Summary
Die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) ist eine Methode zur genauen Quantifizierung der Konzentrationen und Lokalisierung spezifischer RNAs auf Einzelzellebene. Hier berichten wir über unsere validierten Laborprotokolle für die Nasstischverarbeitung, Bildgebung und Bildanalyse zur Einzelzellquantifizierung spezifischer RNAs.
Abstract
Die Gentranskription ist ein wesentlicher Prozess in der Zellbiologie und ermöglicht es Zellen, interne und externe Hinweise zu interpretieren und darauf zu reagieren. Herkömmliche Massenpopulationsmethoden (Northern Blot, PCR und RNAseq), die den mRNA-Spiegel messen, sind nicht in der Lage, Informationen über die Variation der Reaktionen zwischen Zellen zu liefern. Eine präzise Einzelzell- und allelische Visualisierung und Quantifizierung ist über die Einzelmolekül-RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (smFISH) möglich. RNA-FISH wird durch Hybridisierung von Ziel-RNAs mit markierten Oligonukleotidsonden durchgeführt. Diese können in Modalitäten mit mittlerem /hohem Durchsatz abgebildet werden und liefern durch Bildanalyse-Pipelines quantitative Daten sowohl zu ausgereiften als auch zu entstehenden RNAs, alles auf Einzelzellenebene. Die Fixierungs-, Permeabilisierungs-, Hybridisierungs- und Bildgebungsschritte wurden im Labor über viele Jahre mit dem hier beschriebenen Modellsystem optimiert, was zu einer erfolgreichen und robusten Einzelzellanalyse der smFISH-Markierung führt. Das Hauptziel bei der Probenvorbereitung und -verarbeitung ist es, qualitativ hochwertige Bilder zu erzeugen, die sich durch ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis auszeichnen, um Fehlalarme zu reduzieren und genauere Daten bereitzustellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll, das die Pipeline von der Probenvorbereitung bis zur Datenanalyse in Verbindung mit Vorschlägen und Optimierungsschritten beschreibt, um sie auf bestimmte Proben zuzuschneiden.
Introduction
Gentranskription und -translation sind die beiden Hauptprozesse, die am zentralen Dogma der Biologie beteiligt sind und von der DNA-Sequenz über RNA bis hin zu Protein1reichen. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die Produktion von Boten-RNA (mRNA) während der Transkription. Das entstehende RNA-Molekül umfasst sowohl nicht-kodierende Introns als auch kodierende Exons. Introns werden co-transkriptionell ausgespleißt, bevor sich die mRNA zur Translation auf die Ribosomen2,3in das Zytoplasma bewegt.
Traditionell wird die Messung von mRNA in Massenpopulationen von Zellen (Hunderte bis Millionen) mit klassischen Assays wie RT-qPCR oder Northern Blotting durchgeführt. Obwohl diese Methoden sehr leistungsfähig sind, sind sie begrenzt, da sie keine Einblicke in die Zell-zu-Zell-Variation (phänotypische Heterogenität), die Identifizierung der Anzahl der transkriptionell aktiven Allele und, was vielleicht noch wichtiger ist, den Mangel an räumlichen Informationen liefern. In jüngerer Zeit begannen genomweite Technologien, die eine Einzelzell-RNA-Sequenzierung (RNAseq) ermöglichen, die Lücke zwischen bildgebenden Verfahren und Sequenzierung zu schließen4. RNAseq leidet jedoch unter relativ geringen Erkennungseffizienzen und die Verarbeitungsschritte führen zum vollständigen Verlust räumlicher Informationen5. Obwohl Einzelzell-RNAseq Einblicke in die phänotypische Heterogenität einer Population isogener Zellen liefern kann, kann die RNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) eine vollständigere Untersuchung der Zielgenexpression auf räumlicher Ebene und auf Allel-für-Allel-Basis ermöglichen6,7.
RNA FISH ist eine Technik, die den Nachweis und die Lokalisierung von Ziel-RNA-Molekülen in festen Zellen ermöglicht. Im Gegensatz zu früheren, mühsamen Methoden verwendet das derzeit hochmoderne RNA-FISH kommerziell verfügbare Nukleinsäuresonden, die die Ziel-RNA-Sequenzen ergänzen, und diese Sonden hybridisieren durch Watson-Crick-Basenpaarung8zu ihren Zielen. Die frühen In-situ-Hybridisierungstechniken beinhalteten ein ähnliches Protokoll, das 1969 von Gall und Pardue festgelegt wurde, als eine Probe mit Nukleinsäuresonden verarbeitet wurde, die spezifisch zu einer Ziel-RNA9hybridisiert wurden. Ursprünglich wurde der Assay mittels radioaktiver oder kolorimetrischer Detektion durchgeführt; In den 1980er Jahren eröffnete jedoch die Entwicklung von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungsprotokollen (FISH) zu DNA FISH und später RNA FISH den Weg zu empfindlicheren Nachweisen und das Potenzial für multiplexing10,11.
Weiterentwicklungen in RNA FISH haben dazu geführt, dass einzelne RNA-Moleküle (smFISH) nachgewiesen und quantifiziert werdenkönnen 12,13. Der direkte Nachweis ist eine Methode, bei der die Sonden selbst mit Fluorophoren markiert werden. Eine Herausforderung bei smFISH besteht darin, dass genügend hybridisierende Sonden/ Target benötigt werden, um die Detektion von fluoreszierenden Signalen als ausgeprägte, beugungsbegrenzte Flecken zu erleichtern. Um dieses Problem zu lösen, kann man einen Sondensatz von kurzen einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden verwenden, die sich komplementär zu verschiedenen Regionen der Ziel-RNA8,12,14ergänzen. Die Bindung mehrerer Sonden erhöht die lokale Fluorophordichte, wodurch die RNA durch Fluoreszenzmikroskopie als eigenständiger, hochintensiver Spot sichtbar wird. Diese Methode ist vorteilhaft, da die Off-Target-Bindung von Oligonukleotiden im Sondensatzpool vom echten RNA-Spot-Signal unterschieden werden kann, indem die Spotgröße und -intensität quantitativ analysiert wird, um zwischen echter Signal- und falscher Oligonukleotidbindung zu unterscheiden, wodurch eine genauere Analyse durch Reduzierung von Fehlalarmen ermöglicht wird12.
Alternative Methoden zum Nachweis von mRNA sind die klassische BAC-klonbasierte Nick-Translation-Methode und das neu entwickelte verzweigte DNA-System. Bei der BAC-geklonten Nick-Translation-Methode wird die zu kennzeichnende DNA enzymatisch genickt und dem exponierten 3'-Ende wird ein neues Nukleotid hinzugefügt. Die Aktivität der DNA-Polymerase I fügt ein markiertes Nukleotid hinzu, was zu der gewünschtenSonde 15,16führt. Die verzweigte DNA-Technik beinhaltet Oligonukleotidsonden, die paarweise zu RNA-Zielen hybridisieren, und diese Sonden werden unter Verwendung mehrerer Signalverstärkungsmoleküle amplifiziert. Diese Methode kann das Signal-Rausch-Verhältnis erheblich verbessern, aber die Verstärkung kann die genaue Quantifizierung verzerren, da fluoreszierende Flecken in Größe und Intensität stark unterschiedlich sein können17.
Als Modellsystem für dieses Protokoll, das im Rahmen des NIEHS Superfund Research Program voll eingesetzt wird, um die Auswirkungen endokrin wirksamer Chemikalien in Galveston Bay / Houston Ship Channel zu quantifizieren, verwendeten wir die Östrogenrezeptor (ER) positive Brustkrebszelllinie MCF-7, die über Nacht mit einem ER-Agonisten, 17β-Estradiol (E2)7,18,19behandelt wurde. E2 reguliert viele ER-Target-Gene, darunter das prototypische ER-Target-Gen GREB17,20,21,22. Das hier beschriebene smFISH-Protokoll verwendet einen Satz von zwei spektral getrennten Sondensätzen, die auf GREB1 abzielen; eine, die zu Exons und die andere zu Introns hybridisiert, was die Messung sowohl von reifer als auch von naszierender RNA7ermöglicht. Wir verwenden dann Epifluoreszenzmikroskopie in Verbindung mit Dekonvolution, um smFISH-markierte Proben abbilden, und wenden dann Bildanalyseroutinen an, um die Anzahl der aktiven Allele und reifen RNAs pro Zelle zu quantifizieren.
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Protocol
Um optimale Ergebnisse zu gewährleisten, erfordert der Nasslaborteil dieses Protokolls standard-RNase-freie Vorsichtsmaßnahmen bei allen Schritten. Zum Beispiel wird die Verwendung von gefilterten Pipettenspitzen, sterilen Gefäßen und RNase-freien Puffern dringend empfohlen. Die Verwendung von RNase-Inhibitoren wie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexen wird ebenfalls empfohlen, insbesondere für Ziel-RNAs mit geringer Häufigkeit.
1. Zellkultur und Versuchsaufbau
- Halten Sie adhärente MCF-7-Brustkrebszellen (ATCC #HTB-22) in einem T75-Gewebekulturkolben mit phenolrotfrei (nur für Hormonstimulationsexperimente erforderlich) Dulbeccos modifiziertem Eagle's Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin.
- Säuregeätzte, poly-D-lysinbeschichtete runde Decklippen (0,16 bis 0,19 mm dick, 12 mm Durchmesser) in eine 24-Mehrwell-Gewebekulturplatte geben.
HINWEIS: Verwenden Sie 1 M HCl, um die Deckschichten mit Säure zu ätzen und mit einer 1 mg / ml Lösung von Poly-D-Lysin zu beschichten, die in sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Ca++ und Mg++) gemäß Standardprotokollen rekonstituiert ist. - Entfernen Sie die Wachstumsmedien aus den Zellen und waschen Sie sie einmal mit 5 mL sterilem PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohneCa++ undMg++). McF-7-Zellen mit 2-3 ml Trypsin-EDTA 0,25% iger Lösung lösen. Sobald sich die Zellen gelöst haben, neutralisieren Sie die Trypsin-EDTA 0,25% ige Lösung mit einem gleichen Volumen an Wachstumsmedien.
- Die Zellen in der Mediensuspension in ein 15 mL konisches Rohr geben, bei 391 x g für 1 Minute herunterdrehen, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie die Medien vorsichtig aus dem konischen Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie die Zellen in einer angemessenen Menge an Behandlungsmedien.
HINWEIS: Das Behandlungsmedium ist phenolrotfreies DMEM, ergänzt mit 5% Holzkohle-Dextran-gestreiften und dialysierten FBS, 2 mM L-Glutamin, 1 nM Natriumpyruvat, 50 I.E./ml Penicillin und 50 μg/ml Streptomycin. Dieses Medium ist für Steroidhormonstimulationsexperimente unerlässlich, da die Serumkomponente durch Holzkohleabisolierung der Medien weitgehend von Steroiden erschöpft ist und wachstumsfaktoren durch Dialyse reduziert hat. - Säen Sie die Zellen auf Coverlips in der 24-Multiwell-Platte bei 60.000 bis 70.000 Zellen pro Vertiefung in 500 μL Behandlungsmedien. Für dieses Experiment sollte die Zellkonfluenz zu Beginn der Behandlung bei etwa 70-80% liegen. Optimieren Sie die Zellaussaatdichte in Abhängigkeit von Zelltyp, Wachstumsrate und Länge des Experiments, um Konfluenz zu vermeiden, was die Bildanalyse erschwert.
HINWEIS: Für eine optimale Bildgebung und Bildanalyse vermeiden Sie Zellverklumpung. Zu diesem Zweck mischen Sie das Aliquot der Zellen gründlich, indem Sie die Zellen einige Male pipettieren (oder kurz vortexen), bevor Sie sie in die Vertiefungen dosieren. Bevor die plattierten Zellen wieder in den Inkubator gelegt werden, können die Zellen für etwa 20 Minuten in der Gewebekulturhaube absetzen, um die Zellverklumpung zu reduzieren. - Inkubieren Sie die Zellen mindestens zwei Tage vor der Behandlung, um die Synchronisation des Zellzyklus und die Hintergrundreduktion aufgrund von Signalmolekülen, die im gestreiften / dialysierten Serum von Wachstumsmedien verbleiben, sicherzustellen.
- Nach einer 48-stündigen Inkubation in Behandlungsmedien behandeln Sie MCF-7-Zellen mit 10 nM 17β-Estradiol (E2) und Vehikelkontrolle (DMSO), die 24 Stunden lang in Behandlungsmedien verdünnt wurden. Diese Behandlung verwendet eine sättigende Dosis von E2, um eine maximale Reaktion zu induzieren. Führen Sie Zeitverlaufs- und Dosis-Wirkungs-Experimente durch, um die Bedingungen für verschiedene Zielgene, Zellmodelle und Behandlungstypen empirisch zu bestimmen. Als Beispiel sehen Sie unsere aktuelle Publikation7.
2. Vorbereitung von Puffern
- Zur Herstellung des Fixationspuffers wird gereinigtes, monomeres Formaldehyd (von Elektronenmikroskopie-Lieferanten als 16% Paraformaldehyd verkauft) auf 4% in sterilem PBSCa++/Mg++ (phosphatgepufferte Kochsalzlösung plusCa++ undMg++)verdünnt. Fügen Sie Vanadyl-Ribonukleosid-Komplexe (VRC) zum Fixationspuffer für eine Endkonzentration von 2 mM hinzu, um den RNA-Abbau zu verzögern.
- Berechnen Sie die Gesamtmenge des Fixationspuffers basierend auf dem Bedarf von 300-500 μL Fixiermittel pro Vertiefung einer 24-Multiwell-Platte. Lagern Sie das 4% Formaldehyd auf Eis, bis es im Fixierungsschritt erforderlich ist.
HINWEIS: Machen Sie den Fixierungspuffer für jedes Experiment neu.
ACHTUNG: Formaldehyd ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß Ihren institutionellen Vorschriften.
- Berechnen Sie die Gesamtmenge des Fixationspuffers basierend auf dem Bedarf von 300-500 μL Fixiermittel pro Vertiefung einer 24-Multiwell-Platte. Lagern Sie das 4% Formaldehyd auf Eis, bis es im Fixierungsschritt erforderlich ist.
- Für den Permeabilisierungsschritt bereiten Sie 70% Ethanol in nukleasefreiem Wasser vor. Eine alternative Option ist 0,5% Triton-X100 in sterilem PBS Ca++/ Mg++ plus 2 mM VRC. Berechnen Sie die Gesamtmenge des benötigten Permeabilisierungspuffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Bohrstück verwenden.
- Um 9 mL des Hybridisierungspuffers vorzubereiten, fügen Sie 2 mL 50% Dextransulfat und 1 ml 20x SSC-Puffer (salzhaltiges Natriumcitrat) zu 6 ml nukleasefreiem Wasser hinzu. Vortex, um den Hybridisierungspuffer gründlich zu mischen. Dieser Puffer kann bis zu einer Woche bei 4 °C gelagert werden.
- Es gibt fünf separate Waschschritte, die einen 2x salzhaltigen Natriumcitratpuffer (SSC) erfordern. Berechnen Sie das endgültige Volumen des benötigten 2x SSC-Puffers, indem Sie 500 μL Puffer pro Abdecklappen und Waschschritt antizipieren. Verdünnen Sie die erforderliche Menge an Füllmaterial 20x SSC-Puffer in nukleasefreiem Wasser. 2 mM VRC kann als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zu Waschschritten hinzugefügt werden. Dieser Puffer kann für die Dauer der Verarbeitungsschritte bei Raumtemperatur gelagert werden.
3. Fixierung für RNA FISH
- Nach der Behandlung das Medium aus den Vertiefungen nehmen und einmal mit sterilem, kaltem PBSCa++/Mg++waschen. Wenn ein Zellmodell mit geringer Adhärenz verwendet wird, verwenden Sie kein Vakuum, um Flüssigkeit anzusaugen. Verwenden Sie manuelles Pipettieren, um Medien vorsichtig von der Seite des Brunnens zu entfernen und den ersten Waschschritt zu unterlassen. Fügen Sie 500 μL Fixationspuffer für 30 Minuten auf Eis hinzu.
HINWEIS: Wenn die Probe anfällig für RNA-Abbau ist, verwenden Sie steriles PBS mit 2 mM VRC für den Waschschritt an dieser Stelle. - Entfernen Sie Fixiermittel und entsorgen Sie es in chemischen Abfällen gemäß den institutionellen Vorschriften. Waschen Sie die Zellen zweimal mit kaltem sterilem PBS Ca++/ Mg++ für 3 Minuten.
- Entfernen Sie PBS und fügen Sie 500 μL 70% Ethanol zu jeder Vertiefung hinzu. Versiegeln Sie die 24-Well-Platte mit einer Paraffin-Kunststofffolie. Mindestens vier Stunden lang bei 4 °C auf einen Rotator legen. Es ist am besten, die Proben über Nacht in 70% Ethanol zu lassen. Das Protokoll kann an dieser Stelle pausiert werden und die Proben können bis zu einer Woche in 70% Ethanol gelagert werden.
HINWEIS: Alternativ kann ein 0,5% Triton-X100 in PBS mit 2 mM VRC-Lösung verwendet werden. Inkubieren Sie die Proben in 500 μL dieses Permeabilisierungspuffers für 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator. Bei Verwendung dieses Permeabilisierungspuffers kann das Protokoll an dieser Stelle nicht angehalten werden und muss den Hybridisierungsschritt durchlaufen.
4. Hybridisierung für RNA FISH
- Entfernen Sie den Permeabilisierungspuffer und waschen Sie ihn einmal in 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für 5 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.
- Bereiten Sie den vollständigen Hybridisierungspuffer vor. Berechnen Sie ca. 30 μL vollständigen Hybridisierungspuffer pro Coverslip. Fügen Sie Formamid zum Hybridisierungspuffer hinzu, um den erforderlichen Prozentsatz zu erreichen. Wenn beispielsweise 500 μL vollständiger Hybridisierungspuffer benötigt werden, dann würde er aus 450 μL des zuvor hergestellten Hybridisierungspuffers plus 50 μL molekularem Formamid bestehen, um 10% vol / vol zu erreichen. Vortex kurz zu mischen.
ACHTUNG: Formamid ist ein Teratogen, das über die Haut aufgenommen wird. Verwenden Sie diese Chemikalie in einem Abzug zusammen mit geeigneten PSA gemäß den institutionellen Vorschriften. - Verdünnen Sie die SONDEN GREB1 Intron (markiert mit Atto 647N) und GREB1 Exon (markiert mit Quasar 570) 1:300 im Hybridisierungspuffer. Mischen Sie durch Pipettieren. Schützen Sie diesen Puffer vor Licht und verwenden Sie ihn sofort.
HINWEIS: Die Sonden wurden wie in Stossi et al7 beschriebenentworfen und hergestellt. Die Sonden werden in der Regel als getrockneter Oligonukleotid-Sondenpool bereitgestellt, der gemäß Herstellerprotokoll14in RNAse-freiem TE-Puffer rekonstituiert werden muss. Die Stammlösung für diese Sonden betrug daher 12,5 μM; die Arbeitskonzentration der Sonden beträgt 42 nM. - Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer für den Hybridisierungsschritt über Nacht vor. Legen Sie ein Stück Paraffin-Kunststofffolie, unbelichtet, mit der Seite nach oben in eine Glas-Petrischale, die mit einem Oberflächendekontaminationsmittel gereinigt wird, um RNases zu entfernen. Sättigen Sie zwei Papiertücher mit sterilem Wasser und legen Sie sie an den Rändern der Petrischale, um Feuchtigkeit zu spenden, da das Trocknen bestimmte Etiketten zerstören kann.
- Aliquotieren Sie die Sonden, indem Sie 30 μL Sonden im Hybridisierungspuffer auf die saubere Seite der Paraffin-Kunststofffolie punktieren. Verteilen Sie die Aliquoten der Sonden so, dass die Abdeckungsrutsche nicht miteinander in Berührung kommen.
- Drehen Sie mit einer sterilisierten Zette die Abdeckzellenseite vorsichtig auf die Sonden in der Glas-Petrischale. Vermeiden Sie Luftblasen und drücken Sie die Abdeckfolien nicht aus.
HINWEIS: Entsorgen Sie die Gewebekulturplatte nicht mit dem 2x SSC-Puffer, da sie für nachfolgende Schritte benötigt wird. - Versiegeln Sie die Glas-Petrischale mit Paraffin-Kunststofffolie und bedecken Sie die Platte mit Folie, um eine Lichteinwirkung gegenüber den Fluorophoren zu verhindern. Über Nacht bis zu 16 Stunden bei 37 °C auf einer flachen, nicht rotierenden Oberfläche inkubieren. Die Inkubationszeit kann empirisch variiert werden, es wird jedoch ein Minimum von 4 Stunden empfohlen.
HINWEIS: Die Coverlips sind anfällig für das Rutschen beim Inkubieren im Hybridisierungspuffer, was zu trockenen Stellen auf dem Coverslip führen und die Probe beschädigen kann.
5. Proben für die Bildgebung vorbereiten
- Am nächsten Tag entfernen Sie die Abdeckungsrlips mit einer Zette aus der Befeuchtungskammer und bringen sie mit der Zellseite nach oben auf die 24-Well-Platte zurück. Fügen Sie 500 μL frischen 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid hinzu, um überschüssige Sonde und unspezifische Hybridisierung auszuwaschen.
HINWEIS: Schützen Sie die Proben ab diesem Zeitpunkt vor Licht. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit 500 μL 2x SSC-Puffer plus 10% Formamid für jeweils 15 Minuten bei 37°C auf einem beheizten Rotator.
- Gegenfärbung von DNA mit DAPI bei 1 μg/ml in 2x SSC-Puffer für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Rotator.
- Einmal mit 2x SSC-Puffer für 5 Minuten bei Raumtemperatur waschen.
- Montieren Sie die Abdeckrlips mit nicht härtenden Montagemedien auf Glasträger, nachdem Sie überschüssigen 2x SSC-Puffer mit einem Papiertuch und einem schnellen Waschen in nukleasefreiem Wasser entfernt haben, um überschüssige Salze zu entfernen. Zum Schluss die Abdecklippen mit klarem Nagellack versiegeln.
6. Hochauflösende Mikroskopie und Bildverarbeitung
- Stellen Sie die Proben auf einem Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop mit einem 60- oder 100-fachen Ölobjektiv und einer sCMOS-Kamera ab. Siehe die Materialtabelle für das spezifische Mikroskop und objektiv, das für dieses Experiment verwendet wurde.
- Vollständige Bildgebung, sobald die Proben vollständig verarbeitet sind, um eine zeitabhängige Verschlechterung des Signals zu vermeiden.
HINWEIS: In diesem Experiment wird Tauchöl mit einem Brechungsindex (RI) von 1,516 verwendet. Empirische Tests sollten durchgeführt werden, um den Öl-RI bestimmten Proben zuzuordnen, da RI-Diskrepanzen zu Aberrationen der Punktspreizfunktion führen, die sich auf die Bilddekonvolution auswirken.
- Vollständige Bildgebung, sobald die Proben vollständig verarbeitet sind, um eine zeitabhängige Verschlechterung des Signals zu vermeiden.
- Die Bilder werden mit einer seitlichen Pixelgröße von 0,10827 μm aufgenommen.
- Optimieren Sie die Beleuchtungsstärke der Lichtquelle (d. h. die prozentuale Durchlässigkeit) und die Belichtungszeiten für jeden Kanal (DAPI-, TRITC-, CY5-Filter in diesem speziellen Beispiel) mit der Probe, die voraussichtlich die höchste Intensität aufweist (d. h. positive Kontrollen). In diesem Experiment wird erwartet, dass die E2-behandelte Probe für beide GREB1-Sondensätze eine höhere Intensität aufweist. Im Allgemeinen beträgt die prozentuale Transmission für GREB1-Intron- und Exonsonden 50 – 100% und die Belichtungszeiten liegen zwischen 0,25 und 0,60 Sekunden.
- Darüber hinaus können Sie Bilder unter Bedingungen erfassen, die Photobleaching und/oder eine Sättigung der Kamerapixel vermeiden. Unserer Erfahrung nach sollte es einen mindestens zehnfachen Unterschied zwischen dem Hintergrund und der Signalintensität geben. Eine Sättigung von wenigen Pixeln/Feld kann aufgrund unspezifischer Signale in der Probe auftreten (z. B. Schmutz auf dem Coverlip, Sondenaggregate außerhalb der Zelle), was akzeptabel sein kann, aber nur, wenn gesättigte Bereiche nicht in die Quantifizierung einbezogen werden.
- Um die Erfassung eines Z-Stacks festzulegen, konzentrieren Sie sich auf das Sample im DAPI-Kanal. Wählen Sie die Ober- und Unterseite des Z-Stapels in den Abständen aus, in denen die DAPI-gefärbten Kerne unsauch werden. Die von uns verwendete z-Stack-Schrittgröße beträgt 0,25 μm pro Slice und der gesamte z-Stack sollte die gesamte Zelle umfassen (ca. 10 μm in MCF-7-Zellen). Die Z-Stack-Schrittgröße ändert sich jedoch je nach verwendetem Objektiv und sollte dem Nyquist-Stichprobenkriterium folgen.
HINWEIS: Introns sind normalerweise nur im Kern vorhanden; Exons befinden sich jedoch sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Wenn Sie den Z-Stack wie oben beschrieben einstellen, erfasst er daher den größten Teil der Intron- und Exon-Markierung, da der Z-Stack die gesamte Zelle umfasst. - Bilden Sie in der Regel mindestens 200 Zellen für die quantitative Analyse in vorläufigen Experimenten ab, um eine Momentaufnahme des Ausmaßes der Reaktion und Variation zwischen den Zellen zu erfassen.
- Einige abgebildete Zellen werden von der endgültigen Analyse ausgeschlossen (d. h. die Abbruchrate), da sie von der Analysepipeline herausgefiltert werden (d. h. Zellen, die den Rahmen des Bildes berühren, apoptotische/mitotische Zellen).
HINWEIS: Bei der Auswahl von Bildbereichen sind einige Faktoren zu beachten. Wählen Sie Bereiche mit gleichmäßig verteilten, nicht überlappenden Zellen, wie sie durch DAPI-markierte Kernfluoreszenz definiert sind. Versuchen Sie außerdem, Bereiche auszuwählen, die die geringste Anzahl von Kernen entlang der Ränder des Bildbereichs aufweisen, um das Zählen von Teilzellen zu vermeiden. Automatisierte, unvoreingenommene Bildgebung wird immer für Experimente bevorzugt, die eine statistische Analyse erfordern. - Devolvieren Sie bilder nach der Aufnahme mit einem aggressiven restaurativen Algorithmus mit 10 Zyklen (d. H. Anzahl der Iterationen). Generieren Sie Projektionen mit maximaler Intensität für die Bildanalyse (lassen Sie diesen Schritt weg, wenn eine spezifische 3D-Analyse erforderlich ist). Speichern Sie alle Projektionsbilder entsprechend der Bittiefe der verwendeten Kamera; in unserem Fall wurden 16-Bit-TIFF-Graustufenbilder gespeichert. RGB-Bilder haben eine reduzierte Bittiefe, was zu einem Informationsverlust führt. DAHER sind RGB-Bilder nicht für die Bildanalyse geeignet.
7. Bildanalyse
- Lesen Sie die Anleitung und laden Sie das Jupyter-Notebook von github herunter (https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).
- Installieren Sie die Python anaconda-Distribution (https://www.anaconda.com/distribution/) Version 3.6 oder höher.
- Öffnen Sie die Eingabeaufforderung anaconda und geben Sie den Installationsbefehl install simple ITK for anaconda ( https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk )ein.
- Öffnen Sie anaconda navigator und starten Sie jupyter notebook. Es öffnet sich ein Webbrowser mit Verzeichnissen und Dateien. Durchsuchen Sie die Verzeichnisstrukturen, um zu dem Verzeichnis zu gelangen, das das heruntergeladene Jupyter-Notebook von github enthält.
- Öffnen Sie das Notizbuch und führen Sie jede Zelle aus, indem Sie gleichzeitig die Umschalttaste und die Eingabetaste drücken.
- Befolgen Sie die Details der einzelnen Funktionen und Schritte im Notizbuch. Für einen anderen Satz von Bildern muss man möglicherweise einige Parameterwerte ändern.
HINWEIS: Kurz gesagt, Kerne werden aus dem DAPI-Kanal mit lokalem Schwellenwert mit einer Blockgröße von 251 Pixeln segmentiert, Löcher wurden gefüllt und Objekte kleiner als 100 Pixel entfernt. Berührende Kerne wurden mit einem Wassereinzugsgebietsalgorithmus gespalten. Die Kernmaske wurde dann um 100 Pixel erweitert und die Wasserscheide wurde verwendet, um berührende Objekte mit Kernen als Becken zu trennen. Um Steady-State-RNA (Exons) zu identifizieren, wurde Otsu-Schwellenwerte verwendet; für transkriptionelle aktive Allele (Intron) wurde zunächst eine Gaußsche Unschärfe (Sigma=1) angewendet und dann die maximale Entropieschwelle verwendet.
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Representative Results
Um hormonelle Reaktionen über smFISH zu analysieren, haben wir beispielsweise das Östrogenrezeptormodell (ER) gewählt, das in Hochdurchsatztests verwendet wird, um das Vorhandensein endokrin wirksamer Chemikalien bei Umweltkatastrophen im Rahmen der Teilnahme am NIEHS Superfund Research Program7zu bestimmen. In diesem Experiment wurden adhärente MCF-7-Brustkrebszellen 24 Stunden lang mit dem ER-Agonisten 17β-Estradiol (E2, 10 nM) oder Vehikel (DMSO) behandelt. Spektral getrennte Sondensätze gegen GREB1 intronic (Atto 647N, rot in Abbildung 1)und exonische (Quasar 570, grün in Abbildung 1)Sequenzen ermöglichen die gleichzeitige Visualisierung und Quantifizierung von entstehenden und reifen mRNA; Wichtig ist, dass die Anzahl der transkriptionell aktiven Allele in jeder Zelle markiert wird, die nachweislich Teil des Östrogen-Reaktionszeitkursesist 7.
Das fertige Protokoll generiert 16-Bit-TIFF (Maximum Intensity Projections) für jede Region von Interesse. Die Kernsegmentierung wird mit DAPI-gefärbten Kernen durchgeführt, und die Zellgrenzen werden durch Erweiterung der Kernmaske geschätzt. GREB1-Intron- und Exonsignale werden dann segmentiert und jeder einzelnen Zelle zugeordnet. Abbildung 1 zeigt devolvierte max.projizierte Bilder und deren Segmentierung für eine mit DMSO und E2 behandelte Probe.
Abbildung 1: smFISH-Beispielbilder und Ausgabe der Bildsegmentierung. (A) MCF-7-Zellen, die 24 Stunden lang mit DMSO (linkes Panel) und 17β-Estradiol (E2, rechtes Panel) behandelt wurden, wurden zu GREB1-Introns (Atto 647N, entstehende mRNA, rot) und GREB1-Exons (Quasar 570, reife mRNA, grün) hybridisiert. Die Bilder werden mit 60x/1,42NA aufgenommen, dezentral und mit maximaler Intensität projiziert. (B) Bilder aus (A) werden durch die beschriebene Bildanalyse-Pipeline verarbeitet, die die Kernmaske definiert, die zelluläre Maske schätzt, einzelne reife mRNA und transkriptionell aktive Allele identifiziert. GREB1-Intron- und Exon-Spots werden dann einzelnen Zellen zugeordnet. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Im Anschluss an die Bildanalyse-Pipeline erhielten wir die Anzahl der Zellen, die die Bildgrenzen nicht berührten, basierend auf der Abbildung von zehn zufälligen Feldern pro Behandlung, und es wurde festgestellt, dass es 150 DMSO-behandelte Zellen und 149 E2-behandelte Zellen gab. Da die aneuploiden MCF-7-Zellen vier Kopien des GREB1-Gens haben, und mit Intron- und Exonsonden, werden überlappende Signale die Anzahl der Allele und Zellen bestimmen, die an der aktiven Transkription beteiligt sind24. Wir bestimmten den Anteil der Zellpopulation für jede Behandlung, die null bis vier aktive GREB1-Allele aufwies, indem wir überlappende Intron- und Exonflecken zählten. Wie in unserer vorherigen Studie definieren wir transkriptionell aktive Zellen als solche, die zwei oder mehr aktive GREB1-Allele7 auften. Wie in Abbildung 2 A-2Bzu sehen ist, weisen E2-behandelte Zellen einen 4-fach erhöhten Anteil von Zellen auf, die zwei oder mehr aktive GREB1-Allele im Vergleich zu vehikelbehandelten Zellen aufweisen7.
Abbildung 2: Quantifizierung von E2-induziertem GREB1 auf Zell-für-Zelle- und Allel-für-Allel-Ebene. (A) Die Verteilung der Anzahl der aktiven GREB1-Allele pro Zelle im Vergleich zu den behandelten Zellen des Fahrzeugs (blaue Balken) und des E2 (rote Balken). (B) Anteil von Zellen, die als transkriptionell aktiv gelten, hier definiert als Zellen mit zwei oder mehr aktiven GREB1-Allelen7. (C) Verteilung der Anzahl der reifen GREB1-mRNA pro Zelle für jede Behandlung. (D) Durchschnittliche Anzahl reifer GREB1-RNA/-Zellen, die als Mittelwert für die Population dargestellt werden. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Introns werden aus entstehendem mRNA gespleißt, um reife mRNA zu erzeugen, die nur aus Exonsequenzen besteht. Daher ist es auch möglich, die Anzahl der reifen mRNA pro Zelle zu zählen, indem die Anzahl der grünen Flecken quantifiziert wird. Abbildung 2C-2D zeigt die Verschiebung der Verteilung der reifen GREB1 mRNA/Zelle und die aggregierte Faltenänderung (20x) in der Zellpopulation nach E2-Behandlung.
In Übereinstimmung mit den ursprünglichen Beobachtungen über 24 Stunden der E2-Behandlung reagieren nicht alle Zellen auf die gleiche Weise (d.h. die Reaktionen sind in der MCF-7-Population heterogen)7. Zum Beispiel zeigt die Anzahl der reifen GREB1 mRNAs pro Zelle selbst in den 24-Stunden-E2-behandelten Zellen einen großen Expressionsbereich (~ 15-fach); Massen-RNA-Quantifizierungsmethoden können die vielfältigen Transkriptionsniveaus in Zellen durch statistische Mittelung nicht erkennen. Dies unterstreicht die Leistungsfähigkeit von smFISH, heterogene Zell-zu-Zell- und Allel-für-Allel-Reaktionen in einer Population isogener Zellen zu untersuchen.
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Discussion
Die beschriebene smFISH-Methodik basiert auf den zuvor veröffentlichten Protokollen7,12,14. In diesem Protokoll erklären wir die kritischen Schritte, die vom Nasslabor (einschließlich Seeding-Dichte, Fixierungszeit, Permeabilisierung und Sondenkonzentration) bis hin zur Bildgebung und Bildanalyse optimiert wurden, um eine vollständige experimentelle Pipeline für Labore bereitzustellen, die an der Durchführung von Einzelzellanalysen der Gentranskription interessiert sind.
Um die Einzelzellanalyse zu erleichtern, ist es wichtig, dass die Zellen subkonfluent sind und sich nicht überlappen, so dass Zellgrenzen geschätzt werden, ohne dass eine Zellgrenze erforderlich ist. Wir schlagen vor, einen Zellproliferationstest durchzuführen, der einen breiten Bereich von Samendichten für die Dauer des Experiments umfasst, um die Zelldichte zu optimieren.
Die Bestimmung der optimalen Fixierungszeit ist entscheidend für ein erfolgreiches smFISH-Experiment. Wir haben festgestellt, dass die Fixierung der Proben mit 4% gereinigtem Formaldehyd, verdünnt in sterilem PBS, das VRC enthält, für 30 Minuten auf Eis die Konsistenz hochwertiger smFISH-Bilder signifikant verbessert, insbesondere wenn eine Strukturanalyse durch Kombination von Antikörpern gegen faktoren von Interesse erforderlich ist. Formaldehyd fixiert Proben durch Vernetzung von Makromolekülen und kann zelluläre Strukturen besser erhalten als andere Fixierungsmethoden, z. B. solche, die organische Lösungsmittel verwenden25. Eine Anpassung der Fixierzeit und -temperatur ist jedoch für die spezifische Probe erforderlich, um eine Über- oder Unterfixierung der Probe zu vermeiden26. VRC ist nützlich, weil es den RNA-Abbau reduziert und besonders bei wenig reichlich vorhandener RNA27hilfreich ist. Es gibt zwei Optionen, mit denen wir für den Permeabilisierungsschritt Erfolg hatten. Die erste ist eine 70% Ethanolinkubation bei 4 °C und die zweite ist eine 0,5% Triton-X100 Inkubation bei Raumtemperatur7,14. Es ist möglich, das gleiche Protokoll bei hohem Durchsatz mit bildgebenden Glasboden-Multiwell-Platten (96 und 384 Wells) durchzuführen. Der konsistente Erfolg bei der Durchführung von smFISH hing von der Verwendung von Glas-Multiwell-Platten mit fixierendem VRC und 0,5% Triton-X 100 mit VRC für den Permeabilisierungsschritt ab. Obwohl optische Kunststoffbodenplatten eine Option sind, waren die Bildqualität und der Erfolg deutlich geringer.
Für die Einzelzellanalyse ist ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis erforderlich, um Hintergrundsignale und Fehlalarme herauszufiltern und beugungsbegrente Stellen korrekt zu identifizieren. Hintergrundsignal ergänzt die Intensitätswerte des interessierenden Signals. Hoher Hintergrund entsteht oft aus suboptimalem experimentellem Design, und obwohl er von fluoreszierenden Intensitätsmessungen subtrahiert wird, ist es am besten, die interessierenden Regionen zunächst mit so wenig Hintergrundsignal wie möglichabbilden 28. Ein hoher Dynamikbereich mit einer minimalen ~ 10-fachen Differenz ist erforderlich, um erfolgreich zu bestimmen, ob das Signal als Hintergrund oder Signal von Interesse betrachtet wird29. Falsch positive Flecken beziehen sich auf Signale, die sich außerhalb der Zellgrenzen befinden, oft aufgrund schlecht gereinigter Abdeckungslippen, unzureichender Waschung nach Hybridisierung oder Sondenaggregation, die auftritt, wenn sonden sich selbst assoziieren30. Wenn unspezifische Signale aufgrund einer unechten Bindung des Oligosatzes an RNAs auftreten, die sich vom Ziel unterscheiden (d. h. aufgrund von Pseudogenen oder Sequenzähnlichkeiten), können diese ausgewertet werden, indem die Sondensätze in einem Modell getestet werden, das das interessierende Gen nicht exprimiert (d. H. Knock-out-MEFs, CRISPR / Cas9-Knock-out)31. Darüber hinaus müssen die Intron- und Exonsonden wie bei jedem Fluoreszenzmikroskopieexperiment spektral getrennt sein. In unserem Beispielexperiment haben wir atto 647N und Quasar 570 Farbstoffe für das GREB1-Sondenset ausgewählt, da sie mit den Spezifikationen der Filtersätze auf dem verwendeten Mikroskop kompatibel sind, beständig gegen Photobleaching sind und eine relativ hohe Quantenausbeutevon 8,14,32aufweisen . Abhängig von der Probe empfehlen wir, eine Verdünnungsreihe der Stammsonde (normalerweise eine Verdünnung von 1:200 bis 1:1000 oder 12,5 nM bis 62,5 nM) zu erstellen, um das beste Signal-Rausch-Verhältnis für jeden spezifischen Sondensatz zu identifizieren. Einige Anbieter liefern individuell beschriftete Sonden mit vom Benutzer ausgewählten Fluorophoren, um die Helligkeit zu erhöhen, das Photobleaching zu reduzieren und bei Bedarf zusätzliche 1-2 Kanäle hinzuzufügen, die bei den meisten modernen Fluoreszenzmikroskopen7,8,14allgemein verfügbar sind. Obwohl smFISH in der Lage ist, RNA mit geringer Häufigkeit zu messen, ist ein Schlüsselproblem die Erhöhung seiner Empfindlichkeit und Fähigkeit, teilweise abgebaute RNA zu erkennen, insbesondere für Gewebeproben. Das Erreichen eines höheren Signal-Rausch-Verhältnisses ist durch die Verwendung verzweigter DNA-Sonden möglich, die das Signal verstärken sollen, obwohl wir in unseren Studien nicht festgestellt haben, dass dieser Ansatz hilfreich ist33. Konfokale Mikroskope verwenden eine fokussierte Lichtquelle, um die Probe zu beleuchten, während sie das unsymperierte Licht daran hindern, die Detektoren mit einem oder mehreren Nadellöchern zu erreichen. Von der konfokalen Punkt-Scanning-Mikroskopie wird für die RNA-FISH-Bildgebung im Allgemeinen abgeraten, da Sonden durch Laserbeleuchtung schneller photobleachen. Abhängig von der Proben- und Signalintensität können konfokale Mikroskope jedoch Bilder mit wenig bis gar keinem Signalverlust erzeugen8. Hier verwendeten wir ein Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskop mit hoher Vergrößerung und hoher numerischer Apertur, um die maximale Anzahl von Photonen zu sammeln, die von den FISH-Sonden emittiert wurden34. Obwohl Bilder durch unscharfes Licht von benachbarten Ebenen des Z-Stacks verschwommen werden können, werden restaurative Dekonvolutionsalgorithmen angewendet, um gebeugtes Licht zwischen den erfassten Z-Stacks rechnerisch bis zu seinem Ursprungspunkt "neu zuzuweisen"34. So entstehen endgültige hochauflösende Bilder für die Bildanalyse. Wenn möglich, wäre es am besten, verschiedene Bildgebungsmodalitäten empirisch zu vergleichen, um das System zu bestimmen, das für Ihr Experiment am besten geeignet ist28.
Es gibt viele mögliche Erweiterungen und Anwendungen von smFISH. In unserem Modellexperiment haben wir eine Runde der Hybridisierung mit einem Satz Sonden für das GREB1-Gen abgeschlossen. Es ist jedoch möglich, mehrere Runden smFISH nacheinander abzuschließen (seqFISH)13,35. Bei dieser Methode werden die mRNAs in der Zelle durch sequentielle Runden der Hybridisierung, Bildgebung, Sondenabstreifung und Rehybridisierung markiert. Um das Multiplexing massiv auf die ebene Ebene des gesamten Transkriptoms zu erhöhen, wurden Barcoding-Techniken entwickelt (z.B. MER-FISH)36,37,38. Dies verwendet eine Fluoreszenz-Barcode-Strategie, um jede mRNA37,39 eindeutigzu identifizieren. Diese Techniken wurden an Gewebe angepasst, und in Verbindung mit der Expansionsmikroskopie, einer Methode, die eine Probe physikalisch mit einem Polymernetzwerk erweitert, kann sie einen verbesserten Zugang von Sonden zu endogenen RNAs36,40,41ermöglichen. MER-FISH ermöglicht auch die Erhöhung der Signalhelligkeit einzelner Moleküle durch Signalverstärkungstechniken38. Das von uns beschriebene Protokoll ist ein zweitägiger Prozess, es ist jedoch möglich, das smFISH-Protokoll so zu verkürzen, dass die Hybridisierung der Sonden zur Ziel-RNA in nur ~ 5 Minuten erfolgen kann (Turbo-FISH)26. Immunfluoreszenz kann mit smFISH (IF-FISH) kombiniert werden, um gleichzeitig Proteine und mRNA in einer einzigen Probenachzuweisen 42. Das Protokoll muss für die FISH-Sonden und Antikörper optimiert werden, die für jedes Experiment verwendet werden, um den Abbau von Protein und / oder RNA-Abbau in der Probe zu reduzieren, da einige Materialien (d. H. Puffer und Fixiermittel) nicht für die Verarbeitung von Protein und mRNA kompatibel sind43. Beziehen Sie sich auf mehrere Publikationen aus unserem Labor als Beispiele für erfolgreiche IF-FISH-Experimente zusätzlich zu den optimierten IF-FISH-Protokollen7,18.
Abschließend stellen wir eine SmFISH-Methode (Single Molecule Fluorescence in situ Hybridization) vor, die Einblicke in die Heterogenität einzelner Zellen und die Allel-für-Allel-Variation als Reaktion auf Reize bietet. Während dieses Protokoll für das zuvor beschriebene Modellsystem optimiert ist, bieten wir eine Reihe möglicher Anpassungen, die andere Zielgenmodelle verbessern können7.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
MAM, FS und MGM werden von NIEHS gefördert (Project 4, P42ES027704, PI, Rusyn). MAM, FS, RMM, MGM und PKS werden vom CPRIT-finanzierten GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics (RP170719) unterstützt. Die Bildgebung wird auch vom Integrated Microscopy Core am Baylor College of Medicine mit Mitteln von NIH (DK56338 und CA125123), CPRIT (RP150578), dem Dan L. Duncan Comprehensive Cancer Center und dem John S. Dunn Gulf Coast Consortium for Chemical Genomics unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2257 | CAS Number 50-28-2 |
| Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free | ThermoFisher Scientific | AM9770 | |
| Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose | Fisher Scientific | MT10017CV | Manufactured by Invitrogen |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D8417 | Without sodium pyruvate |
| Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile | Sigma-Aldrich | 3730-100ML | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++ | Corning | 21030CV | Manufactured by Calbiochem |
| Ethanol, 200 Proof (100%) | Fisher Scientific | 07-678-005 | |
| Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate | Corning | 353047 | Manufactured by Decon Laboratories |
| Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL | Fisher Scientific | 50-753-2978 | Manufactured by Gemini Bio Products |
| GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope | GE Healthcare | ||
| Hyclone Water, Molecular Biology Grade | Fisher Scientific | SH3053802 | |
| Immersion Oil 1.516 | GE Healthcare Life Sciences | 29162940 | Manufactured by GE Healthcare Bio-Science |
| L-glutamine Solution | Fisher Scientific | MT25005Cl | Manufactured by Corning |
| MCF-7 cells | ATCC | HTB-22 | |
| Molecular Grade Formamide | Promega | PAH5051 | |
| Olympus 60x/1.42 NA Objective | Olympus | ||
| Parafilm | Bemis Company, Inc. | 52858-076 | Distributed by VWR |
| Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Penicilin-Streptomycin Solution | Fisher Scientific | MT3001Cl | Manufactured by Corning |
| Ribonucleoside Vanadyl Complex | VWR | 101229-716 | Manufactured by New England Biosciences |
| RNase Away | Ambion | 9780 | |
| Sodium pyruvate, 100 mM | Fisher Scientific | 11-360-070 | Manufactured by Gibco |
| Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5 | Fisher Scientific | 12-545-81P | |
| Triton X-100, 100 mL | Fisher Scientific | BP151-100 | Manufactured by Fisher BioReagents |
| Trypsin-EDTA Solution 0.25% | Sigma-Aldrich | T4049-500ML | |
| Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL | Fisher Scientific | NC9265087 | Manufactured by Vector Laboratories |
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