Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimalisering av krystallvekst for nøytron makromolekylær krystallografi

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Strukturelle studier av biomacromolecules av krystallografi krever krystaller av høy kvalitet. Her demonstrerer vi en protokoll som kan brukes av OptiCrys (et helautomatisk instrument utviklet i laboratoriet vårt) og/eller mikroanalyseknapper for dyrking av store krystaller av høy kvalitet basert på kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet.

Abstract

Bruken av nøytron makromolekylær krystallografi (NMX) ekspanderer raskt med de fleste strukturer bestemt i det siste tiåret takket være nye NMX strålelinjer har blitt bygget og økt tilgjengelighet av struktur raffinement programvare. Nøytronkildene som for tiden er tilgjengelige for NMX, er imidlertid betydelig svakere enn tilsvarende kilder for røntgenkrystallografi. Til tross for fremskritt på dette feltet, vil betydelig større krystaller alltid være nødvendig for nøytrondiffraksjonsstudier, spesielt med tendens til å studere stadig større makromolekyler og komplekser. Ytterligere forbedringer i metoder og instrumentering egnet til å vokse større krystaller er derfor nødvendig for bruk av NMX å utvide.

I dette arbeidet introduserer vi rasjonelle strategier og en krystallvekstbenk (OptiCrys) utviklet i laboratoriet vårt som kombinerer sanntidsobservasjon gjennom et mikroskopmontert videokamera med presis automatisert kontroll av krystalliseringsløsninger (f.eks. stupbrakt konsentrasjon, pH, additiv, temperatur). Vi viser deretter hvordan denne kontrollen av temperatur og kjemisk sammensetning letter søket etter optimale krystalliseringsforhold ved hjelp av modellløselige proteiner. Grundig kunnskap om krystalliseringsfasediagrammet er avgjørende for å velge startposisjon og kinetisk bane for ethvert krystalliseringseksperiment. Vi viser hvordan en rasjonell tilnærming kan kontrollere størrelsen og antall krystaller generert basert på kunnskap om flerdimensjonale fasediagrammer.

Introduction

Å forstå strukturfunksjonsforholdet mellom proteiner og mekanismen for fysiologiske veier er ofte avhengig av å kjenne posisjonene til hydrogenatomer (H) og hvordan ladning overføres i et protein1,2. Siden hydrogenatomer sprer røntgenstråler svakt, kan deres posisjoner bare bestemmes med svært høyoppløselige røntgendiffraksjonsdata (> 1 Å)3,4. Omvendt kan nøytronkrystallografi brukes til å oppnå en nøyaktig posisjon av hydrogenatomer i biologiske makromolekyler som hydrogen og deuterium (H2, isotop av hydrogen) atomer har spredningslengder av omtrent like stor størrelse som oksygen, nitrogen og karbon5. Nøytronfluks fra tilgjengelige nøytronkilder er imidlertid svakere enn for røntgenstråler, så dette må ofte kompenseres for2,3. Dette kan oppnås ved å utveksle H med H2 og/eller øke volumet av krystaller for å redusere usammenhengende spredning av hydrogener og øke signal-til-støy-forholdet mellom diffraksjonsbilder.

Det finnes ulike krystalliseringsmetoder (det tilsvarende skjematiske fasediagrammet er vist i figur 1) for å oppnå store krystaller av høy kvalitet for både røntgen- og nøytronbiomakromolekylær krystallografi6. I dampdiffusjon er en dråpe tilberedt fra en blanding av et protein og en krystalliseringsløsning likevekt over tid, gjennom fordampning av vann eller andre flyktige arter, mot et reservoar som inneholder en høyere konsentrasjon av precipitant av samme krystalliseringsløsning. Økningen i konsentrasjonen av protein og bunnfall i dråpet fører til supermetning som kreves for spontan kjerne etterfulgt av krystallvekst ved disse kjernene6,7. Selv om dampdiffusjon er den mest brukte teknikken for dyrking avkrystaller 4, kan krystalliseringsprosessen ikke kontrolleres nøyaktig8. I den frie grensesnittdiffusjonsmetoden sprer krystalliseringsløsningen seg inn i en konsentrert proteinløsning, og retter systemet sakte mot supermetning. Denne metoden kan betraktes som en satsvis metode med en langsom blandehastighet6,9,10,11,12. I batchmetoden blandes proteinet raskt med en krystalliseringsløsning som fører til rask supermetning og i sin tur jevn kjerner med mangekrystaller 3,7. Denne metoden står for omtrent en tredjedel av alle strukturer som for tiden er deponert i Protein Data Bank. Dialysemetoden brukes også til å dyrke høykvalitets og velfnærende proteinkrystaller. I dialysemetoden diffuserer molekyler av bunndeig fra et reservoar gjennom en halvgjennomtrengelig membran inn i et eget kammer med proteinoppløsningen. Kinetikken av likevekt er avhengig av ulike faktorer, for eksempel temperatur, membran porestørrelse, og volumet og konsentrasjonen av proteinprøver og krystalliseringsmidler6.

Krystalliseringsfasediagrammer kan brukes til å beskrive forskjellige tilstander av et protein som en funksjon av forskjellig fysisk eller kjemisk variabel3. Som illustrert i figur 1kan hver krystalliseringsteknikk visualiseres som å bruke en annen kinetisk bane for å nå kjerne- og metastable sonene i et slikt diagram6,10,13. Dette gir informasjon om proteinløselighet og proteinkonsentrasjonen der en termodynamisk likevekt mellom krystall og løsning observeres, og dermed finner de optimale forholdene for kjerneringog vekst 3,14. I et todimensjonalt fasediagram plottes proteinkonsentrasjonen som en funksjon av en variabel, og de andre variablene holdes konstant15. I et slikt fasediagram, når proteinkonsentrasjonen er under løselighetskurven, er løsningen i den undermeterte regionen og ingen kjerner eller krystallvekst oppstår. Over denne kurven er supermetningssonen der proteinkonsentrasjonen er høyere enn løselighetsgrensen3,14. Dette er videre delt inn i tre regioner: metasonen, den spontane kjernesonen og nedbørssonen. I metastable sonen er supermetning ikke tilstrekkelig for at kjerner skal skje innen rimelig tid, men veksten av seedede krystaller kan finne sted. Aggregering og nedbør favoriseres i nedbørssonen, hvor supermetning er for høy14,15.

Når tilstrekkelig overmetning for spontan kjerner oppnås, vil de første kjernene vises10. Veksten av krystaller fører til en reduksjon i proteinkonsentrasjonen til grensen for løselighet er nådd. Så lenge overmetningen forblir i nærheten av løselighetskurven, vil det ikke være noen signifikant endring i krystallstørrelsen. Det har imidlertid vist seg at variasjoner i temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsning (for eksempel konsentrasjonen av stupbrakt) vil påvirke proteinløselighet og kan føre til initiering av ytterligere krystallvekst8,13,16.

Som dialyse er en fordel for god kvalitet krystallvekst, OptiCrys krystallisering benken illustrert i figur 2, ble designet og utviklet i vårt laboratorium for å kontrollere krystallisering på en helautomatiskmåte 8. For dette formålet ble programvare skrevet med LabVIEW som tillater kontroll og overvåking av temperaturen på et flytende reservoardialyseoppsett i kontakt med Peltier-elementer, via en elektronisk kontroller og en kjøler. Den samme programvaren regulerer også automatisk den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen (for eksempel utveksling av krystalliseringsmidler) ved hjelp av et flerkanals fluidisk system. I tillegg brukes et digitalt kamera og et omvendt mikroskop til å visualisere og registrere krystalliseringsprosessen. To krystalliseringskamre med 15 μL og 250 μL volumer er tilgjengelige for dyrking av krystaller til forskjellige formål. Siden krystalliseringsprosessen er reversibel, er screening for ulike forhold mulig med bare noen få mikroliter av proteinløsningen så lenge prøven ikke er skadet8. Som et resultat minimerer bruk av denne metoden mengden proteinmateriale som brukes.

Fra tidligere arbeid8er det tydelig at under krystallvekstprosessen må in situ-observasjoner utføres med jevne mellomrom. Disse kan variere fra noen få sekunder til flere dager, avhengig av hendelsen under observasjon (nedbør, kjerner eller krystallvekst).

Optimaliseringen av krystallvekst med OptiCrys er basert på temperaturutfellende konsentrasjonsfasediagrammer. Ved proteiner med løselighet som en direkte funksjon av temperatur, er det mulig å gjøre bruk av saltingsregimet18. Det er her å øke den ioniske styrken av løsningen, som kan visualiseres ved hjelp av protein-stupbrapende fasediagrammer, reduserer oppløseligheten av proteinet. På samme måte kan proteiner med invers løselighet gjøre bruk av saltingsregimet18. Nucleation forekommer i kjernesonen, i nærheten av den metastable sonen, og krystallvekst finner deretter sted i den metastable sonen i fasediagrammet til proteinkonsentrasjonen når løselighetsgrensen. Som vist i figur 3A, med konstant kjemisk sammensetningstemperatur kan reduseres for å holde krystalliseringsløsningen i metastable sonen for å forhindre ny kjerne. Krystaller vokser til den andre krystall / løsning likevekt oppnås, og etter det observeres ingen ytterligere økning i størrelsen på krystaller. Temperaturen reduseres flere ganger til krystallene når ønsket størrelse. I figur 3B, ved konstant temperatur, holder den utløsende konsentrasjonen løsningen i metasonen. Denne prosessen kan deretter gjentas flere ganger for å oppnå store krystaller. Endre temperaturen og manipulere krystallisering løsning forhold, ved å kontrollere supermetning nivåer, er to kraftige verktøy for å skille kjerner og vekst av krystaller som styres nøyaktig og automatisk av OptiCrys5,8,14.

Eksempler på proteinkrystaller dyrket av temperaturkontrollerte, eller temperatur- og bunnkonsentrasjonskontrollert krystallisering, samt relative diffraksjonsdata innhentet er tilgjengelige i litteraturen og PDB. Blant dem er menneskelig γ-krystallin E, PA-IIL lectin, gjær uorganisk pyrofosfatase, uratoksidase, human karbonsyreanhydrase II, YchB kinase, og laktat dehydrogenase5,14,17,18.

Selv om OptiCrys ble kommersialisert av NatX-ray, er det mange laboratorier som ikke har tilgang til dette instrumentet eller til den serielle tilnærmingen det tilbyr. Alternativet til denne teknikken er å bruke kommersielt tilgjengelige plastmikroanalyseknapper med ulike volumer. Ved hjelp av disse kan temperatur og kjemisk sammensetning justeres og varieres manuelt. Inspeksjon av mikrodialyseknapper kan ikke gjøres in situ og må i stedet gjøres manuelt med et optisk mikroskop. Temperaturkontroll kan oppnås ved å holde prøven i en vibrasjonsfri temperaturkontrollert inkubator. Det er viktig å holde temperaturen konstant for å sikre at krystalliseringseksperimenter er reproduserbare. Betydelig temperaturvariasjon kan også føre til skade eller ødeleggelse av krystaller5.

Her gir vi en detaljert protokoll som beskriver prøveforberedelse og bruk av kontrollprogramvare for vekst av store krystaller av høy kvalitet egnet for nøytronproteinkrystallografi. Denne trinnvise prosedyren ble utformet for å dra nytte av krystalliseringsfasediagrammet for å velge en startposisjon og kinetisk bane for å kontrollere størrelsen og kvaliteten på krystallene som genereres. I tillegg presenteres en detaljert protokoll for voksende krystaller med mikroanalyseknapper som bruker samme begrunnelse for å oppnå store krystaller av høy kvalitet.

Protocol

1. Dialysemetode med mikrodialyseknapper

  1. Prøve forberedelse
    1. Forbered proteinoppløsning ved å oppløse 30 mg kyllingegg-hvitt lysozym som et lyofilisert pulver i 1 ml CH3COONa buffer (100 mM natriumacetat, pH 4) for å oppnå en løsning med en endelig konsentrasjon på 30 mg·ml-1.
    2. Sentrifuge prøven på 13.000 × g for 10 min ved 277 K. Denne prosessen bidrar til å fjerne eventuelle aggregater før du starter krystalliseringsprosessen.
    3. Kontroller absorbansen av prøven ved 280 nm og beregn proteinkonsentrasjonen ved hjelp av Øl-Lambert-ligningen (A = εcl).
      MERK: I henhold til Øl-Lambert-ligningen er elektronisk absorbans (A) direkte proporsjonal med konsentrasjonen (c, mg·ml-1) av en absorberende art gitt en konstant optisk banelengde (l, cm). Gradienten i dette lineære forholdet er molar utryddelseskoeffisienten (ε, for lysozym ved 280 nm er 2,64 ml·mg−1·cm−1)19. Sidekjedene av aromatiske aminosyrer (tyrosin, tryptofan og fenylalanin) og disulfidbindinger mellom cysteinrester har sterk absorbans på ~ 280 nm som følge av spektroskopisk tillatte π - π * overganger. Etter hvert som de fleste proteinene inneholder disse rester, kan proteinkonsentrasjon vanligvis beregnes enkelt ved å måle absorbansen ved 280 nm, gitt kunnskap om utryddelseskoeffisienten.
    4. Klargjør krystalliseringsløsninger som vist i figur 4. Filtrer alle lagerløsningene med 0,22 μm Millipore-filtre før du klargjør krystalliseringsløsningen.
  2. Krystall vekst
    1. Skjær en cellulosedialysemembran med passende molekylvektsavskjæring (6-8 kDa) og suge den i destillert vann.
      MERK: Dialysemembranplater er kommersielt tilgjengelige for mikrodialyseknapper, men hvis dialyseslangen brukes, ikke glem å kutte kantene for å skille de to lagene av membran fra røret for å ha bare enkeltlagsmembraner.
    2. Fyll brønner i en 24-brønns skuff med 2 ml krystalliseringsløsning i samme rekkefølge som vist i figur 4.
      MERK: Hvis knapper med større volumer brukes (f.eks. 200 μL), fyller du 50 ml rør med minimum 5 ml krystalliseringsløsning for å sikre effektiv utveksling.
    3. Tilsett/ Pipette 35 μL lysozymløsning til mikrodialyseknappens kammer som vist i figur 5A.
      MERK: For å unngå dannelse av luftbobler i en 30 μL dialyseknapp når den lukkes, må det tilsettes et ekstra volum (dødt volum) på 5 μL ekstra protein, noe som betyr totalt 35 μL proteinprøve. Denne ekstra proteinprøven skaper en litt kuppelformet form på toppen av kammeret, som vist i figur 5B, som forhindrer dannelsen av luftbobler.
    4. Ta en applikator av riktig størrelse og plasser den elastiske O-ringen på ekstremiteten (figur 5C). Plasser deretter membranen, som tidligere er lett tørket/drenert ved hjelp av et stykke fiberfritt papir, oppå dialyseknappens kammer. Vær forsiktig så du ikke legger støv i kammeret når du påfører papiret. Sett dialysemembranen på plass ved å overføre den elastiske O-ringen fra applikatoren til sporet på dialyseknappen (figur 5C).
      MERK: Det kritiske håndteringsøyeblikket er å feste dialysemembranen på toppen av kammeret ved å overføre den elastiske O-ringen fra applikatoren til sporet på dialyseknappen. Alle bevegelser må være perfekt synkronisert for å unngå å omslutte luftbobler med prøven i proteinkammeret. Det er nyttig å øve på å strekke den elastiske O-ringen før påføringen for å kjenne stivheten, bruk pinsett for å holde en del av membranen under påføringen og utføre de første testeksperimentene med et modellprotein.
    5. Overfør knappen til brønnen eller til 50 ml-røret med pinsett (figur 5D).
    6. Dekk brønnen med en dekkslipp, trykk den forsiktig på fettet for å forsegle brønnen (figur 5E).
      MERK: Hvis det ikke er fett på toppen av brønnene, må du legge til dette før du starter eksperimentet eller bruker et stykke tape i stedet for glassdeksler. Prinsippet om proteinkrystallisering ved hjelp av mikrodialyseknapper er illustrert i figur 5.
    7. Oppbevar prøven på 293 K i en termoregulert inkubator. Ulike temperaturer kan være nødvendig i henhold til protein- og krystalliseringsforholdene som brukes.
      MERK: Det samme rutenettet av krystalliseringsforhold vist i figur 4 (slik at konsentrasjonen av bunnfall kan varieres) kan screenes som en funksjon av temperatur. I et slikt tilfelle må den samme krystalliseringsplaten reproduseres, og hver kopi må plasseres i en inkubator regulert ved en annen temperatur. Dette krever at flere vibrasjonsfrie termoregulerte inkubatorer er tilgjengelige.
    8. Kontroller skuffen eller rørene for krystaller (figur 4) og ta notater regelmessig, vanligvis daglig, for å skille mellom hva som er i hver skuff. Gode notater er avgjørende for å unngå falske positive resultater og å diskriminere støv fra krystaller.

2. Krystallvekstprosess ved hjelp av OptiCrys

  1. Prøve forberedelse
    1. Forbered en proteinløsning og en dialysemembran som beskrevet i pkt. 1.1.
    2. Klargjør lagerløsninger av NaCl (4 M) og CH3COONa pH 4 (1 M) og filtrer dem i 50 ml rør.
    3. Tilsett proteinoppløsningen (15 μL lysozym med 30 mg·ml-1) i dialysekammeret i det temperaturkontrollerte flytende reservoardialyseoppsettet. Se figur 6 for detaljer om det temperaturkontrollerte flytende reservoardialyseoppsettet. OptiCrys har to dialysekamre, minimumsvolumet er 15 μL og maksimumsvolumet er 250 μL.
    4. Dekk overkammeret med en dialysemembran og fest membranen med den elastiske O-ringen (figur 6B).
      MERK: Dette oppsettet er forskjellig fra mikrodialyseknapper der hvert kammer er forseglet direkte av en dialysemembran. I strømningscellen festes dialysemembranen i stedet til overkammeret slik at montering av krystaller uten fjerning. For dette formålet kan overkammeret ganske enkelt skrus ut av reservoaret.
    5. Vend overkammeret og plasser det på toppen av dialysekammeret. Trykk den langsomt og forsiktig for å fjerne all luften som er fanget mellom de to delene og unngå bobler i kammeret (figur 6C). Øv med et modellprotein kan være en fordel når du trener for å unngå luftbobler og prøvetap.
    6. Fest beholderen i sin posisjon ved å forsiktig skru det på toppen av overkammeret, igjen være oppmerksom på å unngå å fange luftbobler. Overstramming av reservoaret kan også danne bobler i krystalliseringskammeret (figur 6D).
    7. Tilsett krystalliseringsløsningen og dekk reservoarkammeret med den lufttette hetten. (Figur 6G). Maksimalt volum av reservoaret er 1 ml.
    8. Overfør denne enheten og sett den inn i messingstøtten. Denne støtten er i kontakt med Peltier-elementer som brukes til å kontrollere temperaturen.
    9. Som vist i figur 6er den lufttette hetten utstyrt med et optisk vindu for å tillate toppbelysning av dialysekammeret. Sett lyskilden (figur 2) på vinduet slik at lyset kan passere gjennom kammeret.
    10. Reservoarkammeret kan kobles til en pumpe slik at den kan fungere som en kontinuerlig strømningscelle. Koble slangen på toppen av de 50 ml rørene som inneholder lagerløsningene og destillert vann til dreieventilen som vist i figur 7.
      MERK: Hvis automatisk tilberedning og endring av krystalliseringsløsninger ikke er ønsket under forsøket, utelater du trinn 2.1.10. I et slikt tilfelle må krystalliseringsløsningen tilberedes og reservoaret fylles manuelt.
  2. Programvare
    1. Slå på datamaskinen og starte programvaren Croissance cristalline [Crystal vekst]. Denne kontrollprogramvaren er skrevet med LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) og tilbyr et brukervennlig grafisk grensesnitt. Den inneholder 4 forskjellige grafiske grensesnitt (Accueil [Welcome], Paramétrage [Setting], Essai [Test], og Vedlikehold [Vedlikehold]) (figur 8).
      MERK: Oversettelser fra fransk er i parentes.
    2. Velg Vedlikehold-visningen ved å klikke på knappen som vist i Figur 8. Denne visningen er for øyeblikket den mest brukte og tillater brukere å kontrollere de fleste parametere under eksperimentet.
      MERK: Når du har klikket på Vedlikehold-visningen, vises et nytt vindu med forskjellige seksjoner for å kontrollere parametere som temperatur eller lys. I figur 8 vises forskjellige deler av denne visningen med piler og rammer. I de følgende trinnene viser vi hvordan hver parameter styres ved hjelp av programvaren.
    3. Régulateur de température [Temperaturregulator] delen tillater kontroll og overvåking av temperatur. Klikk på knappen, nummer én (1) i Figur 8, for å slå den på.
      MERK: Temperaturområdet i OptiCrys er 233,0 – 353,0 ± 0,1 K.
    4. Still inn temperaturen på mottakerens seksjon [settpunkt], og trykk enter (figur 8(2)). Under denne knappen er det en graf med 2 spor (rød og gul). Det røde sporet viser den endelige (bestilte) temperaturen, og det gule sporet viser gjeldende temperatur. Som vist i figur 8(2)er temperaturen satt til 20 °C.
      MERK: For å vokse en krystall, som forklart i krystallvekstseksjonen, må mange temperaturer velges. Hvis du vil endre temperaturen, legger du til hver ny temperatur i delen mottaker [settpunkt] og trykker på Enter-knappen på tastaturet.
    5. Slå på lyset ved å øke lysstyrken fra Lumières [Lights]-delen i figur 8. Lysstyrke varierer fra 0 til 100, "0" indikerer at lyset er av og ved "100" lyset er satt til maksimal intensitet og lysstyrke. Ved å øke lyset, i mikroskopseksjonen, kan man se inne i dialysekammeret. Under eksperimentet kan lysstyrken i cellen variere; justere parametrene for å tydelig visualisere inne i dialysekammeret. Forstørrelse kan også økes eller reduseres ved hjelp av knappene + og – foran "zoom" for bedre visning.
    6. På høyre side av mikroskopseksjonen er det flere seksjoner for lagring av relevant informasjon for hvert krystalliseringseksperiment. Hver bruker kan opprette en mappe for å lagre informasjon om krystalliseringsforhold, proteinnavn og molekylvektsavskjæringen av dialysemembranen som brukes (figur 8(3)).
    7. Brukeren kan definere et navn for eksperimentet ved ganske enkelt å skrive det inn på Nom Dossier [Mappenavn]. Ved å klikke på Dossier [Mappe-knappen] (vist med en grønn ramme i Figur 8) åpnes et nytt vindu. I dette vinduet vil det være en tekstfil som inneholder all informasjonen som er definert for eksperimentet. I tillegg lagres tidsstemplede bilder i denne mappen for fremtidig behandling.
    8. Fra NB Images-delen velger du antall bilder som skal tas i løpet av eksperimentet. Angi antall bilder i panelet til høyre sammen med ønsket tidsintervall mellom disse (f.eks. min, time, dag). Figur 8 viser programvareoppsettet for å ta opp null bilder på et minutt.
      MERK: Bruk avsnittet Pompe [Pumpe] til å blande lagerløsninger og injisere krystalliseringsløsning i reservoarkammeret. Se pkt. 2.1.10 og figur 7 for en forklaring på prinsippet om væskeblandingssystemet.
    9. Inngangskonsentrasjoner av lagerløsningene i Etape 1 [Trinn 1]: løsninger aksjer. For krystalliseringseksperimentet i neste avsnitt vil NaCl 4 M og CH3COONa 1 M pH 4 bli brukt.
      MERK: Konsentrasjoner av lagerløsninger er i molarenheter.
    10. Definer den endelige konsentrasjonen av hver løsning. For eksempel 0,75 M for NaCl og 0,1 M for CH3COONa pH 4. Skriv inn disse i det endelige konsentrasjonsavsnittet (figur 8) i Etape 2 [Trinn 2]: løsning à préparer [løsning for klargjøring]. Trykk på Calcul [Compute]-knappen, som vises med en rød ramme i Figur 8. Det endelige volumet av hver lagerløsning som skal brukes i blanding, vises i volumpanelet foran hvert konsentrasjonspanel.
    11. Trykk på Knappen Lancer préparation [Launch preparation]( Figur 8). Som vist i figur 7,tar dreieventilen hver lagerløsning og injiserer dem til blanderøret via en bryter.
    12. Etter at krystalliseringsløsningen er klargjort, klikker du på Entrée-løsningen [Løsningsoppføring]-knappen i Etape 3 [Trinn 3]: Fluks av pumpedelen (gul ramme i figur 8). Bryteren endres for å injisere den nye krystalliseringsløsningen fra blanderøret inn i reservoarkammeret. Hvis du vil stoppe utvekslingsprosessen, trykker du på Arrêt-fordelingen [Distribusjonsstopp]-knappen.
      MERK: Vær oppmerksom på krystalliseringsprosessen under forsøket og endre parametere som temperatur, krystalliseringsløsning og zoom, i det tilsvarende grafiske grensesnittet til tilsynsprogramvaren. Ved å bruke programvaren er det ikke nødvendig å fjerne den lufttette hetten eller strømningscellen under eksperimentet, slik at den eneste variabelen vil være den som brukeren endrer gjennom programvaren.
  3. Stor krystallvekst
    1. Tilsett 15 μL lysozym med en konsentrasjon på 30 mg·ml-1 i dialysekammeret (figur 6A).
      MERK: Klargjør proteinprøven som beskrevet i pkt. 1.1.
    2. Monter det temperaturkontrollerte flytende reservoardialyseoppsettet som beskrevet i pkt. 2.1 og figur 6.
    3. Forbered krystalliseringsløsningen. Ikke glem å filtrere alle lagerløsningene før prøveklargjøring med 0,22 μm filtre. For dette eksperimentet inneholder krystalliseringsløsningen 0,75 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4. Dette kan legges til manuelt eller ved hjelp av reservoarkammeret og pumpesystemet som beskrevet i pkt. 2.2.10 til 2.2.12.
    4. Still inn temperaturen til 295 K som forklart i avsnittene 2.2.3 og 2.2.4 og vist i bilde 8. Under innledende forhold vil likevekt mellom dialysekammeret og reservoaret nås etter ca. 90 minutter, og de første synlige kjernene vil vises etter 22 timer.
    5. La krystaller vokse til det ikke blir observert flere synlige endringer i krystallstørrelsen (figur 9, panel 1).
      MERK: For å bestemme kjernetiden og måle variasjonen i krystallstørrelsen, ta opp bilder hver 15 eller 20 min, som er henholdsvis 4 eller 3 bilder per time i NB Images-delen. For in situ observasjon av protein denaturation, aggregering og nedbør eller krystall oppløsning eller kjernering, vanligvis mellom noen få sekunder til noen titalls minutter er nødvendig. Men for krystallvekst er dette området mellom noen få minutter til noen timer.
    6. Etter tre dager, senk temperaturen til 291 K for å starte krystallveksten på nytt. Hold temperaturen konstant og la krystallen utvikle seg (figur 9, panel 2). For dette stadiet av eksperimentet vil det være tilstrekkelig å ta opp bilder hver 2. Eksperimentet kan fortsette hvis ingen endring i størrelsen på krystallene observeres.
      MERK: Avhengig av protein- og bunnkonsentrasjonene i krystalliseringsløsningen og proteinvolumene som brukes, kan tiden som trengs for å nå likevekten for hvert trinn variere.
    7. Reduser temperaturen til 288 K for å starte krystallveksten på nytt. I den eksperimentelle tilstanden til saken presentert her, er en dag nok til å nå likevekt (Figur 9, panel 3).
    8. Kontroller størrelsen på krystallene og opprettholde en konstant temperatur så lenge krystallen fortsetter å vokse.
    9. Etter 4 dager, reduser temperaturen til 275 K for å starte krystallvekst (figur 9, panel 4).
      – Under de eksperimentelle forholdene i saken som presenteres, vil det etter rundt 10 dager bli oppnådd en krystall som er 500 μm i en dimensjon (figur 9).
  4. Kontrollere krystallstørrelsen
    1. Forbered en proteinløsning og den temperaturkontrollerte flytende reservoardialyse satt opp som beskrevet i pkt. 2.3.1 og 2.3.2.
    2. Klargjør krystalliseringsløsninger med 0,9 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4.
    3. Sett temperaturen til 291 K og la krystaller vokse. Under innledende forhold vil den første nucleation hendelsen starte etter rundt en time og mange krystaller vil vokse i dialysekammeret i tre timer (Figur 10, trinn: 1 og 2). Ta opp bilder hvert 20.
      MERK: Optimaliseringen av krystalliseringsforhold er avgjørende for å kontrollere de fleste av de endelige egenskapene til genererte krystaller. Temperaturen og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsninger kan endres for å oppløse og re-vokse krystaller av ensartet størrelse. Det bør også bemerkes at en proteinprøve ikke forbrukes i et slikt eksperiment, da forholdene kan reverseres for å oppløse prøven på nytt så lenge den ikke er denaturert. Når du løser krystaller ved å endre temperatur og opprettholde konstant kjemisk sammensetning, fortsett eksperimentet som følger:
    4. Når krystaller har vokst på 291 K, kan disse oppløses for å vokse færre, større krystaller. Øk temperaturen gradvis over 20 min for å nå 313 K. Det tar rundt en time å oppløse alle krystallene inne i dialysekammeret (Figur 10, trinn: 3-5). Ta opp bilder hvert 5 til 15 minutt for å overvåke oppløsningsprosessen.
      MERK: Mange proteiner er følsomme for høye temperaturer. Pass på å arbeide innenfor temperaturområdet der proteinet er stabilt for å unngå skade / denaturation. I tillegg til proteinløselighet påvirker temperaturen også bufferløsningen. PH-en til bufferen kan for eksempel endres med temperatur, spesielt i Tris-bufferen. I et slikt tilfelle er det avgjørende å sette pH i henhold til temperaturen der eksperimentet utføres18. Det bør også bemerkes at proteinoppløsning tar betydelig mindre tid (fra noen få minutter til noen timer) sammenlignet med proteinkrystallvekst (fra noen timer til noen dager). Generelt, under oppløsningen av krystallene, øker temperaturen gradvis og sakte (respekterer den korte totale oppløsningstiden), hovedsakelig i tilfelle delvis oppløsning av krystallene for å unngå økningen av krystallmosaikkiteten. Når krystallene vokser, kan temperaturen reduseres raskt (på mindre enn et minutt) til den innstilte temperaturen (respektere den lange totale veksttiden). Regelmessig overvåking av krystalliseringskammeret ved å registrere bilder er tilrådelig for å forhindre skade på proteinet og bidra til å definere den optimale tiden for oppløsning eller vekst av krystaller for hvert protein som studeres.
    5. Etter at alle krystaller er oppløst, sett temperaturen til 295 K for å starte en ny kjernehendelse (figur 10, trinn: 6,7). Ta opp bilder hvert femte minutt for å overvåke den andre kjerneprosessen. I dette trinnet vises de første kjernene etter rundt 18 minutter.
      MERK: Ved denne temperaturen vil løsningen være i kjernesonen, i nærheten av metasonen. Som et resultat vil bare noen få kjerner vises i krystalliseringskammeret.
    6. Fortsett eksperimentet med å gjenta optimaliseringsarbeidsflyten som er beskrevet i del 2.3 for å dyrke større krystaller. Den totale varigheten av eksperimentet representert i figur 10 er bare noen få dager.
      MERK: Hvis krystallene i kjernefasen vises på forskjellige tidspunkter, oppnås krystaller av forskjellige størrelser i krystalliseringskammeret. I et slikt tilfelle vil økningen i temperatur (i tilfelle proteiner med direkte løselighet) resultere i raskere oppløsning av de mindre krystallene. Avhengig av kinetisk modningseffekt, kan det ekstra proteinet (oppnådd ved oppløsning) deretter brukes til vekst av de større krystallene.
      Ved oppløsning av krystaller ved konstant temperatur ved å endre krystalliseringsløsningens kjemiske sammensetning, fortsett eksperimentet som følger:
      Det er også mulig å oppløse krystaller dyrket tidligere ved å endre den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen under forsøket for å re-vokse en populasjon av jevnt størrelse krystaller under nye forhold.
    7. Klargjør proteinoppløsningen (2.3.1), det temperaturkontrollerte flytende reservoardialyseoppsettet (2.1) og krystalliseringsløsningen (2.4.2) som beskrevet ovenfor. Under innledende forhold i kjernesonen langt fra metasonen, vil mange små krystaller vises i krystalliseringskammeret og begynne å vokse (Figur 11, trinn: 1,2).
    8. Etter tre timer, når mange mellomstore krystaller er synlige i krystalliseringskammeret (figur 11, trinn: 3), reduserer NaCl-konsentrasjonen (0,9 M) gradvis for å nå null. For dette kan du lage en ny krystalliseringsløsning som bare inneholder bufferløsning med 0,1 M CH3COONa pH 4. Bruk pumpesystemet til å bytte det med krystalliseringsløsningen i reservoarkammeret. Følg trinn 2.2.10 til 2.2.12 for tilberedning og injeksjon av en ny løsning i reservoarkammeret. Med denne nye løsningen, når løsninger utveksles, reduseres NaCl-konsentrasjonen i kammeret til den endelige løsningen i reservoarkammeret ikke inneholder mer enn 0,1 M CH3COONa pH 4 og ingen NaCl. Ta bilder hvert 10.
    9. La krystallene oppløses helt (figur 11, trinn: 4,5). Oppløsningstiden er rundt to timer for dette eksperimentet. Som tidligere nevnt er oppløsningstiden avhengig av proteinsystemet, krystalliseringsforholdene og dialysekammervolumet som brukes. Regelmessig observasjon av krystalliseringskammeret (se Mikroskopseksjon) og opptak av bilder og notater under forsøket er avgjørende.
    10. Når alle krystaller inne i kammeret er oppløst (Figur 11, trinn: 5), bruk pumpesystemet igjen til å forberede en ny krystalliseringsløsning ved å injisere NaCl ved en lavere konsentrasjon enn den forrige (0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4).
    11. Injiser den nye løsningen i reservoarkammeret (figur 11, trinn: 6,7) og gjenta arbeidsflyten for krystalliseringsvekstoptimalisering som beskrevet i avsnitt 2.3. En jevn populasjon av større krystaller vil bli generert. Resultatene som ble vist i figur 11 ble oppnådd etter noen dager.

Representative Results

I seksjon 2.3 og 2.4 presenteres tre eksempler på optimalisert krystallvekst, som viser bruk av instrumentet og en eksperimentell design for dyrking av store krystaller. For denne demonstrasjonen har vi brukt lysozym som modellprotein, selv om krystallveksteksperimenter har blitt utført med mange andre proteinsystemer ved hjelp av denne metoden (se ovenfor). Ved å bruke og mestre protokollen som presenteres her, kan man tilpasse den til andre proteinkandidater.

I pkt. 2.3 viste vi at etablerte rasjonelle krystalliseringsstrategier kunne være gunstige for voksende krystaller med tilstrekkelig spredning av volumer for nøytronproteinkrystallografi. Her viser vi at de rasjonelle optimaliseringsstrategiene som foreslås, også tillater generering av en ensartet befolkning av krystaller av hvilken som helst bestemt størrelse som kreves for nedstrøms strukturbestemmelsesmetoder.

Disse to eksperimentene er utformet for å understreke viktigheten av fasediagrammer for å kontrollere krystallkryklering og vekst. Her brukes kontroll av temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsninger i kombinasjon med overvåking av krystalliseringsprosessen i sanntid til å studere det kvalitative fasediagrammet. Ved hjelp av denne metoden kan kjerne- og krystallvekst rasjonelt optimaliseres på en reversibel måte. Bruk av en slik seriell tilnærming reduserer også mengden protein og tiden som kreves for å kontrollere krystallenes størrelse og kvalitet.

I dialysemetoden skilles en proteinløsning fra en krystalliseringsløsning med en halvgjennomtrengelig membran6 (figur 5). Denne dialysemembranen gjør at små molekyler som tilsetningsstoffer, buffer og ioner kan passere gjennom membranen, men ikke makromolekyler somproteiner 6,20. Denne funksjonen gjør at krystalliseringsløsningen kan endres i løpet av eksperimentet6. Utveksling av løsningen kan gjøres manuelt, for eksempel i mikrodialyseknapper, eller på en automatisert måte ved hjelp av et instrument utviklet for dette formålet, OptiCrys8.

I det første settet med eksperimenter ble mikrodialyseknapper brukt til krystallisering av kyllingegg-hvitt lysozym. Mikroanalyseknapper ble nedsenket i krystalliseringsløsninger med forskjellige saltkonsentrasjoner. I dette enkle krystalliseringsrutenettet er den eneste variabelen bunnkonsentrasjon mens temperaturen holdes konstant (293 K). Som vist i figur 4, små variasjoner i saltkonsentrasjonen indusere en endring i størrelsen og antall krystaller observert, slik at undersøkelse av krystalliseringfasediagrammet. I figur 4, panel 1 inneholder krystalliseringsløsningen 0,7 M NaCl og et begrenset antall større krystaller har dukket opp i knappene. Ved å øke saltkonsentrasjonen fra 0,7 til 1,2 M øker supermetningen og løsningen i kjernesonen beveger seg bort fra metasonen (figur 4, panel 1 til 6). Som et resultat øker antall krystaller og størrelsen reduseres.

I det første eksperimentet med et helautomatisk instrument som muliggjør temperaturkontrollert dialysekrystallisering, OptiCrys (figur 9),ble krystallveksteksperimentet skreddersydd for å generere stor krystallvekst. Eksperimentet ble lansert ved en innledende temperatur på 295 K med en krystalliseringsløsning som inneholder 0,75 M NaCl og 0,1 M Na acetatbuffer pH 4. Under disse eksperimentelle forholdene nådde krystalliseringsløsningen kjernesonen i nærheten av den metastable sonen i fasediagrammet (figur 9, pil 1). Som et resultat ble bare noen få kjerner generert i løpet av den første fasen av eksperimentet. For å vokse utvalgte krystaller ytterligere (vist i figur 9)ble arbeidsflyten for krystallvekstoptimalisering drevet mot den metastable sonen med varierende temperatur så snart krystallløsningslikevekten ble nådd.

Hver gang likevekt mellom krystall og løsning ble nådd, ble temperaturen senket, først til 291 K, deretter til 288 K og til slutt til 275 K, for å holde krystalliseringsløsningen i metasonesonen. Resultatet av dette eksperimentet er en enkelt stor krystall egnet for både makromolekylær røntgen og nøytronkrystallografi.

For de fleste proteiner er det nøyaktige kvantitative fasediagrammet (eller bare et kvalitativt diagram) ennå ikke oppnådd på grunn av mangel på eksperimentelle enheter som er i stand til å måle proteinkonsentrasjonen (eller bare for å observere / oppdage krystalliseringsprosessen i sanntid) under krystalliseringseksperimenter18. Som et resultat er det ofte ikke mulig å designe eksperimentet på en slik måte at krystallisering begynner i det optimale området av fasediagrammet, i nærheten av metasonen.

Derfor må en krystalliseringsoptimaliseringsstudie finne sted før eksperimentet dedikert til veksten av en stor volumkrystall utføres. I denne studien, ved hjelp av temperaturvariasjoner (ved konstant kjemisk sammensetning) på den ene siden og variasjoner i kjemisk sammensetning (ved konstant temperatur) på den annen side, er nødvendig for å identifisere metastable sonen og for å avgrense de optimale forholdene for å starte et stort krystallveksteksperiment.

For dette formål presenteres to andre eksperimenter som var skreddersydd for å demonstrere reversibilitetet til de temperaturkontrollerte dialysekrystalliseringseksperimentene med OptiCrys for kjernering, krystallvekst, oppløsning og revekst. Arbeidsflyten for krystallvekstoptimalisering ble kontrollert slik at en jevn befolkning på færre, større lysozymkrystaller ble dyrket ved hjelp av variasjon av temperatur eller bunnkonsentrasjon.

I det andre eksperimentet med OptiCrys ble den kjemiske sammensetningen av krystalliseringsløsningen holdt konstant gjennom hele eksperimentet (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Den opprinnelige temperaturen ble satt til 291 K. Resultatene av dette eksperimentet er oppsummert i figur 10. På grunn av høy overmetning dukket et stort antall små krystaller opp i krystalliseringskammeret (figur 10, paneler 1 og 2). I samsvar med begrepet direkte proteinløselighet, ved gradvis å øke temperaturen til 313 K, ble alle krystallene oppløst (figur 10, paneler 3, 4 og 5). Til slutt, ved å senke temperaturen til 295 K, ble den andre kjernen initiert i nærheten av metasonen og tillot kontrollert dannelse av et lavere antall kjerner. Ytterligere krystallvekst resulterte i ensartet generasjon av en befolkning av større krystaller (Figur 10, panel 7).

Som vist i figur 11kan variasjon av krystalliseringsløsningens kjemiske sammensetning ved en konstant temperatur på 291 K også brukes til å oppnå en jevn populasjon av større krystaller. I likhet med det forrige eksperimentet var den første tilstanden 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-konsentrasjonen ble deretter senket gradvis fra 0,9 M til null for å oppløse krystallene (figur 11, panel 4 og 5). På dette tidspunktet ble NaCl fullstendig erstattet av en bufferløsning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Reduksjon av saltkonsentrasjonen holder løsningen i den undermetettede sonen i fasediagrammet, noe som fører til oppløsning av krystallene. Deretter ble en ny krystalliseringsløsning med lavere ionisk styrke, på 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4, injisert i reservoarkammeret. Ved denne bunnkonsentrasjonen dukket den første kjernene opp (figur 11, panel 6) etter 90 minutter. Antallet genererte krystaller var lavere og krystallene når et større volum (Figur 11, panel 7) enn før.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fasediagram. Kinetiske baner for tre krystalliseringsteknikker er representert i et saltingsregime. Hver metode oppnår kjernering og krystallisering annerledes, visualisert av en annen kinetisk vei gjennom fasediagrammet for å nå kjerne- og metastable sonene. Løselighetskurven skiller undermetning og supermetningsområder. Supermetning er delt inn i tre soner: metastable, kjerner og nedbør. I kjernesonen oppstår spontan kjerner mens i metasonen krystallvekst finner sted. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk representasjon av krystalliseringsbenken (OptiCrys). LED-lyskilden er plassert på toppen av den temperaturkontrollerte dialysestrømningscellen. Et invertert mikroskop og digitalkameraet vises øverst til høyre på bildet med den røde pilen. Den røde sirkelen representerer plasseringen av kjølerslangen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Skjematisk todimensjonal proteinkrystalliseringsfasediagram som en funksjon av temperatur (A) og bunnkonsentrasjon (B). (A) Ved protein med direkte løselighet holder temperaturen krystalliseringsløsningen i metasone. Temperaturvariasjon kan gjentas flere ganger for å kontrollere krystallvekstprosessen til krystaller med ønsket volum oppnås. (B) Endring av konsentrasjonen av den utløsende oppløsningen kan også brukes til å holde krystalliseringsløsningen i metasonen for voksende krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Krystaller av lysozym oppnådd ved hjelp av dialysemetoden. Dette eksperimentet ble utført ved en konstant temperatur på 293 K i 0,1 M natriumacetatbuffer pH 4. Økende NaCl-konsentrasjon fra 0,7 M til 1,2 M øker kjernehastigheten og resulterer i et større antall krystaller. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Oversikt over proteinkrystalliseringsprosessen ved dialysemetoden. (A) Ved å legge proteinet til kammeret på dialyseknappen, (B) opprettes en kuppelform på toppen av kammeret. (C) En applikator brukes til å overføre O-ringen til sporet på dialyseknappen for å fikse dialysemembranen på plass. (D) Dialyseknappen er klar for nedsenking i reservoarløsningen. (E) Krystalliseringsløsning passerer gjennom den halvgjennomtrengelige membranen og krystaller begynner å danne seg inne i kammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk visning av det temperaturkontrollerte flytende dialyseoppsettet. (A) Proteinprøven tilsettes dialysekammeret. (B) Dialysemembranen festes på overkammeret med en O-ring ved hjelp av en applikator. (C) Overkammeret dreies og festes på toppen av dialysekammeret. Hvite piler indikerer hvor skruene er plassert på overkammeret. (D) Reservoarkammeret dreies med klokken (E) og festes oppå overkammeret. (F) Reservoarkammeret er dekket av en lufttett hette med kontakter til et pumpesystem, og (G) strømningscellen er plassert i messingstøtten. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Tilberedning og injeksjon av krystalliseringsløsningen i reservoaret av det fluidiske systemet (A). Rør som inneholder salt og vann er koblet til trykk-/vakuumregulatoren (B) og til dreieventilen (C). Ved å bruke trykket skaper trykk-/vakuumregulatoren en konstant strøm av væskene fra rørene til dreieventilen. Hver væske som passerer gjennom strømningsmåleren (D) og bryteren injiseres i blanderøret (F). Når alle væskene er lagt til blanderøret, injiserer bryteren ved noen modifikasjoner den endelige løsningen fra blanderøret inn i reservoaret (G). Væsken strømmer gjennom systemet i retning av pilene i diagrammet merket i stigende rekkefølge (fra 1 til 6). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Vedlikeholdsvisning av tilsynsprogramvaren. Denne visningen brukes til å kontrollere ulike parametere som temperatur, lys, krystalliseringsløsning og zoom. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Fasediagrammet som en funksjon av temperaturen (valgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). En enkelt stor lysozymkrystall oppnås ved systematisk å endre temperaturen fra 295 K til 275 K. I hvert trinn stoppes krystallveksten ved å nå løselighetskurven. Redusere temperaturen ved å holde løsningen i metastable sonen starter krystallvekst. Bildene har forskjellige nivåer av forstørrelse. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av dennefiguren.

Figure 10
Figur 10: Optimalisering av krystallvekst ved konstant kjemisk sammensetning ved hjelp av temperaturkontroll (utvalgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). Starter kjerneprosessen i kjernesonen ved 291 K, langt fra metasonen, resulterer i dannelsen av mange krystaller. Øke temperaturen til 313 K deretter oppløses krystallene til ingen synlige kjerner er sett i dialysekammeret. Til slutt, redusere temperaturen til 295 K starter kjerneprosessen for andre gang fører til et begrenset antall større krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av dennefiguren.

Figure 11
Figur 11: Optimalisering av krystallvekst ved konstant temperatur ved hjelp av variasjoner i bunnkonsentrasjon (utvalgte bilder skal spores i stigende rekkefølge). Hvis du reduserer bunnkonsentrasjonen fra 0,9 M til 0 M oppløses krystallene som oppnås under den første nucleasjonshendelsen. Krystalliseringsprosessen startes på nytt ved injeksjon av samme stup, men ved lavere ionisk styrke, 0,75 M, noe som fører til dannelsen av noen større krystaller. Dette tallet er tilpasset fra Junius et al. 8,18 Vennligstklikk her for å se en større versjon av dennefiguren.

Discussion

Ulike fysiske, kjemiske og biologiske variabler påvirker proteinkrystallisering ved å påvirke proteinløselighet21. Blant disse variablene brukes temperatur og kjemisk sammensetning av krystalliseringsløsningen her i kombinasjon med dialyseteknikk for å forbedre og vokse store krystaller av høy kvalitet av biomacromolecules for nøytrondiffraksjonsstudier. Ved å bruke kunnskap om fasediagrammer, er krystallisering gjort mer forutsigbar. Selv om screening av ulike krystalliseringsforhold i en seriell tilnærming også er mulig, er hovedmålet med å bruke de rasjonelle tilnærmingene som presenteres å skille og kontrollere kinetikken til krystallkjerner og vekst.

I likhet med alle krystalliseringsstudier øker rene og homogene proteinprøver av høy kvalitet og støvfrie krystalliseringsløsninger suksessraten for eksperimentet. Filtrering og sentrifugering av løsninger er viktige trinn i de beskrevne protokollene. Å kjenne de fysikalske egenskapene til proteinene studert som molekylvekt (for å velge riktig dialysemembran), isoelektrisk punkt, og proteinløselighet er avgjørende for utformingen av et optimalt krystallveksteksperiment. Det må også vurderes for proteinstabilitet ved forskjellige temperaturer eller med forskjellige kjemikalier for å forhindre prøvetap og øke sannsynligheten for suksess. Med tanke på temperaturområdet til OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K), kan et bredt spekter av proteiner krystalliseres ved hjelp av det. Men det er verdt å understreke at proteiner som primært er termo-stabile, som proteiner fra termofile kilder, vil ha mest nytte i temperaturkontrollerte krystallveksteksperimenter som tilbys av dette instrumentet.

Ved hjelp av et dialysekammer med lavt volum (ved bruk av OptiCrys) eller mikroanalyseknapper og screening av flere temperaturer og krystalliseringsforhold (f.eks. rutenett av bunnkonsentrasjon eller pH), er det mulig å få informasjon om plasseringen av grensen for den metastable sonen (kinetisk likevekt mellom kjerner og meterbare soner). Dette er uvurderlig når du utformer et vellykket krystallveksteksperiment, spesielt for nye proteinkandidater i krystallisering. Uten denne informasjonen kan eksperimenter starte fra et område av fasediagrammet med høy supermetning, for langt fra grensen for metastable sonen for å enkelt kontrollere krystallkjerner. Selv om oppløsning av proteinutløsning kan forsøkes, for eksempel ved å øke temperaturen i tilfelle direkte løselighet, for proteiner med redusert termobilitet, kan det å holde prøven ved høy temperatur i lengre tid gjøre proteinnedbøren irreversibel. Dermed består den beste strategien av å bruke en innledende tilstand med lavere supermetning som ligger nær grensen for metabilitet, hvor kjerner kan kontrolleres og proteinnedbør unngås. I tråd med dette reduserer krystalliseringsprescreening sjansen for å ha et proteinutfelling i dialysekammeret og øker suksessraten for eksperimentet.

Etter å ha designet et eksperiment, er det et annet viktig skritt å forberede dialysekamre (OptiCrys) eller mikrodialyseknapper. Forebygging av luftbobledannelse i dialysekammeret/knappen øker sjansen for vellykket krystallisering, spesielt når små volumer brukes. Tilstedeværelsen av luftbobler i dialysekammeret kan også endre kinetikken i krystalliseringsprosessen og redusere reproduserbarheten av eksperimentet (fordi protein/løsningskontaktoverflaten er endret). Ikke bare protein, men også krystalliseringsløsning kan påvirke eksperimentets suksess. Ved hjelp av nye 50 ml rør for pumpesystemet hver gang man ønsker å starte et nytt eksperiment og vaskerør etter hvert eksperiment reduserer sjansen for forurensning og unngår etablering av saltkrystaller i apparatet.

Bruk av mikroanalyseknapper er et alternativ når OptiCrys ikke er tilgjengelig. Strategiene for å optimalisere krystallisering og overvåking av krystallvekst nevnt ovenfor, må utføres manuelt. Vanligvis nødvendiggjør dette å være utenfor en termoregulert inkubator, noe som kan være problematisk når temperaturregulering er et kritisk skritt i metodikken som er beskrevet. Dette forenkler ikke endring av krystalliseringsløsningenes kjemiske sammensetning, eller overvåking av krystallvekst ved avbildning, slik at krystallvekstprosessen ikke kan kontrolleres i sanntid.

Kunnskap om fasediagrammet er grunnlaget for å bruke krystalliseringsbenken, OptiCrys, til systematisk å vokse store krystaller av høy kvalitet på en automatisert måte. Kontroll av fysikalske parametere som temperatur, bunnkonsentrasjon og pH under krystallisering beveger proteinløsningslikevekten i en veldefinert kinetisk bane over fasediagrammet. Dette suppleres ved bruk av dialysemembran for å justere massetransport og skape en kontrollert gradient i krystalliseringskammeret som påvirker krystallenes størrelse og kvalitet. Derfor er bruk av både termodynamiske data og kinetiske baner avgjørende for å kontrollere krystalliseringsprosessen for å vokse krystaller av høy kvalitet. Takket være OptiCrys kan systematiske fasediagrammer i et flerdimensjonalt rom studeres med en seriell tilnærming ved hjelp av betydelig mindre materiale enn før. For å demonstrere denne metodikken gir vi her en case-studie med et modellprotein, kyllingegg-hvitt lysozyme. Ved å bruke og mestre protokollen som presenteres her kan man tilpasse den for ekte proteinsystemer5,14,17,18.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

MBS anerkjenner støtten fra LABEX VALO GRAL under kontrakten 2015. NJ anerkjenner CEA's International Doctoral Research Program (Irtelis) for PhD Fellowship. Forfattere anerkjenner støtte fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Program under Marie Skłodowska-Curie tilskuddsavtale nummer 722687. Forfatterne er også takknemlige til Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) og Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) for nyttige samtaler og innsikt. IBS anerkjenner integrering i Det tverrfaglige forskningsinstituttet i Grenoble (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  2. Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  3. Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  4. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  5. Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase. Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).
  6. Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).
  7. Chayen, N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques. REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).
  8. Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  9. Salemme, F. R. A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).
  10. Chayen, N. E., Saridakis, E. Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).
  11. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  12. Garciá-Ruiz, J. M. Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization. Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).
  13. Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).
  14. Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).
  15. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  16. Astier, J. P., Veesler, S. Using temperature to crystallize proteins: A mini-review. Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).
  17. Budayova-Spano, M., et al. A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).
  18. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).
  19. Grimsley, G. R., Pace, C. N. Spectrophotometric Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).
  20. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  21. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34 (3), 254-265 (2004).

Tags

Biologi Utgave 169 Dialyse Nøytron makromolekylær krystallografi OptiCrys Fasediagram Temperaturkontroll Krystallvekst Proteinløselighet
Optimalisering av krystallvekst for nøytron makromolekylær krystallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova … More

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter