Summary
이 프로토콜은 마이크로 혈관 증식의 전 생체 모델인 초로이드 발아 분석체를 제시합니다. 이 분석체는 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관여하는 경로를 평가하고 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 약물 치료를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
노화와 관련된 황반 변성의 현저한 특징인 병리학적인 천동 혈관신생은 시력 장애와 실명으로 이어집니다. 인체망막 내피 세포(EC) 증식 분석(HRMEC) 또는 분리된 1차 망막 IC를 이용한 증식 분석은 생체외 모델에서 망막 혈관신생을 연구하는 데 널리 사용된다. 그러나, 순수한 뮤린망 내피 세포를 격리하는 것은 기술적으로 도전적이고 망막 EC는 choroidal 내피 세포 및 다른 세포/세포 상호 작용과 다른 증식 반응을 가질 수 있다. 초로이드 미생물 증식의 모델로서 매우 재현 가능한 전 생체 균 발아 분석이 개발되었다. 이 모형은 choroid 혈관분기 (EC, 대식세포, pericytes) 및 망막 안료 상피 (RPE)사이 상호 작용을 포함합니다. 마우스 RPE/choroid/scleral 이병은 성장 인자 감소 기막 추출물(BME)(일 0)에서 분리되고 배양됩니다. 배지는 격일로 변경되고 코로이드 발아는 6일째에 정량화된다. 개별 choroid explant의 이미지는 반전된 상 현미경으로 촬영되고 발아 영역은 이 실험실에서 개발된 ImageJ 소프트웨어에 반자동 매크로 플러그인을 사용하여 정량화됩니다. 이 재현 가능한 ex vivo choroidal 발아 분석은 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 choroidal 마이크로 혈관 증식에 관여하는 경로를 평가하기 위해 잠재적 인 치료 및 마이크로 혈관 질환 연구에 대한 화합물을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
Choroidal 혈관 신생 이소화 조절은 신생 혈관 노화 관련 황반 변성 (AMD)1과관련이 있습니다. choroid는 망막 색소 상피 (RPE) 아래에 존재하는 미세 혈관 침대입니다. 코로이드의 혈류감소는 AMD2의진행과 관련이 있는 것으로 나타났다. 혈관 내피, RPE, 대식세포, 회낭체 및 기타 세포 사이의 복잡한 관계는 조직3,4,5의항상성에 대한 책임이 있다. 따라서, 재현 가능한 분석 모델링 choroidal 마이크로 환경은 neovascular AMD의 연구에 대 한 중요 한.
전 생체 혈관 신생 분석 및 체외 내피 세포 배양은 생체 내 미생물 의 행동, 신약 테스트 및 병인의 연구를 보완 할 수 있습니다. 인간 망막 미생물 내피 세포(HRMEC), 인간 배꼽 정맥 내피 세포(HUVEC), 격리된 원발성 동물 뇌 또는 망막 IC와 같은 내피 세포는 종종 안구 혈관 신생 연구6,7,8을위한 체외 연구에서 사용된다. 특히 HRMEC는 내피증, 이주, 관 형성 및 혈관 누설을 평가하여 체외 외 혈관 신생혈관화(CNV)9의 모델로 널리 사용되어 내정간섭6,10을평가한다. 그러나, 배양에 있는 EC는 choroid에서 찾아낸 그밖 세포 모형과의 상호 작용의 부족 때문에 CNV의 모형으로 제한되고 이 소집에서 이용되는 대부분의 EC는 choroid에서 유래하지 않기 때문에. 마우스 코로이드 EC는 문화권에서 분리하고 유지하기가 어렵습니다.
대동맥 고리 분석은 매크로 혈관 증식의 모델로 널리 사용된다. 대동맥 각출소에서 혈관 새싹은 EC, 백혈구 및대식세포(11)를포함한다. 대동맥 고리 분석모델은 큰 혈관 혈관신생을 잘12,13,14로모델한다. 그러나, 대동맥 고리로서 코로이드 외혈관화의 모델로서 한계가 있어 특징적인 초로이드 미생물 혈관 환경이 결여된 대색조직이며, 큰 혈관으로부터의 새싹은 미생물 병리학에 관여하는 모세관 네트워크로부터 새싹과 다를 수 있다. 최근 그룹은 전 생체 망막 분석15,16을발표했다. 망막 신혈관 질환에 적합하지만 AMD에서 볼 수 있듯이 코로이드 신혈관화에는 적합하지 않습니다.
마우스 RPE, 코로이드 및 경마 성 이식 조직을 이용한 코로이드 발아 분석체는 CNV를 더 잘 모델링하기 위해 개발되었다. 조직은 마우스 (또는 다른 종) 눈(17)로부터쉽게 분리 될 수 있습니다. 이 분석법은 약리학적 화합물의 프로 및 항 혈관 신생 잠재력의 재현 가능한 평가 및 유전자 변형 마우스로부터 조직을 사용하여 코로이드 신생 혈관화에서 특정 경로의 역할의 평가 및 제어18을허용한다. 이 코로이드 발아 분석체는 많은 후속 간행물9,10,18,19,20에서참조되었다. 여기서, 이 분석법의 사용에 관여하는 방법이 입증된다.
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Protocol
설명된 모든 동물 실험은 보스턴 아동 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다 (ARCH 프로토콜 번호 19-04-3913R).
1. 준비
- 페니실린/스트렙토마이신(10000 U/mL)과 5mL 및 10mL의 상용 보충제를 500mL의 완전한 클래식 매체에 추가합니다. Aliquot 50 mL 의 배지 는 처음에.
참고: 오염을 방지하기 위해 배지를 재고로 되돌리지 마십시오. - 얼음에 완전한 클래식 매체의 알리쿼트를 넣습니다.
- 70%의 에탄올을 사용하여 해부하는 현미경, 집게 및 가위를 청소하십시오.
- 2개의 세포 배양 접시 (10cm), 해부 현미경에 하나, 얼음에 하나 준비; 각 접시에 완전한 클래식 매체 10 mL을 넣습니다.
2. 실험 단계(그림 1)
- 산후 (P) 주위에 C57BL/6J 마우스를 희생 (P) 20 75-100 mg/kg 케타민과 7.5-10 mg/kg 자일라진 주입을 사용 하 여. 해부 전에 얼음에 완전한 고전적인 매체에 눈을 유지합니다.
- 눈에 결합 조직 (근육과 지방 조직) 및 시신경을 제거합니다.
- 마이크로 가위를 사용하여 0.5mm 후방을 각막 limbus로 원주 절단합니다. 각막/홍채 복합체, 유리체 및 렌즈를 제거합니다.
- 시신경을 향해 절단 가장자리에 수직으로 1mm 절개를 하고 1mm 너비의 할례 밴드를 자릅니다. 복합체의 중앙 및 주변 영역을 분리합니다. 집게를 사용하여 RPE/choroid/sclera 복합체에서 망막을 벗깁니다.
- 주변 초보 밴드를 얼음에 완벽한 클래식 매체로 유지하십시오. 다른 눈을 분리하고 두 번째 밴드를 잘라 과정을 반복합니다.
- 원형 밴드를 6 ~동등한 사각형 조각 (~1mm x 1mm)으로 자른다.
참고: 가장자리를 만지지 마십시오. - 제조의 지시에 따라 기저막 추출물(BME)을 해동합니다. 24 개의 잘 조직 배양 플레이트의 각 우물의 중심에 30 μL / 웰BME를 추가합니다. BME의 액적가장자리가 가장자리를 건드리지 않고 플레이트 바닥에 볼록돔을 형성해야 합니다.
참고 : 냉장고에서 하룻밤 BME를 해동하십시오. BME는 해동 후 언제든지 얼음위에 있어야 합니다. - BME의 중간에 조직을 배치합니다.
참고 : 코로이드 축출을 평평하게하지 마십시오; 일반적으로, 조직이 BME 내에서 확장하자. 조직의 방향 (경피측 위 또는 아래) 실험 결과에 영향을 미치지 않습니다. - 37°C에서 10분 동안 플레이트를 배양하여 젤이 고화하게 합니다.
- 전체 클래식 중간/웰의 500 μL을 추가합니다.
- 격일(500 μL)의 클래식 매체를 변경합니다. 코로이드 발아는 현미경으로 3 일 후에 관찰 될 수있다.
참고: 성장 인자 치료를 위해 4 시간 동안 조직을 굶어. 성장 인자 감소 매체에서 시험 화합물을 희석 (1:200 대신 부스트 1:50).
3.SWIFT-코로이드 전산화 정량화 방법17 (도 2)
참고: 성장하는 선박이 적용되는 영역을 측정하는 전산화 된 방법이 사용되었습니다. ImageJ 소프트웨어에 대한 매크로 플러그인은 정량화 하기 전에 필요합니다(자세한 내용은 추가 정보 참조).
- ImageJ로 코로이드 발아 이미지를 열고"이미지 | 유형| 회색눈금으로 8비트"
- "이미지| 조정 | 밝기/콘트라스트(Ctrl/shift/C)" 및 콘트라스트를 최적화합니다.
- 마법 지팡이 기능을 사용하여 새싹 중앙에 존재하는 코로이드 조직을 이미지에서 윤곽을 그리고 제거합니다(바로 가기 키"F1")(그림2A, B).
참고: 마법 지팡이의 허용 오차 속도를 20-30%로 설정합니다. - 무료 선택도구(그림 2C)로이미지의 배경을 제거합니다. "이미지| 조정 | 임계값(Ctrl/shift/T)". 임계값 함수를 사용하여 배경 및 주변부(그림2D)에대해 미세 혈관 새싹을 정의합니다.
- "F2"를클릭하면 요약이 나타납니다. "저장"을 클릭하여 선택한 영역의 이미지를저장합니다. 향후 참조를 위해 원본 이미지와 동일한 폴더에 저장합니다.
- 샘플 그룹을 측정한 후 데이터 분석을 위해 기록된 샘플을 복사합니다.
참고:"분석| 스케일 바가 있는 이미지를 사용하여 "배율"을 설정합니다.
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Representative Results
하루에 빛나는 choroid 의 성장의 비교
우리는 BME에 내장 된 sclera로 choroid를 해부하고 6 일 동안 배양(그림 1). 3일부터 6일까지 C57BL/6J 마우스에서 의초로이드 발아는 현미경으로 검사되었고 IMAGEJ에서 반자동 정량화 방법인 SWIFT-Choroid로 정량화되었다. 대표적인 경우, 축출면적(축출자체를 제외한 각성으로부터 연장된 혈관)은 3일째 0.38mm2(그림 3A),4일째 1.47mm2(그림 3B),5.62mm2(그림 3C),6일째 10.09mm2일(그림 3D)이었다.
자유 지방산 수용체 (FFAR)4 억제는 코로이드 성 혈관화 ex vivo를 악화시니다.
Choroidal 혈관 발아에 FFAR4 (또한 G-단백질 결합 수용체 120이라고도 함)의 손실의 효과는 choroid 발아 분석18을사용하여 평가되었다. choroid, RPE 및 clera 복합체는 Ffar4 녹아웃 (-/-) 및 Ffar4+/+ 마우스에서 해부되었고 위에서 설명한 바와 같이 배양되었습니다. Ffar4/--에서 발아 영역 Ffar4+/+ 6일째 (p = 0.004)(그림 4A, B)에비해 증가된 차로이드 혈관 성장. FFAR4 작용제(1 μM)의 치료는 6일째에 처리되지 않은 마우스에 비해 코로이드 발아 부위를 감소시켰습니다(p = 0.03)(도 4C,D).
그림 1: 치매화 일러스트레이션으로 치로이드 발아 분석.
눈은 먼저 에클레오티드하고 약 0.5mm 후방을 림푸스로 절단시켰다. 각막, 홍채, 렌즈 및 유리체가 제거되었습니다. 그런 다음 눈 컵 가장자리에서 시신경쪽으로 1mm 컷이 만들어졌습니다. 그런 다음 밴드는 약 1.0mm 후방을 절단하여 절단 가장자리로 절단하고 밴드와 복합체의 주변 영역이 분리되었다. 밴드는 약 1mm x 1mm 조각으로 절단되었고 BME에 내장되었습니다. 그런 다음 현미경을 사용하여, 코로이드에서 미세 혈관 콩나물은 시각화되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: SWIFT-Choroid 전산화 정량화 방법.
(A,B) 매직 지팡이 기능은 새싹의 중앙에 있는 치로이드 조직(흰색 화살표)을 윤곽을 잡기 위해 사용되었고 디지털로 제거되었습니다(바로 가기 키 "F1"). (C, D) 이미지의 배경은 무료 선택 도구(검정 화살표)로 제거되었습니다. 마이크로 혈관 콩나물은 배경과 주변에 대한 임계 값 함수를 사용하여 정의되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 마우스 주변 초보 초로이드 발아.
(A-D) C57BL/6J 마우스를 이용한 코로이드 콩나물의 대표적인 이미지와 새싹의 영역을 정량화하는 SWIFT-Choroid 방법의 데모. 추로이드 발아 면적은 3일째(A), 4일째 1.47mm 2일째(B), 5일째 5.62mm 2(C),6일째 10.09mm 2(D)였다. 스케일 바; 500 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 자유 지방산 수용체 (FFAR) 4 억제는 choroidal 신생 혈관화를 악화시니다.
(A) Ffar4녹아웃(-/-) 마우스와 비교하여 자유 지방산 수용체(Ffar)4+/++에서 코로이드를 가진 발아 분석의 대표적인 이미지는 Ffar4+/+의 크로로이드를 나타내며, 상층부는 Ffar4-/-choroid를 나타낸다. (B)Ffar4-/-Ffar4 +/+ 마우스(n=6-8)에 비해 코로이드 발아가 증가된 것으로 나타났다. (C) 코로이드 발아의 대표적인 이미지: 상부 이미지는 차량 처리(control)를 보여줍니다. 낮은 이미지는 FFAR4 작용제 치료를 보여줍니다. (D) FFAR4 작용제는 대조군(n = 10-12)에 비해 치오로이드 발아를 억제하였다. 스케일 바 = 500 μm. 데이터는 학생의 t-시험에 의해 분석되었고 평균 ± SE로 표현되었습니다. * p < 0.05; **p & 0.01. 이 그림은 토미타 외18에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1: choroid 발아 분석 프로그램에 대 한 플러그인 및 바로 가기를 만드는 방법. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
천로이드 발아 분석체는 NEovascular AMD9,10,18,19,20에서연구를 돕습니다. 초로이드 이질은 쥐뿐만 아니라 쥐와인간(17,21)으로부터분리될 수 있다. choroid 축출에는 EC, 대식세포 및 pericytes17이포함됩니다. 이 분석에서 choroidal IC와 RPE 세포와 같은 인접 한 세포 간의 상호 작용, choroidal 혈관 성장에 관련 된 메커니즘을 해명 하는 데 도움이(17). 또한, 이러한 재현 가능한 반자동 평가 방법은 관찰자 간가변성(17)을감소시다.
ex vivo choroidal 조직의 첫 번째 간행된 연구 결과는 DR 및 AMD22, 23,24,25를취급하는 잠재력을 가진 약리학적 내정간섭을 시험하기 위하여 고립된 choroid를 이용했습니다. 분석은 관찰자 간 가변성을 받을 수 있는 발아 용기의 수와 길이를 계산했습니다. 대조적으로, 여기에 기재된 정량화 방법은17을표준화하였다. 미세 혈관 조뇌 혈관 신생의 이 분석은 상호 작용 파트너 세포 및 세포 외 매트릭스를 포함한다. 배양에 있는 EC는 RPE와 같은 그밖 세포와의 상호 작용의 손실 때문일 지도 모르다 혈관 관을 형성하는 기능 과 같은 그들의 생리적인 속성의 많은 것을 분실할 수 있습니다26. 따라서, EC 내 체외 배양은 코로이드 성 혈관화의 모든 측면을 반영하지 않을 수 있다. 대동맥 고리 분석에는 대형 혈관 내피 세포및 대형 용기에서 발아를 평가하는 대화형 세포가 포함됩니다. 그러나 큰 혈관 콩나물은 정확하게 choroidal 미세 혈관 질환을 반영하지 않을 수 있습니다(27). choroidal 발아 분석체는 choroidal microvascular 반응의 가까운 표현입니다.
중요한 주의 사항이 있습니다. 첫째, 말초 초로이드 복합물은 중앙제17절에서 파기하는 것보다더 일관되고 훨씬 빠르게 자랍니다. 둘째, RPE를 가진 choroid sprouts가 RPE17없이 보다는 훨씬 더 빨리 성장하기 때문에 choroid에서 RPE는 제거되지 않았습니다. 약물이 코로이드에 미치는 영향을 단독으로 이해하기 위해 RPE가 없는 분석이 사용될 수 있습니다. 마지막으로, 매직 지팡이 기능을 이용하여 코로이드 조직과 발아 부위의 이미지를 설명할 때, 높은 배경 소음으로 인해 코로이드 발아의 영역을 추적하기가 때로는 어렵다. 이미지 간에 는 변형이 있을 수 있습니다. 따라서 일관성을 위해 도 2에서볼 수 있듯이 choroid와 배경 간의 충분한 대비를 디지털방식으로 만드는 것이 중요합니다.
요약하자면, 전 생체 외 코로이드 발아 분석이 특징화되고 반자동. 이 방법은 AMD 연구를 위한 실험 도구를 제공합니다. 이 분석은 잠재적인 치료로 화합물을 선별하거나 야생 유형 및 유전자 변형 마우스 조직을 사용하여 코로이드 마이크로 혈관의 증식에 관련된 경로를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 재정 적 공개가 없습니다. 전산화 된 방법은 저자를 통해 교육 기관에 무료로 사용할 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품은 만페이 스즈키 당뇨병 재단 (YT), 보스턴 아동 병원 OFD / BTREC / CTREC 교수 진로 개발 보조금, 보스턴 아동 병원 안과 재단, BCH 파일럿 상, BCH 맨튼 센터 펠로우십의 보조금에 의해 지원되었다, 리틀 기린 재단 (ZF), 독일 연구 재단 (DFG; BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
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