Summary
Dit protocol presenteert choroïde kiemen test, een ex vivo model van microvasculaire proliferatie. Deze test kan worden gebruikt om trajecten die betrokken zijn bij het verspreiden van choroidale microvaten te beoordelen en te beoordelen drug behandelingen met behulp van wilde type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.
Abstract
Pathologische choroidale angiogenese, een treffend kenmerk van leeftijdsgebonden maculadegeneratie, leidt tot gezichtsstoornissen en blindheid. Endotheelcel (EC) proliferatietesten met behulp van menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs) of geïsoleerde primaire retinale EC's worden veel gebruikt in vitro modellen om retinale angiogenese te bestuderen. Echter, isoleren van zuivere murine retinale endotheelcellen is technisch uitdagend en retinale ECs kunnen verschillende proliferatie reacties dan choroidale endotheelcellen en verschillende cel / cel interacties. Een zeer reproduceerbare ex vivo choroidale kiemen test als een model van choroidale microvasculaire proliferatie werd ontwikkeld. Dit model omvat de interactie tussen choroïde vasculatuur (EC, macrofagen, pericyten) en retinale pigment epitheel (RPE). Muis RPE/choroïde/scleral explants worden geïsoleerd en geïncubeerd in groeifactor-verminderde basale membraan extract (BME) (dag 0). Medium wordt om de andere dag veranderd en choroid ontkiemen wordt gekwantificeerd op dag 6. De beelden van individuele choroid explant worden genomen met een omgekeerde fase microscoop en het ontkiemen gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een semi-geautomatiseerde macro plug-in om de ImageJ software ontwikkeld in dit lab. Deze reproduceerbare ex vivo choroidale spruittest kan worden gebruikt om verbindingen voor potentiële behandeling te beoordelen en voor microvasculair ziekteonderzoek om trajecten te beoordelen die betrokken zijn bij de proliferatie van choroidale microvaten met behulp van wild type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.
Introduction
Choroidale angiogenese dysregulatie wordt geassocieerd met neovasculaire leeftijdsgebonden maculadegeneratie (AMD)1. De choroïde is een microvasculair bed aanwezig onder het retinale pigment epitheel (RPE). Het is aangetoond dat verminderde bloedstroom in de choroid wordt geassocieerd met progressie van AMD2. De ingewikkelde relatie tussen vasculair endotheel, RPE, macrofagen, pericyten en andere cellen is verantwoordelijk voor de homeostase van het weefsel3,4,5. Daarom is een reproduceerbare test modellering choroidale micro-omgeving is van cruciaal belang voor de studie van neovasculaire AMD.
Ex vivo angiogenese testen en in vitro endotheelcelculturen kunnen studies naar microvasculair gedrag in vivo aanvullen, voor het testen van nieuwe geneesmiddelen en voor studies van pathogenese. Endotheelcellen zoals menselijke retinale microvasculaire endotheelcellen (HRMECs), Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), geïsoleerde primaire dierlijke hersenen of retinale VC's worden vaak gebruikt in vitro studies voor oculair angiogenese onderzoek6,7,8. Met name HRMECs zijn op grote schaal gebruikt als een model van in vitro choroidale neovascularisatie (CNV)9 door de beoordeling van endotheelproliferatie, migratie, buisvormige vorming en vasculaire lekkage om interventies6,10te evalueren . ECs in de cultuur zijn echter beperkt als model van CNV vanwege het gebrek aan interacties met andere celtypen in de chooïde en omdat de meeste EG-maatregelen die in deze tests worden gebruikt, niet afkomstig zijn van chooïde. Muis choroidale ECs zijn moeilijk te isoleren en te onderhouden in de cultuur.
De aorta ring test wordt veel gebruikt als een model van macro vasculaire proliferatie. Vasculaire spruiten van aorta-explants zijn onder andere ECs, pericyten en macrofagen11. De aortaringtest modelleert grote scheeps angiogenese goed12,13,14. Echter, het heeft beperkingen als een model van choroïdale neovascularisatie als aorta ringen zijn een macrovasculair weefsel ontbreekt de karakteristieke choroidale microvasculaire omgeving, en spruiten uit grote vaten kunnen verschillen van spruiten van capillaire netwerken die betrokken zijn bij microvasculaire pathologie. Onlangs publiceerde een groep een ex-vivo retinale test15,16. Hoewel het geschikt is voor retinale neovasculaire ziekte, is het niet zo geschikt voor choroidale neovascularisatie zoals gezien in AMD.
De choroidale kiemende test met muis RPE, choroïde en scleral explanted tissue werd ontwikkeld om CNV beter te modelleren. Het weefsel kan gemakkelijk worden geïsoleerd van de muis (of andere soorten) ogen17. Deze test maakt reproduceerbare evaluatie van pro- en anti-angiogeen potentieel van farmacologische verbindingen en evaluatie van de rol van specifieke trajecten in choroidale neovascularisatie met behulp van weefsel van genetisch gemodificeerde muizen en controles18. In veel latere publicaties 9 , 10,18,19,20. Hier wordt de methode die betrokken is bij het gebruik van deze test aangetoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle beschreven dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee in het Boston Children's Hospital (ARCH protocolnummer 19-04-3913R).
1. Voorbereiding
- Voeg 5 mL Penicilline/Streptomycine (10000 U/mL) en 5 mL en 10 mL aan commercieel beschikbare supplementen toe aan 500 mL compleet klassiek medium met serum. Aliquot 50 mL van het medium in eerste instantie.
LET OP: Breng geen medium terug naar de voorraad om besmetting te voorkomen. - Zet een aliquot van complete klassieke medium op ijs.
- Gebruik 70% ethanol om de ontledende microscoop, tangen en scharen schoon te maken.
- Bereid twee celkweekgerechten (10 cm), een op de dissectiemicroscoop, één op ijs; zet 10 mL van complete klassieke medium in elk gerecht.
2. Experimentele stappen (figuur 1)
- Offer C57BL/6J muizen rond postnatale (P) 20 met behulp van 75-100 mg/kg ketamine en 7,5 -10 mg/kg xylazine intraperitoneally geïnjecteerd. Houd de ogen in volledig klassiek medium op ijs voor dissectie.
- Verwijder het bindweefsel (spier- en vetweefsel) en de oogzenuw.
- Gebruik een microschaar om 0,5 mm achterste te snijden naar het hoornvlies limbus. Verwijder het hoornvlies/iriscomplex, glasvocht en de lens.
- Maak een incisie van 1 mm loodrecht op de snijkant naar de oogzenuw en snijd een omtrekband van 1 mm breed. Scheid de centrale en perifere regio's van het complex. Gebruik tangen af te pellen van het netvlies van RPE / choroïde / sclera complex.
- Houd de perifere choroidband in volledig klassiek medium op ijs; isoleer het andere oog en herhaal het proces om een tweede band te snijden.
- Snijd de ronde band in 6 ~ gelijke vierkante stukken (~ 1 mm x 1 mm).
LET OP: Raak nooit een rand aan. - Ontdooi het basaal membraanextract (BME) per gebruiksinstructie van de fabrikant. Voeg 30 μL/put BME toe in het midden van elke put van een 24 goed weefselkweekplaat. Zorg ervoor dat de druppel BME een bolle koepel vormt aan de onderkant van de plaat zonder de randen aan te raken.
LET OP: Ontdooi de BME 's nachts in een koelkast. BME moet op het ijs elk moment na het ontdooien. - Plaats het weefsel in het midden van de BME.
LET OP: Maak de choroïde explant niet plat; laat het weefsel over het algemeen uitzetten binnen de BME. De oriëntatie van het weefsel (sclerale kant omhoog of omlaag) heeft geen invloed op de experimentele uitkomst. - Incubeer de plaat op 37 °C gedurende 10 minuten om de gel te laten stollen.
- Voeg 500 μL van het complete klassieke medium/well toe.
- Verander het klassieke medium om de andere dag (500 μL). Choroïde ontkiemen kan worden waargenomen na 3 dagen met een microscoop.
OPMERKING: Voor de behandeling van de groeifactor verhongert u het weefsel gedurende 4 uur. Verdun een proefsamenstelling in groeifactor-verlaagd medium (1:200 boost in plaats van 1:50).
3.SWIFT-Choroid geautomatiseerde kwantificeringsmethode17 (Figuur 2)
OPMERKING: Er werd gebruik gemaakt van een geautomatiseerde methode om het gebied waarop groeiende vaten betrekking hebben, te meten. Een macro plugin naar ImageJ software is nodig voorafgaand aan kwantificering (zie Aanvullende informatie voor meer details).
- Open de choroïde kiemende afbeelding met ImageJ en check "Image | Type| 8-bits" met grijze schaal.
- Ga naar "Image | | aanpassen Helderheid/contrast (Ctrl/shift/C)" en optimaliseer het contrast.
- Gebruik de toverstaffunctie om het choroïde weefsel dat in het midden van de spruiten aanwezig is te schetsen en uit de afbeelding te verwijderen (met behulp van sneltoets "F1") (Figuur 2A,B).
LET OP: Stel het tolerantiepercentage van de toverstok in op 20-30%. - Verwijder de achtergrond van de afbeelding met de gratis selectiegereedschappen(figuur 2C). Ga naar "Image | | aanpassen Drempelwaarde (Ctrl/shift/T)". Gebruik de drempelfunctie om de microvasculaire spruiten tegen de achtergrond en de periferie te definiëren (figuur 2D).
- Klik opF2en er verschijnt een samenvatting. Sla een afbeelding van het geselecteerde gebied op door opOpslaante klikken. Sla op in dezelfde map als de oorspronkelijke afbeelding voor toekomstige referentie.
- Nadat een groep monsters is gemeten, kopieert u de opgenomen voor gegevensanalyse.
LET OP: Het is ook mogelijk om het gebied (μm²) te meten door "Analyse | Schaal instellen" met afbeeldingen met schaalbalken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vergelijking van choroid ontkiemen groei per dag
We ontleed de choroid met sclera, ingebed in BME en gekweekt ze voor 6 dagen (Figuur 1). De chooïde die van dag 3 tot dag 6 in C57BL/6J muizen ontkiemde, werd met een microscoop onderzocht en gekwantificeerd met SWIFT-Choroid een semi-geautomatiseerde kwantificeringsmethode in ImageJ. In een representatief geval bedroeg het kiekkiemende gebied (de vaten die zich uitstrekken van de explant, met uitzondering van de explant zelf) 0,38 mm2 op dag 3 (Figuur 3A),1,47 mm2 op dag 4 (Figuur 3B), 5,62 mm2 op dag 5 (figuur 3C), en 10,09 mm2 op dag 6 (figuur 3D).
Gratis vetzuurreceptor (FFAR)4 onderdrukking verergert choroidale neovascularisatie ex vivo.
De effecten van verlies van FFAR4 (ook bekend als G-eiwit gekoppeld receptor 120) op choroïdale vasculaire kiemen werden geëvalueerd met behulp van de choroid ontkiementest 18. De choroid, RPE, en sclera complex werden ontleed uit Ffar4 knock-out (-/-) en Ffar4 + + muizen en gekweekt zoals hierboven beschreven. Het ontkiemende gebied in Ffar4-/- verhoogde choroidale vasculaire groei in vergelijking met Ffar4+/+ op dag 6 (p = 0,004) (figuur 4A,B). De behandeling van FFAR4 agonist (1 μM) verminderde het choroïdaal ontkiemen gebied in vergelijking met onbehandelde muizen op dag 6 (p = 0,03) (Figuur 4C, D).
Figuur 1: Schematische illustratie die choroid ontkiemende test toont.
Ogen werden eerst toegeveerd en gesneden omtrek ongeveer 0,5 mm achterste naar de limbus. Het hoornvlies, de iris, de lens en het glasvocht werden verwijderd. Vervolgens werd een 1 mm snede gemaakt vanaf de rand van de oogbeker naar de oogzenuw. Een band werd vervolgens gesneden omtrek ongeveer 1,0 mm achterste aan de snijkant en de band en de perifere gebieden van het complex werden gescheiden. De band werd in stukken van ongeveer 1 mm x 1 mm gesneden en ingebed in BME. Vervolgens met behulp van een microscoop, de microvasculaire spruiten van de choroïde werden gevisualiseerd. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: SWIFT-Choroid geautomatiseerde kwantificeringsmethode.
(A,B) Toverstaf functie werd gebruikt om de choroïde weefsel (witte pijl) schetsen in het midden van de spruiten en het werd digitaal verwijderd (Sneltoets sleutel "F1"). (C, D) De achtergrond van de afbeelding is verwijderd met de gratis selectiegereedschappen (zwarte pijl). Microvasculaire spruiten werden vervolgens gedefinieerd met behulp van de drempel functie tegen de achtergrond en periferie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Muis perifere chooïde ontkiemen.
(A-D) Representatieve afbeeldingen van chooïde spruiten met een C57BL/6J muis en demonstraties van SWIFT-Choroid methode kwantificeren van het gebied van de spruiten. Het kiekgebied was 0,38 mm2 op dag 3 (A), 1,47 mm2 op dag 4 (B), 5,62 mm2 op dag 5 (C), en 10,09 mm2 op dag 6 (D). Schaalbalk; 500 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Gratis vetzuurreceptor (FFAR) 4 onderdrukking verergeren choroidale neovascularisatie.
(A) Representatieve beelden van de kiemende test met choroïde van Gratis vetzuur receptor (Ffar)4 +/+ in vergelijking met Ffar4 knock-out (-/-) muizen: bovenste afbeelding toont de choroïde van Ffar4 +/+ terwijl het onderste beeld toont Ffar4-/- choroid. (B)Ffar4-/- toonde een verhoogde chooïde kiemen in vergelijking met Ffar4 +/+ muizen (n = 6-8). (C) Representatieve beelden van chooïde ontkiemen: bovenste beeld toont voertuig behandeling (controle); lager beeld toont FFAR4 agonistische behandeling. (D) FFAR4 agonist onderdrukte choroïdale kiemen in vergelijking met controle (n = 10–12). Schaalbalken = 500 μm. De gegevens werden geanalyseerd door student t-test en werden uitgedrukt als gemiddelde ± SE. * p < 0,05; **p < 0,01. Dit cijfer is gewijzigd van Tomita et al.18. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Supplemental File 1: Hoe maak je plugins en snelkoppelingen voor de choroid ontkiemen test programma. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De choroidale kiemen test helpt onderzoek in neovasculaire AMD9,10,18,19,20. Choroid explants kunnen worden geïsoleerd van muizen, evenals ratten en mensen17,21. De choroid explant omvat ECs, macrofagen, en pericytes17. In deze test de interactie tussen choroïdale ECs en aangrenzende cellen zoals RPE cellen, helpen verduidelijken van de mechanismen die betrokken zijn bij choroidale vasculaire groei17. Bovendien vermindert deze reproduceerbare en semi-geautomatiseerde beoordelingsmethode de interobservervariabiliteit17.
De eerste gepubliceerde studie van ex vivo choroïdaal weefsel gebruikte geïsoleerde choroïde om farmacologische interventies te testen met het potentieel om DR en AMD22,23,24,25te behandelen . De test telde het aantal en de lengte van ontkiemende vaten, die kunnen worden onderworpen aan interobserver variabiliteit. De hier beschreven kwantificeringsmethode is daarentegen gestandaardiseerd17. Deze test van microvasculaire choroid angiogenese omvat interactieve partnercellen en extracellulaire matrix. VC's in de cultuur kunnen veel van hun fysiologische eigenschappen verliezen, zoals de mogelijkheid om vasculaire buizen26 te vormen die te wijten kunnen zijn aan het verlies van interactie met andere cellen zoals RPE. Daarom kunnen EG in vitro culturen niet alle aspecten van choroidale neovascularisatie weerspiegelen. De aorta ringtest omvat grote vat endotheelcellen en interactieve cellen om ontkiemen van grote vaten te evalueren. Maar grote vatpruiten kunnen niet nauwkeurig choroidale microvasculaire ziekte27weerspiegelen. De choroidale kiemende test is een nauwere weergave van choroidale microvasculaire reacties.
Er zijn belangrijke kanttekeningen. Ten eerste, de perifere choroid complex explant spruiten zijn consistenter en groeien veel sneller dan explants uit de centrale secties17. Ten tweede werd de RPE van choroïde niet verwijderd omdat choroidspruiten met RPE veel sneller groeien dan zonder RPE17. Om de impact van een medicijn op choroïde alleen te begrijpen, kan de test zonder RPE worden gebruikt. Ten slotte, bij het schetsen van het beeld van choroïde weefsel en ontkiemen gebied met behulp van de toverstokfunctie, is het soms moeilijk om het gebied van chooïde ontkiemen als gevolg van hoge achtergrondgeluid te traceren. Er kan variatie zijn tussen afbeeldingen. Daarom is het voor consistentie belangrijk om digitaal voldoende contrast te creëren tussen choroid en achtergrond zoals te zien in figuur 2.
Samengevat, ex vivo choroid ontkiemen test is gekenmerkt en semi-geautomatiseerd. Deze methode biedt een experimenteel hulpmiddel voor AMD-onderzoek. Deze test kan worden gebruikt om verbindingen te screenen als potentiële behandelingen of om trajecten te beoordelen die betrokken zijn bij het verspreiden van choroïdale microvaten met behulp van wild type en genetisch gemodificeerd muisweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen financiële informatie. De geautomatiseerde methode is gratis beschikbaar voor academische instellingen via de auteurs.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door Subsidies van de Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), Boston Children's Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, Boston Children's Hospital Ophthalmology Foundation, BCH Pilot Award, BCH Manton Center Fellowship en Little Giraffe Foundation (ZF), The German Research Foundation (DFG; bc [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH IDDRC (1U54HD090255), Massachusetts Lions Foundation Eye (LEHS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Basal membrane extract (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Cell culture dish | NEST | 704001 | 10cm |
| Complete classic medium with serum and CultureBoost | Cell systems | 4Z0-500 | |
| Ethyl alcohol 200 Proof | Pharmco | 111000200 | use for 70% |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Tissue culture plate (24-well) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Ketamine) | AKORN | 59399-114-10 |
References
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778 (2020).
- Fu, Z., et al.
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188 (2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C.
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939 (2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552 (2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470 (2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
