Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimering af krystalvækst for neutronkromolekylær krystallografi

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Strukturelle undersøgelser af biomacromolecules ved krystallografi kræver krystaller af høj kvalitet. Her demonstrerer vi en protokol, der kan bruges af OptiCrys (et fuldautomatisk instrument udviklet i vores laboratorium) og/ eller mikrodialyseknapper til dyrkning af store krystaller af høj kvalitet baseret på viden om krystalliseringsfasediagrammet.

Abstract

Brugen af neutron makromolekylær krystallografi (NMX) er i hastig vækst med de fleste strukturer bestemmes i det sidste årti takket være nye NMX strålelinjer er blevet bygget og øget tilgængelighed af struktur raffinement software. De neutronkilder, der i øjeblikket er tilgængelige for NMX, er imidlertid betydeligt svagere end tilsvarende kilder til røntgenkrystallografi. På trods af fremskridt på dette område vil der altid være behov for betydeligt større krystaller til neutrondiffraktionsundersøgelser, især med tendensen til at studere stadig større makromolekyler og komplekser. Yderligere forbedringer i metoder og instrumentering, der er egnet til dyrkning af større krystaller, er derfor nødvendige for brugen af NMX til at udvide.

I dette arbejde introducerer vi rationelle strategier og en krystalvækstbænk (OptiCrys), der er udviklet i vores laboratorium, der kombinerer realtidsobservation gennem et mikroskopmonteret videokamera med præcis automatiseret kontrol af krystalliseringsløsninger (f.eks. foregribende koncentration, pH, additiv, temperatur). Derefter demonstrerer vi, hvordan denne kontrol af temperatur og kemisk sammensætning letter søgningen efter optimale krystalliseringsforhold ved hjælp af modelopløselige proteiner. Indgående kendskab til krystalliseringsfasediagrammet er afgørende for at vælge udgangspositionen og den kinetiske vej til ethvert krystalliseringseksperiment. Vi viser, hvordan en rationel tilgang kan styre størrelsen og antallet af krystaller genereret baseret på viden om flerdimensionale fasediagrammer.

Introduction

Forståelse af proteiners strukturfunktionsforhold og mekanismen for fysiologiske veje afhænger ofte af at kende placeringen af hydrogenatomer (H), og hvordan ladning overføres inden for et protein1,2. Da brintatomer spreder røntgenstråler svagt, kan deres positioner kun bestemmes med røntgendiffraktionsdata med meget høj opløsning (>1 Å)3,4. Omvendt kan neutronkrystallografi bruges til at opnå en nøjagtig position af hydrogenatomer i biologiske makromolekyler, da brint og deuteriumatomer (H2, hydrogenisotop) har spredningslængder af nogenlunde samme størrelsesorden som ilt, nitrogen og kulstof5. Neutronflux fra tilgængelige neutronkilder er imidlertid svagere end røntgenstråler, så dette skal ofte kompenseres for2,3. Dette kan opnås ved at udskifte H med H2 og/eller øge mængden af krystaller for at reducere den usammenhængende spredning af brinter og øge signal-til-støj-forholdet for diffraktionsbilleder.

Der er forskellige krystalliseringsmetoder (det tilsvarende skematiske fasediagram er vist i figur 1) til opnåelse af store krystaller af høj kvalitet til både røntgen og neutronbiomakromolekylær krystallografi6. Ved dampspredning udslibres en dråbe fremstillet af en blanding af et protein og en krystalliseringsopløsning over tid gennem fordampning af vand eller andre flygtige arter mod et reservoir, der indeholder en højere koncentration af præcipitant af samme krystalliseringsopløsning. Stigningen i koncentrationen af protein og præcipitant i dråben fører til den overmætning, der kræves til spontan nukleation efterfulgt af krystalvækst ved disse kerner6,7. Selvom dampdiffusion er den hyppigst anvendte teknik til dyrkning afkrystaller 4, kan krystalliseringsprocessen ikke styres præcist8. I den frie grænseflade diffusion metode, krystallisering løsning diffunderer i en koncentreret proteinopløsning, meget langsomt lede systemet i retning af overmætning. Denne metode kan betragtes som en batchmetode med en langsom blandingshastighedpå 6,9,10,11,12. I batchmetoden blandes proteinet hurtigt med en krystalliseringsopløsning, der fører til hurtig overmætning og til gengæld ensartet kernedannelse med mangekrystaller 3,7. Denne metode tegner sig for ca. en tredjedel af alle strukturer, der i øjeblikket deponeres i Protein Data Bank. Dialysemetoden bruges også til dyrkning af højkvalitets og godt spredende proteinkrystaller. I dialysemetoden spredes molekyler af præcipitant fra et reservoir gennem en semipermeabel membran ind i et separat kammer med proteinopløsningen. Ækvilibreringens kinetik afhænger af forskellige faktorer, såsom temperatur, membranporestørrelse og volumen og koncentration af proteinprøver og krystalliseringsmidler6.

Krystalliseringsfasediagrammer kan bruges til at beskrive forskellige tilstande af et protein som en funktion af forskellige fysiske eller kemiskevariabler 3. Som illustreret i figur 1kan hver krystalliseringsteknik visualiseres ved hjælp af en anden kinetisk bane for at nå nukleations - og metastablezonerne i et sådant diagram6,10,13. Dette giver information om proteinopløselighed og proteinkoncentrationen, hvor en termodynamisk ligevægt mellem krystal og opløsning observeres, og derved finder de optimale betingelser for kernedannelse og vækst3,14. I et todimensionelt fasediagram afbildes proteinkoncentrationen som en funktion af en variabel, og de andre variabler holdes konstante15. I et sådant fasediagram, når proteinkoncentrationen er under opløselighedskurven, er opløsningen i det undersættede område, og der opstår ingen kerne- eller krystalvækst. Over denne kurve er overmætningszonen , hvor proteinkoncentrationen er højere end opløselighedsgrænsen3,14. Dette er yderligere opdelt i tre regioner: den metastable zone, den spontane kernezone og nedbørszonen. I den metastable zone er overmætning ikke tilstrækkelig til, at nukleation kan forekomme inden for en rimelig tid, men vækst af seedede krystaller kan finde sted. Sammenlægning og nedbør er begunstiget i nedbørszonen, hvor overmætning er for høj14,15.

Når der opnås tilstrækkelig overmætning til spontan kernedannelse, vises de første kerner10. Væksten af krystaller fører til en reduktion i proteinkoncentrationen, indtil grænsen for opløselighed er nået. Så længe overmætning forbliver i nærheden af opløselighedskurven, vil der ikke være nogen væsentlig ændring i størrelsen af krystaller. Det har dog vist sig, at variationer i temperaturen og den kemiske sammensætning af krystalliseringsopløsning (for eksempel koncentrationen af præcipitant) vil påvirke proteinopløseligheden og kan føre til indledning af yderligere krystalvækst8,13,16.

Da dialyse er fordelagtig for krystalvækst af god kvalitet, blev OptiCrys krystalliseringsbænken illustreret i figur 2designet og udviklet i vores laboratorium til at kontrollere krystallisering på en fuldt automatiseret måde8. Til dette formål blev software skrevet med LabVIEW, der gør det muligt at kontrollere og overvåge temperaturen i en flydende reservoir dialyse setup i kontakt med Peltier elementer, via en elektronisk controller og en chiller. Den samme software regulerer også automatisk den kemiske sammensætning af krystalliseringsopløsningen (for eksempel udveksling af krystalliseringsmidler) ved hjælp af et multikanalvæskesystem. Derudover bruges et digitalt kamera og et omvendt mikroskop til at visualisere og optage krystalliseringsprocessen. To krystalliseringskamre med 15 μL- og 250 μL-mængder er tilgængelige til dyrkning af krystaller til forskellige formål. Da krystalliseringsprocessen er reversibel, er screening for forskellige forhold mulig med blot et par mikroliter af proteinopløsningen, så længe prøven ikke er beskadiget8. Som følge heraf minimerer brugen af denne metode mængden af proteinmateriale, der anvendes.

Fra tidligere arbejde8er det tydeligt, at in situ-observationer skal udføres med jævne mellemrum under krystalvækstprocessen. Disse kan variere fra et par sekunder til flere dage, afhængigt af hændelsen under observation (nedbør, kernedannelse eller krystalvækst).

Optimeringen af krystalvækst med OptiCrys er baseret på temperatur-precipitant koncentrationsfasediagrammer. I tilfælde af proteiner med opløselighed som en direkte funktion af temperaturen er det muligt at gøre brug af saltningsregimet18. Det er her at øge opløsningens ioniske styrke, som kan visualiseres ved hjælp af protein-precipitant fasediagrammer, reducerer proteinets opløselighed. Ligeledes kan proteiner med omvendt opløselighed gøre brug af saltning-in regime18. Nukleation forekommer i nukleationszonen, i nærheden af den metastable zone, og krystalvækst finder derefter sted i fasediagrammets metastable zone, indtil proteinkoncentrationen når opløselighedsgrænsen. Som vist i figur 3Akan med konstant kemisk sammensætningstemperatur reduceres for at holde krystalliseringsopløsningen i den metastable zone for at forhindre ny kernedannelse. Krystaller vokser, indtil den anden krystal / opløsning ligevægt er opnået, og derefter observeres ingen yderligere stigning i størrelsen af krystaller. Temperaturen reduceres flere gange, indtil krystallerne når den ønskede størrelse. I figur 3Bholder en forøgelse af præcipitantkoncentrationen opløsningen i den metastable zone ved konstant temperatur. Denne proces kan derefter gentages flere gange for at opnå store krystaller. Ændring af temperaturen og manipulere krystallisering løsning betingelser, ved at kontrollere overmætning niveauer, er to kraftfulde værktøjer til at adskille kernedannelse og vækst af krystaller, der styres præcist og automatisk af OptiCrys5,8,14.

Eksempler på proteinkrystaller, der dyrkes ved temperaturkontrolleret eller temperatur- og præcipitant koncentrationskontrolleret krystallisering, samt relative diffraktionsdata, der er opnået, er tilgængelige i litteraturen og FBF. Blandt dem er menneskelig γ-krystallin E, PA-IIL lectin, gær uorganisk pyrophosphatase, urate oxidase, human carbonic anhydrase II, YchB kinase og laktat dehydrogenase5,14,17,18.

Selvom OptiCrys blev kommercialiseret af NatX-ray, er der mange laboratorier, der ikke har adgang til dette instrument eller til den serielle tilgang, det tilbyder. Alternativet til denne teknik er at bruge kommercielt tilgængelige plast mikrodialyse knapper med forskellige mængder. Ved hjælp af disse kan temperatur og kemisk sammensætning justeres og varieres manuelt. Inspektion af mikrodialyseknapper kan ikke udføres på stedet og skal i stedet udføres manuelt med et optisk mikroskop. Temperaturregulering kan opnås ved at holde prøven i en vibrationsfri temperaturstyret inkubator. Det er vigtigt at holde temperaturen konstant for at sikre, at krystalliseringseksperimenter kan reproduceres. Betydelig temperaturvariation kan også føre til beskadigelse eller ødelæggelse afkrystaller 5.

Her leverer vi en detaljeret protokol, der beskriver prøveforberedelse og brugen af kontrolsoftware til vækst af store krystaller af høj kvalitet, der er egnet til neutronproteinkrystallografi. Denne trinvise procedure er designet til at drage fordel af krystalliseringsfasediagrammet for at vælge en startposition og kinetisk sti til at styre størrelsen og kvaliteten af de genererede krystaller. Derudover præsenteres en detaljeret protokol til dyrkning af krystaller med mikrodialyseknapper, som bruger det samme rationale til at opnå store krystaller af høj kvalitet.

Protocol

1. Dialysemetode med mikrodialyseknapper

  1. Prøveforberedelse
    1. Proteinopløsningen fremstilles ved at opløse 30 mg kyllingeæghvid lysozym som lyofilieret pulver i 1 ml CH3COONa buffer (100 mM natriumacetat, pH 4) for at opnå en opløsning med en endelig koncentration på 30 mg·mL-1.
    2. Prøven centrifugeres ved 13.000 × g i 10 min ved 277 K. Denne proces hjælper med at fjerne eventuelle aggregater, før du starter krystalliseringsprocessen.
    3. Prøvens absorbans ved 280 nm kontrolleres, og proteinkoncentrationen beregnes ved hjælp af Beer-Lambert-ligningen (A= εcl).
      BEMÆRK: Ifølge Beer-Lambert-ligningen er elektronisk absorbans (A) direkte proportional med koncentrationen (c, mg·mL-1)af en absorberende art, der får en konstant optisk vejlængde (l, cm). Gradienten af dette lineære forhold er molarudryddelseskoefficienten (ε, for lysozym ved 280 nm er 2,64 mL·mg−1,cm−1)19. Sidechains af aromatiske aminosyrer (tyrosin, tryptofan og phenylalanin) og disulfidbindinger mellem cysteinrester har stærk absorbans ved ~ 280 nm som følge af spektroskopisk tilladt π – π * overgange. Da størstedelen af proteinerne indeholder disse rester, kan proteinkoncentrationen typisk beregnes let ved at måle absorbansen ved 280 nm på grund af viden om udryddelseskoefficienten.
    4. Forbered krystalliseringsløsninger som vist i figur 4. Filtrer alle stamopløsninger med 0,22 μm Millipore-filtre, før krystalliseringsopløsningen forberedes.
  2. Krystal vækst
    1. Skær en cellulosedialysemembran med passende molekylær vægtafskæring (6-8 kDa) og blød den i destilleret vand.
      BEMÆRK: Dialysemembranskiver er kommercielt tilgængelige for mikrodialyseknapper, men hvis dialyserøret anvendes, skal du ikke glemme at skære kanterne for at adskille de to lag membran fra røret for kun at have enkeltlagsmembraner.
    2. Fyld brønde i en 24-brønds bakke med 2 ml krystalliseringsopløsning i samme rækkefølge som vist i figur 4.
      BEMÆRK: Hvis der anvendes knapper med større volumener (f.eks. 200 μL), fyldes 50 ml rør med mindst 5 ml krystalliseringsopløsning for at sikre effektiv udskiftning.
    3. Der tilsættes/pipetter 35 μL lysozymopløsning til mikrodialyseknappens kammer som vist i figur 5A.
      BEMÆRK: For at undgå dannelse af luftbobler i en dialyseknap på 30 μL, når den lukkes, skal der tilsættes et ekstra volumen (dødt volumen) på 5 μL ekstra protein, hvilket betyder i alt 35 μL proteinprøve. Denne ekstra proteinprøve skaber en let kuplet form oven på kammeret, som vist i figur 5B, som forhindrer dannelsen af luftbobler.
    4. Tag en applikator af den passende størrelse, og placer den elastiske O-ring i dens ekstremitet (Figur 5C). Placer derefter membranen, der tidligere var let tørret/drænet med et stykke fiberfrit papir, oven på dialyseknappens kammer. Pas på ikke at lægge støv i kammeret, når du påfører papiret. Sæt dialysemembranen på plads ved at overføre den elastiske O-ring fra applikatoren til dialyseknappens rille (Figur 5C).
      BEMÆRK: Det kritiske håndteringsøjeblik er at fastgøre dialysemembranen oven på kammeret ved at overføre den elastiske O-ring fra applikatoren til dialyseknappens rille. Alle bevægelser skal være perfekt synkroniseret for at undgå at omslutte luftbobler med prøven i proteinkammeret. Det er nyttigt at øve sig i at strække den elastiske O-ring før dens anvendelse for at kende dens stivhed, bruge pincet til at holde en del af membranen under dens anvendelse og udføre de første testeksperimenter med et modelprotein.
    5. Knappen overføres til brønden eller til 50 mL røret ved hjælp af pincet(Figur 5D).
    6. Dæk brønden med en coverlip, og tryk forsigtigt på fedtet for at forsegle brønden (Figur 5E).
      BEMÆRK: Hvis der ikke er fedt oven på brøndene, skal du sørge for at tilføje dette, før du starter eksperimentet eller bruge et stykke tape i stedet for glasovertræk. Princippet om proteinkrystallisering ved hjælp af mikrodialyseknapper er illustreret i figur 5.
    7. Prøven opbevares ved 293 K i en thermoreguleret inkubator. Forskellige temperaturer kan være nødvendige i henhold til de anvendte protein- og krystalliseringsforhold.
      BEMÆRK: Det samme gitter af krystalliseringsbetingelser, der er vist i figur 4 (som gør det muligt at variere koncentrationen af præcipitanter), kan screenes som en funktion af temperaturen. I så fald skal den samme krystalliseringsplade gengives, og hver kopi skal anbringes i en inkubator, der reguleres ved en anden temperatur. Dette kræver, at der er flere vibrationsfrie thermoregulerede inkubatorer til rådighed.
    8. Kontroller bakken eller rørene for krystaller (Figur 4) og tag noter regelmæssigt, typisk dagligt, for at skelne mellem, hvad der er i hver bakke. Gode noter er afgørende for at undgå falske positive resultater og for at diskriminere støv fra krystaller.

2. Krystal vækst proces ved hjælp af OptiCrys

  1. Prøveforberedelse
    1. Der fremstilles en proteinopløsning og en dialysemembran som beskrevet i punkt 1.1.
    2. Forbered lageropløsninger af NaCl (4 M) og AF CH3COONa pH 4 (1 M) og filtrer dem i 50 mL rør.
    3. Proteinopløsningen (15 μL lysozym med 30 mg-mL-1)til dialysekammeret i den temperaturregulerede temperaturstyrede temperaturdialyseopsætning. Se figur 6 for at få nærmere oplysninger om opsætningen af temperaturstyret strømafbrydende reservoirdialyse. OptiCrys har to dialysekamre, minimumsvolumenet er 15 μL, og det maksimale volumen er 250 μL.
    4. Dæk overchamberen med en dialysemembran og fastgør membranen med den elastiske O-ring (Figur 6B).
      BEMÆRK: Denne opsætning er forskellig fra mikrodialyseknapper, hvor hvert kammer forsegles direkte af en dialysemembran. I flowcellen fastgøres dialysemembranen i stedet til overchamberen, hvilket gør det muligt at montere krystaller uden at fjerne den. Til dette formål kan overchamber simpelthen skrues ud af reservoiret.
    5. Vend overchamber og læg det på toppen af dialysekammeret. Tryk langsomt og forsigtigt på den for at fjerne al den luft, der er fanget mellem de to stykker, og undgå bobler i kammeret (Figur 6C). Praksis med en model protein kan være en fordel, når uddannelse for at undgå luftbobler og prøve tab.
    6. Fastgør reservoiret i sin position ved forsigtigt at skrue det oven på overchamberen, igen at være opmærksom på at undgå at fange luftbobler. Overstramning af reservoiret kan også danne bobler i krystalliseringskammeret (Figur 6D).
    7. Tilsæt krystalliseringsopløsningen og dæk reservoirkammeret med den lufttætte hætte. (Figur 6G). Det maksimale volumen af reservoiret er 1 mL.
    8. Overfør denne samling, og indsæt den i messingstøtten. Denne støtte er i kontakt med Peltier elementer, der bruges til at styre temperaturen.
    9. Som det fremgår af figur 6, er lufttæt hætte udstyret med et optisk vindue, der gør det muligt at belyse dialysekammeret. Sæt lyskilden (Figur 2) på vinduet, så lyset kan passere gennem kammeret.
    10. Reservoirkammeret kan tilsluttes en pumpe, så det kan fungere som en kontinuerlig flowcelle. Tilslut slangen oven på de 50 mL rør, der indeholder stamopløsningerne og det destillerede vand, til drejeventilen som vist i figur 7.
      BEMÆRK: Hvis der ikke ønskes automatisk forberedelse og ændring af krystalliseringsopløsninger under forsøget, skal du udelade trin 2.1.10. I så fald skal krystalliseringsopløsningen fremstilles, og reservoiret forfyldes manuelt.
  2. Software
    1. Tænd computeren og lancere softwaren Croissance cristalline [Crystal vækst]. Denne kontrol software er skrevet med LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) og tilbyder en brugervenlig grafisk grænseflade. Den indeholder 4 forskellige grafiske grænseflader (Accueil [Welcome], Paramétrage [Setting], Essai [Test] og Maintenance [Maintenance]) (Figur 8).
      BEMÆRK: Oversættelser fra fransk er i parentes.
    2. Vælg vedligeholdelsesvisningen ved at klikke på knappen som vist i Figur 8. Denne visning bruges i øjeblikket oftest og giver brugerne mulighed for at styre de fleste parametre under eksperimentet.
      BEMÆRK: Når du har klikket på vedligeholdelsesvisningen, vises et nyt vindue med forskellige sektioner til styring af parametre som temperatur eller lys. I figur 8 vises forskellige dele af denne visning med pile og rammer. I de følgende trin demonstrerer vi, hvordan hver parameter styres ved hjælp af softwaren.
    3. Afsnittet Régulateur de température [Temperaturregulator] gør det muligt at styre og overvåge temperaturen. Klik på knappen, nummer et (1) i Figur 8, for at slå den til.
      BEMÆRK: Temperaturområdet i OptiCrys er 233,0 – 353,0 ± 0,1 K.
    4. Angiv temperaturen på modtagerens [setpoint]-sektion, og tryk på enter (figur 8,stk. 2). Under denne knap er der en graf med 2 spor (rød og gul). Den røde spor viser den endelige (ordnede) temperatur, og den gule spor viser den aktuelle temperatur. Som vist i figur 8( 2 )er temperaturen indstillet til 20 °C.
      BEMÆRK: For at dyrke en krystal, som forklaret i krystalvækstsektionen, skal der vælges mange temperaturer. Hvis du vil ændre temperaturen, skal du tilføje hver ny temperatur i afsnittet modtager [setpoint] og trykke på enter-knappen på tastaturet.
    5. Tænd lyset ved at øge lysstyrken fra lumières-afsnittet i figur 8. Lysstyrken varierer fra 0 til 100, "0" angiver, at lyset er slukket, og ved "100" er lyset indstillet til maksimal intensitet og lysstyrke. Ved at øge lyset, i mikroskopsektionen, kan man se inde i dialysekammeret. Under forsøget kan lysstyrken i cellen variere; justere parametrene for tydeligt at visualisere inde i dialysekammeret. Forstørrelse kan også øges eller reduceres ved hjælp af + og - knapper foran "zoom" for bedre visning.
    6. På højre side af mikroskopsektionen er der flere sektioner til lagring af relevante oplysninger for hvert krystalliseringseksperiment. Hver bruger kan oprette en mappe til lagring af oplysninger om krystalliseringsforhold, proteinnavne og den anvendte dialysemembrans molekylære vægtnedskæring (Figur 8(3)).
    7. Brugeren kan definere et navn til eksperimentet ved blot at skrive det på Nom Dossier [Mappenavn]. Hvis du klikker på knappen Dossier [Mappe] (vist med en grøn ramme i Figur 8), åbnes et nyt vindue. I dette vindue vil der være en tekstfil, der indeholder alle de oplysninger, der er defineret for eksperimentet. Derudover gemmes tidsstemplede billeder i denne mappe til fremtidig behandling.
    8. Vælg det antalbilleder, der skal tages i løbet af eksperimentet, i afsnittet NB-billeder . Angiv nummeret på billederne i panelet til højre sammen med det ønskede tidsinterval mellem disse (f.eks. min., min. time, dag). Figur 8 viser softwareopsætningen til at optage nul billeder på et minut.
      BEMÆRK: Brug Pompe [Pump]-sektionen til at blande stamopløsninger og injicere krystalliseringsopløsning i reservoirkammeret. Se punkt 2.1.10 og figur 7 for en forklaring af princippet om væskeblandingssystemet.
    9. Inputkoncentrationer af lagerløsningerne i Etape 1 [Trin 1]: løsningslagre. Til krystalliseringseksperimentet i næste afsnit vil NaCl 4 M og CH3COONa 1 M pH 4 blive anvendt.
      BEMÆRK: Koncentrationerne af stamopløsninger findes i molarenheder.
    10. Definer den endelige koncentration af hver løsning. F.eks. 0,75 M for NaCl og 0,1 M for CH3COONa pH 4. Indtast disse i det sidste koncentrationsafsnit (figur 8) i Etape 2 [Trin 2]: løsning à préparer [løsning til forberedelse]. Tryk på knappen Calcul [Compute], som vises med en rød ramme i Figur 8. Det endelige volumen af hver stamopløsning, der skal anvendes til blanding, vil blive vist i volumenpanelet foran hvert koncentrationspanel.
    11. Tryk på knappen Lancer préparation [Startforberedelse] (Figur 8). Som det fremgår af figur 7, tager rotationsventilen hver stamopløsning og injicerer dem i røret via en kontakt.
    12. Når krystalliseringsopløsningen er udarbejdet, skal du klikke på knappen Entrée-opløsningen i Etape 3 [Trin 3]: Pumpesektionens flux (gul ramme i figur 8). Kontakten ændres for at injicere den nye krystalliseringsopløsning fra blandingsrøret ind i reservoirkammeret. Tryk på knappen Arrêt distribution [Distribution Stop] for at stoppe udvekslingsprocessen.
      BEMÆRK: Overhold krystalliseringsprocessen under eksperimentet, og rediger parametre som temperatur, krystalliseringsopløsning og zoom i den tilsvarende grafiske grænseflade i overvågningssoftwaren. Ved at bruge softwaren er der ingen grund til at fjerne lufttæt hætten eller flowcellen under eksperimentet, så den eneste variabel vil være den, som brugeren ændrer gennem softwaren.
  3. Stor krystalvækst
    1. Der tilsættes 15 μL lysozym med en koncentration på 30 mg-mL-1 til dialysekammeret (figur 6A).
      BEMÆRK: Forbered proteinprøven som beskrevet i punkt 1.1.
    2. Den temperaturregulerede dialyseopsætning af det flydende reservoir samles som beskrevet i punkt 2.1 og figur 6.
    3. Forbered krystalliseringsopløsningen. Glem ikke at filtrere alle stamopløsningerne før prøveforberedelse med 0,22 μm filtre. Til dette eksperiment indeholder krystalliseringsopløsningen 0,75 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4. Dette kan tilsættes manuelt eller ved hjælp af reservoirkammeret og pumpesystemet som beskrevet i punkt 2.2.10 til 2.2.12.
    4. Temperaturen indstilles til 295 K som forklaret i punkt 2.2.3 og 2.2.4 og vist på billede 8. Under de første forhold vil ligevægten mellem dialysekammeret og reservoiret blive nået efter ca. 90 minutter, og de første synlige kerner vises efter 22 timer.
    5. Lad krystallerne vokse, indtil der ikke er observeret mere synlige ændringer i krystallernes størrelse (Figur 9, panel 1).
      BEMÆRK: For at bestemme nukleationstiden og måle variationen i krystallernes størrelse skal du optage billeder hvert 15. eller 20. minut, hvilket er henholdsvis 4 eller 3 billeder i timen i afsnittet NB-billeder. For in situ observation af protein denaturering, sammenlægning og nedbør eller krystal opløsning eller kernedannelse, typisk mellem et par sekunder til et par snese minutter er påkrævet. Men for krystalvækst er dette interval mellem et par minutter til et par timer.
    6. Efter tre dage skal du sænke temperaturen til 291 K for at genstarte krystalvæksten. Hold temperaturen konstant og lad krystallen udvikle sig (Figur 9, panel 2). I denne fase af eksperimentet vil det være tilstrækkeligt at optage billeder hver 2. time og kontrollere hver 10. til 12. time for enhver ændring i krystallernes størrelse. Forsøget kan fortsættes, hvis der ikke observeres nogen ændring i krystallernes størrelse.
      BEMÆRK: Afhængigt af protein- og præcipitantkoncentrationerne i krystalliseringsopløsningen og de anvendte proteinmængder kan den tid, det tager at nå ligevægten for hvert trin, variere.
    7. Reducer temperaturen til 288 K for at genstarte krystalvæksten. I den eksperimentelle tilstand af sagen præsenteret her, en dag er nok til at nå ligevægt (Figur 9, panel 3).
    8. Kontroller størrelsen af krystallerne og opretholde en konstant temperatur, så længe krystal fortsætter med at vokse.
    9. Efter 4 dage skal du sænke temperaturen til 275 K for at genstarte krystalvæksten (Figur 9, panel 4).
      – I de fremlagte forsøgsbetingelser vil der efter ca. 10 dage blive fremstillet en krystal på 500 μm i én dimension (figur 9).
  4. Styring af krystalstørrelsen
    1. Der fremstilles en proteinopløsning og den temperaturregulerede flydende reservoirdialyse, der er opsættet som beskrevet i punkt 2.3.1 og 2.3.2.
    2. Forbered krystalliseringsløsninger med 0,9 M NaCl og 0,1 M CH3COONa pH 4.
    3. Indstil temperaturen til 291 K og lad krystallerne vokse. Under de første forhold starter den første kernebegivenhed efter ca. en time, og mange krystaller vil vokse i dialysekammeret i tre timer (Figur 10, trin: 1 og 2). Optag billeder hvert 20. minut for at kontrollere størrelsen af krystallerne under vækstprocessen.
      BEMÆRK: Optimering af krystalliseringsforhold er afgørende for at kontrollere de fleste af de endelige egenskaber ved genererede krystaller. Temperaturen og den kemiske sammensætning af krystalliseringsopløsninger kan ændres til at opløse og re-vokse krystaller af ensartet størrelse. Det skal også bemærkes, at en proteinprøve ikke indtages i et sådant forsøg, da forholdene kan vendes for at opløse prøven igen, så længe den ikke denatureres. Ved opløsning af krystaller ved at ændre temperaturen og opretholde konstant kemisk sammensætning, skal du fortsætte eksperimentet på følgende måde:
    4. Når krystaller er vokset ved 291 K, kan disse opløses for at vokse færre, større krystaller. Forøg temperaturen gradvist over 20 minutter for at nå 313 K. Det tager omkring en time at opløse alle krystaller inde i dialysekammeret (Figur 10, trin: 3-5). Optag billeder hvert 5. til 15. minut for at overvåge opløsningsprocessen.
      BEMÆRK: Mange proteiner er følsomme over for høje temperaturer. Sørg for at arbejde inden for temperaturområdet, hvor proteinet er stabilt, for at undgå skader/denaturering. Ud over proteinopløseligheden påvirker temperaturen også bufferopløsningen. For eksempel kan bufferens pH ændre sig med temperatur, især i Tris-bufferen. I et sådant tilfælde er det vigtigt at indstille pH-temperaturen i henhold til den temperatur, hvor forsøget udføres18. Det skal også bemærkes, at proteinopløsning tager betydeligt mindre tid (fra et par minutter til et par timer) sammenlignet med proteinkrystalvækst (fra et par timer til et par dage). Generelt stiger temperaturen gradvist og langsomt under opløsningen af krystallerne (under overholdelse af den korte samlede opløsningstid), hovedsagelig i tilfælde af delvis opløsning af krystallerne for at undgå stigningen i krystalmosaikken. Når krystallerne vokser, kan temperaturen falde hurtigt (på mindre end et minut) til den indstillede temperatur (under overholdelse af den lange samlede væksttid). Regelmæssig overvågning af krystalliseringskammeret ved at optage billeder er tilrådeligt for at forhindre skader på proteinet og hjælpe med at definere den optimale tid til opløsning eller vækst af krystaller for hvert undersøgt protein.
    5. Når alle krystaller er opløst, skal du indstille temperaturen til 295 K for at starte en anden kernebegivenhed (Figur 10, trin: 6,7). Optag billeder hvert 5. minut for at overvåge den anden kerneproces. I dette trin vises de første kerner efter ca. 18 minutter.
      BEMÆRK: Ved denne temperatur vil opløsningen være i nukleationszonen i nærheden af metastable-zonen. Som følge heraf vises kun få kerner i krystalliseringskammeret.
    6. Fortsæt eksperimentet med at gentage den optimeringsarbejdsgang, der er beskrevet i afsnit 2.3, til dyrkning af større krystaller. Den samlede varighed af eksperimentet, der er repræsenteret i figur 10, er kun nogle få dage.
      BEMÆRK: Hvis krystallerne i nukleationsfasen forekommer på forskellige tidspunkter, opnås krystaller af forskellig størrelse i krystalliseringskammeret. I et sådant tilfælde vil temperaturstigningen (i tilfælde af proteiner med direkte opløselighed) resultere i hurtigere opløsning af de mindre krystaller. Afhængigt af den kinetiske modningseffekt kan det ekstra protein (opnået ved opløsning) derefter bruges til vækst af de større krystaller.
      Når krystaller opløses ved konstant temperatur ved at ændre krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning, skal du fortsætte forsøget på følgende måde:
      Det er også muligt at opløse krystaller dyrket tidligere ved at ændre krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning under forsøget for at genoplive en population af ensartet størrelse krystaller under nye forhold.
    7. Proteinopløsningen (2.3.1), den temperaturstyrede opsætning af flydende reservoirdialyse (2.1) og krystalliseringsopløsningen (2.4.2) fremstilles som beskrevet ovenfor. Under de første forhold i nukleationszonen langt fra den metastable zone vises mange små krystaller i krystalliseringskammeret og begynder at vokse (Figur 11, trin: 1,2).
    8. Efter tre timer, når mange mellemstore krystaller er synlige i krystalliseringskammeret (Figur 11, trin: 3), skal du gradvist reducere NaCl-koncentrationen (0,9 M) for at nå nul. Til dette skal du forberede en ny krystalliseringsopløsning, der kun indeholder bufferopløsning med 0,1 M CH3COONa pH 4. Brug pumpesystemet til at udskifte det med krystalliseringsopløsningen i reservoirkammeret. Følg trin 2.2.10 til 2.2.12 for fremstilling og injektion af en ny opløsning i reservoirkammeret. Med denne nye løsning falder NaCl-koncentrationen i kammeret, indtil den endelige opløsning i reservoirkammeret ikke indeholder mere end 0,1 M CH3COONa pH 4 og ingen NaCl. Tag billeder hvert 10. minut for at registrere opløsningsprocessen.
    9. Lad krystallerne opløses fuldstændigt (Figur 11, trin: 4,5). Opløsningstid er omkring to timer for dette eksperiment. Som tidligere nævnt afhænger opløsningstiden af proteinsystemet, krystalliseringsbetingelserne og den anvendte dialysekammervolumen. Regelmæssig observation af krystalliseringskammeret (se mikroskopsektionen) og optagelse af billeder og noter under eksperimentet er afgørende.
    10. Når alle krystaller inde i kammeret er opløst (Figur 11, trin: 5), skal du bruge pumpesystemet igen til at forberede en ny krystalliseringsopløsning ved at injicere NaCl ved en lavere koncentration end den foregående (0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4).
    11. Indsprøjt den nye opløsning i reservoirkammeret (Figur 11, trin: 6,7) og gentag arbejdsgangen for optimering af krystallisering som beskrevet i afsnit 2.3. En ensartet population af større krystaller vil blive genereret. Resultaterne i figur 11 blev opnået efter et par dage.

Representative Results

I afsnit 2.3 og 2.4 præsenteres tre eksempler på optimeret krystalvækst, der viser brugen af instrumentet og et eksperimentelt design til dyrkning af store krystaller. Til denne demonstration har vi brugt lysozym som modelprotein, selvom krystalvæksteksperimenter med succes er blevet udført med mange andre proteinsystemer ved hjælp af denne metode (se ovenfor). Ved at bruge og mestre den protokol, der præsenteres her, kan man tilpasse den til andre proteinkandidater.

I afsnit 2.3 påviste vi, at etablerede rationelle krystalliseringsstrategier kunne være gavnlige i dyrkning af krystaller med tilstrækkelige spredningsvolumener til neutronproteinkrystallografi. Her viser vi, at de foreslåede rationelle optimeringsstrategier også gør det muligt at få en ensartet population af krystaller af enhver specifik størrelse, der kræves til downstream-strukturbestemmelsesmetoder.

Disse to eksperimenter er designet til at understrege vigtigheden af fasediagrammer i styringen af krystalkerner og vækst. Her bruges kontrol af temperaturen og den kemiske sammensætning af krystalliseringsløsninger i kombination med overvågning af krystalliseringsprocessen i realtid til at studere det kvalitative fasediagram. Ved hjælp af denne metode kan nukleation og krystalvækst optimeres rationelt på en reversibel måde. Brug af en sådan seriel tilgang reducerer også mængden af protein og den tid, der kræves for at kontrollere krystallernes størrelse og kvalitet.

I dialysemetoden adskilles en proteinopløsning fra en krystalliseringsopløsning af en semipermeabel membran6 (Figur 5). Denne dialysemembran gør det muligt for små molekyler som tilsætningsstoffer, buffer og ioner at passere gennem membranen, men ikke makromolekyler som proteiner6,20. Denne funktion gør det muligt at ændre krystalliseringsopløsningen i løbet af eksperimentet6. Udveksling af løsningen kan udføres manuelt, for eksempel i mikrodialyseknapper, eller på en automatiseret måde ved hjælp af et instrument udviklet til dette formål, OptiCrys8.

I det første sæt eksperimenter blev mikrodialyseknapper brugt til krystallisering af kyllingæghvid lysozym. Mikrodialyseknapper blev nedsænket i krystalliseringsopløsninger med forskellige saltkoncentrationer. I dette enkle krystalliseringsgittereksperiment er den eneste variabel præcipitantkoncentration, mens temperaturen holdes konstant (293 K). Som vist i figur 4medfører små variationer i saltkoncentrationen en ændring i størrelsen og antallet af observerede krystaller, hvilket gør det muligt at undersøge krystalliseringsfasediagrammet. I figur 4, panel 1, indeholder krystalliseringsopløsningen 0,7 M NaCl, og et begrænset antal større krystaller er dukket op i knapperne. Ved at øge saltkoncentrationen fra 0,7 til 1,2 M øges overmætningen, og opløsningen i nukleationszonen bevæger sig væk fra den metastable zone (Figur 4, panel 1 til 6). Som følge heraf øges antallet af krystaller, og deres størrelse falder.

I det første eksperiment med et fuldautomatisk instrument, der muliggør temperaturstyret dialysekrysekrystallisering, OptiCrys (Figur 9), blev krystalvæksteksperimentet skræddersyet til at generere stor krystalvækst. Eksperimentet blev lanceret ved en indledende temperatur på 295 K med en krystalliseringsopløsning indeholdende 0,75 M NaCl og 0,1 M Na acetat buffer pH 4. Under disse forsøgsbetingelser nåede krystalliseringsopløsningen nukleationszonen i nærheden af fasediagrammets metastable zone (Figur 9, pil 1). Som følge heraf blev der kun genereret nogle få kerner i løbet af eksperimentets første fase. For at dyrke udvalgte krystaller yderligere (vist i figur 9) blev krystalvækstoptimeringsarbejdsgangen drevet mod den metastable zone ved varierende temperatur, så snart krystalopløsningsligevægten blev nået.

Hver gang ligevægten mellem krystal og opløsning blev nået, blev temperaturen sænket, først til 291 K, derefter til 288 K og endelig til 275 K, for at holde krystalliseringsopløsningen i den metastable zone. Resultatet af dette eksperiment er en enkelt stor krystal egnet til både makromolekylær røntgen og neutronkrystallografi.

For de fleste proteiners vedkommende er det præcise kvantitative fasediagram (eller blot et kvalitativt diagram) endnu ikke opnået på grund af manglen på eksperimentelle anordninger, der er i stand til nøjagtigt at måle proteinkoncentrationen (eller blot observere/detektere krystalliseringsprocessen i realtid) under krystalliseringsforsøg18. Som følge heraf er det ofte ikke muligt at designe eksperimentet på en sådan måde, at krystallisering begynder i det optimale område af fasediagrammet i nærheden af den metastable zone.

Derfor skal en krystalliseringsoptimeringsundersøgelse finde sted, før eksperimentet dedikeret til væksten af en stor volumenkrystal udføres. I denne undersøgelse er det ved hjælp af temperaturvariationer (ved konstant kemisk sammensætning) på den ene side og variationer i kemisk sammensætning (ved konstant temperatur) på den anden side nødvendigt at identificere den metastable zone og afgrænse de optimale betingelser for at starte et stort krystalvæksteksperiment.

Til dette formål præsenteres to andre eksperimenter, som blev skræddersyet til at demonstrere reversibiliteten af de temperaturstyrede dialysekrystalliseringseksperimenter med OptiCrys til kernedannelse, krystalvækst, opløsning og genvækst. Krystalvækstoptimeringsarbejdsgangen blev kontrolleret, så der blev dyrket en ensartet population af færre, større lysozymkrystaller ved hjælp af temperaturvariation eller begyndende koncentration.

I det andet eksperiment med OptiCrys blev krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning holdt konstant under hele forsøget (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Den oprindelige temperatur blev sat til 291 K. Resultaterne af dette eksperiment er sammenfattet i figur 10. På grund af høj overmætning dukkede et stort antal små krystaller op i krystalliseringskammeret (Figur 10, paneler 1 og 2). I overensstemmelse med begrebet direkte proteinopløselighed blev alle krystallerne opløst ved gradvist at øge temperaturen til 313 K (Figur 10, panel 3, 4 og 5). Endelig blev den anden kerne ved at sænke temperaturen til 295 K indledt i nærheden af den metastable zone og tilladt kontrolleret dannelse af et lavere antal kerner. Yderligere krystalvækst resulterede i en ensartet generation af en bestand af større krystaller (Figur 10, panel 7).

Som vist i figur 11kan variation af krystalliseringsopløsningens kemiske sammensætning ved en konstant temperatur på 291 K ligeledes bruges til at opnå en ensartet population af større krystaller. I lighed med det foregående eksperiment var den oprindelige tilstand 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-koncentrationen blev derefter gradvist sænket fra 0,9 M til nul for at opløse krystallerne (Figur 11, panel 4 og 5). På dette tidspunkt blev NaCl fuldstændig erstattet af en bufferopløsning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Reduktion af saltkoncentrationen holder opløsningen i den undersættede zone i fasediagrammet, hvilket fører til opløsning af krystallerne. Derefter blev en ny krystalliseringsopløsning med lavere ionisk styrke ved 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4 sprøjtet ind i reservoirkammeret. Ved denne begyndende koncentration dukkede de første kerner op (Figur 11, panel 6) efter 90 minutter. Antallet af genererede krystaller var lavere, og krystallerne når et større volumen (Figur 11, panel 7) end før.

Figure 1
Figur 1: Skematisk fasediagram. Kinetiske baner for tre krystalliseringsteknikker er repræsenteret i et saltningsregime. Hver metode opnår nukleation og krystallisering forskelligt, visualiseret af en anden kinetisk vej gennem fasediagrammet for at nå nukleations- og metastablezonerne. Opløselighedskurven adskiller undersætnings- og overmætningsområder. Overmætning er opdelt i tre zoner: metastable, nukleation og nedbør. I nukleationszonen opstår spontan kernedannelse, mens krystalvæksten i den metastable zone finder sted. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Skematisk repræsentation af krystalliseringsbænken (OptiCrys). LED-lyskilden er placeret oven på den temperaturstyrede dialysestrømcelle. Et omvendt mikroskop og det digitale kamera vises øverst til højre på billedet med den røde pil. Den røde cirkel repræsenterer placeringen af chillerrøret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Skematisk todimensionalt proteinkrystalliseringsfasediagram som funktion af temperatur (A) og præcipitantkoncentration (B). (A) I tilfælde af et protein med direkte opløselighed holder en reduktion af temperaturen krystalliseringsopløsningen i den metastable zone. Temperaturvariation kan gentages flere gange for at kontrollere krystalvækstprocessen, indtil krystaller med det ønskede volumen er opnået. (B) Ændring af koncentrationen af den præcipitantopløsning kan også bruges til at holde krystalliseringsopløsningen i metastabelzonen til dyrkning af krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Krystaller af lysozym opnået ved hjælp af dialysemetoden. Dette eksperiment blev udført ved en konstant temperatur på 293 K i 0,1 M natriumacetat buffer pH 4. Stigende NaCl koncentration fra 0,7 M til 1,2 M øger nukleationshastigheden og resulterer i et større antal krystaller. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Oversigt over proteinkrystalliseringsprocessen ved dialysemetoden. (A) Ved at tilføje proteinet til dialyseknappens kammer, (B) skabes en kuppelform øverst i kammeret. (C) En applikator anvendes til at overføre O-ringen til dialyseknappens rille for at rette dialysemembranen på plads. (D) Dialyseknappen er klar til nedsænkning i reservoiropløsningen. (E) Krystalliseringsopløsningen passerer gennem den semipermeable membran, og der begynder at danne sig krystaller inde i kammeret. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Skematisk visning af den temperaturstyrede flydende dialyseopsætning. (A) Proteinprøven tilsættes dialysekammeret. (B) Dialysemembranen fastgøres på overchamberen med en O-ring ved hjælp af en applikator. (C) Overchamberen drejes og fastgøres på toppen af dialysekammeret. Hvide pile angiver, hvor skruer er placeret på overchamber. (D) Reservoirkammeret drejes med uret (E) og fastgøres oven på overchamberen. (F) Reservoirkammeret er dækket af en lufttæt hætte med stik til et pumpesystem, og (G) flowcellen placeres i messingstøtten. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Forberedelse og injektion af krystalliseringsopløsningen i reservoiret af det fluidiske system (A). Rør, der indeholder salt og vand, tilsluttes tryk-/vakuumregulatoren (B) og rotationsventilen (C). Ved at bruge trykket skaber tryk-/vakuumregulatoren en konstant strøm af væsker fra rørene til rotationsventilen. Hver væske, der passerer gennem flowmåleren (D), og kontakten injiceres i blandingsrøret (F). Når alle væskerne er tilsat blanderøret, injicerer kontakten ved nogle modifikationer den endelige opløsning fra blanderøret i reservoiret (G). Væsken strømmer gennem systemet i retning af pilene i diagrammet markeret i stigende rækkefølge (fra 1 til 6). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: Vedligeholdelsesvisning af overvågningssoftwaren. Denne visning bruges til at styre forskellige parametre som temperatur, lys, krystalliseringsløsning og zoom. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: Fasediagrammet som en funktion af temperaturen (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). En enkelt stor lysozym krystal opnås ved systematisk at ændre temperaturen fra 295 K til 275 K. Ved hvert trin stoppes krystalvæksten, når du når opløselighedskurven. Reduktion af temperaturen ved at holde opløsningen i metastable zone genstarter krystal vækst. Billederne har forskellige niveauer af forstørrelse. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: Optimering af krystalvækst ved konstant kemisk sammensætning ved hjælp af temperaturregulering (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). Start af nukleationsprocessen i nukleationszonen ved 291 K, langt fra den metastable zone, resulterer i dannelsen af mange krystaller. Ved at øge temperaturen til 313 K opløses krystallerne, indtil der ikke ses synlige kerner i dialysekammeret. Endelig, faldende temperaturen til 295 K genstarter nukleationsprocessen for anden gang, hvilket fører til et begrænset antal større krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Optimering af krystalvækst ved konstant temperatur ved hjælp af variationer i præcipitantkoncentrationen (udvalgte billeder skal spores i stigende rækkefølge). Reduktion af præcipitantkoncentrationen fra 0,9 M til 0 M opløser de krystaller, der opnås under den første kernebegivenhed. Krystalliseringsprocessen genstartes ved injektion af den samme precipitant, men ved lavere ionisk styrke, 0,75 M, hvilket fører til dannelsen af et par større krystaller. Dette tal er tilpasset fra Junius et al. 8,18Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Forskellige fysiske, kemiske og biologiske variabler påvirker proteinkrystallisering ved at påvirke proteinopløseligheden21. Blandt disse variabler anvendes temperatur og kemisk sammensætning af krystalliseringsopløsningen her i kombination med dialyseteknik til at forbedre og dyrke store højkvalitetskrystaller af biomacromolecules til neutron diffraktionsundersøgelser. Ved at bruge viden om fasediagrammer gøres krystallisering mere forudsigelig. Selv om screening af forskellige krystalliseringsforhold i en seriel tilgang også er mulig, er hovedformålet med at bruge de fremlagte rationelle tilgange at adskille og kontrollere kinetik af krystalkerner og vækst.

I lighed med alle krystalliseringsundersøgelser øger rene og homogene proteinprøver af høj kvalitet og støvfri krystalliseringsløsninger eksperimentets succesrate. Filtrering og centrifugering af løsninger er væsentlige trin i de beskrevne protokoller. Kendskab til de fysiskkemiske egenskaber af de undersøgte proteiner såsom den molekylære vægt (for at vælge den passende dialysemembran), det isoelektriske punkt og proteinopløseligheden er afgørende for udformningen af et optimalt krystalvæksteksperiment. Der skal også tages hensyn til proteinstabilitet ved forskellige temperaturer eller med forskellige kemikalier for at forhindre tab af prøver og øge sandsynligheden for succes. I betragtning af temperaturområdet OptiCrys (233,0-353,0 ± 0,1 K) kan en bred vifte af proteiner krystalliseres ved hjælp af det. Men det er værd at understrege, at proteiner, der primært er termostalde, såsom proteiner fra termofile kilder, ville gavne mest i temperaturstyrede store volumen krystalvæksteksperimenter, der tilbydes af dette instrument.

Ved hjælp af et lavvolumendialysekammer (ved brug af OptiCrys) eller mikroanalyseknapper og screening af flere temperaturer og krystalliseringsforhold (f.eks. gitter af præcipitantkoncentration eller pH) er det muligt at få oplysninger om placeringen af grænsen for den metastable zone (kinetisk ligevægt mellem nukleations- og metastable zoner). Dette er uvurderligt, når man designer et vellykket krystalvæksteksperiment specielt til nye proteinkandidater i krystallisering. Uden disse informationseksperimenter kan man starte fra et område i fasediagrammet med høj overmætning, for langt fra grænsen for den metastable zone til nemt at kontrollere krystalkerner. Selv om opløsning af proteinudfældning kan forsøges, kan det for eksempel ved at øge temperaturen i tilfælde af direkte opløselighed for proteiner med reduceret termostabilitet gøre prøven ved høj temperatur i længere tid gøre proteinudfældning irreversibel. Således består den bedste strategi i at bruge en indledende tilstand med lavere overmætning placeret nær grænsen for metastability, hvor nukleation kan kontrolleres og proteinudfældning undgås. I overensstemmelse med dette reducerer krystallisering prescreening chancen for at få et proteinudfældelse i dialysekammeret og øger eksperimentets succesrate.

Efter at have designet et eksperiment er forberedelse af dialysekamre (OptiCrys) eller mikrodialyseknapper et andet vigtigt skridt. Forebyggelse af dannelse af luftbobler i dialysekammeret/-knappen øger risikoen for vellykket krystallisering, især når der anvendes små mængder. Tilstedeværelsen af luftbobler i dialysekammeret kan også ændre krystalliseringsprocessens kinetik og reducere forsøgets reproducerbarhed (fordi protein/opløsningens kontaktflade er blevet ændret). Ikke kun protein, men også krystalliseringsløsning kan påvirke eksperimentets succes. Brug af nye 50 mL rør til pumpesystemet, hver gang man ønsker at starte et nyt eksperiment og vaskeslanger efter hvert eksperiment, mindsker risikoen for forurening og undgår at skabe saltkrystaller i apparatet.

Brugen af mikrodialyseknapper er et alternativ, når OptiCrys ikke er tilgængelig. Strategierne for optimering af krystallisering og overvågning af krystalvækst, der er nævnt ovenfor, skal udføres manuelt. Dette kræver typisk at være uden for en thermoregulated inkubator, hvilket kan være problematisk, når temperaturregulering er et kritisk skridt i den beskrevne metode. Dette letter ikke at ændre krystalliseringsopløsningernes kemiske sammensætning eller overvåge krystalvækst ved billeddannelse, så krystalvækstprocessen kan ikke styres i realtid.

Kendskab til fasediagrammet er grundlaget for at bruge krystalliseringsbænken, OptiCrys, til systematisk at dyrke store krystaller af høj kvalitet på en automatiseret måde. Kontrol af fysiskkemiske parametre som temperatur, præcipitantkoncentration og pH under krystallisering flytter proteinopløsningsligevægten i en veldefineret kinetisk bane på tværs af fasediagrammet. Dette suppleres af brugen af en dialysemembran til at justere massetransport og skabe en kontrolleret gradient i krystalliseringskammeret, der påvirker krystallernes størrelse og kvalitet. Derfor er det vigtigt at bruge både termodynamiske data og kinetiske baner for at kontrollere krystalliseringsprocessen for at vokse krystaller af høj kvalitet. Takket være OptiCrys kan systematiske fasediagrammer i et flerdimensionalt rum studeres med en seriel tilgang ved hjælp af betydeligt mindre materiale end før. For at demonstrere denne metode leverer vi her et casestudie med et modelprotein, kyllingæghvid lysozym. Ved at bruge og mestre den protokol, der præsenteres her, kan man tilpasse den til rigtige proteinsystemer5,14,17,18.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

MBS anerkender støtten fra LABEX VALO GRAL i henhold til kontrakten 2015. NJ anerkender CEA's International Ph.d.-forskningsprogram (Irtelis) for ph.d.-stipendiet. Forfattere anerkender finansiering fra EU's Horizon 2020 Research and Innovation Program under Marie Skłodowska-Curie tilskudsaftale nummer 722687. Forfatterne er også taknemmelige for Dr. Esko Oksanen (ESS, Lund) og Dr. Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) for nyttige samtaler og indsigter. IBS anerkender integration i Grenobles tværfaglige forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  2. Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  3. Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  4. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  5. Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase. Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).
  6. Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).
  7. Chayen, N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques. REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).
  8. Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  9. Salemme, F. R. A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).
  10. Chayen, N. E., Saridakis, E. Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).
  11. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  12. Garciá-Ruiz, J. M. Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization. Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).
  13. Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).
  14. Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).
  15. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  16. Astier, J. P., Veesler, S. Using temperature to crystallize proteins: A mini-review. Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).
  17. Budayova-Spano, M., et al. A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).
  18. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).
  19. Grimsley, G. R., Pace, C. N. Spectrophotometric Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).
  20. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  21. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34 (3), 254-265 (2004).

Tags

Biologi Problem 169 Dialyse Neutron makromolekylær krystallografi OptiCrys Fase diagram Temperaturkontrol Krystal vækst Protein opløselighed
Optimering af krystalvækst for neutronkromolekylær krystallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova … More

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter