Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

In Vitro Культурная стратегия для Oocytes от раннего антрального фолликула в крупного рогатого скота

Published: July 8, 2020 doi: 10.3791/61625
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Reproductive and Developmental Biology Laboratory, Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan

Summary

Мы описываем процедуры изоляции растущих яйцеклеток от фолликулов яичников на ранних стадиях развития, а также установку системы культуры in vitro, которая может поддерживать рост и дифференциацию до полностью выращенной стадии.

Abstract

Ограниченный резерв зрелых, удобренных яйцеклеток представляет собой основной барьер для успеха вспомогательной репродукции у млекопитающих. Учитывая, что в период репродуктивной жизни только около 1% яйцеклеток в яичниках зрелых и овуляции, несколько методов были разработаны для увеличения эксплуатации яичников резерва для растущей популяции неовуляторных фолликулов. Такие технологии позволили проведить сохранение плодородия, программы отбора скота и сохранения исчезающих видов. Тем не менее, огромный потенциал резерва яичников по-прежнему в значительной степени неэксплуатируются. У коров, например, предпринимались некоторые попытки поддержать культуру экстракорпорального использования яйцеклеток на конкретных стадиях развития, однако эффективные и надежные протоколы еще не разработаны. Здесь мы описываем культурную систему, которая воспроизводит физиологические условия соответствующей фолликулярной стадии, определяемой для развития в пробирке растущих яйцеклеток, собранных из ранних антральных фолликулов крупного рогатого скота на полностью выращенную стадию, соответствующую среднему антральную фолликулу in vivo. Сочетание гормонов и ингибитора фосфодиэстеразы 3 было использовано для предотвращения несвоевременного мейотического возобновления и для руководства дифференциацией яйцеклеток.

Introduction

Во время репродуктивной жизни, только минимальная доля яйцеклеток, которые присутствуют в яичнике зрелые, высвобождаются в фаллопиевых труб после овуляции, и доступны для оплодотворения и развиваться в жизнеспособный эмбрион1. С другой стороны, большинство яйцеклеток в яичнике проходят атрезию и никогда не овуляции. Технологии производства эмбрионов in vitro (IVP) пытались увеличить эксплуатацию резерва яичников2,,3. До сих пор такие технологии позволяли мероприятия по сохранению плодородия, программам отбора скота и сохранению исчезающих видов. Тем не менее, большинство протоколов использовать яйцеклетки, которые в основном завершили фазу роста в антрал яичников фолликула, и, следовательно, называются полностью выращенных яйцеклеток. В крупного рогатого скота, где технологии IVP широко используются, полностью выращенные яйцеклетки достигают конечного диаметра около 120 мкм и собираются из фолликулов, которые охватывают от 2 до 8 мм в диаметре (средние антрал фолликулы)1. После изоляции от фолликулов такие яйцеклетки созревают и оплодотворяются в пробирке. Зиготы затем культурны до стадии бластоцист и либо переданы получателю или криоконсервированы. У крупного рогатого скота, как и у многих других видов, несмотря на потенциал, предлагаемый IVP, количество эмбриона в пробирке на корову в значительной степени не улучшась в течение последних 40 лет. Отчасти это связано с ограниченным числом полностью выращенных яйцеклеток, которые населяют яичник в данный момент времени, которые могут быть извлечены и подвергнуты стандартным методам IVP4,,5,,6.

Ооциты, заключенные в ранние антрал фолликулы, т.е. те фолликулы диаметром менее 2 мм, представляют собой потенциальный источник, который будет использоваться впрограммах сохранения плодородия 7, так как яичник примерно содержит в 10 раз больше ранних антрал-фолликулов, чем среднийантрал 8. Тем не менее, эти яйцеклетки все еще находятся в фазе роста и еще не достигли полностью выращенной стадии9. Таким образом, они по-прежнему транскрипционно активны, производя mRNAs, которые будут храниться для более поздних шагов развития, и еще не прошли весь процесс дифференциации, необходимые для придать яйцеклетки с возможностью спонтанного возобновления и завершения мейоза я когда-то изолированы от фолликулярногоотсека 10,11. Поэтому они не могут быть непосредственно представлены к стандартным протоколам созревания in vitro (IVM), но они требуют дополнительного периода культуры, который позволил бы им завершить фазу роста и правильно дифференцировать.

Переход от выращивания к полностью выращенной стадии, которая у крупного рогатого скота происходит, когда фолликул развивается от ранней антраля к средней антральную стадию, является одним из важнейших шагов во время развития яйцеклеток. В крупного рогатого скота, несколько исследований пытались повторить эти события впробирке2,12,,13,,14,,15,,16,,17,,18,19. Однако до настоящего времени никаких надежных протоколов не разрабатывалось, и сообщалось лишь об ограниченном успехе. Согласно предыдущим исследованиям20, эти растущие яйцеклетки представляют собой однородную популяцию. Помимо транскрипционной активной, их хроматин рассеивается в зародышевой везикуле (GV), в конфигурации, которая называется GV02,21. И наоборот, популяция полностью выращенных яйцеклеток, полученных из средних антрал фолликулов, является более неоднородной, состояние, которое отражается в различных степенях уплотнения хроматина (GV1, GV2 и GV3), которыеможно наблюдать 20. Среди них, предыдущие данные показали, что GV2 и GV3 ооцитов в целом характеризуется лучшим качеством и более высокойэмбриональной компетенции развития 20,21,22,23,24.

Начиная с вышеуказанных наблюдений, здесь мы описываем 5-дней культурную систему ооцитов (L-IVCO), которая позволяет дифференцировать ооциты, изолированные как кумулятиво-ооцитные комплексы (COCs) от ранних антралальных фолликулов. Эта стратегия культуры развивалась из 10 лет исследований, проведенных в нашей лаборатории и корни его землю на ранее разработанных 24-48 часов в пробирке ооцитов культуры (IVCO)2,недоношенных систем 23,25 и цинк добавок во время культуры яйцеклеток . Использовалась комбинация фолликулостимулирующего гормона (ФФГ) и ингибитора фосфодиэстеразы-3 (PDE3), способного усилить кумулятивно-ооцитнуюсвязь 2, предотвратитьнесвоевременное межиоптическое возобновление 2,атакже поддержать рост яйцеклеток 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Яичники были собраны от 4 до 8 лет Гольштейн молочных коров, восстановленных на местной скотобойне (INALCA S.p.A., Ospedaletto Lodigiano, LO, IT 2270M CE, Италия).

1. Подготовка средств массовой информации

ПРИМЕЧАНИЕ: Все средства массовой информации должны быть подготовлены по крайней мере за четыре часа до использования. Бикарбонат натрия буферизированных средств массовой информации инкубируются при 38,5 градусов по Цельсию и 5% CO2 в воздухе, максимальная влажность. В термостатической печи средства массовой информации с буфером HEPES поддерживаются при температуре 38,5 градусов по Цельсию.

  1. Длинная культура пробирки яйцеклеток (L-IVCO) среды
    1. Подготовка 15 мл базовой среды культуры (M199-B): Дополнение M199 с 2 мМ глутамин, 0,4% жирных кислот свободной бычьей сыворотки альбумин (BSA), 0,2 м натрия пируват, 25 мМ натрия бикарбонат, 0,1 мМ цистимин, 21,3 мкг/мл фенола красного, 75 мкг/мл канамицина и 4% поливинилпирролидон (PVP; 360 к молекулярному весу).
    2. Приготовьте 3 мл среды холдинга (M199-H): К M199-B добавьте 5 мкм цилостамида и вылейте его в чашку Петри диаметром 35 мм.
    3. Подготовка L-IVCO среды (M199-L): Дополнение M199-B с 0,15 мкг / мл сульфата, 10-4 МЕ / МЛ ФФГ, 10 нг / мл эстрадиола, 50 нг / мл тестостерона, 50 нг / мл прогестерона и 5 МК Цилостамид.
    4. Поместите 200 мкл среды M199-L в каждом колодец из 96 хорошо покрытием пластины. Заполните колодцы в четырех краях пластины стерильной культурной водой, чтобы компенсировать испарение и поддерживать соответствующую влажность во время культуры.
    5. Инкубировать пластину 96 хорошо и M199-H среды в инкубаторе при 38,5 градусов по Цельсию и 5% CO2 в воздухе, максимальная влажность.
  2. Среда вскрытия
    1. Подготовка среды вскрытия (M199-D): Дополнение M199 с 0,4% BSA фракции V, 0,164 мМ пенициллин, 0,048 мМ стрептомицин, 1790 единиц / L гепарин. M199-D может быть подготовлен оптом, распределяется в 20 мл aliquots и хранится при 4 кк в течение 6 месяцев. При необходимости, тепло и дополнить 1 aliquot.
    2. Приготовьте 20 мл M199-D, дополненный 5 цилостамидом (M199-D цилостамид).

2. Сбор и обработка яичников

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры проводятся при комнатной температуре (26 градусов по Цельсию), если не указано иное.

  1. Восстановление яичников на скотобойне от коров.
  2. Поместите яичники в стерильный солевой раствор (NaCl, 9 г/л) при 26 - 28 градусах Цельсия, добавленных пенициллином 100 U/mL и стрептомицином 0,1 мг/мл.
  3. Транспорт органов в лабораторию в теплом стерильном солинии в пределах 4 ч.
  4. Вымойте яичники 4x в стерильном солевом растворе, поддерживаемом при 26 градусах Цельсия.
  5. Удалите все средние и большие антрал фолликулы, аспирируя все фолликулы диаметром более 2 мм с помощью иглы диаметром 18 Г, подключенной к аспирированному насосу с вакуумным давлением, установленным на уровне -28 мм рт. ст., и поместите аспирированные яичники в стакан со стерильным солевым раствором при 26 градусах Цельсия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление содержимого фолликулов 2 мм является критическим шагом, чтобы удалить как можно больше источника полностью выращенных яйцеклеток, которые бы "загрязнять" эксперимент.
  6. Под горизонтальным капотом ламинарного потока поместите один яичник в то время на стерильную полиэтиленовую разделольную доску. С помощью хирургического лезвия No 22, установленного на скальпеле, вырезать ломтики коры яичников (внешняя часть яичника, которая содержит фолликулы), толщиной 1,5 - 2 мм и параллельно основной оси органа.
  7. Поместите ломтики коры яичников в стерильную стеклянную чашку Петри, покрытую препаравной средой, на теплую тарелку при 38,5 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне все процедуры выполняются при 38,5 градусов по Цельсию с помощью теплой пластины.

3. Отбор и изоляция фолликулов и извлечение COCs

  1. Поместите один ломтик коры яичников в 60 мм стеклянную чашку Петри с 2-3 мл M199-D.
  2. Используя рассечение микроскопа, выберите фолликулы между 0,5 - 2 мм с помощью микрометра оборудованных окуляр.
  3. Определите здоровые, неатретические фолликулы под стереомикроскопом. Оцените атрезию фолликула, наблюдая морфологические параметры, такие как очень ясный полупрозрачный вид, с темным COC внутри. Отбросьте атретические фолликулы и обработать все остальные.
  4. С помощью хирургического лезвия No 22, установленного на ручке скальпеля, удаляют ткани яичников, окружающие фолликул с одной стороны, пока фолликул не будет выставлен на одном краю.
  5. Используя иглу 26G, установленную на шприце, тщательно сделайте щель в открытой стенке фолликула. Это действие выпустит фолликулярное содержание, состоящее из КОК, фолликулярной жидкости и скоплений клеток.
  6. Определите COC под микроскопом и изучить на целостность cumulus, zona pellucida целостности и однородности цитоплазмы. Если эти критерии будут выполнены, аспирировать COC с помощью P20 пипетки.
  7. Поместите изолированный COC в M199-D цилостамида.
  8. Продолжить процедуру изоляции в течение 30 минут.

4. Отбор КОК, подлежащих культуре in vitro

  1. Под микроскопом вскрытия выберите здоровые COC на основе критериев в шаге 3.6.
  2. В 60 мм чашке Петри, подготовить 16 капель 20 МКЛ M199-D цилостамида и место один здоровый КОК на каплю (Рисунок 1A).
  3. С помощью перевернутого микроскопа, прикрепленного к камере, измеряет диаметр яйцеклетки, исключая зону pellucida, используя программное обеспечение, предоставляемое камерой.
  4. С четкой визуализацией яйцеклетки, сделать два перпендикулярных измерений, исключая zona pellucida (Рисунок 1B).
  5. Убедитесь, что среднее измерение двух яйцеклеток, за исключением зоны pellucida, находится в пределах 100 - 110 мкм. Откажитесь от COC с не округлыми ооцитами или ооцитами, которые не измеримы.
  6. Передача выбранных COCs в 35 мм блюдо, содержащее M199-H среднего и держать их в инкубаторе при 38,5 градусов по Цельсию и 5% CO2 в воздухе, максимальная влажность до шага 5,1.
  7. Повторите шаги 3 и 4 до 4x. Общее рабочее время не должно превышать 2 ч.

5. Длинная культура пробирки яйцеклеток (L-IVCO)

  1. Передача одного COC на колодец в центре хорошо 96 пластины, которые будут подготовлены в шаге 1.1.5.
  2. Инкубировать пластину в течение 5 дней при 38,5 градусов по Цельсию и 5% CO2 в воздухе, максимальная влажность.
  3. Каждый день (день 2 и день 4) подготовить свежие M199-L, как описано в шаге 1.
  4. Обновив половину среды, удалив 100 л среды и заменив 100 л свежеприготовленного M199-L. Выполните среднее обновление под стереомикроскопом и избегайте перемещения COCs в колодец.

6. Классификация COC после культуры

  1. В конце L-IVCO проанализируйте морфологию COCs под микроскопом вскрытия.
  2. Классифицировать, как по изображено на рисунке 2.
    1. Классифицировать как класс 1, если COCs показать компактный кучевые клетки инвестиций без признаков расширения cumulus и дегенерации клеток.
    2. Классифицировать как класс 2, если COCs показать компактный cumulus ячейки инвестиций без признаков расширения cumulus и дегенерации клеток и с antrum-как образование в кучевые массы.
    3. Классифицировать как класс 3, если COCs показывают несколько слоев кучевых клеток без признаков расширения cumulus и некоторые дезагрегированные клетки во внешнем слое кучевых клеток и не antrum-как образование.
    4. Классифицировать как класс 4, если COCs показывает обильные потери кучевых клеток, простирающихся на более чем 50% поверхности яйцеклеток, и признаки дегенерации клеток и клеточного мусора.

7. Оценка мейотической прогрессии после культуры

  1. Денудация яйцеклеток яйцеклеток ооцитов
    1. Поместите каждый КОК в один колодец из четырех хорошо пластины, содержащей 400 МКЛ 199D на колодец.
    2. Под микроскопом вскрытия аккуратно удалите кучевые клетки механически, повторив пипетку, установленную на уровне 130-140 МКЛ.
    3. После того, как яйцеклетки свободны от кумулятивных инвестиций, перенесите их в другой колодец, содержащий 199D.
    4. Повторите процесс до тех пор, пока все яйцеклетки полностью оголикнул.
  2. Ооциты ядерного окрашивания
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отныне все процедуры выполняются при комнатной температуре. Реагенты находятся при комнатной температуре.
    1. Зафиксировать яйцеклетки в параформальдегиде 4% в фосфатной буферной солевой растворе (PBS) в течение 1 ч.
      ВНИМАНИЕ: Носите средства индивидуальной защиты при обработке параформальдегида и утилизируете загрязненные материалы в соответствии с руководящими принципами удаления опасных отходов.
    2. Вымойте яйцеклетки 3x в течение 5 мин каждый в PBS, содержащий 1% поливинилалкохол (PVA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы могут быть обработаны сразу или храниться при 4 кк в течение максимум одной недели.
    3. Поместите яйцеклетки в PBS, содержащие 0,1% Тритон X в течение 10 мин.
    4. Вымойте яйцеклетки 3x в течение 5 мин каждый в PBS, содержащий 1% PVA.
    5. Поместите ооциты сингулярно в капли 5 МКЛ антифадной среды, дополненной 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) дилактатом (1 мкг/мл) над горкой.
    6. Поместите две полосы двусторонний ленты вдоль длинных сторон слайда, чтобы избежать чрезмерного уплощения яйцеклеток при вводе крышки скольжения на вершине.
    7. Поместите крышку скольжения на вершине, сделать его придерживаться ленты и держать в темноте при обработке всех образцов.
    8. Проанализируйте ооциты с помощью обычного микроскопа эпифлюоресценции, оснащенного фильтрами DAPI (Возбуждение/Выброс: 358⁄461) для оценки мейотической прогрессии яйцеклеток.
    9. Классифицировать яйцеклетки в соответствии с их мейотической прогрессии: GV - яйцеклетки с разной степенью конденсации хроматина в GV; МИ – яйцеклетки от GV, разбиваемые на метафазу I; и вырожденных - яйцеклетки, которые не могут быть определены как на любом из предыдущих этапов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

В конце L-IVCO, валовая морфология COCs изменилась и 4 класса были определены на основе внешнего вида кучевых клеток, как показано на рисунке 2. Основываясь на морфологических критериев, обычнопринятых для выбора здоровыхCOCs 11,26,27, класс 1, 2 и 3 были признаны здоровыми, в то время как класс 4, который показал явные признаки дегенерации, такие как отсутствие полных слоев кучевых клеток, окружающих ооциты, были признаны серьезно скомпрометированы и непригодны для прохождения процедур ниже по течению в перспективных IVP настройки. В целом, было проанализировано 74 яйцеклетки в 5 биологических репликациях, из которых 9,45% были в классе 4 и были отброшены от дальнейшей оценки.

Как показано на рисунке 3 и рисунке 4,оценка мейотической стадии в конце L-IVCO показала, что значительно более высокий процент яйцеклеток (78,57 ± 4,43%) по-прежнему арестован на незрелой стадии, с хроматин по-прежнему заключены в GV (поэтому, также называют GV этапе), без вырождения. Среди них 59,43% были в конфигурации GV2/3. Небольшой процент возобновил мейоз, достигнув стадии метафазы I (13,76 ± 5,85%) или дегенеративных (7,67 ± 4,61%). Всего было проанализировано 67 яйцеклеток в 5 биологических репликациях. В общей сложности эти данные свидетельствуют о том, что культура L-IVCO поддерживает жизнеспособность яйцеклеток, предотвращая при этом межиотические возобновления в течение 5 дней.

Figure 1
Рисунок 1: Контур блюда, используемого для измерения диаметра яйцеклетки и репрезентативного изображения COC. (A)Схематическое представление 60-мм чашки Петри с 16 каплями по 20 МКЛ M199-D, каждая из которых содержит один КОК. (B)Репрезентативное изображение COC с оси, используемой для измерения диаметра. Обратите внимание, что zona pellucida не включена. Масштабная планка 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения COCs во время сбора и после L-IVCO. (A, B, C, D) Верхний ряд (Коллекция) представляет COCs во время поиска. (A', B', C', D') Тот же COC изображен 5 дней спустя, в конце L-IVCO и классифицируется как сообщается в шаге 6.1. Нижний ряд (5 дней) представляет собой COCs классифицируется как: Класс 1, показывая компактный кумулятивных клеток инвестиций без признаков расширения и дегенерации клеток (A'); Класс 2, показывающий компактный кумуляций инвестиций клеток без признаков расширения и дегенерации клеток и с antrum-как образование (стрелки) в кучевые массы (B'); Класс 3, показывающий несколько слоев кучевых клеток без признаков расширения кумулятива и некоторые дезагрегированные клетки во внешнем слое кучевых клеток (C'); Класс 4, показывая обильные потери кучевых клеток на более чем 50% поверхности яйцеклеток и признаки дегенерации клеток и клеточного мусора (D'). Масштабная планка 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Репрезентативные изображения мейотической прогрессии. Верхний ряд (окрашивание ДНК) показывает ДНК (синий) репрезентативных яйцеклеток на этапе (A) GV0 и(B) GV2-как конфигурация, ( C )MIэтапе и (D) выродились ооцитов,() во время сбора и (B, C, D) после 5 дней L-IVCO. Нижний ряд является соответствующим изображением в ярком поле яйцеклетки в верхнем ряду. Стрелка указывает на GV. Масштабная планка 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Mэйотической прогрессии яйцеклеток в конце культуры. График бара представляет распределение яйцеклеток на стадии GV и MI и вырожденных яйцеклеток в конце L-IVCO. Яйцеклетки, ранее классифицированные в классе 4, были исключены. Данные были проанализированы 1-путь ANOVA следуют Несколько тест сравнения Tukey и значения являются ± SEM (N-5; Пя lt;0.05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем культурную систему выращивания яйцеклеток, которая способствует развитию яйцеклеток в течение 5 дней, поддерживая их жизнеспособность и предотвращая мейотические возобновления. Этот последний аспект имеет первостепенное значение, чтобы обеспечить дальнейший рост и дифференциацию, необходимые для присвоить яйцеклетки с мейотическойи эмбриональной компетенцииразвития 2,20, которые в противном случае были бы заблокированы преждевременное возобновление мейотического деления.

При разработке этой системы культуры, мы приняли во внимание несколько характеристик физиологического роста и дифференциации, что происходит в фолликуле. В этом разделе мы предоставляем обзор основных аспектов, которые мы рассмотрели при разработке этой стратегии.

Во-первых, выращивание яйцеклеток в бычьих ранних антальных фолликулах занимает около 5 дней, чтобы пройти переход от растущей к полностью выращенной стадии in vivo8,19. Таким образом, продолжительность культуры была увеличена до 5 дней, в отличие от предыдущих попыток, сделанных в нашей лаборатории, где яйцеклетки были отговорки до 24 ч2.

Другим фактором, который мы включили в L-IVCO была повышенная вязкость среды, в которой COCs культуры, чтобы имитировать физиологическую вязкость фолликулярной жидкости. Это было воссоздано путем добавления 4% PVP и, вместе с использованием коллагена я покрытием поверхности культуры, он способствовал формированию 3D, как культура, как сообщалось в предыдущихисследованиях 13.

Cilostamide, ингибитор PDE3, был добавлен для поддержания ооцитов meiotically арестован на стадии GV, предотвращая преждевременное межотические возобновления путем поддержания высокого уровня циклических нуклеотидов в ооцитов2,19,25,28,29. Наши результаты показывают, что 5-дневное лечение цилостамидом не оказывает валового влияния на здоровье COCs, так как только небольшая часть комплексов выродилась, также в согласии с результатами, полученными Алам и др.19.

Включение сульфата, и его концентрация, подтверждается недавними результатами, показывающими, что этот микроэлемент играет определенную роль в поддержке дифференциации и транскрипционные деятельности бычьих растущих яйцеклеток вкультуре 30.

Наконец, сочетание гормонов было введено, чтобы тесно имитировать физиологической гормональной среды, характерной для раннегоантального фолликула 31,32,33. Например, эстрадиол имеет известные виды деятельности вподдержке роста яйцеклеток 16,17,19 и связей между гранулозаклеток 17, а также содействие приобретению мейотической компетенции34. Аналогичным образом, тестостерон, помимо того, что предшественник эстрадиола, также стимулирует фолликулярный рости развитие 35, в то время как прогестерон был в основном добавлен для его антиапоптотическойактивности 36.

Важно и в согласии с нашим предыдущимисследованием 2, концентрация ФФУ была сохранена в концентрации, которая является физиологической для фазы роста. Действительно, низкая концентрация ХХГ способствует развитию яйцеклеток путем поддержания разрыва соединения опосредовательной связи между яйцеклетки и сопутствующих кучевых клеток и способствует транскрипционные активности и дифференциации яйцеклеток, не вызывая межотическойвозобновления 2.

По нашему опыту, одним из ключей к успеху L-IVCO является выбор однородной популяции здоровых COCs, поступающих из ранних антрал-фолликулов. Согласно данным, собранным в литературе, 80% яйцеклеток, собранных из ранних антрал фолликулов, характеризуются хроматином, организованным в конфигурации под термином GV020. Эта однородность представляет собой преимущество для культуры in vitro, так как в принципе она гарантирует, что клетки будут вести себя аналогичным образом при воздействии культурной среды. С этим в виду, COCs сбор должен быть выполнен, пытаясь свести к минимуму "загрязнение" с COCs исходя из менее или более поздних стадиях дифференциации. Однако, в связи с тем, что обработка корковых срезов довольно трудоемкая и должна осуществляться в относительно короткое время, этап сбора/выбора, вероятно, представляет собой наиболее критический проход L-IVCO. Для достижения этой цели, некоторые ключевые соображения должны быть борода в виду.

Например, исследователь/техник должен быть обучен распознавать и отбрасывать фолликулы с признаками фолликулярной атрезии. На данном этапе, только морфологические параметры могут быть использованы для распознавания атретических фолликулов, таких как очень ясный полупрозрачный вид, и наличие темного COC внутри. Все остальные фолликулы, в которых нельзя четко различить атретические знаки, должны быть открыты и дальнейший отбор на основе морфологии изолированных COCs должны быть проведены длявыявления здоровых 2,3,37,38,39. Это достигается снова морфологических наблюдений, таких как наличие по крайней мере четырех слоев кучевых клеток, грубо сферической формы, нетронутой oolemma и однородной и мелко гранулированной ооплазмы11,26,27.

Изоляция и манипуляции с КОК представляют собой дополнительную техническую проблему, которая требует квалифицированного персонала и надлежащего оборудования для микросектации под стереомикроскопом и точного определения диаметра яйцеклеток. Этот последний шаг имеет важное значение для выбора равномерной популяции яйцеклеток, таким образом, исключая любой возможный источник загрязнения COCs из других фолликулярных стадиях. По этой причине важно убедиться, что яйцеклетки, заключенные в извлеченные COCs имеют диаметр от 100 до 110мкм 2,40.

Помимо поддержки жизнеспособности яйцеклеток и предотвращения мейотического возобновления, L-IVCO способствовал переходу хроматиновой конфигурации из GV0 в постепенно более сгущенные GV2 и GV3 в 59% яйцеклеток. Примечательно, хроматин конденсации в GV является маркером "прибыль" мейотических и развития компетенции в основном все млекопитающих ооцитов изучены досих пор 20. Этот результат очень многообещающий, особенно по сравнению с нашей предыдущей 24-часовой системой IVCO. В этом исследовании, высшая степень уплотнения хроматина в GV не были достигнуты и 22% яйцеклеток были найдены с конфигурацией GV1 2 ,этап, связанныйс полной мейотической компетенции, но все еще скудные компетенцииразвития 20. Даже в этих условиях некомпетентные растущие яйцеклетки смогли созреть и произвести эмбрионы, хотя и в ограниченном количестве. Последовательное увеличение этапов GV2/3, наблюдаемое в L-IVCO, совместимо с более высоким потенциалом для производства жизнеспособных эмбрионов. Мы находимся в процессе тестирования этой гипотезы экспериментально, представив COCs, полученных из L-IVCO на следующие шаги IVP (в пробирке созревания, оплодотворения и эмбриона культуры до стадии бластоцист). Если это подтвердится, L-IVCO развяжет некоторые из еще неиспользованный потенциал резерва яичников, с важными последствиями для нескольких областей, представляющих интерес для сохранения женской фертильности. Например, это увеличит источник оплодотворенных готей, которые будут использоваться в программах сохранения высокой генетической заслуги селекционеров. Еще одно приложение, которое мы предвидим, для генетического спасения находящихся под угрозой исчезновения видов семьи bovid, а также местных пород, которые находятся под угрозой исчезновения или риску генетической эрозии из-за широкого распространения космополитии пород. И последнее, но не менее важное, L-IVCO представляет собой инструмент для всех ученых, которые заинтересованы в вскрытии клеточных и молекулярных процессов, которые регулируют формирование компетентного gamete.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторов нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Регион Ломбардия PSR INNOVA N.201801061529 и UNIMI n.PSR 2019_DIP_027_ALUCI_01

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-well dishes Nunclon 179830
96-well dish Becton Dickinson Biosciences 356649 BioCoat™ Collagen I
Bovine Serum Albumin (Fatty acid free) Sigma A8806
Bovine Serum Albumin (Fraction V) Sigma A3311
Cell culture water Sigma W3500
Cilostamide Sigma C7971
Cysteamine Sigma M9768
Digital camera Nikon Corp Camera DS-5M
Disodium phosphate Sigma S5136
Estradiol Sigma E2758
Glutamax Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061
Gonal F Merck Serono
Heparin Sigma H3149
HEPES Sigma H3784
Vacuum pump Cook-IVF KMAR-5100
Incubator Sanyo
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma K1377
Medium 199 Sigma M3769 Powder for bicarbonate-buffered media
Medium 199 Sigma M2520 Powder for HEPES-buffered media
Microscope Nikon Corp Nikon Diaphot
Microscope Nikon Corp Eclipse E 600
Monopotassium phosphate Sigma P5655
Paraformaldehyde Sigma 158127
Penicilin Sigma P3032
Phenol Red Sigma P5530
Polyvinyl alcohol Sigma P8137
Polyvinylpyrrolidone Sigma P5288 360k molecular weight
Potassium chloride Sigma P5405
Progesterone Sigma P8783
Sodium bicarbonate Sigma S5761
Sodium choride Sigma P5886
Sodium pyruvate Sigma P4562
Streptomycin Sigma S9137
Testosterone Sigma 86500
Triton X Sigma T9284
Vectashield with DAPI Vector Laboratories H1200
Water Sigma W3500
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Z0251

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lonergan, P., Fair, T. Maturation of Oocytes in Vitro. Annual Review of Animal Biosciences. 4, 255-268 (2016).
  2. Luciano, A. M., Franciosi, F., Modina, S. C., Lodde, V. Gap junction-mediated communications regulate chromatin remodeling during bovine oocyte growth and differentiation through cAMP-dependent mechanism(s). Biology of Reproduction. 85 (6), 1252-1259 (2011).
  3. McLaughlin, M., Telfer, E. E. Oocyte development in bovine primordial follicles is promoted by activin and FSH within a two-step serum-free culture system. Reproduction. 139 (6), 971-978 (2010).
  4. Galli, C. Achievements and unmet promises of assisted reproduction technologies in large animals: a per-sonal perspective. Animal Reproduction. 14 (3), 614-621 (2017).
  5. Luciano, A. M., Sirard, M. A. Successful in vitro maturation of oocytes: a matter of follicular differentiation. Biology of Reproduction. 98 (2), 162-169 (2018).
  6. Lonergan, P., Fair, T. In vitro-produced bovine embryos: dealing with the warts. Theriogenology. 69 (1), 17-22 (2008).
  7. Clement, M. D. F., Dalbies-Tran, R., Estienne, A., Fabre, S., Mansanet, C., Monget, P. The ovarian reserve of primordial follicles and the dynamic reserve of antral growing follicles: what is the link. Biology of Reproduction. 90 (4), 85 (2014).
  8. Lussier, J. G., Matton, P., Dufour, J. J. Growth rates of follicles in the ovary of the cow. Journal of Reproduction and Fertility. 81 (2), 301-307 (1987).
  9. Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M. Oocyte ultrastructure in bovine primordial to early tertiary follicles. Anatomy and Embryology (Berlin). 195 (4), 327-336 (1997).
  10. Pavlok, A., Lucas-Hahn, A., Niemann, H. Fertilization and developmental competence of bovine oocytes derived from different categories of antral follicles. Molecular Reproduction and Development. 31 (1), 63-67 (1992).
  11. Blondin, P., Sirard, M. A. Oocyte and follicular morphology as determining characteristics for developmental competence in bovine oocytes. Molecular Reproduction and Development. 41 (1), 54-62 (1995).
  12. Harada, M., et al. Bovine oocytes from early antral follicles grow to meiotic competence in vitro: effect of FSH and hypoxanthine. Theriogenology. 48 (5), 743-755 (1997).
  13. Hirao, Y., et al. In vitro growth and development of bovine oocyte-granulosa cell complexes on the flat substratum: effects of high polyvinylpyrrolidone concentration in culture medium. Biology of Reproduction. 70 (1), 83-91 (2004).
  14. Alm, H., Katska-Ksiazkiewicz, L., Rynska, B., Tuchscherer, A. Survival and meiotic competence of bovine oocytes originating from early antral ovarian follicles. Theriogenology. 65 (7), 1422-1434 (2006).
  15. Taketsuru, H., et al. Bovine oocytes in secondary follicles grow in medium containing bovine plasma after vitrification. Journal of Reproduction and Development. 57 (1), 99-106 (2011).
  16. Endo, M., et al. Estradiol supports in vitro development of bovine early antral follicles. Reproduction. 145 (1), 85-96 (2013).
  17. Makita, M., Miyano, T. Steroid hormones promote bovine oocyte growth and connection with granulosa cells. Theriogenology. 82 (4), 605-612 (2014).
  18. Yamamoto, K., et al. Development to live young from bovine small oocytes after growth, maturation and fertilization in vitro. Theriogenology. 52 (1), 81-89 (1999).
  19. Alam, M. H., Lee, J., Miyano, T. Inhibition of PDE3A sustains meiotic arrest and gap junction of bovine growing oocytes in in vitro growth culture. Theriogenology. 118, 110-118 (2018).
  20. Lodde, V., Modina, S., Galbusera, C., Franciosi, F., Luciano, A. M. Large-scale chromatin remodeling in germinal vesicle bovine oocytes: interplay with gap junction functionality and developmental competence. Molecular Reproduction and Development. 74 (6), 740-749 (2007).
  21. Lodde, V., et al. Oocyte morphology and transcriptional silencing in relation to chromatin remodeling during the final phases of bovine oocyte growth. Molecular Reproduction and Development. 75 (5), 915-924 (2008).
  22. Dieci, C., et al. Differences in cumulus cell gene expression indicate the benefit of a pre-maturation step to improve in-vitro bovine embryo production. Molecular Human Reproduction. 22 (12), 882-897 (2016).
  23. Soares, A. C. S., et al. Steroid hormones interact with natriuretic peptide C to delay nuclear maturation, to maintain oocyte-cumulus communication and to improve the quality of in vitro-produced embryos in cattle. Reproduction, Fertililty and Development. 29 (11), 2217-2224 (2017).
  24. Soares, A. C. S., et al. Characterization and control of oocyte large-scale chromatin configuration in different cattle breeds. Theriogenology. 141, 146-152 (2020).
  25. Franciosi, F., et al. Natriuretic peptide precursor C delays meiotic resumption and sustains gap junction-mediated communication in bovine cumulus-enclosed oocytes. Biology of Reproduction. 91 (3), 61 (2014).
  26. Luciano, A. M., et al. Effect of different levels of intracellular cAMP on the in vitro maturation of cattle oocytes and their subsequent development following in vitro fertilization. Molecular Reproduction and Development. 54 (1), 86-91 (1999).
  27. Bilodeau-Goeseels, S., Panich, P. Effects of oocyte quality on development and transcriptional activity in early bovine embryos. Animal Reproduction Science. 71 (3-4), 143-155 (2002).
  28. Dieci, C., et al. The effect of cilostamide on gap junction communication dynamics, chromatin remodeling, and competence acquisition in pig oocytes following parthenogenetic activation and nuclear transfer. Biology of Reproduction. 89 (3), 68 (2013).
  29. Shu, Y. M., et al. Effects of cilostamide and forskolin on the meiotic resumption and embryonic development of immature human oocytes. Human Reproduction. 23 (3), 504-513 (2008).
  30. Lodde, V., et al. Zinc supports transcription and improves meiotic competence of growing bovine oocytes. Reproduction. 159 (6), 679-691 (2020).
  31. Henderson, K. M., McNeilly, A. S., Swanston, I. A. Gonadotrophin and steroid concentrations in bovine follicular fluid and their relationship to follicle size. Journal of Reproduction and Fertility. 65 (2), 467-473 (1982).
  32. Kruip, T. A., Dieleman, S. J. Steroid hormone concentrations in the fluid of bovine follicles relative to size, quality and stage of the oestrus cycle. Theriogenology. 24 (4), 395-408 (1985).
  33. Sakaguchi, K., et al. Relationships between the antral follicle count, steroidogenesis, and secretion of follicle-stimulating hormone and anti-Mullerian hormone during follicular growth in cattle. Reproductive Biology and Endocrinology. 17 (1), 88 (2019).
  34. Makita, M., Miyano, T. Androgens promote the acquisition of maturation competence in bovine oocytes. Journal of Reproduction and Development. 61 (3), 211-217 (2015).
  35. Walters, K. A., Allan, C. M., Handelsman, D. J. Androgen actions and the ovary. Biology of Reproduction. 78 (3), 380-389 (2008).
  36. Luciano, A. M., Pappalardo, A., Ray, C., Peluso, J. J. Epidermal growth factor inhibits large granulosa cell apoptosis by stimulating progesterone synthesis and regulating the distribution of intracellular free calcium. Biology of Reproduction. 51 (4), 646-654 (1994).
  37. Gordon, I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd edn. , CABI Publishing. (2003).
  38. Telfer, E. E., McLaughlin, M., Ding, C., Thong, K. J. A two-step serum-free culture system supports development of human oocytes from primordial follicles in the presence of activin. Human Reproduction. 23 (5), 1151-1158 (2008).
  39. McLaughlin, M., Albertini, D. F., Wallace, W. H. B., Anderson, R. A., Telfer, E. E. Metaphase II oocytes from human unilaminar follicles grown in a multi-step culture system. Molecular Human Reproduction. 24 (3), 135-142 (2018).
  40. Fair, T., Hyttel, P., Greve, T. Bovine oocyte diameter in relation to maturational competence and transcriptional activity. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 437-442 (1995).

Tags

Биология развития Выпуск 161 Растущие яйцеклетки ранние антрал фолликулы дифференциация яйцеклеток изоляция яйцеклеток бык фолликулеза в пробирке резерв яичников сохранение плодовитости атрезия выработка эмбриона in vitro IVP фолликулостимулирующего гормона ФСГ
In Vitro Культурная стратегия для Oocytes от раннего антрального фолликула в крупного рогатого скота
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barros, R. G., Lodde, V., Franciosi, … More

Barros, R. G., Lodde, V., Franciosi, F., Luciano, A. M. In Vitro Culture Strategy for Oocytes from Early Antral Follicle in Cattle. J. Vis. Exp. (161), e61625, doi:10.3791/61625 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter