Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur

Published: August 5, 2021 doi: 10.3791/61683
Automatic Translation
*1, *1, 2, 2, 2, 1
1College of Veterinary Medicine, Department of Small Animal Clinical Sciences, Michigan State University, 2Lineage Cell Therapeutics, Inc.
* These authors contributed equally

Summary

Här presenteras en kirurgisk teknik för transplantation av human pluripotent stamcellsvävnad (hPSC)-härledd näthinnevävnad i subretinalutrymmet i en stordjursmodell.

Abstract

Retinal degenerativa (RD) tillstånd associerade med fotoreceptorförlust såsom åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) och Leber medfödd amauros (LCA) orsakar progressiv och försvagande synförlust. Det finns ett ouppfyllt behov av terapier som kan återställa synen när fotoreceptorer har gått förlorade. Transplantation av human pluripotent stamcellsvävnad (hPSC)-härledd retinal vävnad (organoider) i det subretinala utrymmet i ett öga med avancerad RD ger retinala vävnadsark med tusentals friska mutationsfria fotoreceptorer och har potential att behandla de flesta/alla blindande sjukdomar associerade med fotoreceptordegeneration med ett godkänt protokoll. Transplantation av fetal näthinnevävnad i subretinalt utrymme hos djurmodeller och personer med avancerad RD har utvecklats framgångsrikt men kan inte användas som rutinbehandling på grund av etiska problem och begränsad vävnadsförsörjning. Stora ögonärvda retinal degeneration (IRD) djurmodeller är värdefulla för att utveckla synåterställningsterapier som använder avancerade kirurgiska metoder för att transplantera näthinneceller / vävnad i subretinalutrymmet. Likheterna i globstorlek och fotoreceptorfördelning (t.ex. närvaro av makulaliknande regionområdescentralis) och tillgängligheten av IRD-modeller som nära rekapitulerar human IRD skulle underlätta snabb översättning av en lovande terapi till kliniken. Här presenteras en kirurgisk teknik för att transplantera hPSC-härledd retinal vävnad i subretinalutrymmet i en stordjursmodell, vilket möjliggör bedömning av detta lovande tillvägagångssätt i djurmodeller.

Introduction

Miljontals människor runt om i världen påverkas av retinal degeneration (RD) med resulterande synnedsättning eller blindhet i samband med förlust av ljusavkännande fotoreceptorer (PR). Åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) är en viktig orsak till blindhet till följd av en kombination av genetiska riskfaktorer och miljö- / livsstilsfaktorer. Dessutom har över 200 gener och loci visat sig orsaka ärftlig RD (IRD)1. Retinitis pigmentosa (RP), den vanligaste IRD, är genetiskt heterogen med mer än 3 000 genetiska mutationer i cirka 70 gener som rapporterats 2,3,4. Leber medfödd amauros (LCA), som orsakar blindhet i barndomen är också genetiskt heterogen 5,6. Genförstärkningsterapi har utvecklats och är i kliniska prövningar för behandling av ett litet antal IRD 3,7. En separat terapi måste dock utvecklas för behandling av varje distinkt genetisk form av IRD och därmed endast behandling av en liten undergrupp av patienter. Dessutom är genförstoring beroende av närvaron av en population av räddningsbara fotoreceptorer och är därför inte tillämplig för avancerad degeneration.

Det finns därför ett brådskande och ännu ouppfyllt kliniskt behov av utveckling av terapier som adresserar och behandlar avancerade RD och djup till terminal blindhet. Under de senaste 2 decennierna har neuroprostetiska implantat utvecklats och testats i stora djurmodeller, såsom katten, före mänsklig användning 8,9,10,11,12,13,14. På samma sätt har retinala ersättningsterapier under de senaste 20 åren som använder ark av embryonal eller till och med mogen däggdjursnäthinna ympad subretinalt utvecklats 15,16,17,18,19,20,21,22 och till och med testats framgångsrikt hos RD-patienter 23,24,25. Båda tillvägagångssätten använder idén att införa nya sensorer (fotovoltaiska kiselfotodioder i fallet med neuroprostetiska enheter26,27 och friska mutationsfria fotoreceptorer organiserade i ark, vid implantation av retinalark) i näthinnan med degenererade PR. Nyligen genomförda studier har undersökt användningen av stamcellsbaserade metoder såsom transplantation av humana pluripotenta stamceller (hPSC)-härledda retinala föregångare28,29, hPSC-fotoreceptorer 30 och hPSC-retinala organoider31,32,33. Retinala organoider möjliggör bildandet av retinal vävnad i en maträtt och härledning av fotoreceptorark med tusentals mutationsfria PR, som liknar fotoreceptorskiktet i den utvecklande mänskliga fosternäthinnan 34,35,36,37,38,39,40 . Transplantation av hPSC-härledd retinal vävnad (organoider) i subretinalutrymmet hos patienter med RD-tillstånd är en av de nya och lovande undersökningscellterapimetoderna, som eftersträvas av ett antal team 31,32,41,42. Jämfört med transplantation av cellsuspensionen (av unga fotoreceptorer eller retinala stamfäder) visade sig transplanterade ark av fetala fotoreceptorer resultera i synförbättringar i kliniska prövningar23,24.

Protokollet som presenteras här beskriver i detalj ett transplantationsförfarande för subretinal leverans av hela retinala organoider (snarare än organoidfälgar33,41) som ett potentiellt bättre sätt att införa intakta näthinneark med PR, för att öka transplantatöverlevnaden och förbättra arkbevarandet. Även om procedurer för att införa en platt bit av mänsklig näthinna och även RPE-plåster har utvecklats43,44,45, har transplantation av större 3D-transplantat inte undersökts. Stamcellshärledda retinala organoider ger en outtömlig källa till fotoreceptorark för att utveckla synåterställningsteknik, är fria från etiska begränsningar och anses vara en utmärkt källa till mänsklig näthinnevävnad för terapier som fokuserar på behandling av avancerad RD och terminal blindhet46. Utveckling av kirurgiska metoder för exakt subretinal implantation av retinala organoider med minimal skada på värdens näthinnenisch (neural näthinna, retinal pigmentepitel och retinal och koroidal vaskulatur) är ett av de kritiska stegen för att utveckla sådan terapi mot kliniska tillämpningar31,32. Stora djurmodeller som katter, hundar, grisar och apor har visat sig vara bra modeller för att undersöka kirurgiska leveransmetoder samt för att visa säkerheten hos implanterade vävnadsark (retinal pigmentepitel (RPE) celler) och undersöka användningen av organoider 41,44,45,47,48,49,50 . Det stora djurögat har en liknande klotstorlek som människa såväl som liknande anatomi inklusive närvaron av en region med hög fotoreceptordensitet, inklusive kottar (area centralis), som liknar den mänskliga makula 6,51,52.

I detta manuskript beskrivs en teknik för implantation av hPSC-härledd retinal vävnad (organoider) i subretinalutrymmet hos kattdjur stora djurmodeller (både vildtyp och CrxRdy / + katter), vilket tillsammans med lovande effektresultat32,53 bygger en grund för vidareutveckling av sådan prövningsterapi mot kliniska tillämpningar för att behandla RD-tillstånd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedurerna utfördes i enlighet med Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) uttalande för användning av djur i oftalmisk och synforskning. De godkändes också av Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee. Vildtyp och CrxRdy / + katter från en koloni av katter som underhålls vid Michigan State University användes i denna studie. Djuren hölls under 12 timmar: 12 timmar ljus-mörka cykler och matades med en kommersiell komplett kattdiet.

1. Preimplantatoriska ingrepp och kirurgisk uppbyggnad

  1. Välj vildtyp eller CrxRdy/+ katter beroende på studiedesign. Utför en prekirurgisk oftalmisk undersökning, inklusive spaltlampbiomikroskopi och indirekt oftalmoskopi. Uteslut alla djur med fundusavvikelser som inte är relaterade till deras genotyper.
  2. En vecka före implantation, starta djuren på ett immunsuppressivt protokoll av oralt cyklosporin 2 mg / kg och prednisolon 1 mg / kg båda två gånger dagligen för att förhindra transplantatavstötning.
  3. Fasta djuren över 4 månaders ålder över natten (minst 8 timmar). Ge en begränsad mängd våtfoder över natten till djuren under 4 månaders ålder, och sedan fasta dem i 2 timmar före operationen.
  4. Utför en allmän fysisk undersökning, inklusive bröstauskultation (med hjälp av ett stetoskop). Registrera hjärt- och andningsfrekvens, temperatur, slemhinnefärg och kapillärpåfyllningstid.
  5. Premedicinera djur yngre än 4 månader med buprenorfin (0,02 mg/kg) och de över 4 månaders ålder med buprenorfin (0,02 mg/kg) i kombination med acepromazin (0,02 mg/kg) subkutant eller intramuskulärt 30–45 minuter före generell anestesiinduktion.
  6. Applicera topikal 1% tropicamid, oftalmisk lösning och 10% fenylefrin oftalmisk lösning på ögonytan minst två gånger för att vidga eleverna. Upprepa om eleverna inte är väl dilaterade.
  7. Placera en 22 G intravenös kateter i den cefaliska venen hos alla djur: klipp först håret från ett 2 x 3 cm område över den cefaliska venen; Förbered huden genom att först skrubba den med 70% etanol och sedan med en klorhexidinskrubba; Placera katetern och säkra med medicinsk tejp och spola med hepariniserad saltlösning. Hos djur under 4 månader kan detta göras efter induktion av anestesi.
  8. Inducera generell anestesi 30–45 min efter premedicinering: djur under 4 månaders ålder induceras med isofluran levererat med mask, de över 4 månaders ålder induceras med intravenöst propofol (4–6 mg/kg).
  9. Intubera med en lämplig storlek av endotrakealtuben. Visualisera struphuvudet med ett undersökningsljus eller laryngoskop. Spraya 0,1 ml lidokain 2% på struphuvudet, vänta några sekunder och intubera sedan.
  10. Behåll anestesi med isofluran (mellan 2% -3,5%) i syre (300-600 ml / kg / min) via ett Bain-system.
  11. Placera djuret i ryggliggande på en positioneringskudde på vilken en uppvärmd vattenfilt täckt av handdukar är placerad. Fäst en patientmonitor och övervaka hjärtfrekvensen och elektrokardiogrammet (EKG), andningsfrekvens, blodtryck, syremättnad och koldioxid i sluttid. Övervaka regelbundet kroppstemperaturen under proceduren. En lämpligt utbildad person ansvarar för underhåll och övervakning av anestesi.
  12. Placera djuret med hjälp av positioneringskudden så att hornhinnans yta är horisontell när ögat roteras till en primär blickposition. Säkra huvudet på plats med medicinsk tejp.
  13. Täck djuret med filtar för att bibehålla kroppstemperaturen.
  14. Spola den intravenösa katetern med hepariniserad saltlösning och starta en intravenös infusion av Ringer-laktat som levereras vid 2-5 ml / kg / h under hela proceduren.
  15. Förbered ögonytan, konjunktivalsäcken och ögonlocken för aseptisk kirurgi med 0,2% povidonjod, sterila bomullspinneapplikatorer och bomullsbollar.
  16. Placera operationsmikroskopet med okular också justerat på lämpligt sätt. Placera fotkontrollen för mikroskopet (fokus, zoom och XY-axelkontroll) och vitrektomimaskinen så att kirurgen kan använda dem.
  17. Förbered dig för aseptisk kirurgi: all personal måste bära kirurgiska scrubs, en kirurgisk hatt och en mask. Se till att kirurgen och assistenten (erna) skrubbar, klänning och handske som för rutinmässig aseptisk kirurgi. All personal bör känna till aseptiska tekniker.
  18. När personalen är skrubbad, klädd och handske, öppna kirurgiska förpackningar och lägg ut instrumenten. Placera sterila manipulationsknappar på mikroskopjusteringsknapparna så att kirurgen eller assistenten kan justera utan att bryta asepsis. Drapera djuret på ett rutinmässigt sätt för okulär kirurgi.
  19. Förbered vitrektomimaskinen enligt tillverkarens instruktioner för en vitrektomi med två portar.
    1. Placera en vitrektomi kontaktlins och två port 23 G vitrektomi på assistentens bord. Fäst det våta fältkauteriet. Sätt fast och fyll på infusionsslangen och 23 G vitrektomihandstycket.
    2. Placera vitrektomiinstrumenten och vätskeledningarna över det sterila draperiet och håll dem på plats med handduksklämmor. Ställ in vitrektomimaskinen i proportionellt vakuumläge mellan 1 500 och 2 500 skärningar per minut (cpm) och maximalt vakuum på 500 mmHg. Detta utförs genom att trycka på pilknapparna (uppåt eller nedåt) som finns på vitrektomimaskinens frontpanel.

2. Beredning av organoiderna för subretinal implantation (figur 1)

  1. Härled retinala organoider enligt beskrivningen tidigare 31 och, om nödvändigt, skicka över natten vid37 ° C som tidigare rapporterats54.
  2. Torka av ytorna i vävnadsodlingsrummet i det mottagande laboratoriet med ett desinfektionsmedel och behåll samma höga nivå av aseptisk teknik som i en kirurgisk svit för ögonoperationer, för att undvika bakteriell eller svampkontaminering och överför till operationsrummet för att undvika infektion i operationsområdet.
  3. Använd kirurgiska skoskydd, engångslaboratorierockar, motorhuvar, kirurgiska masker, ärmar och kirurgiska scrubs inuti vävnadsodlingsrummet som är avsett för organoidberedning för okulära operationer.
  4. Pre-jämvikt neurala medier med 20 ng / ml grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och 20 ng / ml hjärnhärledd neurotrofisk faktor (BDNF) i 1 timme i en vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2). Placera organoider i medier i plattor med ultralåg vidhäftning med ungefär en fjärdedel konditionerat medium (från leveransen över natten) och tre fjärdedelar volym färskt medium 31,54. Behåll i 24–48 timmar.
  5. Bered och balansera flera färska 60 mm plattor med nervmedium (enligt beredningen i steg 2.4) i minst 1 timme i vävnadsodlingsinkubatorn (37 °C, 5 %CO2) innan det första djuret bedövas. Observera att dessa plattor används för att överföra organoiderna för varje enskild operation, med ett antagande om att pH-förhållanden och CO2-mättnad kommer att bibehållas i mediet i minst 20 minuter, tillräckligt för att flytta plattan till operationsrummet och ladda organoider i kanylen.
  6. Använd en ny 60 mm platta med förmättade neurala medier för varje transplantationsfall, samtidigt som de återstående plattorna i vävnadsodlingsinkubatorn hålls vid 37 °C.
  7. Överför 6–9 organoider till en 60 mm skål (med återmättat medium) genom att pipettera ut dem med en manuell enkanalspipett (20–200 μL) med 200 μL steril filterspets med en bred (~0,7 mm) öppning. Dessa tips kan förberedas i förväg eller under proceduren genom att klippa av ~ 3-4 mm av spetsen med ett par sterila saxar (gjort i vävnadsodlingshuven för att undvika kontaminering). Placera 60 mm-skålen i en 100 mm vävnadsodlingsskål (för att undvika kontaminering under rumstransport) och transportera snabbt till operationssviten.
  8. Placera plattan med organoider på en 37 °C elektrisk värmedyna täckt av ett sterilt draperi.
  9. Byt till ett nytt par sterila handskar innan du förbereder organoiderna.
  10. Skölj organoiderna i steril balanserad saltlösning (BSS) (valfritt) och fyll sedan på i injektorn, som består av en tunnväggig borosilikatglaskanyl (ytterdiameter, OD 1,52 mm; innerdiameter, ID 1,12 mm) med en polerad trubbig ände fäst med sterila plaströr på en steril 500 μL Hamilton-spruta förfylld med steril BSS.
  11. Skicka kanylen till det kirurgiska teamet på ett sterilt sätt när de är redo att injicera organoiderna.
  12. Håll längden på hela proceduren (från avlägsnande av organoiderna från vävnadsodlingsmedia till laddning av kanylen) till 20 minuter eller mindre.
  13. Om det finns en fördröjning i implantationen av organoiderna, placera dem tillbaka i vävnadsodlingsinkubatorn för att undvika förändringar i pH / CO2-mättnad inuti skålen.
  14. Behåll oanvända organoider i 1 vecka i samma vävnadsodlingsinkubator och övervaka eventuella tecken på kontaminering.

3. Implantation av subretinala organoider

  1. Utför en 0,5-1 cm lateral canthotomy med Stevens tenotomy sax. Placera ett Barraquer-ögonlocksspekulum av lämplig storlek för att hålla ögonlocken öppna. Se till att den kirurgiska assistenten irrigerar hornhinnan regelbundet med BSS under hela proceduren.
  2. Placera 2 stag suturer av 6-0 silkesutur i bindhinnan omedelbart intill limbus vid 4 och 8 klockpositionerna för att hålla ögat i primär blick och dra tillbaka det tredje ögonlocket. Använd 0,5 Castroviejo hornhinnebindningstångstång och en liten mygghemostat för att försiktigt ta tag i bulbarbindhinnan bredvid limbus. Lämna suturerna långa och kläm fast ändarna med små mygghemostater för att hjälpa till med deras manipulation.
    OBS: Att placera suturen under det tredje ögonlocket är svårare; Var noga med att placera den omedelbart intill limbus.
  3. Placera en annan sutur vid klockan 12 vid limbus, delvis genom limbustjockleken, var försiktig så att du inte tränger in i ögat. Knut denna sutur löst och skär ändarna korta. Detta ger en robust ankarsutur, som används under operationen som ett "handtag" för att rotera ögat för att ge kirurgen tillgång till olika delar av världen under olika stadier av proceduren.
    Steg 3.2 och 3.3 kan inverteras. Sekvensen för vistelsesuturplacering är kirurgens preferens.
  4. Reflektera bulbar konjunktiva mellan klockan 10-2 (en perimetri). Använd tenotomy sax, skära konjunktiva 2-3 mm från limbus. Undergräva det och rensa tenons kapsel för att exponera sclera på platserna för vitrektomiportarna klockan 2 och 10, som kommer att placeras ca 3-5 mm från limbus beroende på djurets ålder. Använd kirurgiska cellulosaspjut för hemostas och för att rensa blod.
  5. Identifiera platser för sklerotomi efter reflektion av konjunktiva och tenons kapsel med hjälp av bromsok. Välj sklerotomiplatser (klockan 2 och 10 som syftar till att passera genom pars plana) för att undvika de stora sklerala kärlen som kan vara framträdande i katten. Använd våtfältscautery på sclera vid de planerade sklerotomiplatserna för att minska skleral blödning, planera för en ~ 3 mm region vid instrumentporten (klockan 10 för en högerhänt kirurg) eftersom detta kommer att förstoras efter vitrektomi för att möjliggöra implantationskanylen att införas.
  6. Förplacera korsmönstersuturer (6-0 eller 7-0 polyglaktinsutur) utan att knyta knuten på platsen för de föreslagna sklerotomierna innan vitrektomiportarna placeras.
    OBS: Detta underlättar snabb stängning av sklerotomier i slutet av proceduren. Suturen för den planerade instrumentporten måste ha en längre bit sclera eftersom detta kommer att vara ett långt snitt.
  7. När suturerna är placerade, be assistenten att hjälpa till att placera världen genom att hålla klockan 12 genom att binda eller använda biskop-Harmon-pincett. Låt kirurgen stabilisera jordklotet också, med hjälp av en 0,12 mm Castroviejo-pincett för att hålla vävnaden bredvid sklerotomiplatsen.
    1. Introducera en 23 G vitrektomiport med en trokar genom sclera vid både klockan 2 och klockan 10 riktad i en vinkel mot synnerven för att undvika kontakt med linsen.
    2. Kontrollera att bevattningsporten är i glaskroppen genom att försiktigt trycka på porten med hjälp av tång så att spetsen kan visualiseras i glaskroppen. När korrekt positionering har bekräftats, fäst bevattningsledningen i porten och placera linjen med tunna självhäftande bandage för att tejpa den på plats. Ställ in vitrektomiinfusionen av BSS-bufferten initialt på 30–35 mmHg genom att trycka på pilknapparna (uppåt eller nedåt) som finns på vitrektomimaskinens frontpanel.
  8. Låt assistenten hålla en Machemer förstorande bevattnande vitrektomilins på hornhinnan för att möjliggöra visualisering av det bakre segmentet av ögat under nästa steg. Fäst den bevattnande vitrektomilinsen på en droppuppsättning som ger konstant vätsketillförsel för att koppla linsen till hornhinnan.
    OBS: Andra former av kontaktvitrektomilins kan också användas. Dimma eller stäng av rumsbelysningen för att underlätta visualisering genom operationsmikroskopet.
  9. Sätt in 23 G vitrektomisond / skärare (2,500 cpm) genom instrumentporten (intill kirurgens dominerande hand, dvs klockan 10-porten för en högerhänt kirurg) och utför en partiell kärnvitrektomi.
    1. Ta sedan bort glaskroppen helt från näthinnans yta i regionen som kommer att ta emot transplantationen (detta är viktigt för att proceduren ska lyckas) genom att lossa det vitreala ansiktet från näthinnan.
    2. Placera vitrektomisonden över synnervhuvudet med porten vänd bort från näthinnans yta och applicera högre vakuum för att starta vitreala ansiktsavlossningen.
  10. Förbered triamcinolonkristaller för intraokulär användning. Om triamcinolonsuspensionen inte är specifikt avsedd för intravitreal användning, tvätta kristallerna och suspendera sedan igen i BSS.
    1. Filtrera initialt suspensionen med hjälp av ett sterilt 0,22 μm porsprutfilter med PES-membran (fäst vid en 1 ml spruta) för att fånga kristallerna.
    2. Tvätta sedan de fångade triamcinolonkristallerna genom att aspirera BSS i 1 ml sprutan och spola genom filtret (kristallerna förblir fångade i filtret). Detta tar bort konserveringsmedlen i lösningen. Upprepa tvätten 3 gånger, varefter kristallerna återsuspenderas i 1 ml BSS.
  11. För in nålen på sprutan som håller triamcinolon genom instrumentporten. Var försiktig så att du inte vidrör linsen genom att titta på nålspetsen genom pupillen medan nålen förs in genom instrumentporten. Injicera 0,25 till 0,5 ml kristallsuspension. Sätt sedan in vitrektomisonden genom instrumentporten och för den nära synnervhuvudet med porten bort från näthinnans yta och använd högvakuum för att hjälpa till att lossa det vitreala ansiktet från näthinnan.
    OBS: Triamcinolonkristallerna fastnar på och framhäver därmed det återstående glaskroppen. Avlägsna försiktigt eventuellt glasaktigt ovanför och bredvid platsen för planerad organoidimplantation (t.ex. den centrala tapetala fundus nära området centralisregionen ).
  12. Skapa en liten fokal näthinneavlossning på önskat implantationsställe med hjälp av en subretinal injektor, t.ex. 23 G subretinal injektor med en utdragbar 41 G kanyl fäst vid en steril 250 μL gastät Luer lock-spruta fylld med steril BSS.
    1. Innan du skapar subretinal bleb, minska infusionstrycket till 10 mmHg för att underlätta bleb-bildning.
    2. Sätt in injektorn genom instrumentporten och för den mot näthinnans yta. Extrudera kanylspetsen och tryck försiktigt fast den på näthinnans yta. Be assistenten att ge ett lätt snabbt tryck på sprutkolven för att starta näthinneavlossningen som minskar injektionstrycket för att möjliggöra en långsam ökning av näthinneavlossningen tills önskad storlek uppnås (cirka 100 till 200 μL BSS används).
  13. Om den skapade retinotomin är i en lämplig position, vilket undviker att skära näthinnan mellan implantationsstället och det optiska nervhuvudet för att förhindra snittning av nervfiberskiktet härrörande från implantationsstället och för att undvika större retinala blodkärl (detta bestäms också av studiedesignen, i vårt fall valdes den centrala näthinnan), förstora den sedan något med injektorns 41 G-kanyl, i syfte att underlätta införandet av näthinnesax.
  14. Ta bort injektorn från ögat och ta bort skleralporten klockan 10. Förstora sklerotomin på denna plats med en rak 2,85 mm slitskniv / keratom orienterad mot synnerven för att undvika att vidröra linsen. Håll infusionstrycket vid 10–15 mmHg.
  15. Förläng retinotomi med vitreoretinal vertikal 80 ° sax med klämhandtag, undvik att skära näthinnekärl för att förhindra retinal blödning och var noga med att skära näthinnan vid kanten av bleben bort från synnervhuvudet för att undvika att skära nervfibrer som leder från näthinnan i transplantationsområdet till synnerven. Retinotomi bör ha tillräcklig bredd för att ta emot organoiderna.
  16. För in den förladdade glaskapillären som innehåller organoiderna (se steg 2.10) genom den förstorade sklerotomin och för den mot retinotomiplatsen under direkt visualisering.
    1. Använd spetsen på glaskapillären för att öppna retinotomi något för att komma åt öppningen i subretinalblåsan.
    2. Be assistenten att långsamt trycka på kolven på injektorn, medan du tittar genom mikroskopet och injicerar organoiderna i subretinalbleben. BSS bör föregå organoiderna och spola retinotomin öppen.
    3. Tryck försiktigt organoiderna i bleb med spetsen av glaskapillären om de är vid kanten av retinotomi.
  17. Håll glaskapillären vid retinotomi i några sekunder för att försöka stänga retinotomi och förhindra att organoiderna flyr in i glaskroppen.
  18. Ta mycket långsamt bort glaskapillären från ögat och undvik plötslig frisättning av vätska från ögat för att undvika vätskerörelse i ögat som kan utvisa organoiderna från subretinalfläcken.
  19. Öka långsamt infusionstrycket till 20–30 mmHg för att förhindra intraokulär blödning och se till att infusionsvätskan inte sköljs direkt på blåsan. Detta utförs genom att trycka på uppåtpilknapparna som finns på vitrektomimaskinens frontpanel.
  20. Stäng sklerotomin med den förplacerade suturen i ett korsmönster (6-0 eller 7-0 polyglaktin). Lägg till ytterligare enkla avbrutna suturer efter behov för att försegla sklerotomin.
  21. Be assistenten att ta bort infusionsporten och låt kirurgen snabbt binda den förplacerade suturen för att täta sklerotomin och förhindra förlust av intraokulärt tryck.
  22. Stäng konjunktivalsnittet (peritomi) med 6-0 eller 7-0 polyglaktin i ett enkelt kontinuerligt mönster.
  23. Avbilda fundus (t.ex. med hjälp av en RetCam II-videofunduskamera, klarhet eller liknande) och registrera organoidernas omedelbara position inom subretinalutrymmet.
  24. Förbered den okulära ytan igen efter avbildning med 0,2% povidonjodlösning med hjälp av bomullsspetsapplikatorer och bomullsbollar. Ta bort de tre stagsuturerna och lockspekulumet.
  25. Stäng den laterala canthotomy med 6-0 polyglaktinsutur. Placera en enda begravd sutur följt av en figur med 8 hudsuturer för att reformera laterala canthus och använd sedan enkla avbrutna hudsuturer för att stänga resten av såret.
  26. Efter det kirurgiska ingreppet är avslutat, ge en subkonjunktival injektion av en steroid och antibiotika kombination (2 mg metylprednisolonacetat, 0,1 mg dexametason och 1 mg gentamicin). Placera ett oftalmiskt smörjmedel (konstgjorda tårar) på hornhinnan.
  27. Återställ djuret från anestesi och övervaka noggrant under återhämtningen för eventuella tecken på smärta som skulle kräva ytterligare behandling, såsom markerad blefarospasm, svår motvilja mot att manipuleras, slöhet eller minskad aptit och ökad andnings- och hjärtfrekvens. Ge postoperativ analgesi efter behov och övervaka noggrant för eventuella obehag.
    OBS: Endast korrekt utbildad personal bör ansvara för att bedöva och övervaka kattpatienterna före, under och efter operationen. Följ lokala djurförsöksetiska nämnders rekommendationer för postoperativ vård.

4. Postimplantationsprocedurer, postoperativ behandling och bedömning

  1. Fortsätt att behandla med orala immunsuppressiva läkemedel (1 mg / kg prednisolon och 2 mg / kg cyklosporin oralt två gånger om dagen) för att hjälpa till att kontrollera inflammation och avstötning av organoiderna. Ge systemisk antibiotikatäckning (t.ex. oral doxycyklin 5 mg / kg två gånger dagligen - detta antibiotikum valdes på grund av risken för opportunistisk mykoplasmal infektion hos immunsupprimerade djur).
  2. Utför regelbundna oftalmiska undersökningar för att övervaka inflammation eller utveckling av biverkningar. Övervaka retinalblödningen för utplattning, vilket inträffar under de första dagarna efter operationen trots den stora retinotomi som krävs för att organoider ska injiceras i subretinalutrymmet. Spela in fundusbilder vid varje undersökning för att registrera positionen och utseendet på de transplanterade organoiderna.
  3. Avbildning av djuren under narkos genom konfokal skanningslaseroftalmoskopi (cSLO) och spektraldomän – optisk koherenstomografi (SD-OCT)5,31 under övervakningsperioden och innan försöket avslutas.
  4. Avliva djuren på ett humant sätt vid försökets slut med hjälp av en AVMA-godkänd metod, t.ex. intravenös administrering av 85 mg/kg pentobarbital. Efter sedering, placera en intravenös kateter för administrering av pentobarbital för att minimera stress. Bekräfta döden genom upphörande av hjärtslag och gör ett snitt i bröstkorgen för att skapa en pneumotorax.
  5. Ta bort ögonen via en vanlig transkonjunktivalmetod och fixa efter behov. För immunhistokemi (IHC), sänk omedelbart ögonen i 4% paraformaldehydlösning efter att 0,3 ml av fixeringslösningen injicerats i det bakre segmentet genom 3 slitsar gjorda genom pars plana med ett 11 Parker-blad (~ 3-4 mm från limbus).
  6. Dissekera ögonmusslorna efter 3,5 timmars fixering vid 4 °C. Ta bort kvarvarande glaskropp och se till att bevara näthinnan och organoiderna intakta. Lägg tillbaka i fixeringsmedel i ytterligare 30 min vid 4 °C och skölj sedan ögonmusslorna 3 gånger vardera i 10 min i PBS. Överför ögonmusslan till 15% sackaros i 2 timmar, sedan till 30% sackaros i ytterligare 2 timmar.
  7. Skölj ögonmusslan två gånger med PBS och bädda in OCT-medium (optimal skärtemperaturförening) och snabbfrys och förvara sedan vid -80 °C tills snittning för histologi och immunkemi.
  8. Välj antikroppar för IHC baserat på studieprotokoll och mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denna procedur möjliggör framgångsrik och reproducerbar implantation av hPSC-härledda retinala organoider i subretinalutrymmet i en stor ögondjurmodell (demonstreras här med 2 exempel: vildtypskatter med friska fotoreceptorer (PR) och CrxRdy / + katter med degenererande PR och näthinna). Förbered och ladda hPSC-härledda retinala organoider med hjälp av stegen i injektionsanordningens borosilikatglaskanyl så att organoiderna inte skadas. Detta kan bekräftas genom direkt visualisering under laddningen av organoiderna (steg 2.10) och under operationen (steg 3.16) (figur 2A, B) samt genom fundusavbildning i slutet av operationen (steg 3.23, figur 2C). Närvaron av organoiderna i det subretinala utrymmet med hjälp av denna teknik bekräftas postoperativt genom oftalmisk undersökning och fundusavbildning (figur 3A), som registrerar organoidernas position och utseende. Att känna till transplantationens position är mycket viktigt vid bearbetning av globerna för frusen histologi och immunhistokemi och minskar avsevärt arbetsbelastningen, eftersom sektionering av ett stort öga vid 12–14 μm (tjocklek på en kryosektion) tar tid. Före eutanasi utförs också konfokal skanningslaseroftalmoskopi (cSLO) och spektral domän - optisk koherenstomografi (SD-OCT) avbildning för att bedöma organoidernas position i subretinalutrymmet (figur 3AD). Dessa tekniker visar persistensen av retinala organoider i det subretinala utrymmet (mellan neural näthinna och RPE) i mottagarögat (figur 3E). Efter eutanasi (görs humant enligt AVMA-rekommendationer) utförs histologi och immunhistokemi (IHC) rutinmässigt (se detaljer i tidigare publicerad artikel31). Histologin och IHC visar överlevnaden av xenogena transplantat (hPSC-härledda retinala organoider) i det subretinala utrymmet i ett stort öga när djuren var immunsupprimerade (som tidigare beskrivits31), se figur 4.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av stegen för beredning av organoider före implantationen.
Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Kirurgiska subretinala implantationer av organoider. (A) Direkt visualisering av organoider som levereras in i subretinalutrymmet genom en glaskanyl utan att skadas, (B) Direkt visualisering av organoider i subretinalbleb, (C) Vidvinkel fundusfärgbild av de subretinalt implanterade organoiderna omedelbart efter operationen. Blebkanterna indikeras av de svarta pilspetsarna och retinotomiplatsen av de svarta stjärnorna.
Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Postoperativ bedömning av subretinalt implanterade organoider 3 månader efter implantation i en CrxRdy/+ katt. (A) Fundus färgbild av de subretinalt implanterade organoiderna, (B) cSLO fundusbild av de subretinalt implanterade organoiderna, (C) 3D-volymskanningsrekonstruktion av området som innehåller organoiderna, (D) cSLO-bild av området som innehåller subretinala organoider, (E) SD-OCT högupplöst, tvärsnittsbild av de subretinalt implanterade organoiderna. Retinotomiplatsen indikeras av de svarta stjärnorna.
Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Humana retinala organoid-härledda fotoreceptorark (PR-markör RCVRN) i subretinalt utrymme av CrxRdy/+ katt, 3 månader efter ympning.  *Synaptiska boutoner (hSYP=Synaptophysin) i kattens inre kärnskikt (INL).
Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Implantation av hPSC-härledd retinal vävnad (retinala organoider) i subretinalutrymmet är ett lovande experimentellt tillvägagångssätt för att återställa synen för sena retinala degenerativa sjukdomar orsakade av PR-celldöd (djup eller terminal blindhet). Det presenterade tillvägagångssättet bygger på en tidigare utvecklad och framgångsrikt testad experimentell terapi baserad på subretinal ympning av en bit mänsklig fetal näthinnevävnad23,24,25. Den presenterar användningen av en alternativ, påfyllningsbar och etiskt acceptabel retinal vävnadskälla härledd från hPSC. Demonstration av kirurgisk genomförbarhet och okulär säkerhet vid behandling i stora ögondjurmodeller51,55 behövs för att utveckla detta lovande tillvägagångssätt mot kliniska tillämpningar. Detta manuskript tillhandahåller en detaljerad metod för subretinal implantation av hPSC-3D retinal vävnad (retinala organoider) i en stordjursmodell med både normal och degenererande näthinna (modell av CrxRdy/+ cats modell av LCA). Även om procedurer för att införa en platt bit av mänsklig näthinna och även RPE-plåster har utvecklats43,44,45, har transplantation av större 3D-transplantat (som behövs för att återställa synen under förhållanden med avancerad RD) inte undersökts. Protokollet som beskrivs här i detalj är för ett transplantationsförfarande för subretinal leverans av hela retinala organoider (snarare än organoidfälgar33,41) som också bär lite RPE som ett potentiellt bättre sätt att införa intakta näthinneark med PR, för att öka transplantatöverlevnaden och förbättra arkbevarandet. Observera att olika delar av detta protokoll är väl etablerade. Till exempel används vitrektomi i stor utsträckning av vitreoretinala kirurger under retinal reattachment kirurgi 56,57,58,59,60. Subretinala injektioner blir allt vanligare, till exempel i genförstärkningsterapi 3,7,61,62,63,64. Det finns begränsade beskrivningar av skapandet av en adekvat retinotomi och injektion av relativt stora organoider i subretinalutrymmet.

De kritiska stegen inkluderar noggrann positionering och prestanda av sklerotomi för att undvika linsen, fullständigt avlägsnande av glaskroppscortex från näthinnans yta över transplantationsstället, kontrollerad bildning av subretinal bleb, generering av retinotomi av optimal storlek för att rymma transplantationskanylens bredd, bibehålla det definierade infusionstrycket under olika steg, och kanyluttag. Välja rätt transplantationskanyl med optimerad inre och yttre diameter (ID och OD) och längd, kontrollera intraokulär blödning, sterilitet av hela proceduren från organoider till operationssal och instrument och operationstiden (30-45 min / djur) för att säkerställa optimala resultat. Författarna finner att de bästa resultaten uppnås med 23 G vitrektomi på grund av tjockleken / viskositeten hos kattens glasögon, vilket skapar en bleb med en injektor med en 41 G kanyl och sedan förlänger retinotomin vid kanten av bleb med 80 ° vinkel retinal sax. Andra viktiga faktorer inkluderar förlängning av sklerotomin med hjälp av ett 2,85 mm keratom för att passa borosilikatglaskanylen (ytterdiameter OD 1,52 mm; innerdiameter, ID 1,12 mm; och längd 10,16 cm) och tillåter implantation av större organoider i ett stort öga med axiell längd ca 20,5 mm (20,91 mm ± 0,53 mm)55. Användningen av en glaskapillär var den nuvarande bästa tillgängliga för att ladda och leverera organoider av nedstigningsstorlek utan att skada dem under implantationsprocessen. Det visade sig att minskning av infusionstrycket från 20-30 mmHg under vitrektomi till 10 mmHg under blebbildningssteget är optimalt för att generera näthinneavlossningar, som behövs för att skapa utrymme för retinala organoider. Dessutom är livskraften hos hPSC-3D-retinal vävnad (organoider) under långväga transport och val av optimerad immunsuppressionsregim för underhåll av xenogena humana transplantat kritiska som nyligen rapporterades31,54.

Författarna fann att på grund av den mycket reflekterande katttapetum-endobelysningen inte krävdes för att utföra operationen. Transplantation i en atapetal art (t.ex. gris, icke-mänsklig primat) skulle kräva en 3-portars vitrektomi som inkluderar endobelysning. Tamponad (t.ex. med perfluorkarboner följt av silikonolja) som utförs vid rutinmässig näthinneavlossningskirurgi utfördes inte eftersom tryck på blåsan skulle riskera att extrudera organoiderna i glaskroppen. Framtida utveckling kan inkludera användning av material som för närvarande undersöks för tätning av näthinnehål. Detta kan användas för att förhindra förlust av organoider i glaskroppen efter implantationen. Dessutom kan Triescence, som liknar Kenalog-40 men innehåller konserveringsmedelsfritt triamcinolon, användas som ett alternativ för att visualisera glaskroppen.

Den mindre globstorleken hos yngre djur (t.ex. 1–2 månader) gav fler kirurgiska utmaningar jämfört med det stora ögat (vuxna djur). Med hjälp av den metod som beskrivs här är det dock möjligt att leverera subretinaltransplantaten. I CrxRdy/+ LCA-modellen visade sig större retinala blebs inte alltid fästa igen. Att hålla bleb till den minsta storlek som behövs för att tillåta retinala organoider att injiceras, minskade denna komplikation. Att transplantera tidigare i RD-näthinnan (före fullständig förlust av PR när neural näthinna blir markant tunn) är en annan riktlinje, i linje med det tidigare arbetet med mänskliga fosternäthinnetransplantat20. En annan anmärkning - den detaljerade tekniken beror inte på att placera näthinnearket i rätt riktning eftersom hela retinala organoider transplanteras. Med utveckling av platta hESC-retinala ark kommer detta att vara viktigt. Det är dock inte fokus för detta protokoll, som syftar till att leverera intakta hESC-retinala vävnadsark och optimera subretinal bevarande av PR-ark. När tekniken väl var utvecklad var den reproducerbar i både normal och RD-näthinna.

Det finns många potentiella komplikationer till detta kirurgiska ingrepp. Endast de som är skickliga i vitreoretinal kirurgi (t.ex. utbildade veterinära ögonläkare eller vitreoretinala kirurger som är bekanta med artskillnaderna i kattögat jämfört med det mänskliga ögat) bör genomföra proceduren. Möjliga komplikationer inkluderar linsberöring under trokarplacering, skleral blödning under sklerotomiförstoring och subretinala eller retinala blödningar. Andra komplikationer såsom värdens immunsvar mot xenogena humana organoidtransplantat som leder till förstörelse av transplantatet över tid eller endoftalmit är möjliga; Användningen av orala immunsuppressiva och antibiotiska läkemedel hjälper till att förhindra att dessa uppstår. Det är också viktigt att notera att det finns en skillnad mellan implantation i vildtyp och CrxRdy / + katter. När det finns avancerad retinal degeneration tenderar retinal bleb att sprida sig bredare än i vildtypen, och i vissa fall kan detta förhindra fullständig retinal återfästning efter operationen. Tekniken som presenteras här är tillämplig för implantation av organoider i ögonen på stora djurmodeller av IRD. Ytterligare förfining skulle behövas när transplantationen är klar för översättning till kliniken.

Baserat på författarnas erfarenhet av att utföra komplexa vitreoretinala kirurgiska ingrepp i stora ögonmodeller, bör tekniken som presenteras i detta manuskript vara tillämplig på andra stora djurmodeller (med inkludering av endobelysning i atapetala arter) som används för att översätta vitreoretinal kirurgiska tekniker till kliniken43,44,45.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ratnesh K. Singh, Ph.D., Francois Binette, Ph.D., och Igor O. Nasonkin Ph.D. är anställda av Lineage Cell Therapeutics, Inc. Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NEI Fast-track SBIR grant R44-EY027654-01A1 och SBIR grant 3 R44 EY 027654 - 02 S1 (I.O.N., Lineage Cell Therapeutics; Dr. Petersen-Jones är co-PI). Författarna vill tacka Janice Querubin (MSU RATTS) för hennes hjälp med anestesi och allmän vård för djuren som ingår i denna studie samt hjälp med kirurgisk inställning och förberedelse / sterilisering av instrument. Författarna vill tacka Dr. Paige Winkler för hjälpen med att ta emot organoiderna och placera dem i media dagen före implantationen och för hjälpen på implantationsdagen. Författarna är också tacksamma mot Randy Garchar (LCTX) för flitig frakt av retinala organoider, montering av avsändaren och nedladdning av temperatur och G-stress-poster efter varje leverans. Detta arbete utfördes medan författaren Igor Nasonkin var anställd av Biotime (nu Lineage).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 µm pore syringe filter with PES membrane Cameo NA can be found through various suppliers
23G subretinal injector with extendable 41 G cannula DORC 1270.EXT
250 µL hamilton gas tight luer lock syringe Hamilton NA can be found through various suppliers
6-0 Silk suture Ethicon 707G
6-0/7-0 polyglactin suture Ethicon J570G
Acepromazine maleate 500mg/5mL (Aceproject) Henry Schein Animal Health NA can be found through various suppliers
Buprenorphine 0.3 mg/mL Par Pharmaceutical NA can be found through various suppliers
cSLO + SD-OCT Heidelberg Engineering Spectralis HRA+ OCT
Cyclosporine Novartis NA can be found through various suppliers
Dexamethasone 2mg/mL (Azium) Vetone NA can be found through various suppliers
Doxycyline 25mg/5mL Cipla NA can be found through various suppliers
Fatal Plus solution (pentobarbital solution) Vortech NA can be found through various suppliers
Gentamicin 20mg/2mL Hospira NA can be found through various suppliers
Glass capillary (Thin-Wall Single-Barrel Standard Borosilicate (Schott Duran) Glass Tubing World Precision Instruments TW150-4
Methylprednisolone actetate 40 mg/mL Pfizer NA can be found through various suppliers
Microscope Zeiss NA
OCT medium (Tissue-Tek O.C.T. Compound) Sakura 4583
Olympic Vac-Pac Size 23 Natus NA can be found through various suppliers
Paraformaldehyde 16% solution EMS 15719
Phenylephrine Hydrochloride 10% Ophthalmic Solution Akorn NA can be found through various suppliers
Prednisolone 15mg/5mL Akorn NA can be found through various suppliers
Propofol 500mg/50mL (10 mg/mL) (PropoFlo28) Zoetis NA can be found through various suppliers
RetCam II video fundus camera Clarity Medical Systems NA can be found through various suppliers
Triamcinolone 400mg/10 mL (Kenalog-40) Bristol -Myers Squibb Company NA can be found through various suppliers
Tropicamide 1% ophthalmic solution Akorn NA can be found through various suppliers
Vitrectomy 23G port Alcon Accurus systems
Vitrectomy machine Alcon Accurus systems
Vitreo-retinal vertical 80° scissors with squeeze handle Frimen FT170206T

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Veleri, S., et al. Biology and therapy of inherited retinal degenerative disease: insights from mouse models. Disease Models and Mechanisms. 8 (2), 109-129 (2015).
  2. Dias, M. F., et al. Molecular genetics and emerging therapies for retinitis pigmentosa: Basic research and clinical perspectives. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 107-131 (2018).
  3. Petersen-Jones, S. M., et al. Patients and animal models of CNGbeta1-deficient retinitis pigmentosa support gene augmentation approach. The Journal of Clinical Investigation. 128 (1), 190-206 (2018).
  4. Winkler, P. A., et al. A large animal model for CNGB1 autosomal recessive retinitis pigmentosa. PLoS One. 8 (8), 72229 (2013).
  5. Occelli, L. M., Tran, N. M., Narfstrom, K., Chen, S., Petersen-Jones, S. M. CrxRdy Cat: A large animal model for CRX-associated leber congenital amaurosis. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (8), 3780-3792 (2016).
  6. Mowat, F. M., et al. Early-onset progressive degeneration of the area centralis in RPE65-deficient dogs. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (7), 3268-3277 (2017).
  7. Occelli, L. M., et al. Gene supplementation rescues rod function and preserves photoreceptor and retinal morphology in dogs, leading the way towards treating human PDE6A-retinitis pigmentosa. Human Gene Therapy. 28 (12), 1189-1201 (2017).
  8. Eckhorn, R., et al. Visual resolution with retinal implants estimated from recordings in cat visual cortex. Vision Research. 46 (17), 2675-2690 (2006).
  9. Pardue, M. T., et al. Status of the feline retina 5 years after subretinal implantation. Journal of Rehabilitation Research and Development. 43 (6), 723-732 (2006).
  10. Chow, A. Y., et al. Subretinal implantation of semiconductor-based photodiodes: durability of novel implant designs. Journal of Rehabilitation Research and Development. 39 (3), 313-321 (2002).
  11. Volker, M., et al. In vivo assessment of subretinally implanted microphotodiode arrays in cats by optical coherence tomography and fluorescein angiography. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 242 (9), 792-799 (2004).
  12. Chow, A. Y., et al. Implantation of silicon chip microphotodiode arrays into the cat subretinal space. Institute of Electrical and Electronics Engineering Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 9 (1), 86-95 (2001).
  13. Sachs, H. G., et al. Subretinal implantation and testing of polyimide film electrodes in cats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 243 (5), 464-468 (2005).
  14. Villalobos, J., et al. A wide-field suprachoroidal retinal prosthesis is stable and well tolerated following chronic implantation. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 54 (5), 3751-3762 (2013).
  15. Bragadottir, R., Narfstrom, K. Lens sparing pars plana vitrectomy and retinal transplantation in cats. Veterinary Ophthalmology. 6 (2), 135-139 (2003).
  16. Narfstrom, K., Holland Deckman, K., Menotti-Raymond, M. The domestic cat as a large animal model for characterization of disease and therapeutic intervention in hereditary retinal blindness. Journal of Ophthalmology. , 906943 (2011).
  17. Seiler, M. J., et al. Functional and structural assessment of retinal sheet allograft transplantation in feline hereditary retinal degeneration. Veterinary Ophthalmology. 12 (3), 158-169 (2009).
  18. Aramant, R. B., Seiler, M. J. Transplanted sheets of human retina and retinal pigment epithelium develop normally in nude rats. Experimental Eye Research. 75 (2), 115-125 (2002).
  19. Lin, B., McLelland, B. T., Mathur, A., Aramant, R. B., Seiler, M. J. Sheets of human retinal progenitor transplants improve vision in rats with severe retinal degeneration. Experimental Eye Research. 174, 13-28 (2018).
  20. Seiler, M. J., Aramant, R. B. Cell replacement and visual restoration by retinal sheet transplants. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (6), 661-687 (2012).
  21. Seiler, M. J., et al. Vision recovery and connectivity by fetal retinal sheet transplantation in an immunodeficient retinal degenerate rat model. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (1), 614-630 (2017).
  22. Lorach, H., et al. Transplantation of mature photoreceptors in rodents with retinal degeneration. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 30 (2019).
  23. Radtke, N. D., et al. Vision improvement in retinal degeneration patients by implantation of retina together with retinal pigment epithelium. American Journal of Ophthalmology. 146 (2), 172-182 (2008).
  24. Radtke, N. D., Aramant, R. B., Seiler, M. J., Petry, H. M., Pidwell, D. Vision change after sheet transplant of fetal retina with retinal pigment epithelium to a patient with retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 122 (8), 1159-1165 (2004).
  25. Radtke, N. D., Seiler, M. J., Aramant, R. B., Petry, H. M., Pidwell, D. J. Transplantation of intact sheets of fetal neural retina with its retinal pigment epithelium in retinitis pigmentosa patients. American Journal of Ophthalmology. 133 (4), 544-550 (2002).
  26. Lorach, H., Palanker, E. Retinal prostheses: High-resolution photovoltaic implants. Medical Science (Paris). 31 (10), 830-831 (2015).
  27. Mathieson, K., et al. Photovoltaic retinal prosthesis with high pixel density. Nature Photonics. 6 (6), 391-397 (2012).
  28. Banin, E., et al. Retinal incorporation and differentiation of neural precursors derived from human embryonic stem cells. Stem Cells. 24 (2), 246-257 (2006).
  29. Hambright, D., et al. Long-term survival and differentiation of retinal neurons derived from human embryonic stem cell lines in un-immunosuppressed mouse retina. Molecular Vision. 18, 920-936 (2012).
  30. Lamba, D. A., Gust, J., Reh, T. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived photoreceptors restores some visual function in Crx-deficient mice. Cell Stem Cell. 4 (1), 73-79 (2009).
  31. Singh, R. K., Occelli, L. M., Binette, F., Petersen-Jones, S. M., Nasonkin, I. O. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in the subretinal space of the cat eye. Stem Cells and Development. 28 (17), 1151-1166 (2019).
  32. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  33. Assawachananont, J., et al. Transplantation of embryonic and induced pluripotent stem cell-derived 3D retinal sheets into retinal degenerative mice. Stem Cell Reports. 2 (5), 662-674 (2014).
  34. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  35. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  36. Singh, R. K., et al. Characterization of three-dimensional retinal tissue derived from human embryonic stem cells in adherent monolayer cultures. Stem Cells and Development. 24 (23), 2778-2795 (2015).
  37. Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Scientific Reports. 7 (1), 766 (2017).
  38. Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communications. 5, 4047 (2014).
  39. Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), 171686 (2019).
  40. Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (39), 16698-16703 (2009).
  41. Shirai, H., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal tissue in two primate models of retinal degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 81-90 (2016).
  42. Mandai, M., et al. iPSC-derived retina transplants improve vision in rd1 end-stage retinal-degeneration mice. Stem Cell Reports. 8 (4), 1112-1113 (2017).
  43. Scruggs, B. A., et al. Optimizing donor cellular dissociation and subretinal injection parameters for stem cell-based treatments. Stem Cells Translational Medicine. 8 (8), 797-809 (2019).
  44. Singh, R., et al. Pluripotent stem cells for retinal tissue engineering: Current status and future prospects. Stem Cell Reviews and Reports. 14 (4), 463-483 (2018).
  45. Sharma, R., et al. Clinical-grade stem cell-derived retinal pigment epithelium patch rescues retinal degeneration in rodents and pigs. Science Translational Medicine. 11, 475 (2019).
  46. Ghosh, F., Engelsberg, K., English, R. V., Petters, R. M. Long-term neuroretinal full-thickness transplants in a large animal model of severe retinitis pigmentosa. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (6), 835-846 (2007).
  47. Koss, M. J., et al. Subretinal implantation of a monolayer of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium: a feasibility and safety study in Yucatan minipigs. Graefes Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 254 (8), 1553-1565 (2016).
  48. da Cruz, L., et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  49. Kashani, A. H., et al. Subretinal implantation of a human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium monolayer in a porcine model. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1185, 569-574 (2019).
  50. Kashani, A. H., et al. Surgical method for implantation of a biosynthetic retinal pigment epithelium monolayer for geographic atrophy: Experience from a Phase 1/2a study. Ophthalmology. Retina. 4 (3), 264-273 (2020).
  51. Petersen-Jones, S. M., Komaromy, A. M. Dog models for blinding inherited retinal dystrophies. Human Gene Therapy. Clinical Development. 26 (1), 15-26 (2015).
  52. Beltran, W. A., et al. Canine retina has a primate fovea-like bouquet of cone photoreceptors which is affected by inherited macular degenerations. PLoS One. 9 (3), 90390 (2014).
  53. Nasonkin, I. O., et al. Transplantation of human embryonic stem cell derived retinal tissue in the subretinal space of immunodeficient rats with retinal degeneration (RD). Investigative Ophthalmology and Visual Science. 60 (9), 3109 (2019).
  54. Singh, R. K., et al. Development of a protocol for maintaining viability while shipping organoid-derived retinal tissue. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (2), 388-394 (2020).
  55. Petersen-Jones, S. M. Drug and gene therapy of hereditary retinal disease in dog and cat models. Drug Discovery Today. Disease Models. 10 (4), 215-223 (2013).
  56. Machemer, R., Buettner, H., Norton, E., Parel, J. M. Vitrectomy: a pars plana approach. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 75 (4), 813-820 (1972).
  57. Machemer, R., Norton, E. W. Vitrectomy, a pars plana approach. II. Clinical experience. Modern Problems in Ophthalmology. 10, 178-185 (1972).
  58. Machemer, R., Parel, J., Norton, E. Vitrectomy: a pars plana approach. Technical improvements and further results. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 76 (2), 462-466 (1972).
  59. O'Malley, C., Heintz, R. M. Vitrectomy with an alternative instrument system. Annals of Ophthalmology. 7 (4), 585-588 (1975).
  60. Machemer, R., Hickingbotham, D. The three-port microcannular system for closed vitrectomy. American Journal of Ophthalmology. 100 (4), 590-592 (1985).
  61. Petersen-Jones, S. M., et al. AAV retinal transduction in a large animal model species: comparison of a self-complementary AAV2/5 with a single-stranded AAV2/5 vector. Molecular Vision. 15, 1835-1842 (2009).
  62. Annear, M. J., et al. Successful gene therapy in older Rpe65-deficient dogs following subretinal injection of an adeno-associated vector expressing RPE65. Human Gene Therapy. 24 (10), 883-893 (2013).
  63. Beltran, W. A., et al. Optimization of retinal gene therapy for X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR mutations. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 25 (8), 1866-1880 (2017).
  64. Bainbridge, J. W. B., et al. Long-term effect of gene therapy on Leber's Congenital Amaurosis. The New England Journal of Medicine. 372 (20), 1887-1897 (2015).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 174 retinala organoider katt stora ögondjurmodell subretinal transplantation retinal degeneration kirurgisk teknik
Subretinal transplantation av mänsklig embryonal stamcellsderiverad näthinnevävnad i en kattmodell för stora djur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh,… More

Occelli, L. M., Marinho, F., Singh, R. K., Binette, F., Nasonkin, I. O., Petersen-Jones, S. M. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model. J. Vis. Exp. (174), e61683, doi:10.3791/61683 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter