9284 | |
| Vectashield with DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Water | Sigma | W3500 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma | Z0251 |
References
- Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
- Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
- McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
- Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
- Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
- Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
- Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
- Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
- Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
- Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
- Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
- Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
- Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
- Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
- Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
- Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
- Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
- Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
- Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
- Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
- Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
- Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
- Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
- Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
- Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
- Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
- Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
- Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
- Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
- Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
- Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
- Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
- Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
- Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
- Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
- Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
- Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
- McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
- Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).
