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Neuroscience

डीवाईटी/पार्क-एटीपी1ए3 डिस्टोनिया के लिए एक लक्षण, औषधीय माउस मॉडल स्थापित करने के लिए ऑस्मोटिक पंपों का प्रत्यारोपण और तनाव का प्रेरण

Published: September 12, 2020 doi: 10.3791/61635
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Neurology, University Hospital of Würzburg

Summary

हम एक फार्माकोलॉजिकल DYT/पार्क-ATP1A3 डिस्टोनिया माउस मॉडल को बेसल गैंगलिया और सेरिबैलम में कैनुलास के प्रत्यारोपण के माध्यम से उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जो ऑस्मोटिक पंपों से जुड़ा हुआ है । हम एक मोटर चैलेंज के आवेदन और व्यवहार स्कोरिंग सिस्टम के माध्यम से फेनोटाइप के लक्षण वर्णन के माध्यम से डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के शामिल होने का वर्णन करते हैं।

Abstract

आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल सीमाओं का सामना करते हैं, खासकर जब आंदोलन विकारों का अध्ययन करते हैं, जहां अधिकांश उपलब्ध ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल मानव रोग के नैदानिक पहलुओं जैसी मोटर फेनोटाइप पेश नहीं करते हैं। औषधीय माउस मॉडल रोगविज्ञान के अधिक प्रत्यक्ष अध्ययन और व्यवहार फेनोटाइप पर उनके प्रभाव की अनुमति देते हैं। मस्तिष्क कैनुलास से जुड़े ओस्मोटिक पंप स्थानीय और पुरानी दवा वितरण के माध्यम से औषधीय माउस मॉडल बनाने की संभावना को खोलते हैं। तेजी से शुरू होने वाले डिस्टोनिया-पार्किंसंस के वंशानुगत आंदोलन विकार के लिए, एनए +/K+-ATPaseके α3-सबयूनिट में नुकसान-समारोह उत्परिवर्तन ग्लाइकोसाइड ouabain के माध्यम से एक अत्यधिक विशिष्ट नाकाबंदी द्वारा नकली किया जा सकता है ।+ बेसल गंगलिया और सेरिबैलम में α3-उपइकाइकन को स्थानीय रूप से अवरुद्ध करने के लिए, जो दो मस्तिष्क संरचनाएं हैं जो तेजी से शुरू होने वाले डिस्टोनिया-पार्किंसंस के रोगजनन में भारी रूप से शामिल हैं, एक द्विपक्षीय कैनुला को स्टेरियोटैक्सिक रूप से स्ट्राइटम में प्रत्यारोपित किया जाता है और एक अतिरिक्त एकल कैनुला को सेरिबलम में पेश किया जाता है। कैनुलास विनाइल ट्यूबिंग के माध्यम से दो ऑस्मोटिक पंपों से जुड़े होते हैं, जिन्हें जानवरों की पीठ पर चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जाता है और आउबाइन की पुरानी और सटीक डिलीवरी के लिए अनुमति देते हैं। तेजी से शुरू होने वाले डिस्टोनिया-पार्किंसंस के लिए औषधीय माउस मॉडल स्पर्शोन्मुख और रोगसूचक उत्परिवर्तन वाहकों की नैदानिक और रोग सुविधाओं को पुनः रीकैपिटल करने का अतिरिक्त लाभ वहन करता है। तेजी से शुरुआत डिस्टोनिया पार्किंसंसिज्म के उत्परिवर्तन वाहकों की तरह, आउबाइन-परफ्यूस्ड चूहे तनाव के अतिरिक्त जोखिम के बाद ही डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का विकास करते हैं। हम एक हल्के तनाव प्रतिमान प्रदर्शित करते हैं और मोटर फेनोटाइप के मूल्यांकन के लिए दो संशोधित स्कोरिंग सिस्टम पेश करते हैं।

Introduction

मस्तिष्क में सीधे एक निरंतर दवा वितरण के फायदे कई हैं। दोहराव और लगातार इंजेक्शन, जो जानवरों के लिए एक अनावश्यक तनाव कारक का प्रतिनिधित्व करते हैं, से बचा जा सकता है और दवा की अधिक स्थिर इंट्रासर्ब्रल एकाग्रता प्राप्त की जा सकती है। यह विशेष रूप से मान्य है जब व्यवस्थित रूप से प्रशासित दवाएं आसानी से रक्त मस्तिष्क बाधा में प्रवेश करने में विफल हो जाती हैं। इसके अलावा, ऑस्मोटिक पंपों के माध्यम से पुरानी दवा वितरण सब्सट्रेट्स के स्थानीयकृत वितरण के लिए अनुमति देता है जो अन्यथा सिस्टम-वाइड दुष्प्रभाव होंगे। दवाओं को वांछित मस्तिष्क संरचनाओं में लक्षित तरीके से वितरित किया जा सकता है, परिणामस्वरूप प्रभाव को सीधे पता लगाया जा सकता है। इसका उपयोग अनुप्रयोगों की एक सरणी के लिए किया जा सकता है, जैसे चिकित्सीय प्रभावों का अध्ययन और साथ ही रोगविज्ञान का अध्ययन। डिस्टोनिया के लिए एक औषधीय माउस मॉडल बनाने के लिए यहां परियोजना में इस अंतिम आवेदन का उपयोग किया गया था।

डिस्टोनिक सिंड्रोम का विश्लेषण और समझ, जो तीसरे सबसे आम आंदोलन विकार का प्रतिनिधित्व करता है, इस तथ्य से भारी सीमित रहा है कि आनुवंशिक पशु मॉडल रोगग्रस्त मानव के साथ-साथ रोगविज्ञान में पाए जाने वाले रोग फेनोटाइप को पुन: पेश करने में विफल रहते हैं। यह मुद्दा डिस्टोनिक सिंड्रोम तक ही सीमित नहीं है, लेकिन वास्तव में आंदोलन विकारों के क्षेत्र में कई ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडल से संबंधित है1,,2। ट्रांसजेनिक कृंतक मॉडलों में फेनोटाइप की कमी का कारण अत्यधिक प्रभावी प्रतिपूरक तंत्र पर आधारित हो सकता है3. डिस्टोनिया के मामले में, बीमारी अनैच्छिक मांसपेशियों के संकुचन की विशेषता है जिससे घुमावदार आंदोलन और असामान्य मुद्राएं4होती हैं। डिस्टोनिक लक्षणों के माध्यमिक कारणों (यानी, मस्तिष्क की चोट) के अध्ययन ने इन मोटर असामान्यताओं की अभिव्यक्ति में शामिल संरचनाओं की पहचान करने में मदद की है, जैसे बेसल गैंगलिया5। डिस्टोनिया के वंशानुगत रूपों के ब्रेन इमेजिंग अध्ययनों में मोटर नियंत्रण और संवेदी एकीकरण6,7के लिए उत्तरदायी लगभग सभी मस्तिष्क क्षेत्रों में कार्यात्मक असामान्यताएं दिखाई गई हैं । हालांकि, कृंतक मॉडल अभी भी आणविक और बड़े पैमाने पर नेटवर्क स्तर पर तंत्रिका रोगों की समझ को गहरा करने के साथ-साथ चिकित्सीय विकल्पों के विकास के लिए आवश्यक हैं। यह वह जगह है जहां औषधीय माउस मॉडल एक बीमारी के नैदानिक और रोग सुविधाओं को अधिक सटीक तरीके से दोहराने की संभावना प्रदान करते हैं।

रैपिड-शुरुआत डिस्टोनिया-पार्किंसंसवाद (DYT/PARK-ATP1A3; आरडीपी; DYT12) डिस्टोनिया के वंशानुगत रूपों में से एक है। यह ATP1α3 जीन में नुकसान-समारोह म्यूटेशन के कारण होता है, जो एनए+ /K+-ATPase8के α3-subunit के लिए एन्कोड करता है ।+ इसके अलावा, यह माना जाता है कि जीन उत्परिवर्तन वाहक एक तनावपूर्ण घटना के संपर्क में आने के बाद लगातार सामान्यीकृत डिस्टोनिया और पार्किंसंस विकसित करने से पहले वर्षों तक लक्षणों से मुक्त हो सकते हैं। दरअसल, DYT/PARK-ATP1A3 की पेनेट्रेनेस अधूरी और तनावपूर्ण घटनाएं हैं जो शारीरिक अधिक परिश्रम और अत्यधिक तापमान से लेकर शराब और संक्रमण9,,10के अधिक उपभोग तक एक ट्रिगर के रूप में कार्य कर रही हैं । DYT/पार्क-ATP1A3 का अध्ययन करने और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप खोजने के लिए, कृंतक मॉडलों में तनाव पर निर्भर रोग विकास की नकल करने के लिए कई बार कोशिश की गई है । हालांकि, एक मौजूदा आनुवंशिक DYT/PARK-ATP1A3 माउस मॉडल के अलावा, जहां क्षणिक असामान्य और आक्षेप की तरह आंदोलनों हाइपोथर्मिया द्वारा प्रेरित किया गया, DYT के लिए सभी प्रकाशित आनुवंशिक माउस मॉडल/पार्क-ATP1A3 को डिस्एंट्रोनिक लक्षण1, 11,,,12का उत्पादन करने में विफल रहे हैं। 11 Calderon एट अल पहले प्रदर्शन किया है कि बेसल ganglia और जंगली प्रकार चूहों में कार्डियक ग्लाइकोसाइड ouabain के माध्यम से सेरिबैलम में द्विपक्षीय α3-उपयूनिट अवरुद्ध हल्के चाल अशांति13में परिणाम है । एक गर्म वातावरण में बिजली के पैर के झटके के लिए अतिरिक्त जोखिम एक डिस्स्टोनिक और ब्रैडीकाइनेटिक फेनोटाइप के नेतृत्व में, इस प्रकार प्रदर्शन है कि पुरानी और ouabain के लक्षित परफ्यूजन तनाव के बाद सफलतापूर्वक DYT की नकल/

हालांकि, दो घंटे की अवधि में 38-40 डिग्री सेल्सियस के गर्म वातावरण में जानवरों को बिजली के पैर के झटके से उजागर करना जानवरों में दर्द और चिंता को प्रेरित करता है, जो विशेष रूप से डिस्टोनिया के विकास से संबंधित कैटेकोलामाइन प्रणाली में परिवर्तन के आकलन के लिए भ्रामक कारकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। इस प्रकार, हम यहां उच्च अनुवाद मूल्य के साथ एक अलग तरह के तनाव प्रतिमान का वर्णन करते हैं, जो इस तथ्य से संबंधित है कि हल्के से मध्यम व्यायाम को DYT/PARK-ATP1A3 रोगियों में ट्रिगर के रूप में वर्णित किया गया है9। इसके अलावा, दोहराव व्यायाम फोकल डिस्टोनिया14के लिए एक प्रसिद्ध ट्रिगर है । चूहों को बार-बार चुनौतीपूर्ण मोटर कार्यों के अधीन किया गया था जिसमें लकड़ी के ध्रुव ("ध्रुव परीक्षण") के तीन उतरते हैं और रोटरोद उपकरण ("रोटारोड प्रदर्शन परीक्षण") पर तीन रन शामिल हैं। 50 सेमी लकड़ी के पोल के शीर्ष पर जानवरों की नियुक्ति जानवरों को नीचे उतरने के लिए मजबूर करने के लिए उपयोग की जाती थी, रोतारोड उपकरण चूहों को घूर्णन रॉड पर रखकर जबरन गतिविधि के अधीन करने के लिए नियोजित किया गया था।

डिस्टोनिया के लिए माउस मॉडल के मोटर फेनोटाइप का लक्षण वर्णन पूर्वनिर्धारित परीक्षणों और स्कोर की कमी के कारण विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है। हालांकि, कृंतक13, 15, 16,15,16में डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों की गंभीरता और वितरण का मूल्यांकन करने के लिए पिछले वर्षों में मोटर विकलांगता मूल्यांकन के एक भिन्नता का बार-बार उपयोग किया गया है। हम यहां डिस्टोनिया रेटिंग स्केल का एक संशोधित संस्करण प्रस्तुत करते हैं, जो चार मिनट की समय अवधि में मनाए जाने पर जानवरों के डिस्टोनिया जैसे फेनोटाइप का मूल्यांकन करने में प्रभावी साबित हुआ । डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का आकलन करने की दूसरी विधि के रूप में, हम पूंछ निलंबन परीक्षण के दौरान असामान्य आंदोलनों के आकलन के लिए एक नव-विकसित स्कोरिंग प्रणाली पेश करते हैं। यह आगे के अंगों, हिंडिंबों के साथ-साथ ट्रंक की आवृत्ति और अवधि की अनुमति देता है।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं को पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए लागू अंतरराष्ट्रीय, राष्ट्रीय और/या संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था । जर्मनी के रेजियरुंग वॉन अनटरफ्रैंकेन, वुर्ज़बर्ग में स्थानीय अधिकारियों ने सभी पशु प्रयोगों को मंजूरी दी।

1. ऑस्मोटिक पंपों की भड़काना

नोट: यह कदम सर्जरी से पहले कम से ४८ घंटे प्रदर्शन किया जाना है । ALZET ऑस्मोटिक पंपों को यह सुनिश्चित करने के लिए पूर्वतने जाने की आवश्यकता है कि पंपिंग दर प्रत्यारोपण से पहले स्थिर स्थिति तक पहुंचे।

  1. पुरानी परफ्यूजन के लिए वांछित समाधान पहले से तैयार करें। सुनिश्चित करें कि विलायक और एजेंट ऑस्मोटिक पंप और कैथेटर के साथ संगत हैं। यहां परियोजना के लिए, कमरे के तापमान और 10 एस के लिए भंवर पर ouabain (-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत) के एक 10x स्टॉक समाधान गल ।
    सावधानी: Ouabain विषाक्त है: इसे केवल दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए और साँस लेना से बचने के लिए केवल बाँझ हुड के नीचे खोला जाना चाहिए।
  2. बाँझ हुड चालू करें; हुड के साथ-साथ सभी उपकरणों और सामग्री को हुड के नीचे रखने से पहले आवश्यक सभी उपकरणों और सामग्री को कीटाणुरहित करें।
  3. ऑस्मोटिक पंपों को संभालने से पहले सर्जिकल दस्ताने पर रखो। स्ट्राइटम और सेरिबैलम के पंपों के लिए नामित आउबिन-समाधान को अलग से तैयार करें।
    नोट: विचार करें कि स्ट्रिकम के लिए पंप में समाधान की एकाग्रता को सेरिबैलम के लिए नामित पंप में समाधान की एकाग्रता की तुलना में दोगुना किया जाना चाहिए। यह इस तथ्य के कारण है कि स्ट्राटम के लिए पंप डबल कैनुला से जुड़ा हुआ है, प्रवाह दर, हालांकि, सेरिबैलम के पंप के समान है, जो एक कैनुला से जुड़ा हुआ है।
  4. निम्नलिखित सूत्र का उपयोग करके आवश्यक समाधान की मात्रा की गणना करें:
    बड़े पैमाने पर वितरण दर (ko)= मात्रा वितरण दर (क्यू) वाहन में एजेंट की एक्स एकाग्रता (सीडी)
    वर्तमान परियोजना के लिए, ओस्मोटिक पंपों को प्राइमेड किया गया था और नियंत्रण समूह के लिए ११.२ एनजी/एच या ०.९% खारा की एकाग्रता पर या तो ouabain समाधान से भरा गया था ।
  5. भंवर दोनों 10 एस और बाँझ फिल्टर के लिए ouabain समाधान (यानी, 0.22 माइक्रोन सिरिंज-अंत फिल्टर) उन्हें अलग, नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में, प्रत्येक समाधान के लिए एक अलग फिल्टर का उपयोग कर।
  6. प्रवाह मॉडरेटर (लगभग 0.4 ग्राम) के साथ खाली ऑस्मोटिक पंपों का वजन करें।
  7. बाँझ फ़िल्टर किए गए आउबाइन-समाधान या वाहन समाधान के साथ 27 जी भरने वाले कैनुला (अधिमानतः कुंद टिप के साथ) के साथ 1 एमएल सिरिंज भरें।
  8. सिरिंज से बाहर सभी हवा बुलबुले जाओ, एक ईमानदार स्थिति में ओस्मोटिक पंप पकड़ो, कैनुला पंप में सभी तरह डालें और धीरे-धीरे जलाशय को भरने जब तक अतिरिक्त समाधान शीर्ष पर दिखाई देता है (तेजी से भरने से बचें क्योंकि इससे पंप में हवा के बुलबुले हो सकते हैं)। इसके बाद, पंप में प्रवाह मॉडरेटर डालें (अतिरिक्त समाधान शीर्ष पर दिखाई देना चाहिए)।
  9. प्रवाह मॉडरेटर को बाहर खींचें (लगभग 5 मिमी), ध्यान से सफेद फ्लैंज को कैंची से उतारें और प्रवाह मॉडरेटर से विनाइल ट्यूबिंग के एक टुकड़े को कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि कैथेटर की लंबाई लगभग 2 सेमी है ताकि जानवर की उचित गतिशीलता की अनुमति दी जा सके।
  10. भरे हुए ऑस्मोटिक पंप को एक बार फिर तौलें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि भरे हुए और खाली पंप के बीच वजन में अंतर भरे हुए समाधान के अपेक्षित वजन के साथ सामंजस्य है।
    नोट: अधिकांश जलीय समाधानों के लिए यह वजन माइक्रोलीटर में मात्रा के बराबर है। यदि वजन अपेक्षित मात्रा के अनुरूप नहीं है, तो हवा पंप के अंदर फंस सकती है, जिसे खाली करने और फिर से भरे जाने की आवश्यकता होती है।
  11. पंपों के प्राइमिंग के लिए दो 2 एमएल माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब, स्ट्राटम के लिए एक ट्यूब और सेरिबैलम के लिए एक तैयार करें ।
  12. 0.9% खारा समाधान के साथ आधे रास्ते से भरे माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में पंपों को जलमग्न करें। कैथेटर के खुले छोर को न डूबें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए एक थर्मोसाइकिलर में माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखो ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि पंप प्रत्यारोपण से पहले एक स्थिर पंपिंग दर तक पहुंच गया है और कैथेटर पूर्व भर रहे हैं।

2. कैनुला और ऑस्मोटिक पंप प्रत्यारोपण

  1. माउस (पुरुष, C57Bl/6N, 11-12 सप्ताह की उम्र) को साँस लेने के संज्ञाहरण के लिए डिज़ाइन किए गए कक्ष में रखें; आइसोफ्लुन की प्रवाह दर को 2-3% और ऑक्सीजन की प्रवाह दर को 2 एल/मिनट तक सेट करें ।
  2. अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज्ड करने के बाद, जानवर के सिर, पृष्ठीय गर्दन और पीठ के समीपस्थ तीसरे के शीर्ष को दाढ़ी दें।
  3. जानवर को एक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में रखें और स्टीरियोटैक्टिक इंस्ट्रूमेंट (आइसोफ्लारेन फ्लो रेट 1.5-2%, 2 एल/मिन ऑक्सीजन) के लिए डिजाइन किए गए माउस एनेस्थीसिया मास्क के माध्यम से आइसोफ्लारेन के साथ संज्ञाहरण जारी रखें।
  4. रबर युक्तियों या गैर-टूटना कान सलाखों का उपयोग करना, स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम में जानवर के सिर को ठीक करें, ध्यान रखें कि सिर को समतल किया गया है।
  5. हाइपोथर्मिया को रोकने के लिए, जानवर के नीचे एक हीटिंग पैड रखें, गुदा तापमान जांच डालें और तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें। प्रत्येक आंख पर नेत्र मरहम की एक बूंद का उपयोग करके जानवर की आंखों को सूखने से बचाएं।
  6. सर्जरी शुरू करने से पहले एक एनाल्जेसिक, जैसे कार्प्रोफेन (5 मिलीग्राम/किलो बॉडीवेट) को कम से कम करें।
  7. एक सिरिंज के साथ चमड़े के साथ 0.2 मिलील तक बुपिवाकेन 0.25% तक इंजेक्ट करें और स्थानीय संज्ञाहरण के प्रभावी होने के लिए 30 एस का इंतजार करें।
  8. मुंडा क्षेत्रों को एंटीसेप्टिक के साथ अच्छी तरह से कीटाणुरहित करें, जैसे ऑक्टेनिडीन डाइहाइड्रोक्लोराइड।
  9. सर्जिकल क्षेत्र की पूरी तरह से कीटाणुशोधन के बाद, सिर के शीर्ष पर एक चीरा लगाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें और सामने के अंगों के नीचे चीरा जारी रखने के लिए कैंची का उपयोग करें। बुलडॉग क्लैंप की मदद से खोपड़ी का पर्दाफाश करें और एक बाँझ कपास-इत्तला देने वाले एप्लिकेटर के साथ पेरिओस्टेम को मिटा दें।
  10. या तो एक कलम या ब्रेग्मा के साथ काली स्याही में दाग कैनुला की नोक संरेखित करें और खोपड़ी पर मस्तिष्क कैनुलास के लिए तीन प्रवेश बिंदुओं को चिह्नित करने के लिए उपयुक्त निर्देशांक का उपयोग करें (बेसल गैंगलिया के परफ्यूजन के लिए आवश्यक द्विपक्षीय छेद के लिए निर्देशांक: पूर्वकाल/पीछे: + 0.74 मिमी, मध्यान्ह/पार्श्व: +/-१.५० मिमी (+ दाईं ओर का संकेत है,-ब्रेग्मा के सापेक्ष बाईं ओर); सेरिबैलम के मिडलाइन पर छेद के लिए निर्देशांक: पूर्वकाल/पीछे:-६.९० मिमी) । इसके बाद, बेसल गैंगलिया के लिए नामित डबल कैनुला और सेरिबैलम(चित्रा 1A)के लिए नामित एकल कैनुला के लिए छेद को सावधानीपूर्वक ड्रिल करें।
  11. स्ट्राटम और सेरिबैलम के बीच में एक छोटे से पेंच के लिए एक चौथा छेद ड्रिल करें। यह पेंच अंततः दंत सीमेंट में एम्बेडेड हो जाएगा और कैनुलास के लिए अतिरिक्त पकड़ प्रदान करेगा। ठीक संदंश और एक पेंच चालक का उपयोग करना, ध्यान से छोटे छेद में पेंच परिचय जब तक यह दृढ़ता से खोपड़ी में तय हो गया है । पेंच को बहुत गहराई से प्रत्यारोपित न करें क्योंकि इससे मस्तिष्क के ऊतकों को नुकसान पहुंचता है।
    नोट: ऑस्मोटिक कैनुलास डालने से पहले ऑस्मोटिक पंप प्रत्यारोपण जारी रखने की सिफारिश की जाती है। इससे पंप प्रत्यारोपित करते समय कैनुलाल को कोई आकस्मिक क्षति होने से बचा जाता है।
  12. जानवरों के प्रत्येक पक्ष पर ऑस्मोटिक पंप के लिए एक छोटी सी जेब बनाने के लिए, चमड़े के नीचे ऊतक परतों को अलग करने के लिए ऊतक संदंश का उपयोग करें। एक हिंद पैर की ओर संदंश को आगे बढ़ाएं और चमड़े के नीचे की जेब को चौड़ा करने के लिए संदंश को थोड़ा खोलें। दूसरे पक्ष के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएं, पहले चीरा से संदंश को हटाएं और फिर उन्हें धीरे से दूसरे हिंद पैर की ओर धकेलें।
    नोट: जेब पंप में आसानी से स्लाइड करने के लिए अनुमति देनी चाहिए, हालांकि, यह त्वचा के नीचे स्थानांतरित करने के लिए बहुत ज्यादा जगह नहीं होनी चाहिए ।
  13. ऊतक संदंश की मदद से ट्यूबिंग के जुड़े टुकड़े के साथ पहले पंप को एक साथ लेते हैं और इसे एक चमड़े के नीचे की जेब में स्लाइड करते हैं। दूसरे पंप के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएं।
  14. एक मिनीपंप धारक का उपयोग करके, सेरिबैलम के मिडलाइन में ड्रिल किए गए छेद में 3.0 मिमी की कस्टम लंबाई के साथ एक एकल ऑस्मोटिक कैनुला पेश करें। कैनुला हेड को ध्यान से अलग करें और कैनुला के साथ-साथ दंत सीमेंट के साथ छोटे पेंच को ठीक करें, इस बात का ध्यान रखें कि ऑस्मोटिक पंप के ट्यूबिंग के लिए कनेक्टिंग पीस को कवर न करें। सुनिश्चित करें कि कैनुला के आसपास के दंत सीमेंट सर्जरी के साथ जारी रखने से पहले पूरी तरह से सूख गया है।
  15. बेसल गैंगलिया के ऊपर द्विपक्षीय रूप से ड्रिल किए गए छेद में 3.0 मिमी और कस्टम-निर्मित लंबाई 4.0 मिमी की केंद्र-से-केंद्र दूरी के साथ डबल कैनुला डालने से पहले, डबल कैनुला के दो कनेक्टिंग टुकड़ों में विनाइल ट्यूबिंग (0.5 सेमी) के दो छोटे टुकड़े संलग्न करें। विनाइल ट्यूबिंग को एक विभाज्य अनुकूलन के साथ कनेक्ट करें और ओओबिन समाधान या वाहन (कमरे का तापमान, बाँझ पहले से फ़िल्टर किए गए) के साथ एडाप्टर और कैनुला सहित पूरे ट्यूबिंग सिस्टम को सावधानीपूर्वक प्रीफिल करें। यह एक 1 एमएल सिरिंज और एक 27 जी भरने कैनुला विभाजन एडाप्टर(चित्रा 1B)के एकल रियर अंत में पेश के साथ सबसे अच्छा किया जा सकता है ।
  16. एक मिनीपंप धारक का उपयोग करना, ध्यान से द्विपक्षीय छेद में डबल कैनुला डालें। कैनुला हेड को अलग करने और डेंटल सीमेंट के साथ डबल कैनुला को ठीक करने के लिए क्लैंप का इस्तेमाल करें।
  17. ऑस्मोटिक पंपों के कैथेटर को क्रमशः विभाजन एडाप्टर के साथ-साथ एकल कैनुला से कनेक्ट करें। सुनिश्चित करें कि कैथेटर कैनुलास के कनेक्टिंग टुकड़ों पर एक मजबूत पकड़ है।
    नोट: दोनों पंपों में समान प्रवाह दर है, इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि एक ही एकाग्रता बेसल गैंगलिया और सेरिबैलम दोनों तक पहुंचता है, विभाजन एडाप्टर के दोहरे केंद्रित समाधान के साथ ऑमोटिक पंप को जोड़ने के लिए सावधान रहें।
  18. खोपड़ी की दिशा में जहां तक संभव हो टांके के साथ जानवरों की पीठ पर चीरा बंद करें, सावधान किया जा रहा है त्वचा(चित्रा 1C)अधिक फैलाव नहीं है ।
  19. चूहों के निर्जलीकरण से बचने के लिए, ध्यान से पंपों से बचने के लिए, जानवरों के पीछे के प्रत्येक तरफ त्वचा गुना में, 0.9% खारा के 0.5 एमएल इंजेक्ट करें, जिसमें शरीर का तापमान होना चाहिए।

3. मोटर चैलेंज

  1. विषय ouabain-या वाहन-perfused चूहों हल्के तनाव जोखिम के एक फार्म के रूप में मोटर कार्यों को चुनौती देने के लिए 4 घंटे के बाद सर्जरी और दोहराव हर 24 घंटे बाद में डिस्टोनिया की तरह आंदोलनों को प्रेरित करने के लिए । इसमें व्यवहार चरित्र चित्रण शामिल नहीं है; इसका उद्देश्य सामान्य पिंजरे कीपिंग की तुलना में उच्च तनाव स्तर को प्रेरित करना है।
  2. माउस को 50 सेमी रफ-सामने, लकड़ी के पोल पर 1 सेमी व्यास के साथ रखें, नाक नीचे की ओर आ रही है। सुनिश्चित करें कि ध्रुव गिरने के मामले में पर्याप्त बिस्तर के साथ एक बड़े पिंजरे में रखा गया है। वंश के समय को मापना आवश्यक नहीं है, लेकिन ध्रुव उतरते समय आउबाइन-perfused जानवरों द्वारा प्रस्तुत सामने के अंगों और हिंडलिंब के अनैच्छिक हाइपरएक्सटेंड्सन के लिए देखें। चूहों को तीन बार ध्रुव उतरना चाहिए और उतरता है के बीच वसूली के 2 मिनट की अनुमति देते हैं ।
    नोट: Ouabain-perfused चूहों ब्रैडीकिनेसिया 4 एच पोस्ट सर्जरी की तरह पहले लक्षण पेश करना चाहिए । हालांकि, सर्जरी के बाद 24 घंटे चूहों को उतरना के दौरान डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के संकेत के रूप में सामने के अंगों और हिंडलिंब के अनैच्छिक हाइपरएक्सटेंस को पेश करना शुरू कर देना चाहिए।
  3. दूसरे मोटर कार्य के लिए, घूर्णन रॉड पर चूहों को रखें जैसा कि रोटारोड प्रदर्शन परीक्षण के लिए किया जाता है। रोटारोड उपकरण को गिरने के लिए विलंबता के उपाय के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है, इसका उद्देश्य चूहों को मजबूर गतिविधि के अधीन करना है। चूहों को तीन बार घूर्णन रॉड पर रखें और परीक्षणों के बीच 2 मिनट की वसूली की अनुमति दें।
    नोट: तनाव जोखिम बढ़ाने के लिए, एक तेज रोटारोड उपकरण का उपयोग करें। यहां वर्णित परियोजना के लिए, रॉड 300 सेकंड की एक निर्धारित समय अवधि में 5 से 50 आरपीएम तक तेज होती है।
  4. जानवरों को ध्रुव परीक्षण और रोटारोड प्रदर्शन परीक्षण के बीच में 30 मिनट के लिए ठीक होने दें और प्रोटोकॉल चरण 4 के तहत वर्णित डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के लिए स्कोरिंग से पहले एक और 30 मिनट। दोहराव तनाव एक्सपोजर के बीच में, चूहों को 24 एच-अंतराल के लिए ठीक होने की अनुमति देते हैं।

4. डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के आकलन के लिए स्कोरिंग सिस्टम

नोट: प्रयोगकर्ता को पूर्वाग्रह को रोकने के लिए विश्लेषण किए गए समूह असाइनमेंट से अंधा किया जाना चाहिए। चूहों के फेनोटाइप की विशेषता के लिए उपयोग किए जाने वाले व्यवहार परीक्षण दो स्कोरिंग सिस्टम हैं: एक डिस्टोनिया रेटिंग स्केल स्कोरिंग असामान्य, डिस्टोनिया जैसे आंदोलन और पूंछ निलंबन परीक्षण का उपयोग करके एक व्यवहार स्कोर। हल्के तनाव के संपर्क में आने के बाद 30 मिनट की वसूली के समय के बाद डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का आकलन करें।

  1. डिस्टोनिया रेटिंग स्केल
    नोट: पूर्वनिर्धारित व्यवहार कार्यों की कमी के कारण, डिस्टोनिया रेटिंग स्केल को मानव डिस्टोनिया के नैदानिक रेटिंग तराजू के समान पर्यवेक्षक-आधारित स्कोरिंग प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया था। यह काल्डेरॉन एट अल द्वारा उपयोग किए जाने वाले डिस्टोनिया रेटिंग स्केल का एक संशोधित संस्करणहै।
    1. रिकॉर्ड मुद्रा और जानवरों के बाद 4 मिनट की अवधि में जानवरों की चाल एक प्लास्टिक या लकड़ी के बक्से में रखा गया है ।
    2. 0 से 4 अंक तक डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों की आवृत्ति और वितरण के लिए स्कोर: (0) सामान्य मोटर व्यवहार; (1) असामान्य मोटर व्यवहार, कोई डिस्टोनिया जैसी गतिविधियां; (2) हल्के फोकल डिस्टोनिया जैसी गतिविधियों के साथ हल्के मोटर हानि; (3) गंभीर फोकल डिस्टोनिया जैसी गतिविधियों के साथ मध्यम मोटर हानि; (4) गंभीर हानि, निरंतर, सामान्यीकृत डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों(चित्रा 2) केसाथ । निम्नलिखित आंदोलनों या मुद्राओं को डिस्टोनिया-जैसे विचार करें: सामने के अंगों का हाइपरएक्सटेंशन, हिंडलिम्ब के साथ-साथ किफोसिस का व्यापक रुख या हाइपरएक्सटेंशन। यदि शरीर का एक भी हिस्सा प्रभावित होता है और ट्रंक और शरीर के कम से कम दो अन्य अंगों को प्रभावित करने के मामले में सामान्यीकृत होने की स्थिति में डिस्टोनिया को फोकल के रूप में विचार करें।
  2. टेल सस्पेंशन टेस्ट
    नोट: पूंछ निलंबन परीक्षण अक्सर हिंडलिब क्लैपिंग के लिए निरीक्षण और स्कोर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि यह एक अत्यधिक अविशिष्ट फेनोटाइप है जो मोटर हानि का संकेत देता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल में डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के लिए विशिष्ट स्कोरिंग प्रणाली का प्रस्ताव है। DYT/PARK-ATP1A3 रोगियों में डिस्टोनिया के सामान्यीकरण के कारण, डिस्कोनिया जैसी गतिविधियों का आकलन सामने के अंगों, ट्रंक और हिंडलिंबों में किया जाना चाहिए । 0-8 अंकों से एक नव विकसित स्कोरिंग प्रणाली विकसित की गई थी, कुल स्कोर और एलटी; 2 ने संकेत दिया कि कोई डिस्टोनिया जैसी हरकतें मौजूद नहीं थीं(चित्रा 3)।
    1. माउस को उसके आधार के पास पूंछ से उठाएं और जानवर को ऊपर उठाएं। पूंछ निलंबन परीक्षण का 2 मिनट का वीडियो रिकॉर्ड करें और रिकॉर्डिंग के बाद, गहन विश्लेषण में एक स्कोर असाइन करें।
    2. सामने के अंगों को 0 से 4 अंक तक स्कोर करें, जहां एक या दोनों फ्रंट अंगों के दोहराए गए या निरंतर टॉनिक रिऐक्शन, साथ ही सामने के अंगों को पार करने के साथ संयुक्त हाइपरएक्सटेंशन, डिस्टोनिया-जैसे के रूप में वर्गीकृत किया गया: (0) कोई असामान्य आंदोलन नहीं; (1) पंजे के हाइपरएक्सटेंशन के साथ सामने के अंगों की कम गति को देखा गया । रिकॉर्ड किए गए समय का 50%; (2) सामने के अंग (एस) और लेफ्टिनेंट के हल्के डिस्टोनिया जैसे आंदोलन; रिकॉर्ड किए गए समय का 50%; (3) सामने के अंग (एस) के हल्के डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों में रिकॉर्ड किए गए समय का 50% या गंभीर और एलटी; रिकॉर्ड किए गए समय का 50%; (4) सामने के अंग (एस) के गंभीर डिस्टोनिया जैसे आंदोलन दर्ज किए गए समय का 50% ।
      नोट: हिंडलिब क्लैपिंग एक असामान्य आंदोलन है जिसे डिस्टोनिया की तरह नहीं रन दिया जाना चाहिए।
    3. हिंडलिम्ब्स को 0 से 3 अंक तक स्कोर करें, जहां पीछे के अंगों के पीछे हटने और क्लींचिंग के साथ-साथ निरंतर हाइपरएक्सटेंशन को डिस्टोनिया-जैसे के रूप में आंका गया: (0) कोई असामान्य आंदोलन नहीं; (1) पंजे के हाइपरएक्सटेंशन के साथ हिंडलिम्ब्स की कम आवाजाही रिकॉर्ड किए गए समय का 50% देखा गया; (2) एक हिंडलिब के डिस्टोनिया जैसे आंदोलन; (3) दोनों हिंडलिंबों के डिस्टोनिया जैसे आंदोलन ।
    4. दर्ज समय के 80% ट्रंकल विरूपण और जीटी के मामले में, स्कोर में एक अतिरिक्त बिंदु जोड़ा जाता है।
    5. जानवर को वापस अपने पिंजरे में रखें।

Representative Results

चित्रा 4 को रौशेनबर्जर एट अल17से संशोधित किया गया है । डिस्टोनिया रेटिंग स्केल(ए)और टेल सस्पेंशन टेस्ट(बी)दोनों के डेटा विश्लेषण के लिए, प्रत्येक जानवर के लिए प्रत्येक बार बिंदु के लिए कुल स्कोर की गणना करें। प्रत्येक बार बिंदु और प्रत्येक समूह का मतलब एक उचित ग्राफ पर प्लॉट किया जाना चाहिए। मूल्यों के वितरण की जांच की जानी चाहिए और महत्व निर्धारित करने के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय परीक्षण लागू किया जाना चाहिए । पर्याप्त संख्या में जानवरों के साथ, डिस्टोनिया रेटिंग स्केल के साथ-साथ पूंछ निलंबन परीक्षण में असामान्य आंदोलनों के आकलन के साथ एक मोटर फेनोटाइप का पता लगाया जा सकता है। डाइस्टोनिया की तरह फेनोटाइप को आउबाइन-परफ्यूस्ड, स्ट्रेसस्ड, गैर-तनावग्रस्त चूहों के साथ-साथ नियंत्रण चूहों की तुलना में दोनों आकलन में काफी अधिक मोटर स्कोर द्वारा प्रदर्शित किया जाता है।

Figure 1
चित्रा 1: कैनुला और ऑस्मोटिक पंप प्रत्यारोपण के लिए मुख्य शल्य चिकित्सा कदम। (क)संकेतित निर्देशांक के लिए, बेसल गैंगलिया के लिए नामित दोहरे कैनुला के लिए और सेरिबैलम के मिडलाइन पर रखे गए एकल कैनुला के लिए छेदों को द्विपक्षीय रूप से ड्रिल करने की आवश्यकता है । जानवर के प्रत्येक तरफ दो पूरी तरह से निर्मित ऑस्मोटिक पंप दिखाए गए हैं। (ख)यह तस्वीर डेंटल सीमेंट के साथ तय किए गए सेरिबैलम में एक प्रत्यारोपित, सिंगल कैनुला दिखाती है । बेसल गैंगलिया के लिए डबल कैनुला को विभाजन एडाप्टर से जोड़ा जाना चाहिए और प्रत्यारोपण से पहले आउबिन के साथ पूर्व से भरा जाना चाहिए। (ग)तैयार प्रक्रिया की छवि । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: डिस्टोनिया रेटिंग स्केल के साथ डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का आकलन। एक 4 मिनट के वीडियो के दौरान, शरीर के वितरण और अवधि के आधार पर डिस्टोनिया जैसी हरकतें की गईं । सामने के अंगों का अनैच्छिक हाइपरएक्सटेंशन, हिंडिंब के व्यापक रुख या हाइपरएक्सटेंशन के साथ-साथ किफोसिस को डिस्टोनिया की तरह आंका गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: पूंछ निलंबन परीक्षण के दौरान डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का आकलन। 2 मिनट की पूंछ निलंबन परीक्षण के दौरान असामान्य आंदोलनों के लिए नव-विकसित स्कोरिंग सिस्टम कुल में 0-8 अंकों से सामने के अंगों, हिंडिंब और ट्रंक में डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों का मूल्यांकन करता है। सामने के अंगों के लिए, सामने के अंगों का एक हाइपरएक्सटेंशन और क्रॉसिंग के साथ-साथ ट्रंक की ओर एक टॉनिक फ्लेक्सन डिस्टोनिया जैसे योग्य है। हिंडलंबों के लिए अनैच्छिक हाइपरएक्सटेंशन के साथ-साथ मिडलाइन पर विस्तार के साथ रिऐक्शन को डिस्टोनिया की तरह बनाया गया था। दर्ज समय के 80% से अधिक एक ट्रंकल विरूपण एक बिंदु के साथ रन बनाए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: डिस्टोनिया-रेटिंग स्केल और टेल सस्पेंशन टेस्ट के प्रतिनिधि ग्राफ। (क)ग्राफ में नैसीएल-परफ्यूस्ड, स्ट्रेस्ड चूहों (बिंदीदार काली रेखा), आउबाइन-परफ्यूस्ड, गैर-तनावग्रस्त चूहों (बिंदीदार नारंगी रेखा) और आउबाइन-परफ्यूस्ड, स्ट्रेस्ड चूहों (गहरे नीले रंग की रेखा) के लिए डिस्टोनिया-रेटिंग स्केल को दर्शाया गया है । हर बार बिंदु के लिए, मतलब (एसईएम) के औसत मूल्यों ± मानक त्रुटि को दिखाया जाता है। (ख)आरेख नैसीएल-perfused, तनावग्रस्त चूहों (बिंदीदार काली रेखा), ouabain-perfused, गैर तनावग्रस्त चूहों (बिंदीदार नारंगी रेखा) और ouabain-perfused, तनावग्रस्त चूहों (डार्क ब्लू लाइन) के लिए एक 2 मिनट पूंछ निलंबन परीक्षण के दौरान असामान्य आंदोलनों के आकलन से पता चलता है । सांख्यिकीय विश्लेषण डिस्टोनिया रेटिंग स्केल और पूंछ निलंबन परीक्षण स्कोरिंग के लिए किया गया था दो पूंछ मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग कर । पी-वैल्यूज के बोनफेरोनी-होल्म सुधार (§) ने 72 घंटे की अवलोकन अवधि के लिए एक महत्वपूर्ण अंतर दिखाया। गहरे नीले * ouabain-perfused, जोर दिया चूहों और ouabain-perfused, गैर तनावग्रस्त चूहों चूहों, काले * NaCl-perfused, जोर दिया चूहों और ouabain-perfused के बीच महत्वपूर्ण मतभेदों को दर्शाता है, चूहों पर बल दिया के रूप में के रूप में अच्छी तरह से NaCl-perfused, जोर दिया चूहों और ouabain-perfused, गैर जोर दिया चूहों के बीच महत्वपूर्ण मतभेद । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह DYT/PARK-ATP1A3 औषधीय माउस मॉडल बेसल गंगलिया और सेरिबैलम में सोडियम-पोटेशियम आयन पंप के अवरोध के साथ-साथ तनाव जोखिम से संबंधित परिवर्तनों के द्वारा प्रेरित इंट्रासैरेब्रल संरचनात्मक और न्यूरोकेमिकल परिवर्तनों के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। चूहों के मामले में, अधिकतम दो ऑस्मोटिक पंपों को चमड़े के नीचे प्रत्यारोपित किया जा सकता है। हम यहां एक कैनुला के अलावा एक विभाजन एडाप्टर से जुड़े डबल कैनुला को लागू करके कई मस्तिष्क संरचनाओं के लिए पुरानी दवा वितरण का ब्यौरा देने वाली एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस पद्धति का उपयोग किसी भी आवेदन के लिए किया जा सकता है जिसके लिए कई मस्तिष्क संरचनाओं को एक साथ और लंबे समय तक प्रेरित किया जा सकता है।

हम एक दुर्लभ आंदोलन विकार का एक माउस मॉडल पेश करते हैं, जहां रोगियों को तनाव के संपर्क में आने के बाद स्थायी लक्षण विकसित होते हैं। यह माना जीन पर्यावरण बातचीत अभी भी अच्छी तरह से समझ में नहीं आ रहा है, लेकिन DYT में प्रमुख pathomechanisms में से एक का प्रतिनिधित्व कर सकते है/ चूहों को तनाव से अवगत कराने के विभिन्न तरीके अतीत में प्रकाशित किए गए हैं और इसमें बिजली के पैर के झटके, निरोधक, ठंडा या गर्म वातावरण और विभिन्न गंध11,12,,13के संपर्क में शामिल हैं।, अनुवाद मूल्य के साथ एक हल्के तनाव कारक के लिए चूहों को बेनकाब करने के प्रयास में, हम यहां मोटर कार्यों को चुनौती देने के लिए चूहों के दोहराव वाले अधीनता का वर्णन करते हैं। ध्रुव परीक्षण के लिए, ouabain-perfused जानवरों सामने अंगों और हिंडलिम्ब्स के अनैच्छिक अतिव्यवसंगतता का पता चला । ये आंदोलन जानवरों की 4-मिनट वीडियो रिकॉर्डिंग के साथ-साथ पूंछ निलंबन परीक्षण के दौरान देखे गए डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के समान थे। चुनौतीपूर्ण मोटर कार्यों के रूप में हल्के तनाव का उपयोग मोटर लक्षण या न्यूरोडिजेनरेशन दिखाने वाले अन्य माउस मॉडलों में उपयोगी साबित हो सकता है, जहां जीन-पर्यावरणीय बातचीत बड़े पैमाने पर रोग प्रगति की डिग्री को प्रभावित करती है।

चूहों में असामान्य आंदोलनों और मुद्राओं को वर्गीकृत करने के लिए पूर्वनिर्धारित व्यवहार कार्यों के साथ-साथ रेटिंग तराजू की सामान्य कमी है। अधिकांश उपलब्ध मोटर कार्यों से अविशिष्ट असामान्यताएं प्रकट होती हैं, जैसे कि हिंडलिब क्लैपिंग, जो न्यूरोडिजेनरेशन18, 19,19के साथ आंदोलन विकारों के कई माउस मॉडलों में एक प्रसिद्ध घटना है। फेनोटाइप के उचित लक्षण वर्णन के लिए, हालांकि यह विश्लेषण करना आवश्यक है कि माउस मॉडल बीमारी की मुख्य विशेषताओं को पुनः रीकैपिटुलेट करता है या नहीं। इसके साथ ही, हम डिस्टोनिया माउस मॉडल15,,16में मोटर विकलांगता के आकलन के लिए पहले उपयोग किए जाने वाले डिस्टोनिया रेटिंग स्केल का संशोधित संस्करण प्रस्तुत करते हैं। हमने इसके अतिरिक्त पूंछ निलंबन परीक्षण के लिए एक पर्यवेक्षक-आधारित स्कोरिंग प्रणाली विकसित की है, जिसे मानव डिस्टोनिया के नैदानिक रेटिंग तराजू के समान स्थापित किया गया था। दोनों रेटिंग तराजू ouabain-perfused में एक काफी अधिक स्कोर दिखाने के लिए, ouabain-perfused, गैर तनावग्रस्त जानवरों के साथ ही वाहन perfused जानवरों की तुलना में चूहों पर बल दिया । किसी भी पर्यवेक्षक आधारित स्कोरिंग प्रणाली की कमियां लगातार स्कोरिंग सुनिश्चित करने के लिए और पर्यवेक्षक परिवर्तनशीलता को कम करने के साथ-साथ रेटर के संभावित पूर्वाग्रह के खतरे को कम करने के लिए रेटर्स का आवश्यक प्रशिक्षण है, अगर समूह के विश्लेषण के लिए पूरी तरह से अंधा नहीं है । हालांकि, पर्यवेक्षक आधारित स्कोरिंग सिस्टम अभी भी फेनोटाइप की विशेषता के लिए एक आसानी से सुलभ विधि प्रस्तुत करते हैं और विश्लेषण किए गए माउस मॉडल के अनुकूल हो सकते हैं, जैसा कि डिस्स्टोनिया जैसे आंदोलनों के मूल्यांकन के लिए वर्तमान परियोजना में किया गया है। विभिन्न रेटर्स के बीच लगातार स्कोरिंग सुनिश्चित करने के लिए, प्रशिक्षण वीडियो उपलब्ध कराए जाने चाहिए। किसी भी संभावित पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, यह सिफारिश की जाती है कि विभिन्न रेटर्स एक ही वीडियो क्लिप स्कोर करते हैं और व्यक्तिगत स्कोर औसत होते हैं। इस काम के भीतर उल्लिखित दोनों स्कोरिंग सिस्टम जानवरों में डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों की उपस्थिति दर्ज करते हैं। रेटिंग तराजू को एक परियोजना के भीतर विशिष्ट आवश्यकताओं के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है, जैसा कि पहले आईपी एट अल द्वारा किया गया था, जहां पूरी तरह से हिंडलंब्स को डिस्टोनिया 1 (DYT-TOR1A)20के लिए माउस मॉडल में डिस्टोनिया जैसे आंदोलनों के लिए रन बनाए गए थे। रेटिंग तराजू को अन्य पहले प्रकाशित स्कोरिंग सिस्टम द्वारा पूरित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए कृंतक में ब्रैडीकिनेसिया की डिग्री का आकलन किया जा सकता है जैसा कि काल्डेरॉन एट अल द्वारा लोकोमोशन विकलांगता स्कोर के साथ कियाजाताहै।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को संघीय शिक्षा और अनुसंधान मंत्रालय (बीएमबीएफ डिस्ट्रेक्ट से सीडब्ल्यूआई) और इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्लीनिकल रिसर्च (IZKF) द्वारा Würzburg विश्वविद्यालय (Z2-CSP3 से एलआर) में समर्थित किया गया था। लेखक लुइसा फ्रीस, केली रोह्म, वेरोनिका सेंगर और हेके मेंज़ेल और उनकी तकनीकी सहायता के साथ-साथ पशु देखभाल के लिए हेल्गा ब्रूनर का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% saline Fresenius Kabi PZN06178437
Alzet osmotic pumps Durect 4317 model 1002, flowrate 0.25 μL/h
Anchor Screws AgnTho's MCS1x2 2 mm long with a thread of 1mm O.D.
Bulldog Clamps AgnTho's 13-320-035 straight, 3.5 cm
Bupivacain 0.25% Jenapharm mibe GmbH Arzneimittel
Cannula and Minipump Holder Stoelting Co. 51636 designed to hold 3.4 mm cannula heads
Cannula Bifurcation Plastics One 21Y custom made
Cannula tubing Plastics One C312VT/PKG vinyl, 0.69 mm x 1.14 mm
Dumont #5SF forceps Fine Science Tools 11252-00 fine forceps
eye cream Bepanthen Bayer Vital GmbH
Gas Anesthesia Mask for Stereotaxic, Mouse Stoelting Co. 56109M
Hardened fine scissors Fine Science Tools 14090-09
High Speed Rotary Micromotor Kit Foredom K.1070-2
Isoflurane CP 1 mL/mL, 250 mL cp-pharma 1214 prescription needed
Isoflurane System Dräger Vapor 19.3 Dr. Wilfried Müller GmbH
Kallocryl A/C Speiko 1615 dental cement, liquid
Kallocryl CPGM rot Speiko 1692 dental cement, red powder
Mouse and neonates adaptor Stoelting Co. 51625 adaptor for mice for a traditional U-frame
needle holder KLS Martin Group 20-526-14
Non-Rupture Ear Bars and Rubber Tips f/ Mouse Stereotaxic Stoelting Co. 51649
Octenisept Schülke 118211
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, double Plastics One 3280PD-3.0/SPC 28 Gauge, length 4.0 mm, c/c distance 3.0 mm
Osmotic Pump Connector Cannula for Mice, single Plastics One 3280PM/SPC 28, Gauge, custom length 3.0 mm
Ouabain octahydrate 250 mg Sigma-Aldrich 03125-250MG CAUTION: toxic
Precision balance Kern & Sohn PFB 6000-1
Rectal Thermal Probe Stoelting Co. 50304
Rimadyl 50 mg/mL, injectable Zoetis Carprofen, prescription needed
Rodent Warmer X1 with Mouse Heating Pad Stoelting Co. 53800M
RotaRod Advanced TSE Systems
screw driver set AgnTho's 30090-6
Stainless Steel Burrs AgnTho's HM71009 0.9 mm Ø burr
Stainless Steel Burrs AgnTho's HM71014 1.4 mm Ø burr
StereoDrive Neurostar software
Stereotaxic instrument Stoelting Co. custom made by Neurostar
Stereotaxic robot Neurostar
suture: coated vicryl, polyglatin 910 Ethicon V797D
ThermoMixer C Eppendorf AG 5382000015

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References

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डीवाईटी/पार्क-एटीपी1ए3 डिस्टोनिया के लिए एक लक्षण, औषधीय माउस मॉडल स्थापित करने के लिए ऑस्मोटिक पंपों का प्रत्यारोपण और तनाव का प्रेरण
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