Summary
Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC) afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel.
Abstract
Retinale degeneratieve (RD) aandoeningen geassocieerd met fotoreceptorverlies zoals leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), retinitis pigmentosa (RP) en Leber Congenitale Amaurosis (LCA) veroorzaken progressief en slopend verlies van het gezichtsvermogen. Er is een onvervulde behoefte aan therapieën die het gezichtsvermogen kunnen herstellen zodra fotoreceptoren verloren zijn gegaan. Transplantatie van menselijke pluripotente stamcel (hPSC)-afgeleid retinaal weefsel (organoïden) in de subretinale ruimte van een oog met geavanceerde RD brengt retinale weefselvellen met duizenden gezonde mutatievrije fotoreceptoren en heeft een potentieel om de meeste / alle blinderende ziekten geassocieerd met fotoreceptordegeneratie te behandelen met één goedgekeurd protocol. Transplantatie van foetaal netvliesweefsel in de subretinale ruimte van diermodellen en mensen met gevorderde RD is met succes ontwikkeld, maar kan niet worden gebruikt als een routinetherapie vanwege ethische problemen en beperkte weefseltoevoer. Grote oog erfelijke retinale degeneratie (IRD) diermodellen zijn waardevol voor het ontwikkelen van gezichtshersteltherapieën met behulp van geavanceerde chirurgische benaderingen om retinale cellen / weefsel in de subretinale ruimte te transplanteren. De overeenkomsten in bolgrootte en fotoreceptordistributie (bijv. Aanwezigheid van macula-achtige regiogebiedcentralisten) en beschikbaarheid van IRD-modellen die de menselijke IRD nauw samenvatten, zouden een snelle vertaling van een veelbelovende therapie naar de kliniek vergemakkelijken. Hier wordt een chirurgische techniek gepresenteerd voor het transplanteren van hPSC-afgeleid netvliesweefsel in de subretinale ruimte van een groot diermodel waarmee deze veelbelovende aanpak in diermodellen kan worden beoordeeld.
Introduction
Miljoenen mensen over de hele wereld worden beïnvloed door retinale degeneratie (RD) met als gevolg een visuele beperking of blindheid geassocieerd met verlies van de lichtgevoelige fotoreceptoren (PR's). Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) is een belangrijke oorzaak van blindheid als gevolg van een combinatie van genetische risicofactoren en omgevings- / levensstijlfactoren. Daarnaast is gebleken dat meer dan 200 genen en loci erfelijke RD (IRD)1 veroorzaken. Retinitis pigmentosa (RP), de meest voorkomende IRD, is genetisch heterogeen met meer dan 3.000 genetische mutaties in ongeveer 70 genen die 2,3,4 worden gerapporteerd. Leber Congenitale Amaurosis (LCA), die blindheid in de kindertijd veroorzaakt, is ook genetisch heterogeen 5,6. Genaugmentatietherapie is ontwikkeld en bevindt zich in klinische onderzoeken voor de behandeling van een klein aantal IRD's 3,7. Er moet echter een afzonderlijke therapie worden ontwikkeld voor de behandeling van elke afzonderlijke genetische vorm van IRD en daarbij slechts een kleine subgroep van patiënten behandelen. Bovendien is genvergroting afhankelijk van de aanwezigheid van een populatie van te redden fotoreceptoren en is daarom niet van toepassing op gevorderde degeneratie.
Er is daarom een dringende en nog onvervulde klinische behoefte aan de ontwikkeling van therapieën die geavanceerde RD's en diepgaande tot terminale blindheid aanpakken en behandelen. In de afgelopen 2 decennia zijn neuroprothetische implantaten ontwikkeld en getest in grote diermodellen, zoals de kat, voorafgaand aan menselijk gebruik 8,9,10,11,12,13,14. Evenzo zijn in de afgelopen 20 jaar retinale vervangingstherapieën met behulp van vellen embryonaal of zelfs volwassen netvlies van zoogdieren die subretinaal zijn getransplanteerd, ontwikkeld 15,16,17,18,19,20,21,22 en zelfs met succes getest bij RD-patiënten 23,24,25. Beide benaderingen maken gebruik van het idee om nieuwe sensoren (fotovoltaïsche siliciumfotodiodes in het geval van neuroprothetische apparaten26,27, en gezonde mutatievrije fotoreceptoren georganiseerd in vellen, in het geval van retinale plaatimplantatie) in het netvlies te introduceren met gedegenereerde PR's. Recente studies hebben het gebruik van op stamcellen gebaseerde benaderingen onderzocht, zoals transplantatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide retinale voorlopers28,29, hPSC-fotoreceptoren 30 en hPSC-retinale organoïden31,32,33. Retinale organoïden maken de vorming van netvliesweefsel in een schaal mogelijk en afleiding van fotoreceptorvellen met duizenden mutatievrije PR's, die lijken op de fotoreceptorlaag in het zich ontwikkelende menselijke foetale netvlies 34,35,36,37,38,39,40 . Het transplanteren van hPSC-afgeleid retinaal weefsel (organoïden) in de subretinale ruimte van patiënten met RD-aandoeningen is een van de nieuwe en veelbelovende benaderingen voor experimentele celtherapie, die wordt nagestreefd door een aantal teams31,32,41,42. Vergeleken met transplantatie van de celsuspensie (van jonge fotoreceptoren of retinale voorlopercellen), werd aangetoond dat getransplanteerde vellen foetale fotoreceptoren resulteerden in verbeteringen in het gezichtsvermogen in klinische onderzoeken23,24.
Het hier gepresenteerde protocol beschrijft in detail een transplantatieprocedure voor subretinale toediening van de gehele retinale organoïden (in plaats van organoïde randen33,41) als een potentieel betere manier om intacte retinale vellen met PR's te introduceren, om de overleving van het transplantaat te vergroten en de bladconservering te verbeteren. Hoewel procedures voor het introduceren van een plat stuk menselijk netvlies en ook RPE-pleisters zijn ontwikkeld43,44,45, is transplantatie van grotere 3D-grafts niet onderzocht. Van stamcellen afgeleide retinale organoïden bieden een onuitputtelijke bron van fotoreceptorbladen voor het ontwikkelen van technologieën voor het herstel van het gezichtsvermogen, zijn vrij van ethische beperkingen en worden beschouwd als een uitstekende bron van menselijk netvliesweefsel voor therapieën gericht op de behandeling van gevorderde RD en terminale blindheid46. De ontwikkeling van chirurgische methoden voor nauwkeurige subretinale implantatie van retinale organoïden met minimaal letsel aan de retinale niche van de gastheer (neuraal netvlies, retinaal pigmentepitheel en retinale en choroïdale vasculatuur) is een van de kritieke stappen voor het bevorderen van dergelijke therapie in de richting van klinische toepassingen31,32. Grote diermodellen zoals katten, honden, varkens en apen hebben bewezen goede modellen te zijn voor het onderzoeken van chirurgische toedieningsmethoden en om de veiligheid van geïmplanteerde vellen weefsel (retinale pigmentepitheel (RPE) cellen) aan te tonen en het gebruik van organoïden te onderzoeken 41,44,45,47,48,49,50 . Het grote dierlijke oog heeft een vergelijkbare bolgrootte als de mens en een vergelijkbare anatomie, waaronder de aanwezigheid van een gebied met een hoge fotoreceptordichtheid, inclusief kegeltjes (het centrale gebied), dat lijkt op de menselijke macula 6,51,52.
In dit manuscript wordt een techniek beschreven voor de implantatie van hPSC-afgeleid retinaal weefsel (organoïden) in de subretinale ruimte van katachtige grote diermodellen (zowel wild-type als CrxRdy / + katten), die, samen met veelbelovende werkzaamheidsresultaten32,53, een basis vormt voor verdere ontwikkeling van dergelijke onderzoekstherapie in de richting van klinische toepassingen om RD-aandoeningen te behandelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Ze werden ook goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Wild-type en CrxRdy / + katten uit een kolonie katten die worden onderhouden aan de Michigan State University werden gebruikt in deze studie. Dieren werden gehuisvest onder 12 uur: 12 uur licht-donker cycli en kregen een commercieel compleet kattendieet.
1. Pre-implantatieprocedures en chirurgische opzet
- Selecteer wild-type of CrxRdy/+ katten, afhankelijk van de onderzoeksopzet. Voer een pre-chirurgisch oogheelkundig onderzoek uit, inclusief spleetlampbiomicroscopie en indirecte oftalmoscopie. Sluit dieren uit met fundusafwijkingen die geen verband houden met hun genotypen.
- Start de dieren een week voor de implantatie met een immunosuppressief protocol van orale ciclosporine 2 mg/kg en prednisolon 1 mg/kg, beide tweemaal daags om afstoting van het transplantaat te helpen voorkomen.
- Vast de dieren ouder dan 4 maanden 's nachts (minstens 8 uur). Geef 's nachts een beperkte hoeveelheid natvoer aan de dieren jonger dan 4 maanden en vast ze vervolgens 2 uur voorafgaand aan de operatie.
- Voer een algemeen lichamelijk onderzoek uit, inclusief auscultatie op de borst (met behulp van een stethoscoop). Noteer de hart- en ademhalingsfrequentie, temperatuur, slijmvlieskleur en capillaire bijvultijd.
- Premedicatie van de dieren jonger dan 4 maanden met buprenorfine (0,02 mg/kg) en dieren ouder dan 4 maanden met buprenorfine (0,02 mg/kg) in combinatie met acepromazine (0,02 mg/kg) subcutaan of intramusculair 30-45 min voorafgaand aan algemene anesthesie-inductie.
- Breng topische 1% tropicamide oftalmische oplossing en 10% fenylefrine oftalmische oplossing minstens twee keer aan op het oculaire oppervlak om de pupillen te verwijden. Herhaal dit als de pupillen niet goed verwijd zijn.
- Plaats een intraveneuze katheter van 22 G in de cefalische ader bij alle dieren: knip eerst het haar van een gebied van 2 x 3 cm over de cefalische ader; bereid de huid voor door deze eerst te scrubben met 70% ethanol en vervolgens met een chloorhexidinescrub; Plaats de katheter en zet vast met medische tape en spoel met gehepariniseerde zoutoplossing. Bij dieren jonger dan 4 maanden kan dit worden gedaan na inductie van anesthesie.
- Induceer algemene anesthesie 30-45 minuten na premedicatie: dieren jonger dan 4 maanden worden geïnduceerd met isofluraan toegediend door masker, dieren ouder dan 4 maanden worden geïnduceerd met intraveneus propofol (4-6 mg / kg).
- Intubate met een geschikte grootte van de endotracheale buis. Visualiseer het strottenhoofd met een onderzoekslamp of laryngoscoop. Spuit 0,1 ml lidocaïne 2% op het strottenhoofd, wacht een paar seconden en intuber dan.
- Handhaaf anesthesie met isofluraan (tussen 2% -3,5%) in zuurstof (300-600 ml / kg / min) via een Bain-systeem.
- Plaats het dier in dorsale lighouding op een positioneringskussen waarop een verwarmde waterdeken bedekt met handdoeken is geplaatst. Bevestig een patiëntmonitor en controleer de hartslag en het elektrocardiogram (ECG), ademhalingsfrequentie, bloeddruk, zuurstofverzadiging en koolstofdioxide aan het eindgetij. Controleer regelmatig de lichaamstemperatuur tijdens de procedure. Een goed opgeleide persoon is verantwoordelijk voor het onderhoud en de monitoring van anesthesie.
- Plaats het dier met behulp van het positioneringskussen zodanig dat het hoornvliesoppervlak horizontaal is wanneer het oog in een primaire blikpositie wordt gedraaid. Bevestig het hoofd op zijn plaats met medische tape.
- Bedek het dier met dekens om de lichaamstemperatuur te helpen handhaven.
- Spoel de intraveneuze katheter met gehepariniseerde zoutoplossing en start een intraveneuze infusie van Ringerlactaat met 2-5 ml/kg/uur voor de duur van de procedure.
- Bereid het oculaire oppervlak, de conjunctivale zak en de oogleden voor op aseptische chirurgie met behulp van 0,2% povidon-jodium, steriele wattenstaafjesapplicators en wattenbollen.
- Plaats de bedieningsmicroscoop met oculairs die ook op de juiste manier zijn afgesteld. Plaats de voetbediening voor de microscoop (focus-, zoom- en XY-asbesturing) en het vitrectomieapparaat zodanig dat de chirurg ze kan bedienen.
- Bereid je voor op aseptische chirurgie: al het personeel moet chirurgische scrubs, een chirurgische hoed en een masker dragen. Zorg ervoor dat de chirurg en de assistent(en) schrobben, toga en handschoen zoals voor routinematige aseptische chirurgie. Al het personeel moet bekend zijn met aseptische technieken.
- Zodra het personeel is geschrobd, gehuld en gehandschoend, opent u de chirurgische pakketten en legt u de instrumenten neer. Plaats steriele manipulatieknoppen op de instelknoppen van de microscoop om de chirurg of de assistent in staat te stellen zich aan te passen zonder asepsis te breken. Drapeer het dier op een routinematige manier voor oogchirurgie.
- Bereid het vitrectomieapparaat voor volgens de instructies van de fabrikant voor een vitrectomie met twee poorten.
- Plaats een vitrectomie contactlens en twee poorten 23 G vitrectomie op de tafel van de assistent. Bevestig de natte veldketel. Bevestig en primeer de infusieslang en het 23 G vitrectomiehandstuk.
- Plaats de vitrectomie-instrumenten en vloeistofleidingen over het steriele gordijn en houd ze op hun plaats met handdoekklemmen. Stel de vitrectomiemachine in proportionele vacuümmodus in tussen 1.500 en 2.500 sneden per minuut (cpm) en een maximaal vacuüm van 500 mmHg. Dit wordt uitgevoerd door op de pijlknoppen (naar boven of naar beneden) op het voorpaneel van het vitrectomieapparaat te drukken.
2. Voorbereiding van de organoïden voor subretinale implantatie (figuur 1)
- Leid retinale organoïden af zoals eerder beschreven 31 en, indien nodig, verzend 's nachts bij37 ° C zoals eerder gemeld54.
- Veeg de oppervlakken in de weefselkweekruimte in het ontvangende laboratorium af met een ontsmettingsmiddel en handhaaf hetzelfde hoge niveau van aseptische techniek als in een chirurgische suite voor oogoperaties, om bacteriële of schimmelbesmetting te voorkomen, en draag over naar de operatiekamer om infectie van de operatieplaats te voorkomen.
- Draag chirurgische schoenovertrekken, wegwerplaboratoriumjassen, mutsen, chirurgische maskers, mouwen en chirurgische scrubs in de weefselkweekruimte die is toegewezen voor organoïdevoorbereiding voor oogoperaties.
- Pre-equilibrate neurale media met 20 ng / ml basis fibroblastgroeifactor (bFGF) en 20 ng / ml van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF) gedurende 1 uur in een weefselkweekincubator (37 ° C, 5% CO2). Plaats organoïden in media in ultralage hechtingsplaten met ongeveer een vierde volume geconditioneerd medium (van de nachtelijke verzending) en driekwart volume vers medium31,54. Handhaven gedurende 24-48 uur.
- Bereid en balanceer verschillende verse platen van 60 mm met neuraal medium (zoals bereid in stap 2.4) gedurende ten minste 1 uur in de weefselkweekincubator (37 °C, 5% CO2) voordat het eerste dier wordt verdoofd. Merk op dat deze platen worden gebruikt voor het overbrengen van de organoïden voor elke individuele operatie, met de aanname dat pH-omstandigheden en CO2-verzadiging gedurende ten minste 20 minuten in de media worden gehandhaafd, voldoende om de plaat naar de operatiekamer te verplaatsen en organoïden in de canule te laden.
- Gebruik een verse plaat van 60 mm met voorverzadigde neurale media voor elk transplantatiegeval, terwijl u de resterende platen in de weefselkweekincubator op 37 °C houdt.
- Breng 6-9 organoïden over in één schaal van 60 mm (met opnieuw verzadigde media) door ze uit te pipetteren met een handmatige eenkanaalspipet (20-200 μL) met 200 μL steriele filterpunt met een brede (~ 0,7 mm) opening. Deze tips kunnen van tevoren of tijdens de procedure worden voorbereid door ~ 3-4 mm van de punt af te knippen met een steriele schaar (gedaan in de weefselkweekkap om besmetting te voorkomen). Plaats de schaal van 60 mm in een weefselkweekschaal van 100 mm (om besmetting tijdens het transport van kamer naar kamer te voorkomen) en transporteer snel naar de chirurgische suite.
- Plaats de plaat met organoïden op een elektrisch verwarmingskussen van 37 °C, bedekt met een steriel gordijn.
- Verander in een vers paar steriele handschoenen voordat je de organoïden voorbereidt.
- Spoel de organoïden in steriele gebalanceerde zoutoplossing (BSS) (optioneel) en laad ze vervolgens in de injector, die bestaat uit een dunwandige borosilicaatglazen canule (buitendiameter, OD 1,52 mm; binnendiameter, ID 1,12 mm) met een gepolijst stomp uiteinde bevestigd door steriele plastic buizen aan een steriele 500 μL Hamilton-spuit voorgevuld met steriele BSS.
- Geef de canule op een steriele manier door aan het chirurgische team wanneer ze klaar zijn om de organoïden te injecteren.
- Houd de lengte van de gehele procedure (van het verwijderen van de organoïden uit weefselkweekmedia tot het laden van de canule) op 20 minuten of minder.
- Als er een vertraging is bij het implanteren van de organoïden, plaats ze dan terug in de couveuse voor weefselkweek, om veranderingen in pH / CO 2-verzadiging in de schaal te voorkomen.
- Bewaar ongebruikte organoïden gedurende 1 week in dezelfde weefselkweekincubator en controleer op tekenen van besmetting.
3. Subretinale organoïden implantatie
- Voer een 0,5-1 cm laterale canthotomie uit met stevens tenotomieschaar. Plaats een Barraquer-ooglidspeculum van de juiste grootte om de oogleden open te houden. Zorg ervoor dat de chirurgische assistent het hoornvlies regelmatig irrigeert met BSS voor de duur van de procedure.
- Plaats 2 hechtingen van 6-0 zijden hechtingen in het bindvlies direct grenzend aan de limbus op de posities 4 en 8 uur om het oog in primaire blik te houden en het derde ooglid in te trekken. Gebruik 0,5 Castroviejo corneale bindtang en een kleine mug hemostat om het bulbaire bindvlies naast de limbus voorzichtig vast te pakken. Laat de hechtingen lang en klem de uiteinden vast met kleine muggenhemostaten om te helpen bij hun manipulatie.
OPMERKING: Het plaatsen van de hechtdraad onder het derde ooglid is moeilijker; Zorg ervoor dat u het direct naast de limbus plaatst. - Plaats een andere hechting op de positie van 12 uur op de limbus gedeeltelijk door de dikte van de limbus en zorg ervoor dat deze niet in het oog doordringt. Knoop deze hechting los en knip de uiteinden kort. Dit zorgt voor een robuuste ankerhechting, die tijdens de operatie wordt gebruikt als een "handvat" om het oog te roteren zodat de chirurg toegang heeft tot verschillende delen van de wereld tijdens verschillende stadia van de procedure.
OPMERKING: Stap 3.2 en 3.3 kunnen worden omgekeerd. De volgorde van plaatsing van verblijfsnaden heeft de voorkeur van de chirurg. - Reflecteer het bulbaire bindvlies tussen 10-2 uur (een perimetrie). Gebruik een tenotomieschar om het bindvlies 2-3 mm van de limbus in te snijden. Ondermijn het en verwijder de capsule van de tenon om de sclera bloot te leggen op de plaatsen voor de vitrectomiepoorten van 2 en 10 uur, die ongeveer 3-5 mm van de limbus worden geplaatst, afhankelijk van de leeftijd van het dier. Gebruik chirurgische cellulosesperen voor hemostase en om bloed te verwijderen.
- Identificeer plaatsen voor sclerotomie na de reflectie van het bindvlies en de capsule van tenon met behulp van remklauwen. Kies sclerotomieplaatsen (op 2 en 10 uur gericht op het passeren van pars plana), om de belangrijkste sclerale vaten te vermijden die prominent in de kat kunnen zijn. Gebruik natveldcauterie op de sclera op de geplande sclerotomieplaatsen om sclerale bloedingen te verminderen, plan voor een gebied van ~ 3 mm bij de instrumentpoort (10 uur poort voor een rechtshandige chirurg) omdat dit na de vitrectomie zal worden vergroot om de implantatiecanule te kunnen introduceren.
- Plaats vooraf kruispatroonnaden (6-0 of 7-0 polyglictinehechting) zonder de knoop op de plaats van de voorgestelde sclerotomieën te binden voordat de vitrectomiepoorten worden geplaatst.
OPMERKING: Dit vergemakkelijkt een snelle sluiting van de sclerotomieën aan het einde van de procedure. De hechting voor de geplande instrumentpoort moet een langere beet van sclera hebben, omdat dit een lange incisie zal zijn. - Zodra de hechtingen zijn geplaatst, vraag je de assistent om de wereldbol te helpen positioneren door de 12 uur durende hechtingen vast te houden door een tang van Bishop-Harmon vast te binden of te gebruiken. Laat de chirurg ook de wereldbol stabiliseren, met behulp van een 0,12 mm Castroviejo-tang om het weefsel naast de sclerotomieplaats te houden.
- Introduceer een 23 G vitrectomiepoort met behulp van een trocar door de sclera op zowel de 2 uur als 10 uur posities gericht in een hoek naar de oogzenuw om contact met de lens te voorkomen.
- Controleer of de irrigatiepoort zich in het glasvocht bevindt door zachtjes op de poort te duwen met behulp van een bindtang, zodat de punt in het glasvocht kan worden gevisualiseerd. Zodra de juiste positionering is bevestigd, bevestigt u de irrigatielijn aan de poort en positioneert u de lijn met behulp van dunne zelfklevende verbanden om deze op zijn plaats te plakken. Stel de vitrectomie-infusie van de BSS-buffer aanvankelijk in op 30-35 mmHg door op de pijlknoppen (naar boven of naar beneden) op het voorpaneel van het vitrectomieapparaat te drukken.
- Laat de assistent een Machemer vergrotende irrigerende vitrectomielens op het hoornvlies houden om visualisatie van het achterste segment van het oog tijdens de volgende fasen mogelijk te maken. Bevestig de irrigerende vitrectomielens aan een druppelset die zorgt voor een constante vloeistoftoevoer om de lens aan het hoornvlies te koppelen.
OPMERKING: Andere vormen van contactvitrectomie lens kunnen ook worden gebruikt. Dim of schakel de kamerverlichting uit om te helpen visualiseren door de bedieningsmicroscoop. - Steek de 23 G vitrectomiesonde/snijder (2.500 cpm) door de instrumentpoort (grenzend aan de dominante hand van de chirurg, d.w.z. de 10 uur poort voor een rechtshandige chirurg) en voer een gedeeltelijke kernvitrectomie uit.
- Verwijder vervolgens het glasvocht volledig van het netvliesoppervlak in het gebied dat de transplantatie zal ontvangen (dit is belangrijk voor het succes van de procedure) door het vitreale gezicht van het netvlies los te maken.
- Plaats de vitrectomiesonde over de oogzenuwkop met de poort weg van het netvliesoppervlak en breng een hoger vacuüm aan om de vitreale gezichtsloslating te starten.
- Bereid triamcinolonkristallen voor intraoculair gebruik. Als de triamcinolonsuspensie niet specifiek voor intravitreaal gebruik is, was dan de kristallen en suspensie vervolgens opnieuw in BSS.
- Filter in eerste instantie de suspensie met behulp van een steriel poriënspuitfilter van 0,22 μm met PES-membraan (bevestigd aan een spuit van 1 ml) om de kristallen op te vangen.
- Was vervolgens de gevangen triamcinolonkristallen door BSS in de 1 ml spuit te zuigen en door het filter te spoelen (de kristallen blijven gevangen in het filter). Hierdoor worden de conserveermiddelen in de oplossing verwijderd. Herhaal het wassen 3 keer waarna de kristallen opnieuw worden gesuspendeerd in 1 ml BSS.
- Breng de naald van de spuit die de triamcinolon vasthoudt door de instrumentpoort. Zorg ervoor dat u de lens niet aanraakt door de punt van de naald door de pupil te kijken terwijl u de naald door de instrumentpoort brengt. Injecteer 0,25 tot 0,5 ml kristalsuspensie. Steek vervolgens de vitrectomiesonde door de instrumentpoort en breng deze dicht bij de oogzenuwkop met de poort weg van het netvliesoppervlak en gebruik een hoog vacuüm om het vitreale gezicht van het netvlies los te maken.
OPMERKING: De triamcinolonkristallen kleven aan en markeren zo het resterende glasvocht. Verwijder voorzichtig alle glasvochten boven en naast de plaats van geplande organoïde-implantatie (bijvoorbeeld de centrale tapetale fundus dicht bij het centrale gebied van het gebied ). - Maak een kleine focale netvliesloslatingsknop op de gewenste implantatieplaats met behulp van een subretinale injector, bijvoorbeeld 23 G subretinale injector met een uitschuifbare canule van 41 G bevestigd aan een steriele 250 μL gasdichte Luer lock-spuit gevuld met steriele BSS.
- Voordat u de subretinale bleb maakt, verlaagt u de infusiedruk tot 10 mmHg om de vorming van bleb te vergemakkelijken.
- Plaats de injector door de instrumentpoort en breng deze naar het netvliesoppervlak. Extrudeer de punt van de canule en druk deze voorzichtig op het netvliesoppervlak. Vraag de assistent om een lichte snelle druk op de zuiger van de spuit te geven om de netvliesloslating te starten die de injectiedruk vermindert om een langzame toename van de netvliesloslating mogelijk te maken totdat de gewenste grootte is bereikt (ongeveer 100 tot 200 μL BSS wordt gebruikt).
- Als de gecreëerde retiotomie zich op een geschikte positie bevindt, waardoor het netvlies tussen de implantatieplaats en de oogzenuwkop wordt doorgesneden om de doorsnede van de zenuwvezellaag afgeleid van de implantatieplaats te voorkomen en om grote retinale bloedvaten te vermijden (dit wordt ook bepaald door de onderzoeksopzet, in ons geval werd het centrale netvlies gekozen), vergroot het vervolgens iets met behulp van de canule van 41 G van de injector, met als doel de introductie van een retinale schaar te vergemakkelijken.
- Verwijder de injector uit het oog en verwijder de sclerale poort van 10 uur. Vergroot de sclerotomie op deze plaats met behulp van een recht 2,85 mm spleetmes / keratoom gericht op de oogzenuw om te voorkomen dat de lens wordt aangeraakt. Houd de infusiedruk op 10-15 mmHg.
- Verleng de retiotomie met behulp van een vitreoretinale verticale 80 ° schaar met knijphandvat, vermijd het snijden van retinale vaten om retinale bloeding te voorkomen en zorg ervoor dat u het netvlies aan de rand van de bleb wegsnijdt van de oogzenuwkop om te voorkomen dat zenuwvezels worden doorgesneden die van het netvlies in het transplantatiegebied naar de oogzenuw leiden. De retiotomie moet voldoende breed zijn om de organoïden te ontvangen.
- Plaats het voorgeladen glazen capillair met de organoïden (zie stap 2.10) door de vergrote sclerotomie en breng het naar de retinotomieplaats onder directe visualisatie.
- Gebruik de punt van het glazen capillair om de retiotomie enigszins te openen om toegang te krijgen tot de opening in de subretinale bleb.
- Vraag de assistent om langzaam op de zuiger van de injector te drukken, terwijl hij door de microscoop kijkt en de organoïden in de subretinale bleb injecteert. BSS moet voorafgaan aan de organoïden en de retiotomie openspoelen.
- Duw de organoïden voorzichtig in de bleb met de punt van het glazen capillair als ze zich aan de rand van de retiotomie bevinden.
- Houd het glazen capillair een paar seconden bij de retiotomie om te proberen de retiotomie te sluiten en te voorkomen dat de organoïden in het glasvocht ontsnappen.
- Verwijder heel langzaam het glazen capillair uit het oog en vermijd een plotselinge afgifte van vocht uit het oog om vloeistofbewegingen in het oog te voorkomen die de organoïden uit de subretinale bleb kunnen verdrijven.
- Verhoog de infusiedruk langzaam tot 20-30 mmHg om intraoculaire bloedingen te helpen voorkomen en zorg ervoor dat de infusievloeistof niet rechtstreeks op de bleb spoelt. Dit wordt uitgevoerd door op de opwaartse pijlknoppen op het voorpaneel van het vitrectomieapparaat te drukken.
- Sluit de sclerotomie met behulp van de vooraf geplaatste hechtdraad in een kruisbandpatroon (6-0 of 7-0 polyglactine). Voeg indien nodig extra eenvoudige onderbroken hechtingen toe om de sclerotomie af te dichten.
- Vraag de assistent om de infuuspoort te verwijderen en laat de chirurg snel de vooraf geplaatste hechting binden om de sclerotomie af te dichten en verlies van intraoculaire druk te voorkomen.
- Sluit de conjunctivale incisie (peritomie) met behulp van 6-0 of 7-0 polyglactine in een eenvoudig continu patroon.
- Maak een afbeelding van de fundus (bijvoorbeeld met behulp van een RetCam II-videofunduscamera, Clarity of iets dergelijks) en noteer de onmiddellijke positie van de organoïden in de subretinale ruimte.
- Bereid het oculaire oppervlak opnieuw voor na beeldvorming met behulp van 0,2% povidonjodiumoplossing met behulp van wattentipapplicatoren en wattenbollen. Verwijder de drie achterblijvers en het deksel speculum.
- Sluit de laterale canthotomie met 6-0 polyglactine-hechting. Plaats een enkele begraven hechting gevolgd door een figuur van 8 huidnaden om de laterale canthus te hervormen en gebruik vervolgens eenvoudige onderbroken huidnaden om de rest van de wond te sluiten.
- Nadat de chirurgische procedure is voltooid, geeft u een subconjunctivale injectie van een steroïde en een antibioticumcombinatie (2 mg methylprednisolonacetaat, 0,1 mg dexamethason en 1 mg gentamicine). Plaats een oogheelkundig glijmiddel (kunsttranen) op het hoornvlies.
- Herstel het dier van anesthesie en controleer nauwlettend tijdens het herstel op tekenen van pijn die aanvullende behandeling vereisen, zoals duidelijk blefarospasme, ernstige terughoudendheid om te worden gemanipuleerd, lethargie of verminderde eetlust en verhoogde ademhalings- en hartslag. Zorg voor postoperatieve analgesie indien nodig en controleer nauwlettend op eventuele ongemakken.
OPMERKING: Alleen goed opgeleid personeel mag verantwoordelijk zijn voor het verdoven en controleren van de katachtige patiënten voor, tijdens en na de operatie. Volg de aanbevelingen van de lokale ethische commissie voor dieren voor postoperatieve zorg.
4. Post-implantatieprocedures, postoperatieve behandeling en beoordeling
- Doorgaan met behandelen met orale immunosuppressieve medicijnen (1 mg / kg prednisolon en 2 mg / kg ciclosporine oraal tweemaal daags) om ontsteking en afstoting van de organoïden onder controle te houden. Zorg voor systemische antibioticadekking (bijv. Oraal doxycycline 5 mg / kg tweemaal daags - dit antibioticum werd geselecteerd vanwege het risico op opportunistische mycoplasmale infectie bij immunosuppressieve dieren).
- Voer regelmatig oogheelkundig onderzoek uit om te controleren op ontsteking of de ontwikkeling van bijwerkingen. Controleer de retinale bleb op afplatting, die optreedt gedurende de eerste paar dagen na de operatie, ondanks de grote retinomie die nodig is om organoïden in de subretinale ruimte te injecteren. Neem fundusbeelden op bij elk onderzoek om de positie en het uiterlijk van de getransplanteerde organoïden vast te leggen.
- Beeld de dieren onder algemene anesthesie door confocale scanning laser oftalmoscopie (cSLO) en spectraal domein – optische coherentietomografie (SD-OCT)5,31 tijdens de monitoringperiode en voorafgaand aan de beëindiging van het experiment.
- Euthanaseer de dieren op humane wijze aan het einde van het experiment met behulp van een AVMA-goedgekeurde methode, bijvoorbeeld intraveneuze toediening van 85 mg/kg pentobarbital. Plaats na sedatie een intraveneuze katheter voor toediening van het pentobarbital om stress te minimaliseren. Bevestig de dood door het stoppen van de hartslag en maak een incisie in de thorax om een pneumothorax te creëren.
- Verwijder de ogen via een standaard transconjunctivale benadering en fixeer indien nodig. Voor immunohistochemie (IHC), dompel de ogen onmiddellijk onder in 4% paraformaldehyde-oplossing nadat 0,3 ml van de fixatieve oplossing in het achterste segment is geïnjecteerd via 3 spleten gemaakt door pars plana met een 11 Parker-mes (~ 3-4 mm van de limbus).
- Ontleed de oogschelpen na 3,5 uur fixatie bij 4 °C. Verwijder resterend glasvocht en zorg ervoor dat het netvlies en de organoïden intact blijven. Plaats de oogschelpen nog eens 30 minuten terug in fixatief bij 4 °C en spoel de oogschelpen vervolgens 3 keer gedurende 10 minuten in PBS. Breng de oogschelp gedurende 2 uur over naar 15% sucrose en vervolgens naar 30% sucrose gedurende nog eens 2 uur.
- Spoel de oogschelp tweemaal met PBS en insluiten in OCT-medium (optimale snijtemperatuurverbinding) en bevries vervolgens bij -80 °C tot sectie voor histologie en immunochemie.
- Selecteer antilichamen voor IHC op basis van het onderzoeksprotocol en de doelstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze procedure maakt de succesvolle en reproduceerbare implantatie van hPSC-afgeleide retinale organoïden mogelijk in de subretinale ruimte van een groot oogdiermodel (hier gedemonstreerd aan de hand van 2 voorbeelden: wild-type katten met gezonde fotoreceptoren (PR's) en CrxRdy / + katten met degenererende PR's en netvlies). Bereid met behulp van de stappen in figuur 1 de van hPSC afgeleide retinale organoïden voor en laad deze in de borosilicaatglazen canule van het injectieapparaat, zodat de organoïden niet worden beschadigd. Dit kan worden bevestigd door directe visualisatie tijdens het laden van de organoïden (stap 2.10) en tijdens de operatie (stap 3.16) (figuur 2A,B) en door fundusbeeldvorming aan het einde van de operatie (stap 3.23, figuur 2C). De aanwezigheid van de organoïden in de subretinale ruimte met behulp van deze techniek wordt postoperatief bevestigd door oogheelkundig onderzoek en fundusbeeldvorming (figuur 3A), die de positie en het uiterlijk van de organoïden registreert. Het kennen van de positie van de transplantatie is erg belangrijk bij het verwerken van de bollen voor bevroren histologie en immunohistochemie en vermindert de werklast aanzienlijk, omdat het snijden van een groot oog op 12-14 μm (dikte van een cryosectie) tijd kost. Voorafgaand aan euthanasie worden confocale scanning laser oftalmoscopie (cSLO) en spectrale domein - optische coherentietomografie (SD-OCT) beeldvorming ook uitgevoerd om de positie van de organoïden in de subretinale ruimte te beoordelen (figuur 3A-D). Deze technieken tonen de persistentie van retinale organoïden in de subretinale ruimte (tussen het neurale netvlies en RPE) van het ontvangende oog (figuur 3E). Na euthanasie (humaan uitgevoerd volgens avma-aanbevelingen) wordt de histologie en immunohistochemie (IHC) routinematig uitgevoerd (zie details in eerder gepubliceerd artikel31). De histologie en IHC tonen de overleving aan van xenogene grafts (hPSC-afgeleide retinale organoïden) in de subretinale ruimte van een groot oog wanneer de dieren immunosuppressief waren (zoals eerder beschreven31), zie figuur 4.
Figuur 1: Schema van de stappen voor de voorbereiding van organoïden voorafgaand aan de implantatie.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Chirurgische subretinale implantaties van organoïden. (A) Directe visualisatie van organoïden die via een glazen canule in de subretinale ruimte worden afgeleverd zonder te worden beschadigd, (B) Directe visualisatie van organoïden in de subretinale bleb, (C) Groothoek funduskleurenbeeld van de subretinaal geïmplanteerde organoïden onmiddellijk na de operatie. De blebranden worden aangegeven door de zwarte pijlpunten en de retinotomieplaats door de zwarte sterren.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Postoperatieve beoordeling van subretinaal geïmplanteerde organoïden 3 maanden na implantatie bij een CrxRdy/+ kat. (A) Funduskleurbeeld van de subretinaal geïmplanteerde organoïden, (B) cSLO fundusbeeld van de subretinaal geïmplanteerde organoïden, (C) 3D-volumescanreconstructie van het gebied dat de organoïden bevat, (D) cSLO-beeld van het gebied dat subretinale organoïden bevat, (E) SD-OCT-afbeelding met hoge resolutie, dwarsdoorsnede van de subretinaal geïmplanteerde organoïden. De plaats van de retiotomie wordt aangegeven door de zwarte sterren.
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Humane retinale organoïde-afgeleide fotoreceptorvellen (PR-marker RCVRN) in subretinale ruimte van CrxRdy/+ kat, 3 maanden na enten. *Synaptische boutons (hSYP=Synaptophysine) in cat inner nuclear layer (INL).
Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implantatie van hPSC-afgeleid retinaal weefsel (retinale organoïden) in de subretinale ruimte is een veelbelovende experimentele benadering voor het herstellen van het gezichtsvermogen voor retinale degeneratieve ziekten in een laat stadium veroorzaakt door PR-celdood (ernstige of terminale blindheid). De gepresenteerde aanpak bouwt voort op een eerder ontwikkelde en met succes geteste experimentele therapie op basis van subretinale transplantatie van een stuk menselijk foetaal netvliesweefsel23,24,25. Het presenteert het gebruik van een alternatieve, aanvulbare en ethisch aanvaardbare retinale weefselbron afgeleid van hPSC's. Het aantonen van chirurgische haalbaarheid en oculaire veiligheid van therapie in grote oogdiermodellen51,55 is nodig voor de vooruitgang van deze veelbelovende benadering van klinische toepassingen. Dit manuscript biedt een gedetailleerde methode voor subretinale implantatie van hPSC-3D retinale weefsel (retinale organoïden) in een groot diermodel met zowel normaal als degenererend netvlies (model van CrxRdy / + kattenmodel van LCA). Hoewel procedures voor het introduceren van een plat stuk menselijk netvlies en ook RPE-pleisters zijn ontwikkeld43,44,45, is transplantatie van grotere 3D-grafts (nodig om het gezichtsvermogen te herstellen in omstandigheden met geavanceerde RD) niet onderzocht. Het hier in detail beschreven protocol is voor een transplantatieprocedure voor subretinale toediening van de gehele retinale organoïden (in plaats van organoïde randen33,41) die ook wat RPE dragen als een potentieel betere manier om intacte retinale vellen met PR's te introduceren, om de overleving van het transplantaat te vergroten en de plaatconservering te verbeteren. Merk op dat verschillende delen van dit protocol goed ingeburgerd zijn. Vitrectomie wordt bijvoorbeeld veel gebruikt door vitreoretinale chirurgen tijdens retinale herbevestigingschirurgie 56,57,58,59,60. Subretinale injecties worden steeds vaker gebruikt, bijvoorbeeld bij genaugmentatietherapie 3,7,61,62,63,64. Er zijn beperkte beschrijvingen van het creëren van een adequate retiotomie en de injectie van relatief grote organoïden in de subretinale ruimte.
De kritieke stappen omvatten zorgvuldige positionering en uitvoering van de sclerotomie om de lens te vermijden, volledige verwijdering van glasvochtschors van het netvliesoppervlak over de transplantatieplaats, gecontroleerde vorming van de subretinale bleb, het genereren van retinotomie van de optimale grootte om de breedte van de transplantatiecanule te accommoderen, het handhaven van de gedefinieerde infusiedruk tijdens verschillende stappen, en canule-terugtrekking. Het kiezen van de juiste transplantatiecanule met geoptimaliseerde binnen- en buitendiameter (ID en OD) en lengte, controle van intraoculaire bloedingen, steriliteit van de hele procedure van organoïden tot operatiekamer en instrumenten, en de duur van de operatie (30-45 min / dier) om optimale resultaten te garanderen. De auteurs vinden dat de beste resultaten worden verkregen met 23 G vitrectomie vanwege de dikte / viscositeit van het kattenglas, het creëren van een bleb met een injector met een canule van 41 G en vervolgens het verlengen van de retinomie aan de rand van de bleb met behulp van een retinale schaar met een hoek van 80 °. Andere belangrijke factoren zijn het verlengen van de sclerotomie met behulp van een keratoom van 2,85 mm om de roboticlaatglazen canule te passen (buitendiameter OD 1,52 mm; binnendiameter, ID 1,12 mm; en lengte 10,16 cm) en het toestaan van implantatie van grotere organoïden in een groot oog met axiale lengte ongeveer 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. Het gebruik van een glazen capillair was het momenteel beste dat beschikbaar is voor het laden en leveren van organoïden van afdalingsgrootte zonder ze te beschadigen tijdens het implantatieproces. Het bleek dat het verlagen van de infusiedruk van 20-30 mmHg tijdens de vitrectomie tot 10 mmHg tijdens de blebvormingsstap optimaal is voor het genereren van netvliesloslatingen, nodig voor het creëren van ruimte voor retinale organoïden. Bovendien zijn de levensvatbaarheid van hPSC-3D retinaal weefsel (organoïden) tijdens verzending over lange afstand en het kiezen van het geoptimaliseerde immunosuppressieregime voor het onderhoud van xenogene menselijke grafts van cruciaal belang, zoals onlangs gemeld31,54.
De auteurs ontdekten dat vanwege het sterk reflecterende kattentapetum endo-verlichting niet nodig was om de operatie uit te voeren. Transplantatie in een atapetale soort (bijv. Varken, niet-menselijke primaat) zou een 3-poorts vitrectomie vereisen die endo-verlichting omvat. Tamponade (bijv. met perfluorkoolstof gevolgd door siliconenolie) zoals uitgevoerd bij routinematige netvliesloslatingsoperaties werd niet uitgevoerd omdat druk op de bleb het risico zou lopen de organoïden in het glasvocht te extruderen. Toekomstige ontwikkelingen kunnen het gebruik omvatten van materialen die momenteel worden onderzocht voor het afdichten van netvliesgaten. Dit kan worden gebruikt om post-implantatie verlies van organoïden in het glasvocht te voorkomen. Bovendien kan Triescence, dat vergelijkbaar is met Kenalog-40 maar conserveermiddelvrij triamcinolon bevat, worden gebruikt als een alternatief om het glasvocht te visualiseren.
De kleinere bolgrootte bij jongere dieren (bijv. 1-2 maanden) bood meer chirurgische uitdagingen in vergelijking met het grote oog (volwassen dieren). Niettemin is het met behulp van de hier beschreven methode mogelijk om de subretinale grafts af te leveren. In het CrxRdy/+ LCA-model bleken grotere retinale blebs niet altijd opnieuw te hechten. Door de bleb op de minimale grootte te houden die nodig is om de retinale organoïden te kunnen injecteren, werd deze complicatie verminderd. Eerder transplanteren in RD-netvlies (vóór het volledige verlies van PR's wanneer het neurale netvlies duidelijk dunner wordt) is een andere richtlijn, in lijn met het eerdere werk met menselijke foetale netvliestransplantaten20. Een andere opmerking - de gedetailleerde techniek is niet afhankelijk van het plaatsen van het retinale blad in de juiste oriëntatie, omdat de hele retinale organoïden worden getransplanteerd. Bij de ontwikkeling van platte hESC-retinale vellen zal dit belangrijk zijn. Het is echter niet de focus van dit protocol, dat gericht is op het leveren van intacte hESC-retinale weefselvellen en het optimaliseren van de subretinale conservering van PR-vellen. Toen de techniek eenmaal was ontwikkeld, was deze reproduceerbaar in zowel normaal als RD-netvlies.
Er zijn veel mogelijke complicaties aan deze chirurgische ingreep. Alleen degenen die bekwaam zijn in vitreoretinale chirurgie (bijv. Getrainde veterinaire oogartsen of vitreoretinale chirurgen die bekend zijn met de soortverschillen in het kattenoog in vergelijking met het menselijk oog) mogen de procedure uitvoeren. Mogelijke complicaties zijn lensaanraking tijdens trocarplaatsing, sclerale bloedingen tijdens sclerotomievergroting en subretinale of retinale bloedingen. Andere complicaties zoals de immuunrespons van de gastheer op xenogene menselijke organoïde grafts die leiden tot vernietiging van het transplantaat na verloop van tijd of endoftalmitis zijn mogelijk; Het gebruik van orale immunosuppressiva en antibiotische medicijnen helpen voorkomen dat deze optreden. Het is ook belangrijk op te merken dat er een verschil is tussen implantatie bij wildtype en CrxRdy / + katten. Wanneer er sprake is van gevorderde retinale degeneratie, heeft de retinale bleb de neiging zich breder te verspreiden dan in het wildtype, en in sommige gevallen kan dit volledige retinale herbevestiging na de operatie voorkomen. De hier gepresenteerde techniek is toepasbaar voor implantatie van organoïden in ogen van grote diermodellen van IRD's. Verdere verfijning zou nodig zijn zodra de transplantatie klaar is voor vertaling naar de kliniek.
Op basis van de ervaring van de auteurs met het uitvoeren van complexe vitreoretinale chirurgische procedures in grote oogmodellen, zou de techniek die in dit manuscript wordt gepresenteerd toepasbaar moeten zijn op andere grote diermodellen (met inbegrip van endo-illuminatie in atapetale soorten) die worden gebruikt voor het vertalen van vitreoretinale chirurgische technieken naar de kliniek43,44,45.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., en Igor O. Nasonkin Ph.D. zijn werknemers van Lineage Cell Therapeutics, Inc. De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door NEI Fast-track SBIR-subsidie R44-EY027654-01A1 en SBIR-subsidie 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones is een co-PI). De auteurs willen mevrouw Janice Querubin (MSU RATTS) bedanken voor haar hulp bij anesthesie en algemene zorg voor de dieren die in deze studie zijn opgenomen, evenals hulp bij chirurgische instelling en voorbereiding / sterilisatie van instrumenten. De auteurs willen Dr. Paige Winkler bedanken voor de hulp bij het ontvangen van de organoïden en het plaatsen ervan in media op de dag voorafgaand aan de implantatie en voor de hulp op de dag van de implantatie. De auteurs zijn ook de heer Randy Garchar (LCTX) dankbaar voor het ijverig verzenden van retinale organoïden, het assembleren van de verzender en het downloaden van temperatuur- en G-stress-records na elke zending. Dit werk werd uitgevoerd terwijl auteur Igor Nasonkin in dienst was van Biotime (nu Lineage).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 µm pore syringe filter with PES membrane | Cameo | NA | can be found through various suppliers |
| 23G subretinal injector with extendable 41 G cannula | DORC | 1270.EXT | |
| 250 µL hamilton gas tight luer lock syringe | Hamilton | NA | can be found through various suppliers |
| 6-0 Silk suture | Ethicon | 707G | |
| 6-0/7-0 polyglactin suture | Ethicon | J570G | |
| Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) | Henry Schein Animal Health | NA | can be found through various suppliers |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | Par Pharmaceutical | NA | can be found through various suppliers |
| cSLO + SD-OCT | Heidelberg Engineering | Spectralis HRA+ OCT | |
| Cyclosporine | Novartis | NA | can be found through various suppliers |
| Dexamethasone 2mg/mL (Azium) | Vetone | NA | can be found through various suppliers |
| Doxycyline 25mg/5mL | Cipla | NA | can be found through various suppliers |
| Fatal Plus solution (pentobarbital solution) | Vortech | NA | can be found through various suppliers |
| Gentamicin 20mg/2mL | Hospira | NA | can be found through various suppliers |
| Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing | World Precision Instruments | TW150-4 | |
| Methylprednisolone actetate 40 mg/mL | Pfizer | NA | can be found through various suppliers |
| Microscope | Zeiss | NA | |
| OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) | Sakura | 4583 | |
| Olympic Vac-Pac Size 23 | Natus | NA | can be found through various suppliers |
| Paraformaldehyde 16% solution | EMS | 15719 | |
| Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Prednisolone 15mg/5mL | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) | Zoetis | NA | can be found through various suppliers |
| RetCam II video fundus camera | Clarity Medical Systems | NA | can be found through various suppliers |
| Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) | Bristol -Myers Squibb Company | NA | can be found through various suppliers |
| Tropicamide 1% ophthalmic solution | Akorn | NA | can be found through various suppliers |
| Vitrectomy 23G port | Alcon | Accurus systems | |
| Vitrectomy machine | Alcon | Accurus systems | |
| Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle | Frimen | FT170206T |
References
- Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
- Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
- Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
- Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
- Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
- Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
- Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
- Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
- Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
- Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
- Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
- Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
- Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
- Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
- Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
- Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
- Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
- Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
- Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
- Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
- Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
- Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
- Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
- Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
- Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
- Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
- Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
- Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
- Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
- Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
- Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
- McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
- Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
- Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
- Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
- Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
- Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
- Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
- Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
- da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
- Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
- Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
- Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
- Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
- Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
- Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
- Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
- Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
- Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
- Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
- O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
- Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
- Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
- Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
- Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
- Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).
