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Biology

न्यूट्रॉन मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी के लिए क्रिस्टल ग्रोथ का अनुकूलन

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

क्रिस्टलोग्राफी द्वारा बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स के संरचनात्मक अध्ययनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल की आवश्यकता होती है। यहां हम एक प्रोटोकॉल प्रदर्शित करते हैं जिसका उपयोग ऑप्टिक्रिस्ट (हमारी प्रयोगशाला में विकसित एक पूरी तरह से स्वचालित उपकरण) और क्रिस्टलीकरण चरण आरेख के ज्ञान के आधार पर बड़े उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल उगाने के लिए माइक्रोडायलिसिस बटन द्वारा किया जा सकता है।

Abstract

न्यूट्रॉन मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी (एनएमएक्स) का उपयोग तेजी से विस्तार कर रहा है, जो पिछले दशक में निर्धारित अधिकांश संरचनाओं के साथ नए एनएमएक्स बीमलाइनों का निर्माण किया गया है और संरचना शोधन सॉफ्टवेयर की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। हालांकि, एनएमएक्स के लिए वर्तमान में उपलब्ध न्यूट्रॉन स्रोत एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी के लिए समकक्ष स्रोतों की तुलना में काफी कमजोर हैं। इस क्षेत्र में प्रगति के बावजूद, न्यूट्रॉन विवर्तन अध्ययनों के लिए हमेशा बड़े क्रिस्टल की आवश्यकता होगी, विशेष रूप से कभी-बड़े मैक्रोमॉलिक्यूल्स और परिसरों का अध्ययन करने की प्रवृत्ति के साथ। इसलिए एनएमएक्स के विस्तार के लिए बड़े क्रिस्टल उगाने के लिए अनुकूल तरीकों और इंस्ट्रूमेंटेशन में और सुधार आवश्यक हैं।

इस काम में, हम अपनी प्रयोगशाला में विकसित तर्कसंगत रणनीतियों और एक क्रिस्टल ग्रोथ बेंच (ऑप्टीक्रिस्ट) का परिचय देते हैं जो क्रिस्टलीकरण समाधानों (जैसे, तेज़ एकाग्रता, पीएच, योजक, तापमान) के सटीक स्वचालित नियंत्रण के साथ माइक्रोस्कोप-माउंटेड वीडियो कैमरे के माध्यम से वास्तविक समय अवलोकन को जोड़ती है। फिर हम प्रदर्शित करते हैं कि तापमान और रासायनिक संरचना का यह नियंत्रण मॉडल घुलनशील प्रोटीन का उपयोग करके इष्टतम क्रिस्टलीकरण स्थितियों की खोज की सुविधा कैसे प्रदान करता है। क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का संपूर्ण ज्ञान किसी भी क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए शुरुआती स्थिति और गतिज पथ का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम दिखाते हैं कि कैसे एक तर्कसंगत दृष्टिकोण बहुआयामी चरण आरेखों के ज्ञान के आधार पर उत्पन्न क्रिस्टल के आकार और संख्या को नियंत्रित कर सकता है।

Introduction

प्रोटीन के संरचना-कार्य संबंधों और शारीरिक रास्तों के तंत्र को समझना अक्सर हाइड्रोजन परमाणुओं (एच) की स्थिति को जानने पर निर्भर करता है और कैसे चार्ज एक प्रोटीन1, 2केभीतर स्थानांतरित कियाजाताहै । चूंकि हाइड्रोजन परमाणु एक्स-रे को कमजोर रूप से तितर-बितर करते हैं, इसलिए उनकी स्थिति केवल बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन एक्स-रे विवर्तन डेटा (>1 Å)3,4केसाथ निर्धारित की जा सकती है। इसके विपरीत, हाइड्रोजन और ड्यूटेरियम (एच2,हाइड्रोजन के आइसोटोप) परमाणुओं के रूप में जैविक मैक्रोमों में हाइड्रोजन परमाणुओं की सटीक स्थिति प्राप्त करने के लिए न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी का उपयोग किया जा सकताहै। हालांकि, उपलब्ध न्यूट्रॉन स्रोतों से न्यूट्रॉन फ्लक्स एक्स-रे बीम की तुलना में कमजोर है, इसलिए इसे अक्सर2,3के लिए मुआवजा दिया जाना चाहिए। यह एच2 के साथ एच का आदान प्रदान और/या हाइड्रोजन के असंबद्ध बिखरने को कम करने और विवर्तन छवियों के संकेत से शोर अनुपात में वृद्धि करने के लिए क्रिस्टल की मात्रा में वृद्धि करके प्राप्त किया जा सकता है ।

एक्स-रे और न्यूट्रॉन बायो-मैक्रोमॉलिक्यूलर क्रिस्टलोग्राफी 6 दोनों के लिए बड़े और उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए चित्र 1में विभिन्न क्रिस्टलीकरण दृष्टिकोण (संबंधित योजनाबद्ध चरण आरेख चित्र चित्र1में दिखाया गया है) हैं। वाष्प प्रसार में, एक प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण समाधान के मिश्रण से तैयार एक बूंद को समय के साथ, पानी या अन्य अस्थिर प्रजातियों के वाष्पीकरण के माध्यम से, एक जलाशय के खिलाफ समान क्रिस्टलीकरण समाधान के तेज़ की उच्च एकाग्रता वाले जलाशय के खिलाफ समतुल्य किया जाता है। बूंदों में प्रोटीन की सांद्रता में वृद्धि और इसके बाद सहज नाभिक के लिए आवश्यक अधिसंक्षण होता है और इसके बाद इन नाभिक6,7में क्रिस्टल वृद्धि होती है । यद्यपि वाष्प प्रसार क्रिस्टलउगानेके लिए सबसे अधिक बार उपयोग की जाने वाली तकनीक है , लेकिन क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को ठीक से नियंत्रित नहीं किया जा सकताहै 8. मुफ्त इंटरफ़ेस प्रसार विधि में, क्रिस्टलीकरण समाधान एक केंद्रित प्रोटीन समाधान में फैलता है, जो सिस्टम को सुपरसैचुरेशन की ओर निर्देशित करता है। इस विधि को बैच विधि माना जा सकता है जिसमें धीमी मिश्रण दर6,9 ,10,11,12. बैच विधि में, प्रोटीन को तेजी से क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ मिलाया जाता है जिससे तेजी से सुपरसैचुरेशन होता है और बदले में कई क्रिस्टल3, 7के साथ एक समान नाभिकहोताहै। यह विधि वर्तमान में प्रोटीन डेटा बैंक में जमा सभी संरचनाओं में से लगभग एक तिहाई के लिए खातों । डायलिसिस विधि का उपयोग उच्च गुणवत्ता वाले और अच्छी तरह से विवर्तन प्रोटीन क्रिस्टल उगाने के लिए भी किया जाता है। डायलिसिस विधि में, प्रोटीन समाधान के साथ एक अलग कक्ष में अर्ध-पारगम्य झिल्ली के माध्यम से जलाशय से तेज़ फैलाना के अणु। संतुलन की गतिज विभिन्न कारकों पर निर्भर है, जैसे तापमान, झिल्ली ताकना आकार, और प्रोटीन के नमूनों और क्रिस्टलीकरण एजेंटों की मात्रा और एकाग्रता6।

प्रोटीन के विभिन्न राज्यों को विभिन्न भौतिक या रासायनिक चर3के कार्य के रूप में वर्णन करने के लिए क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का उपयोग किया जा सकता है। जैसा कि चित्र 1में दर्शाया गया है , प्रत्येक क्रिस्टलीकरण तकनीक को ऐसे आरेख6, 10,13के नाभिक और मेटास्टेबल क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए एक अलग गतिज प्रक्षेपवक्र का उपयोग करने के रूप में कल्पना की जा सकती है । यह प्रोटीन घुलनशीलता और प्रोटीन एकाग्रता के बारे में जानकारी प्रदान करता है जिस पर क्रिस्टल और समाधान के बीच थर्मोडायनामिक संतुलन देखा जाता है, जिससे नाभिक और विकास3,14के लिए इष्टतम स्थितियां मिल जाती हैं। दो आयामी चरण आरेख में, प्रोटीन एकाग्रता को एक चर के कार्य के रूप में प्लॉट किया जाता है और अन्य चरों को स्थिर15रखा जाता है। ऐसे चरण आरेख में, जब प्रोटीन एकाग्रता घुलनशीलता वक्र से नीचे होती है, तो समाधान अंडरसैचुरेटेड क्षेत्र में होता है और कोई नाभिक या क्रिस्टल विकास नहीं होता है। इस वक्र के ऊपर अधिसंखन क्षेत्र है जहां प्रोटीन की एकाग्रता घुलनशीलता सीमा3,14से अधिक है । यह आगे तीन क्षेत्रों में विभाजित है: मेटास्टेबल जोन, सहज नाभिक क्षेत्र, और वर्षा क्षेत्र। मेटास्टेबल क्षेत्र में, नाभिक के लिए उचित समय के भीतर होने के लिए अतिसंवता पर्याप्त नहीं है लेकिन वरीयता प्राप्त क्रिस्टल का विकास हो सकता है। वर्षा क्षेत्र में एकत्रीकरण और वर्षा का पक्ष लिया जाता है, जहां अधिसंवता बहुत अधिक है14,15।

जब सहज नाभिक के लिए पर्याप्त अधिसंवता प्राप्त की जाती है, तो पहला नाभिक10दिखाई देगा। क्रिस्टल के बढ़ने से जब तक घुलनशीलता की सीमा नहीं पहुंच जाती तब तक प्रोटीन एकाग्रता में कमी आ जाती है। जब तक अतिशयशीलता घुलनशीलता वक्र के आसपास रहता है, तब तक क्रिस्टल के आकार में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं होगा। हालांकि, यह दिखाया गया है कि क्रिस्टलीकरण समाधान के तापमान और रासायनिक संरचना में भिन्नता (उदाहरण के लिए, तेज़ की एकाग्रता) प्रोटीन घुलनशीलता को प्रभावित करेगी और आगे क्रिस्टल विकास8,13,16की शुरुआत हो सकती है।

चूंकि डायलिसिस अच्छी गुणवत्ता वाले क्रिस्टल विकास के लिए लाभप्रद है, इसलिए चित्रा 2में सचित्र ऑप्टिक्रिस क्रिस्टलाइजेशन बेंच को पूरी तरह से स्वचालित तरीके से क्रिस्टलीकरण को नियंत्रित करने के लिए हमारी प्रयोगशाला में डिजाइन और विकसित किया गया था8। इस उद्देश्य के लिए, सॉफ्टवेयर LabVIEW के साथ लिखा गया था जो एक इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रक और चिलर के माध्यम से पेल्टियर तत्वों के संपर्क में एक बहने वाले जलाशय डायलिसिस सेटअप के तापमान के नियंत्रण और निगरानी की अनुमति देता है। यही सॉफ्टवेयर मल्टीचैनल फ्लूइड सिस्टम का उपयोग करके क्रिस्टलीकरण समाधान (उदाहरण के लिए क्रिस्टलीकरण एजेंटों का आदान-प्रदान) की रासायनिक संरचना को स्वचालित रूप से नियंत्रित करता है। इसके अतिरिक्त, एक डिजिटल कैमरा और एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की कल्पना और रिकॉर्ड करने के लिए किया जाता है। 15 माइक्रोन और 250 माइक्रोन वॉल्यूम वाले दो क्रिस्टलीकरण कक्ष विभिन्न उद्देश्यों के लिए क्रिस्टल उगाने के लिए उपलब्ध हैं। चूंकि क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया प्रतिवर्ती है, इसलिए प्रोटीन समाधान के कुछ माइक्रोलीटर के साथ विभिन्न स्थितियों के लिए स्क्रीनिंग संभव है जब तक कि नमूना क्षतिग्रस्त नहींहोता 8। नतीजतन, इस विधि का उपयोग करने से उपयोग की जाने वाली प्रोटीन सामग्री की मात्रा कम हो जाती है।

पिछले काम8से, यह स्पष्ट है कि क्रिस्टल विकास प्रक्रिया के दौरान, सीटू टिप्पणियों में नियमित समय अंतराल पर किए जाने की आवश्यकता होती है। ये कुछ सेकंड से लेकर कई दिनों तक हो सकते हैं, जो अवलोकन (वर्षा, नाभिक या क्रिस्टल विकास) के तहत घटना पर निर्भर करता है।

ऑप्टीक्रिस्ट के साथ क्रिस्टल विकास का अनुकूलन तापमान-तेज़ एकाग्रता चरण आरेख पर आधारित है। तापमान के प्रत्यक्ष कार्य के रूप में घुलनशीलता वाले प्रोटीन के मामले में, नमकीन-आउट शासन18का उपयोग करना संभव है। यह वह जगह है जहां समाधान की आयनिक ताकत में वृद्धि, जिसे प्रोटीन-तेज़ चरण आरेखों का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है, प्रोटीन की घुलनशीलता को कम कर देती है। इसी तरह, विलोम घुलनशीलता वाले प्रोटीन नमकीन-इन शासन18का उपयोग कर सकते हैं । नाभिक नाभिक क्षेत्र में होता है, मेटास्टेबल क्षेत्र के आसपास, और क्रिस्टल विकास तब तक चरण आरेख के मेटास्टेबल क्षेत्र में होता है जब तक कि प्रोटीन एकाग्रता घुलनशीलता सीमा तक नहीं पहुंच जाती है। जैसा कि चित्र 3 एमें दिखाया गया है, निरंतर रासायनिक संरचना तापमान के साथ नए नाभिक को रोकने के लिए मेटास्टेबल क्षेत्र में क्रिस्टलीकरण समाधान रखने के लिए कम किया जा सकता है। क्रिस्टल तब तक बढ़ते हैं जब तक कि दूसरा क्रिस्टल/समाधान संतुलन प्राप्त नहीं हो जाता और उसके बाद क्रिस्टल के आकार में और कोई वृद्धि नहीं देखी जाती है । क्रिस्टल के वांछित आकार तक पहुंचने तक तापमान कई बार कम हो जाता है। चित्रा 3 Bमें, निरंतर तापमान पर, तेज़ एकाग्रता में वृद्धि मेटास्टेबल क्षेत्र में समाधान रखती है। इस प्रक्रिया को फिर बड़े क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए कई बार दोहराया जा सकता है। तापमान को बदलना और क्रिस्टलीकरण समाधान स्थितियों में हेरफेर करना, अतिसंक्षण स्तरों को नियंत्रित करके, नाभिक और क्रिस्टल के विकास को अलग करने के लिए दो शक्तिशाली उपकरण हैं जिन्हेंऑप्टीक्रिस्ट5,8,14द्वारा ठीक और स्वचालित रूप से नियंत्रित किया जाता है।

तापमान नियंत्रित, या तापमान-और तेज़ एकाग्रता-नियंत्रित क्रिस्टलीकरण द्वारा उगाए गए प्रोटीन क्रिस्टल के उदाहरण, साथ ही प्राप्त सापेक्ष विवर्तन डेटा साहित्य और पीडीबी में उपलब्ध हैं। इनमें ह्यूमन γ-क्रिस्टलिन ई, पीए-आईआईएल लेक्टिन, खमीर अकार्बनिक पायरोफोफ्फैटेस, यूरेट ऑक्सीडेस, ह्यूमन कार्बोनिक एंहाइड्रेज II, याचब किनेज, और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज5,14, 17,18हैं।

यद्यपि ऑप्टिक्रिस को नेटएक्स-रे द्वारा व्यावसायीकरण किया गया था, लेकिन कई प्रयोगशालाएं हैं जिनके पास इस उपकरण तक पहुंच नहीं है या यह धारावाहिक दृष्टिकोण प्रदान करता है। इस तकनीक का विकल्प विभिन्न खंडों के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्लास्टिक माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करना है। इनका उपयोग करके, तापमान और रासायनिक संरचना को मैन्युअल रूप से समायोजित और विविध किया जा सकता है। माइक्रोडायलिसिस बटन का निरीक्षण सीटू में नहीं किया जा सकता है और इसके बजाय ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। कंपन मुक्त तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में नमूना रखकर तापमान नियंत्रण प्राप्त किया जा सकता है। यह सुनिश्चित करने के लिए तापमान को स्थिर रखना आवश्यक है कि क्रिस्टलीकरण प्रयोग प्रजनन योग्य हैं। तापमान में उल्लेखनीय भिन्नता से क्रिस्टल का नुकसान या विनाश भी हो सकता है5.

यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं जिसमें नमूना तैयार करने और न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए उपयुक्त बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल के विकास के लिए नियंत्रण सॉफ्टवेयर के उपयोग का वर्णन किया गया है। इस चरण-दर-कदम प्रक्रिया को क्रिस्टलीकरण चरण आरेख का लाभ उठाने के लिए डिज़ाइन किया गया था ताकि आकार और उत्पन्न क्रिस्टल की गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए एक प्रारंभिक स्थिति और गतिज पथ का चयन किया जा सके। इसके अतिरिक्त, माइक्रोडायलिसिस बटन के साथ क्रिस्टल उगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है जो बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए एक ही तर्क का उपयोग करता है।

Protocol

1. माइक्रोडायलिसिस बटन के साथ डायलिसिस विधि

  1. नमूना तैयार करना
    1. 30 मिलीग्राम की अंतिम एकाग्रता के साथ समाधान प्राप्त करने के लिए सीएच3कोना बफर (100 मिलीग्राम सोडियम एसीटेट, पीएच 4) के 1 एमएल में एक लियोफिलाइज्ड पाउडर के रूप में 30 मिलीग्राम चिकनअंडा-सफेदlysozyme को भंग करके प्रोटीन समाधान तैयार करें।
    2. 13,000 × जी पर 277 K पर 10 मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र। यह प्रक्रिया क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया शुरू करने से पहले किसी भी समुच्चय को हटाने में मदद करती है।
    3. 280 एनएम पर नमूने के अवशोषण की जांच करें और बीयर-लैम्बर्ट समीकरण (ए = εसीएल) का उपयोग करके प्रोटीन एकाग्रता की गणना करें।
      नोट: बीयर-लैम्बर्ट समीकरण के अनुसार, इलेक्ट्रॉनिक अवशोषण (ए) एक निरंतर ऑप्टिकल पथलेंगथ (एल, सेमी) को दिए जाने वाले अवशोषित प्रजातियों की एकाग्रता (सी, एमजीएमएल-1)के सीधे आनुपातिक है। इस रैखिक संबंध का ढाल मोलर विलुप्त होने का गुणांक (ε है, क्योंकि 280 एनएम पर लिसोजाइम 2.64 मिलियन−1· सेमी−1)19है। स्पेक्ट्रोस्कोपिक रूप से अनुमन्य π - π * संक्रमण से उत्पन्न होने वाले ~ 280 एनएम पर सुगंधित अमीनो एसिड (टायरोसिन, ट्रिप्टोफान, और फेनिलैनिन) और डिसल्फाइड बांड के साइडचेन में मजबूत अवशोषण होता है। चूंकि अधिकांश प्रोटीनों में ये अवशेष होते हैं, इसलिए विलुप्त होने के गुणांक के ज्ञान को देखते हुए प्रोटीन एकाग्रता की गणना आमतौर पर 280 एनएम पर अवशोषण को मापकर आसानी से की जा सकती है।
    4. चित्रा 4में दिखाए गए क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करें । क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करने से पहले 0.22 माइक्रोन मिलिपोर फिल्टर के साथ सभी स्टॉक समाधान फ़िल्टर करें।
  2. क्रिस्टल विकास
    1. उपयुक्त आणविक वजन कटऑफ (6-8 केडीए) के साथ एक सेल्यूलोज डायलिसिस झिल्ली काटें और इसे आसुत पानी में भिगो दें।
      नोट: डायलिसिस झिल्ली डिस्क माइक्रोडायलिसिस बटन के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन यदि डायलिसिस ट्यूबिंग का उपयोग किया जाता है, तो ट्यूब से झिल्ली की दो परतों को अलग करने के लिए किनारों को काटना न भूलें ताकि केवल एक परत झिल्ली हो।
    2. चित्रा 4 में दिखाए गए उसी क्रम में क्रिस्टलीकरण समाधान के 2 एमएल के साथ 24-अच्छी ट्रेके कुओं को भरें।
      नोट: यदि बड़ी मात्रा वाले बटनों का उपयोग किया जाता है (उदाहरण के लिए, 200 माइक्रोन), कुशल विनिमय सुनिश्चित करने के लिए न्यूनतम 5 एमएल क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ 50 एमएल ट्यूब भरें।
    3. चित्रा 5Aमें सचित्र माइक्रोडायलिसिस बटन के कक्ष में लाइसोजाइम समाधान के 35 μL जोड़ें ।
      नोट: बंद होने पर 30 माइक्रोन डायलिसिस बटन में हवा के बुलबुले के गठन से बचने के लिए, अतिरिक्त प्रोटीन के 5 माइक्रोन की एक अतिरिक्त मात्रा (मृत मात्रा) जोड़ा जाना चाहिए, जिसका अर्थ है कुल 35 माइक्रोन प्रोटीन नमूना। यह अतिरिक्त प्रोटीन नमूना कक्ष के शीर्ष पर थोड़ा गुंबद वाला आकार बनाता है, जैसा कि चित्रा 5Bमें दिखाया गया है, जो हवा के बुलबुले के गठन को रोकता है।
    4. उपयुक्त आकार का एक एप्लिकेट लें और लोचदार ओ-रिंग को अपने चरम(चित्रा 5C)पर रखें। फिर झिल्ली को रखें, पहले हल्के से मिटा दिया/डायलिसिस बटन के कक्ष के शीर्ष पर फाइबर मुक्त कागज के एक टुकड़े का उपयोग कर सूखा । ध्यान रहे कि कागज लगाते समय चैंबर में धूल न डालें। डायलिसिस बटन(चित्रा 5C)के नाली में एप्लिकेटर से लोचदार ओ-रिंग स्थानांतरित करके डायलिसिस झिल्ली को जगह में सेट करें।
      नोट: हैंडलिंग का महत्वपूर्ण क्षण डायलिसिस बटन के नाली में एप्लिकेटर से लोचदार ओ-रिंग स्थानांतरित करके चैंबर के शीर्ष पर डायलिसिस झिल्ली को ठीक कर रहा है। प्रोटीन कक्ष में नमूने के साथ हवा के बुलबुले को संलग्न करने से बचने के लिए सभी आंदोलनों को पूरी तरह से सिंक्रोनाइज्ड किया जाना चाहिए। इसकी कठोरता को जानने के लिए अपने आवेदन से पहले लोचदार ओ-रिंग को खींचने का अभ्यास करना उपयोगी है, अपने आवेदन के दौरान झिल्ली का हिस्सा रखने के लिए चिमटी का उपयोग करें और एक मॉडल प्रोटीन के साथ पहले परीक्षण प्रयोगों को पूरा करें।
    5. चिमटी(चित्रा 5डी)का उपयोग करके बटन को कुएं में या 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. एक कवरस्लिप के साथ अच्छी तरह से कवर, यह तेल पर धीरे दबाने के लिए अच्छी तरह से सील(चित्रा 5E)।
      नोट: यदि कुओं के शीर्ष पर कोई तेल नहीं है, तो प्रयोग शुरू करने से पहले इसे जोड़ना सुनिश्चित करें या ग्लास कवरस्लिप के बजाय टेप के एक टुकड़े का उपयोग करें। माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करके प्रोटीन क्रिस्टलीकरण का सिद्धांत चित्र 5में दर्शाया गया है ।
    7. एक थर्मोरैलेटेड इनक्यूबेटर में 293 K पर नमूना रखें। उपयोग की जाने वाली प्रोटीन और क्रिस्टलीकरण स्थितियों के अनुसार विभिन्न तापमान आवश्यक हो सकते हैं।
      नोट: चित्रा 4 में दिखाए गए क्रिस्टलीकरण स्थितियों का एक ही ग्रिड (तेज़ की एकाग्रता को विविध होने की अनुमति देना) तापमान के एक समारोह के रूप में जांचा जा सकता है। ऐसे मामले में, एक ही क्रिस्टलीकरण प्लेट को पुन: पेश किया जाना चाहिए और प्रत्येक प्रति को एक अलग तापमान पर विनियमित इनक्यूबेटर में रखा जाना चाहिए। इसके लिए कई कंपन मुक्त थर्मोरिलेट इनक्यूबेटर उपलब्ध होने की आवश्यकता होती है।
    8. क्रिस्टल(चित्रा 4)के लिए ट्रे या ट्यूबों की जांच करें और प्रत्येक ट्रे में क्या है, उसे अलग करने के लिए नियमित आधार पर नोट्स लें। झूठे सकारात्मक परिणामों से बचने और क्रिस्टल से धूल के साथ भेदभाव करने के लिए अच्छे नोट्स जरूरी हैं ।

2. ऑप्टीक्राइंस का उपयोग करके क्रिस्टल विकास प्रक्रिया

  1. नमूना तैयार करना
    1. धारा 1.1 में वर्णित प्रोटीन समाधान और डायलिसिस झिल्ली तैयार करें।
    2. एनएसीएल (4 एम) और सीएच 3 सीओएनए पीएच4 (1एम) के स्टॉक समाधान तैयार करें और उन्हें 50 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें।
    3. तापमान नियंत्रित बह जलाशय डायलिसिस सेटअप के डायलिसिस कक्ष में प्रोटीन समाधान (30 मिलीग्राम -1 के साथ lysozyme के15माइक्रोन) जोड़ें। तापमान नियंत्रित बह जलाशय डायलिसिस सेटअप के विवरण के लिए चित्र 6 देखें । ऑप्टीक्रिस्ट में दो डायलिसिस कक्ष हैं, न्यूनतम मात्रा 15 माइक्रोन है और अधिकतम मात्रा 250 माइक्रोन है।
    4. ओवरचमबर को डायलिसिस झिल्ली से ढक दें और इलास्टिक ओ-रिंग(चित्रा 6B)के साथ झिल्ली को ठीक करें।
      नोट: यह सेटअप माइक्रोडायलिसिस बटन से अलग है जहां प्रत्येक कक्ष को डायलिसिस झिल्ली द्वारा सीधे सील किया जाता है। प्रवाह कोशिका में, डायलिसिस झिल्ली के बजाय ओवरचैंबर के लिए तय किया जाता है जो इसके हटाने के बिना क्रिस्टल के बढ़ते हिस्से की अनुमति देता है। इस उद्देश्य के लिए, ओवरचैंबर को जलाशय से बस अनस्क्रू किया जा सकता है।
    5. ओवरचैंबर को पलटें और डायलिसिस चैंबर के ऊपर रखें। धीरे-धीरे और धीरे-धीरे इसे दबाएं ताकि दो टुकड़ों के बीच फंसी सभी हवा को हटाया जा सके और कक्ष(चित्रा 6C)में बुलबुले से बचा जा सके। एक मॉडल प्रोटीन के साथ अभ्यास फायदे में हो सकता है जब हवा के बुलबुले और नमूना हानि से बचने के लिए प्रशिक्षण।
    6. जलाशय को धीरे-धीरे ओवरचैम्बर के शीर्ष पर पंगा लेना, फिर से हवा के बुलबुले को फंसाने से बचने के लिए सचेत किया जा रहा है। जलाशय को अधिक कसने से क्रिस्टलीकरण कक्ष(चित्रा 6डी)में बुलबुले भी बन सकते हैं।
    7. क्रिस्टलीकरण समाधान जोड़ें और एयरटाइट कैप के साथ जलाशय कक्ष को कवर करें। (चित्रा 6G)। जलाशय की अधिकतम मात्रा 1 एमएल है।
    8. इस विधानसभा को स्थानांतरित करें और इसे पीतल के समर्थन में डालें। यह समर्थन पेल्टियर तत्वों के संपर्क में है जिनका उपयोग तापमान को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है।
    9. जैसा कि चित्र 6में दर्शाया गया है, एयरटाइट कैप डायलिसिस कक्ष की शीर्ष रोशनी की अनुमति देने के लिए ऑप्टिकल विंडो से लैस है। प्रकाश स्रोत(चित्रा 2)को खिड़की पर रखें जिससे प्रकाश कक्ष से गुजर सके।
    10. जलाशय कक्ष को एक पंप से जोड़ा जा सकता है ताकि इसे निरंतर प्रवाह कोशिका के रूप में कार्य करने की अनुमति दी जा सके। 50 एमएल ट्यूबों के शीर्ष पर ट्यूबिंग को कनेक्ट करें जिसमें स्टॉक समाधान और आसुत पानी रोटरी वाल्व से होते हैं जैसा कि चित्र 7में दर्शाया गया है।
      नोट: यदि प्रयोग के दौरान स्वचालित तैयारी और क्रिस्टलीकरण समाधानों को बदलना वांछित नहीं है, तो चरण 2.1.10 को छोड़ दें। ऐसे मामले में, क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार किया जाना चाहिए और जलाशय पहले से भरा मैन्युअल रूप से भरा हुआ है।
  2. सॉफ़्टवेयर
    1. कंप्यूटर चालू करें और सॉफ्टवेयर क्रोइसेंस क्रिस्टललाइन [क्रिस्टल ग्रोथ]लॉन्च करें। यह नियंत्रण सॉफ्टवेयर लैबव्यू(http://www.ni.com/labview/)के साथ लिखा गया है और एक उपयोगकर्ता के अनुकूल ग्राफिकल इंटरफेस प्रदान करता है। इसमें 4 अलग-अलग ग्राफिकल इंटरफेस(एक्यूईल [वेलकम], पैरामेट्रेज [सेटिंग], एस्साई [टेस्ट], और रखरखाव [रखरखाव])(चित्र 8)शामिल हैं।
      नोट: फ्रेंच से अनुवाद कोष्ठक में हैं ।
    2. चित्रा 8में सचित्र बटन पर क्लिक करके रखरखाव दृश्य का चयन करें । यह दृश्य वर्तमान में सबसे अधिक उपयोग किया जाता है और उपयोगकर्ताओं को प्रयोग के दौरान अधिकांश मापदंडों को नियंत्रित करने की अनुमति देता है।
      नोट: रखरखाव दृश्य पर क्लिक करने के बाद, तापमान या प्रकाश जैसे मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए विभिन्न वर्गों के साथ एक नई खिड़की दिखाई देगी। चित्रा 8 में इस दृश्य के विभिन्न भागों को तीर और फ्रेम के साथ दिखाया गया है। निम्नलिखित चरणों में, हम प्रदर्शित करते हैं कि सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रत्येक पैरामीटर को कैसे नियंत्रित किया जाता है।
    3. रेगुलेगुर डी टेम्पेरेचर [तापमान नियंत्रक] अनुभाग तापमान के नियंत्रण और निगरानी की अनुमति देता है। बटन पर क्लिक करें, नंबर एक (1) अंक 8में, इसे चालू करने के लिए ।
      नोट: ऑप्टीक्रिस्टिस में तापमान सीमा 233.0 - 353.0 ± 0.1 K है।
    4. कंसाइन [सेटपॉइंट] सेक्शन पर तापमान सेट करें और प्रेस एंटर(चित्रा 8(2))पर रखें। इस बटन के नीचे, 2 निशान (लाल और पीला) के साथ एक ग्राफ है। लाल निशान अंतिम (आदेश दिया) तापमान से पता चलता है और पीले रंग का निशान वर्तमान तापमान से पता चलता है । जैसा कि चित्र 8(2)में दिखाया गया है, तापमान 20 डिग्री सेल्सियस पर सेट किया गया है।
      नोट: क्रिस्टल विकसित करने के लिए, जैसा कि क्रिस्टल विकास अनुभाग में समझाया गया है, कई तापमान को चुना जाना चाहिए। तापमान बदलने के लिए, प्रत्येक नए तापमान को कंसाइन [सेटपॉइंट] अनुभाग में जोड़ें और कीबोर्ड पर एंटर बटन दबाएं।
    5. चित्रा 8में लुमिएरेस [लाइट्स] अनुभाग से चमक बढ़ाकर प्रकाश चालू करें। चमक 0 से 100 तक होती है, "0" इंगित करता है कि प्रकाश बंद है और "100" पर प्रकाश अधिकतम तीव्रता और चमक के लिए सेट है। प्रकाश बढ़ाकर, माइक्रोस्कोप अनुभाग में, डायलिसिस कक्ष के अंदर कोई भी देख सकता है। प्रयोग के दौरान, कोशिका में चमक भिन्न हो सकती है; डायलिसिस कक्ष के अंदर स्पष्ट रूप से कल्पना करने के लिए मापदंडों को समायोजित करें। + और - बेहतर देखने के लिए "ज़ूम" के सामने बटन का उपयोग करके आवर्धन को भी बढ़ाया या घटाया जा सकता है।
    6. माइक्रोस्कोप अनुभाग के दाहिने हाथ की ओर, प्रत्येक क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए प्रासंगिक जानकारी भंडारण के लिए कई अनुभाग हैं। प्रत्येक उपयोगकर्ता क्रिस्टलीकरण की स्थिति, प्रोटीन नाम और उपयोग की गई डायलिसिस झिल्ली(चित्र 8(3)के आणविक वजन कटऑफ के बारे में जानकारी स्टोर करने के लिए एक फ़ोल्डर बना सकता है।
    7. उपयोगकर्ता प्रयोग के लिए एक नाम को परिभाषित कर सकता है बस इसे Nom फाइल [फ़ोल्डर नाम]पर टाइप करके। डोनियर [फ़ोल्डर बटन] पर क्लिक करना (चित्रा 8में हरे फ्रेम के साथ दिखाया गया है) एक नई खिड़की खोलता है। इस विंडो में एक टेक्स्ट फाइल होगी, जिसमें प्रयोग के लिए परिभाषित सभी जानकारी शामिल होगी। इसके अलावा, भविष्य के प्रसंस्करण के लिए इस फ़ोल्डर में समय-मुहर लगी छवियां सहेजी जाती हैं।
    8. एनबी इमेजेज सेक्शनसे, प्रयोग के दौरान ली जाने वाली छवियों की संख्या का चयन करें। इन (जैसे, न्यूनतम, घंटे, दिन) के बीच वांछित समय अंतराल के साथ दाएं हाथ के पैनल में छवियों की संख्या निर्दिष्ट करें। चित्रा 8 एक मिनट में शून्य छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए सॉफ्टवेयर सेटअप दिखाता है।
      नोट: स्टॉक समाधानों को मिलाने और जलाशय कक्ष में क्रिस्टलीकरण समाधान इंजेक्शन के लिए पोम्पे [पंप] अनुभाग का उपयोग करें। द्रव मिश्रण प्रणाली के सिद्धांत के स्पष्टीकरण के लिए धारा 2.1.10 और चित्रा 7 देखें।
    9. Etape 1 [चरण 1]: समाधान स्टॉक्स में स्टॉक समाधानों की इनपुट सांद्रता। अगले खंड में क्रिस्टलीकरण प्रयोग के लिए, एनएसीएल 4 एम और सीएच3सीओएनए 1 एम पीएच 4 का उपयोग किया जाएगा।
      नोट: स्टॉक समाधानों की सांद्रता मोलर इकाइयों में हैं।
    10. प्रत्येक समाधान की अंतिम एकाग्रता को परिभाषित करें। उदाहरण के लिए एनएसीएल के लिए 0.75 एम और सीएच 3 सीओओएनए पीएच4के लिए 0.1 मीटर। अंतिम एकाग्रता अनुभाग में इन इनपुट(चित्रा 8) Etape 2 में [चरण 2]: समाधान à préparer [तैयार करने के लिए समाधान]। कैलकुल [गणना] बटन दबाएं, जो चित्र 8में एक लाल फ्रेम के साथ दिखाया गया है । मिश्रण में उपयोग किए जाने वाले प्रत्येक स्टॉक समाधान की अंतिम मात्रा प्रत्येक एकाग्रता पैनल के सामने वॉल्यूम पैनल में प्रदर्शित होगी।
    11. लांसर प्रेपरेशन [लॉन्च तैयारी] बटन(चित्रा 8) दबाएं। जैसा कि चित्र 7में दर्शाया गया है, रोटरी वाल्व प्रत्येक स्टॉक समाधान लेता है और उन्हें स्विच के माध्यम से मिश्रण ट्यूब में इंजेक्ट करता है।
    12. क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार होने के बाद, एटापे 3 [चरण 3] में एंट्रे सॉल्यूशन [सॉल्यूशन एंट्री] बटन पर क्लिक करें: पंप सेक्शन का फ्लक्स (चित्रा 8में पीला फ्रेम)। स्विच जलाशय कक्ष में ट्यूब मिश्रण से नए क्रिस्टलीकरण समाधान इंजेक्ट करने के लिए बदलता है । आदान-प्रदान प्रक्रिया को रोकने के लिए, Arrêt वितरण [वितरण बंद] बटन दबाएं।
      नोट: प्रयोग के दौरान क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया का निरीक्षण करें और पर्यवेक्षण सॉफ्टवेयर के संबंधित ग्राफिकल इंटरफेस में तापमान, क्रिस्टलीकरण समाधान और ज़ूम जैसे मापदंडों को संशोधित करें। सॉफ्टवेयर का उपयोग करके प्रयोग के दौरान एयरटाइट कैप या प्रवाह सेल को हटाने की कोई आवश्यकता नहीं है, इसलिए केवल चर वह होगा जो उपयोगकर्ता सॉफ्टवेयर के माध्यम से बदलता है।
  3. बड़े क्रिस्टल विकास
    1. डायलिसिस कक्ष(चित्रा 6A)में 30 मिलीएमएल -1 की एकाग्रता के साथ lysozyme के15 μL जोड़ें।
      नोट: धारा 1.1 में वर्णित प्रोटीन नमूना तैयार करें।
    2. धारा 2.1 और चित्रा 6 में वर्णित तापमान नियंत्रित बहने वाले जलाशय डायलिसिस सेटअप को इकट्ठा करें।
    3. क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के साथ नमूना तैयार करने से पहले सभी स्टॉक समाधान फ़िल्टर करने के लिए मत भूलना। इस प्रयोग के लिए, क्रिस्टलीकरण समाधान में 0.75 एम एनएसीएल और 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4 शामिल हैं। इसे मैन्युअल रूप से या जलाशय कक्ष और पंपिंग सिस्टम का उपयोग करके जोड़ा जा सकता है जैसा कि धारा 2.2.10 से 2.2.12 में वर्णित है।
    4. तापमान को 295 K तक सेट करें जैसा कि सेक्शन 2.2.3 और 2.2.4 में समझाया गया है और इमेज 8 में दिखाया गया है। प्रारंभिक परिस्थितियों में, डायलिसिस कक्ष और जलाशय के बीच संतुलन लगभग ९० मिनट के बाद पहुंच जाएगा और पहली बार दिखाई देने वाला नाभिक 22 घंटे के बाद दिखाई देगा ।
    5. क्रिस्टल को तब तक बढ़ने दें जब तक कि क्रिस्टल के आकार में कोई और दृश्यमान परिवर्तन नहीं देखा जाता है(चित्रा 9,पैनल 1)।
      नोट: नाभिक समय निर्धारित करने और क्रिस्टल के आकार में भिन्नता को मापने के लिए, हर 15 या 20 मिनट में छवियों को रिकॉर्ड करें, जो एनबी छवियां अनुभाग में प्रति घंटे क्रमशः 4 या 3 छवियां हैं। प्रोटीन डेनैचुरेशन, एकत्रीकरण और वर्षा या क्रिस्टल विघटन या नाभिक के सीटू अवलोकन में, आमतौर पर कुछ सेकंड से कुछ दसियों मिनट के बीच की आवश्यकता होती है। हालांकि, क्रिस्टल ग्रोथ के लिए यह रेंज कुछ मिनट से लेकर कुछ घंटों के बीच है ।
    6. तीन दिनों के बाद, क्रिस्टल विकास को पुनः आरंभ करने के लिए तापमान को 291 K तक कम करें। तापमान को स्थिर रखें और क्रिस्टल को विकसित होने दें(चित्रा 9,पैनल 2)। प्रयोग के इस चरण के लिए, यह हर 2 घंटे में छवियों को रिकॉर्ड करने और क्रिस्टल के आकार में किसी भी परिवर्तन के लिए हर 10 से 12 घंटे की जांच करने के लिए पर्याप्त होगा। यदि क्रिस्टल के आकार में कोई परिवर्तन नहीं देखा जाता है तो प्रयोग जारी रखा जा सकता है।
      नोट: क्रिस्टलीकरण समाधान में प्रोटीन और तेज़ सांद्रता और उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा के आधार पर, प्रत्येक चरण के लिए संतुलन तक पहुंचने के लिए आवश्यक समय भिन्न हो सकता है।
    7. क्रिस्टल वृद्धि को पुनः आरंभ करने के लिए तापमान को 288 K तक कम करें। यहां पेश किए गए केस की प्रायोगिक स्थिति में एक दिन संतुलन(चित्रा 9,पैनल 3) तक पहुंचने के लिए काफी है ।
    8. क्रिस्टल के आकार की जांच करें और जब तक क्रिस्टल बढ़ता रहता है तब तक निरंतर तापमान बनाए रखें।
    9. 4 दिनों के बाद, क्रिस्टल ग्रोथ(चित्रा 9,पैनल 4) को पुनः आरंभ करने के लिए तापमान को 275 K तक कम करें।
      - प्रस्तुत मामले की प्रायोगिक स्थितियों में, लगभग 10 दिनों के बाद एक क्रिस्टल जो एक आयाम में 500 माइक्रोन है(चित्रा 9)प्राप्त किया जाएगा।
  4. क्रिस्टल आकार को नियंत्रित करना
    1. एक प्रोटीन समाधान और तापमान नियंत्रित बहने जलाशय डायलिसिस स्थापित करने के रूप में वर्ग 2.3.1 और 2.3.2 में वर्णित तैयार करें।
    2. 0.9 एम एनएसीएल और 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4 के साथ क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करें।
    3. तापमान को 291 K तक सेट करें और क्रिस्टल को बढ़ने दें। प्रारंभिक परिस्थितियों में, पहली नाभिक घटना लगभग एक घंटे के बाद शुरू होगी और कई क्रिस्टल डायलिसिस कक्ष में तीन घंटे(चित्रा 10,चरण: 1 और 2) के लिए विकसित होंगे। विकास प्रक्रिया के दौरान क्रिस्टल के आकार की जांच करने के लिए हर 20 मिनट में छवियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: उत्पन्न क्रिस्टल के अधिकांश अंतिम गुणों को नियंत्रित करने में क्रिस्टलीकरण स्थितियों का अनुकूलन महत्वपूर्ण है। क्रिस्टलीकरण समाधानों के तापमान और रासायनिक संरचना को एक समान आकार के क्रिस्टल को भंग करने और फिर से विकसित करने के लिए बदला जा सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस तरह के प्रयोग में प्रोटीन के नमूने का सेवन नहीं किया जाता है, क्योंकि जब तक यह विकृत नहीं होता है, तब तक नमूने को फिर से भंग करने के लिए शर्तों को उलट दिया जा सकता है। तापमान बदलकर और निरंतर रासायनिक संरचना को बनाए रखकर क्रिस्टल को भंग करते समय, प्रयोग को इस प्रकार जारी रखें:
    4. एक बार क्रिस्टल २९१ कश्मीर में हो गए हैं, इन को फिर से कम, बड़े क्रिस्टल बढ़ने के लिए भंग किया जा सकता है । तापमान धीरे-धीरे 20 मिनट से अधिक बढ़ाने के लिए 313 K तक पहुंचने। डायलिसिस कक्ष के अंदर सभी क्रिस्टल को भंग करने में लगभग एक घंटेलगते हैं (चित्रा 10,चरण: 3-5)। विघटन प्रक्रिया की निगरानी के लिए हर 5 से 15 मिनट में छवियों को रिकॉर्ड करें।
      नोट: कई प्रोटीन उच्च तापमान के प्रति संवेदनशील होते हैं। तापमान सीमा के भीतर काम करना सुनिश्चित करें जहां प्रोटीन किसी भी क्षति/denaturation से बचने के लिए स्थिर है । प्रोटीन घुलनशीलता के अलावा तापमान बफर सॉल्यूशन को भी प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, बफर का पीएच तापमान के साथ बदल सकता है, विशेष रूप से ट्रिस बफर में। ऐसे मामले में, पीएच को उस तापमान के अनुसार स्थापित करना महत्वपूर्ण है जिस पर प्रयोग18किया जाता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटीन विघटन में प्रोटीन क्रिस्टल वृद्धि (कुछ घंटों से कुछ दिनों तक) की तुलना में काफी कम समय (कुछ मिनट से कुछ घंटों तक) लगता है। सामान्य तौर पर, क्रिस्टल के विघटन के दौरान, तापमान धीरे-धीरे और धीरे-धीरे बढ़ जाता है (कम कुल विघटन समय का सम्मान करते हुए), मुख्य रूप से क्रिस्टल मोज़ेक की वृद्धि से बचने के लिए क्रिस्टल के आंशिक विघटन के मामले में। जब क्रिस्टल बढ़ रहे हैं, तापमान जल्दी से कम (एक मिनट से भी कम समय में) सेट तापमान (लंबे कुल विकास के समय का संमान) के लिए कर सकते हैं । छवियों को रिकॉर्ड करके क्रिस्टलीकरण कक्ष की नियमित निगरानी प्रोटीन को नुकसान को रोकने और प्रत्येक प्रोटीन अध्ययन के लिए क्रिस्टल के विघटन या विकास के लिए इष्टतम समय को परिभाषित करने में मदद करने की सलाह दी जाती है।
    5. सभी क्रिस्टल के बाद एक दूसरे नाभिक घटना शुरू करने के लिए 295 K करने के लिए तापमान सेट भंग कर दियाहै (चित्रा 10,कदम: 6,7)। दूसरी नाभिक प्रक्रिया की निगरानी के लिए हर 5 मिनट में छवियों को रिकॉर्ड करें। इस स्टेप में करीब 18 मिनट के बाद पहला नाभिक दिखाई देता है।
      नोट: इस तापमान पर, समाधान न्यूक्लियेशन जोन में, मेटास्टेबल जोन के आसपास होगा। नतीजतन, क्रिस्टलीकरण कक्ष में केवल कुछ नाभिक दिखाई देंगे।
    6. बड़े क्रिस्टल उगाने के लिए धारा 2.3 में वर्णित अनुकूलन कार्यप्रवाह को दोहराते हुए प्रयोग जारी रखें। चित्रा 10 में प्रतिनिधित्व प्रयोग की कुल अवधि केवल कुछ ही दिन है ।
      नोट: यदि नाभिक चरण के दौरान क्रिस्टल अलग-अलग समय पर दिखाई देते हैं, तो क्रिस्टलीकरण कक्ष में विभिन्न आकारों के क्रिस्टल प्राप्त किए जाते हैं। ऐसे मामले में, तापमान में वृद्धि (प्रत्यक्ष घुलनशीलता वाले प्रोटीन के मामले में) छोटे क्रिस्टल के जल्दी विघटन के परिणामस्वरूप होगी। गतिज पकने के प्रभाव के आधार पर, अतिरिक्त प्रोटीन (विघटन से प्राप्त) का उपयोग बड़े क्रिस्टल के विकास के लिए किया जा सकता है।
      क्रिस्टलीकरण समाधान की रासायनिक संरचना को बदलकर लगातार तापमान पर क्रिस्टल को भंग करते समय, प्रयोग को इस प्रकार जारी रखें:
      नई परिस्थितियों में समान रूप से आकार के क्रिस्टल की आबादी को फिर से विकसित करने के लिए प्रयोग के दौरान क्रिस्टलीकरण समाधान की रासायनिक संरचना को बदलकर पहले उगाए गए क्रिस्टल को भंग करना भी संभव है।
    7. प्रोटीन समाधान (2.3.1), तापमान नियंत्रित बहने वाले जलाशय डायलिसिस सेटअप (2.1) और क्रिस्टलीकरण समाधान (2.4.2) को ऊपर वर्णित के रूप में तैयार करें। मेटास्टेबल क्षेत्र से दूर नाभिक क्षेत्र में प्रारंभिक परिस्थितियों में, क्रिस्टलीकरण कक्ष में कई छोटे क्रिस्टल दिखाई देंगे और बढ़ने लगेंगे(चित्र 11,चरण: 1,2)।
    8. तीन घंटे के बाद, जब क्रिस्टलीकरण कक्ष(चित्रा 11,चरण: 3) में कई मध्यम आकार के क्रिस्टल दिखाई देते हैं, तो शून्य तक पहुंचने के लिए नैसीएल एकाग्रता (0.9 एम) को धीरे-धीरे कम करें। इसके लिए, 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4 के साथ केवल बफर समाधान युक्त एक नया क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करें। जलाशय कक्ष में क्रिस्टलीकरण समाधान के साथ इसका आदान-प्रदान करने के लिए पंपिंग सिस्टम का उपयोग करें। जलाशय कक्ष में एक नए समाधान की तैयारी और इंजेक्शन के लिए चरण 2.2.10 से 2.2.12 का पालन करें। इस नए समाधान के साथ, जब समाधानों का आदान-प्रदान किया जाता है तो कक्ष में एनएसीएल एकाग्रता कम हो जाती है जब तक कि जलाशय कक्ष में अंतिम समाधान में सीएच3सीओओएनए पीएच 4 और कोई एनएसीएल के 0.1 मीटर से अधिक नहीं होता है। विघटन प्रक्रिया को रिकॉर्ड करने के लिए हर 10 मिनट में छवियों को कैप्चर करें।
    9. क्रिस्टल को पूरी तरह से भंग करने दें(चित्रा 11,चरण: 4,5)। विघटन का समय इस प्रयोग के लिए लगभग दो घंटे है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, विघटन का समय प्रोटीन प्रणाली, क्रिस्टलीकरण की स्थिति और डायलिसिस कक्ष की मात्रा पर निर्भर करता है। क्रिस्टलीकरण कक्ष (माइक्रोस्कोप अनुभाग देखें) का नियमित अवलोकन और प्रयोग के दौरान छवियों और नोटों को रिकॉर्ड करना आवश्यक है।
    10. जब कक्ष के अंदर सभी क्रिस्टल भंग हो जाते हैं(चित्रा 11,चरण: 5), पिछले एक (0.75 एम एनएसीएल में 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4) की तुलना में कम एकाग्रता पर एनएसीएल इंजेक्शन द्वारा एक नया क्रिस्टलीकरण समाधान तैयार करने के लिए पंपिंग सिस्टम का फिर से उपयोग करें।
    11. नए समाधान को जलाशय कक्ष(चित्रा 11,चरण: 6,7) में इंजेक्ट करें और धारा 2.3 में वर्णित क्रिस्टलीकरण विकास अनुकूलन कार्यप्रवाह दोहराएं। बड़े क्रिस्टल की एक समान आबादी पैदा की जाएगी। चित्रा 11 में दिखाए गए परिणाम कुछ दिनों के बाद प्राप्त किए गए थे ।

Representative Results

धारा 2.3 और 2.4 में, अनुकूलित क्रिस्टल विकास के तीन उदाहरण प्रस्तुत किए जाते हैं, जिसमें उपकरण का उपयोग और बड़े क्रिस्टल उगाने के लिए एक प्रयोगात्मक डिजाइन दिखाया जाता है। इस प्रदर्शन के लिए, हमने एक मॉडल प्रोटीन के रूप में lysozyme का उपयोग किया है, हालांकि क्रिस्टल विकास प्रयोगों को सफलतापूर्वक इस विधि का उपयोग करके कई अन्य प्रोटीन प्रणालियों के साथ किया गया है (ऊपर देखें)। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके और माहिर करके कोई भी इसे अन्य प्रोटीन उम्मीदवारों के लिए अनुकूलित कर सकता है।

धारा 2.3 में हमने दिखा दिया कि स्थापित तर्कसंगत क्रिस्टलीकरण रणनीतियां न्यूट्रॉन प्रोटीन क्रिस्टलोग्राफी के लिए पर्याप्त बिखरने की मात्रा के साथ क्रिस्टल उगाने में फायदेमंद हो सकती हैं। यहां, हम प्रदर्शित करते हैं कि प्रस्तावित तर्कसंगत अनुकूलन रणनीतियां डाउनस्ट्रीम संरचना निर्धारण दृष्टिकोणों के लिए आवश्यक किसी भी विशिष्ट आकार के क्रिस्टल की एक समान आबादी की पीढ़ी की अनुमति देती हैं।

इन दो प्रयोगों को क्रिस्टल नाभिक और विकास को नियंत्रित करने में चरण आरेख के महत्व पर जोर देने के लिए डिज़ाइन किया गया है । यहां, वास्तविक समय में क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया की निगरानी के साथ संयोजन में क्रिस्टलीकरण समाधानों के तापमान और रासायनिक संरचना के नियंत्रण का उपयोग गुणात्मक चरण आरेख का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इस विधि का उपयोग करके, नाभिक और क्रिस्टल विकास को तर्कसंगत रूप से रिवर्सिबल तरीके से अनुकूलित किया जा सकता है। इस तरह के सीरियल अप्रोच के इस्तेमाल से प्रोटीन की मात्रा और क्रिस्टल के आकार और गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए जरूरी समय भी कम हो जाता है।

डायलिसिस विधि में, एक प्रोटीन समाधान एक अर्ध-पारमी झिल्ली6 (चित्रा 5) द्वारा क्रिस्टलीकरण समाधान से अलग कियाजाता है। यह डायलिसिस झिल्ली छोटे अणुओं जैसे एडिटिव्स, बफर और आयनों को झिल्ली से गुजरने की अनुमति देती है लेकिन प्रोटीन6,20जैसे मैक्रोमॉलिक्यूल्स नहीं। यह सुविधा प्रयोग 6 केदौरानक्रिस्टलीकरण समाधान को संशोधित करने की अनुमति देती है। समाधान का आदान-प्रदान मैन्युअल रूप से किया जा सकता है, उदाहरण के लिए माइक्रोडायलिसिस बटन में, या इस उद्देश्य के लिए विकसित उपकरण का उपयोग करके स्वचालित तरीके से, ऑप्टीक्रिस्ट8।

प्रयोगों के पहले सेट में, चिकन अंडे-सफेद लाइसोजाइम के क्रिस्टलीकरण के लिए माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग किया गया था। माइक्रोडायलिसिस बटन विभिन्न नमक सांद्रता के साथ क्रिस्टलीकरण समाधान में डूबे हुए थे। इस सरल क्रिस्टलीकरण ग्रिड प्रयोग में, तापमान स्थिर रखा जाता है (293 K) के दौरान एकमात्र चर तेज़ एकाग्रता है। जैसा कि चित्र 4में दिखाया गया है, नमक एकाग्रता में मामूली भिन्नता क्रिस्टल के आकार और संख्या में बदलाव को प्रेरित करती है, जिससे क्रिस्टलीकरण चरण आरेख की जांच की अनुमति होती है। चित्रा 4,पैनल 1 में, क्रिस्टलीकरण समाधान में 0.7 एम एनएसीएल होता है और बटन में सीमित संख्या में बड़े क्रिस्टल दिखाई देते हैं। नमक एकाग्रता को 0.7 से बढ़ाकर 1.2 मीटर तक, अतिसंक्षण बढ़ता है और नाभिक क्षेत्र में समाधान मेटास्टेबल ज़ोन(चित्रा 4,पैनल 1 से 6) से दूर चला जाता है। नतीजतन, क्रिस्टल की संख्या बढ़ जाती है और उनका आकार कम हो जाता है।

तापमान नियंत्रित डायलिसिस क्रिस्टलीकरण, ऑप्टीक्रिस्ट(चित्रा 9)को सक्षम करने वाले पूरी तरह से स्वचालित उपकरण के साथ पहले प्रयोग में, क्रिस्टल विकास प्रयोग को बड़े क्रिस्टल विकास उत्पन्न करने के लिए तैयार किया गया था। यह प्रयोग 295 K के शुरुआती तापमान पर शुरू किया गया था जिसमें 0.75 एम एनएसीएल और 0.1 एम ना एसीटेट बफर पीएच 4 शामिल क्रिस्टलीकरण समाधान था। इन प्रायोगिक परिस्थितियों में, क्रिस्टलीकरण समाधान चरण आरेख(चित्रा 9,तीर 1) के मेटास्टेबल जोन के आसपास के क्षेत्र में नाभिक क्षेत्र तक पहुंच गया। नतीजतन, प्रयोग के पहले चरण के दौरान केवल कुछ नाभिक उत्पन्न हुए थे। चयनित क्रिस्टल को आगे बढ़ाने के लिए (चित्रा 9में दिखाया गया है), क्रिस्टल-समाधान संतुलन जैसे ही तापमान तक पहुंच गया, क्रिस्टल विकास अनुकूलन कार्यप्रवाह को अलग-अलग तापमान द्वारा मेटास्टेबल क्षेत्र की ओर प्रेरित किया गया था।

हर बार क्रिस्टल और समाधान के बीच संतुलन तक पहुंच गया था, तापमान को कम किया गया था, पहले 291 K, फिर 288 K और अंत में 275 K तक, मेटास्टेबल क्षेत्र में क्रिस्टलीकरण समाधान रखने के लिए। इस प्रयोग का परिणाम मैक्रोमॉलिकुलर एक्स-रे और न्यूट्रॉन क्रिस्टलोग्राफी दोनों के लिए उपयुक्त एक बड़ा क्रिस्टल है।

अधिकांश प्रोटीन के लिए, सटीक मात्रात्मक चरण आरेख (या सिर्फ एक गुणात्मक आरेख) अभी तक प्रोटीन एकाग्रता को सही ढंग से मापने में सक्षम प्रयोगात्मक उपकरणों की कमी के कारण प्राप्त नहीं किया गया है (या वास्तविक समय में क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया का पता लगाने/वास्तविक समय में बस का पता लगाने/का पता लगाने) क्रिस्टलीकरणप्रयोगों के दौरान 18। नतीजतन, अक्सर प्रयोग को इस तरह से डिजाइन करना संभव नहीं होता है कि मेटास्टेबल क्षेत्र के आसपास चरण आरेख के इष्टतम क्षेत्र में क्रिस्टलीकरण शुरू होता है।

इसलिए, बड़ी मात्रा में क्रिस्टल के विकास के लिए समर्पित प्रयोग शुरू होने से पहले एक क्रिस्टलीकरण अनुकूलन अध्ययन होना चाहिए। इस अध्ययन में, एक तरफ तापमान विविधताओं (निरंतर रासायनिक संरचना पर) का उपयोग करना और दूसरी ओर रासायनिक संरचना (निरंतर तापमान पर) में भिन्नता, मेटास्टेबल क्षेत्र की पहचान करने और एक बड़े क्रिस्टल विकास प्रयोग शुरू करने के लिए इष्टतम स्थितियों को चित्रित करने के लिए आवश्यक है।

इस उद्देश्य के लिए, दो अन्य प्रयोग प्रस्तुत किए जाते हैं जिन्हें नाभिक, क्रिस्टल विकास, विघटन और पुनः विकास के लिए ऑप्टीक्रिस्ट के साथ तापमान नियंत्रित डायलिसिस क्रिस्टलीकरण प्रयोगों की रिवर्सिबिलिटी प्रदर्शित करने के लिए तैयार किया गया था। क्रिस्टल विकास अनुकूलन कार्यप्रवाह को नियंत्रित किया गया था ताकि तापमान या तेज़ एकाग्रता की भिन्नता का उपयोग करके कम, बड़े lysozyme क्रिस्टल की एक समान आबादी उगाई जा सके।

ऑप्टिक्रिस के साथ दूसरे प्रयोग में, क्रिस्टलीकरण समाधान की रासायनिक संरचना को पूरे प्रयोग (0.9 एम एनएसीएल में 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4) में चर तापमान के साथ स्थिर रखा गया था। शुरुआती तापमान 291 K पर सेट किया गया था। इस प्रयोग के परिणामों को चित्र 10में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है । उच्च अतिसंवता के कारण, क्रिस्टलीकरण कक्ष(चित्रा 10,पैनल 1 और 2) में बड़ी संख्या में छोटे क्रिस्टल दिखाई दिए। प्रत्यक्ष प्रोटीन घुलनशीलता की अवधारणा के अनुसार, धीरे-धीरे तापमान को 313 K तक बढ़ाकर, सभी क्रिस्टल भंग कर दिए गए(चित्र 10,पैनल 3, 4 और 5)। अंत में, तापमान को 295 K तक कम करके, मेटास्टेबल क्षेत्र के आसपास दूसरा नाभिक शुरू किया गया था और कम संख्या में नाभिक के नियंत्रित गठन की अनुमति दी गई थी। इसके अलावा क्रिस्टल विकास के परिणामस्वरूप बड़े क्रिस्टल(चित्रा 10,पैनल 7) की आबादी का एक समान उत्पादन हुआ।

जैसा कि चित्र 11में दिखाया गया है, 2 9 1 के निरंतर तापमान पर क्रिस्टलीकरण समाधान की रासायनिक संरचना की भिन्नता, इसी तरह बड़े क्रिस्टल की एक समान आबादी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता है। पिछले प्रयोग के समान, प्रारंभिक स्थिति 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4 में 0.9 एम एनएसीएल थी। इसके बाद एनएसीएल एकाग्रता को क्रिस्टल(चित्रा 11,पैनल 4 और 5) को भंग करने के लिए धीरे-धीरे 0.9 मीटर से शून्य तक कम कर दिया गया था। इस बिंदु पर, एनएसीएल को पूरी तरह से 0.1 एम सीएच3सीओओएनए पीएच 4 के बफर समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया गया था। नमक एकाग्रता को कम करने से समाधान चरण आरेख के अंडरसैचुरेटेड क्षेत्र में रहता है, जिससे क्रिस्टल का विघटन होता है। फिर, 0.1 एम सीएच3सीओओएना पीएच 4 में 0.75 एम एनएसीएल में कम आयनिक ताकत के साथ एक नया क्रिस्टलीकरण समाधान, जलाशय कक्ष में इंजेक्ट किया गया था। इस तेज़ एकाग्रता पर, पहला नाभिक 90 मिनट के बाद(चित्रा 11,पैनल 6) दिखाई दिया। उत्पन्न क्रिस्टल की संख्या कम थी और क्रिस्टल पहले की तुलना में बड़ी मात्रा(चित्रा 11,पैनल 7) तक पहुंचते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: योजनाबद्ध चरण आरेख। तीन क्रिस्टलीकरण तकनीकों के लिए काइनेटिक प्रक्षेप पथ एक नमकीन बाहर शासन में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं । प्रत्येक विधि नाभिक और क्रिस्टलीकरण को अलग-अलग प्राप्त करती है, जो नाभिक और मेटास्टेबल क्षेत्रों तक पहुंचने के लिए चरण आरेख के माध्यम से एक अलग गतिज मार्ग द्वारा कल्पना की गई है। घुलनशीलता वक्र अंडरसैचुरेशन और सुपरसैचुरेशन क्षेत्रों को अलग करता है। अधिष्ठापन को तीन क्षेत्रों में विभाजित किया गया है: मेटास्टेबल, नाभिक और वर्षा। नाभिक क्षेत्र में, सहज नाभिक होता है जबकि मेटास्टेबल क्षेत्र क्रिस्टल विकास होता है। यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: क्रिस्टलीकरण पीठ (ऑप्टीक्रास) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एलईडी लाइट स्रोत तापमान नियंत्रित डायलिसिस प्रवाह कोशिका के शीर्ष पर स्थित है। एक उल्टे माइक्रोस्कोप और डिजिटल कैमरा लाल तीर के साथ छवि के शीर्ष दाईं ओर दिखाया गया है। लाल वृत्त चिलर ट्यूबिंग के स्थान का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: योजनाबद्ध दो आयामी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण चरण आरेख तापमान (ए) और तेज़ एकाग्रता (बी) के एक समारोह के रूप में। (क) प्रत्यक्ष घुलनशीलता वाले प्रोटीन के मामले में तापमान कम होने से क्रिस्टलीकरण समाधान मेटास्टेबल जोन में रहता है । तापमान भिन्नता को क्रिस्टल विकास प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए कई बार दोहराया जा सकता है जब तक कि वांछित मात्रा के साथ क्रिस्टल प्राप्त न हो जाएं। (ख) क्रिस्टल उगाने के लिए मेटास्टेबल जोन में क्रिस्टलीकरण समाधान रखने के लिए तेज़ समाधान की एकाग्रता को बदलने का भी उपयोग किया जा सकता है । यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: डायलिसिस विधि का उपयोग करके प्राप्त lysozyme के क्रिस्टल। यह प्रयोग 0.1 मीटर सोडियम एसीटेट बफर पीएच 4 में 293 K के निरंतर तापमान पर किया गया था। एनएसीएल एकाग्रता को 0.7 मीटर से बढ़ाकर 1.2 मीटर करने से नाभिक दर बढ़ जाती है और परिणामस्वरूप बड़ी संख्या में क्रिस्टल होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: डायलिसिस विधि द्वारा प्रोटीन क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया का अवलोकन। (क) डायलिसिस बटन के कक्ष में प्रोटीन जोड़कर, (ख) कक्ष के शीर्ष पर एक गुंबद का आकार बनाया जाता है । (ग) डायलिसिस झिल्ली को ठीक करने के लिए ओ-रिंग को डायलिसिस बटन के नाली में स्थानांतरित करने के लिए एक एप्लीकेटर का उपयोग किया जाता है । (घ) जलाशय के घोल में विसर्जन के लिए डायलिसिस बटन तैयार है। (ङ) क्रिस्टलीकरण समाधान अर्धप्रतिम झिल्ली से गुजरता है और क्रिस्टल कक्ष के अंदर बनने लगते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र 6: तापमान नियंत्रित बहने वाले डायलिसिस सेटअप का योजनाबद्ध दृश्य। (क) डायलिसिस कक्ष में प्रोटीन का नमूना जोड़ा जाता है । (ख) डायलिसिस झिल्ली को एप्लिकेटर का उपयोग करके ओ-रिंग के साथ ओवरचमबर पर स्थिर किया जाता है । (ग) ओवरचैम्बर को डायलिसिस कक्ष के शीर्ष पर बदल दिया जाता है और तय किया जाता है । सफेद तीर इंगित करते हैं कि ओवरचमेबर पर शिकंजा कहां रखा जाता है। (घ) जलाशय कक्ष को दक्षिणावर्त (ई) कर दिया जाता है और ओवरचैम्बर के शीर्ष पर निर्धारित किया जाता है । (च) जलाशय कक्ष को एक पंपिंग प्रणाली से कनेक्टर के साथ एक एयरटाइट कैप द्वारा कवर किया जाता है और (जी) प्रवाह कोशिका को पीतल के समर्थन में रखा जाता है । यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8इस आंकड़े का बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्र 7: तरल प्रणाली (ए) द्वारा जलाशय में क्रिस्टलीकरण समाधान की तैयारी और इंजेक्शन। नमक और पानी युक्त ट्यूब प्रेशर/वैक्यूम कंट्रोलर (बी) और रोटरी वाल्व (सी) से जुड़े होते हैं । दबाव का उपयोग करके, दबाव/वैक्यूम नियंत्रक ट्यूबों से रोटरी वाल्व के लिए तरल पदार्थ का एक निरंतर प्रवाह बनाता है । प्रवाह मीटर (डी) और स्विच के माध्यम से गुजर प्रत्येक तरल मिश्रण ट्यूब (एफ) में इंजेक्शन है । एक बार सभी तरल पदार्थ मिश्रण ट्यूब में जोड़ दिया गया है, कुछ संशोधनों द्वारा स्विच जलाशय (जी) में मिश्रण ट्यूब से अंतिम समाधान इंजेक्ट । आरोही क्रम (1 से 6) में चिह्नित आरेख में तीरों की दिशा में सिस्टम के माध्यम से तरल बहता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: पर्यवेक्षण सॉफ्टवेयर का रखरखाव दृश्य। इस दृश्य का उपयोग तापमान, प्रकाश, क्रिस्टलीकरण समाधान और ज़ूम जैसे विभिन्न मापदंडों को नियंत्रित करने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 9
चित्रा 9: तापमान के एक समारोह के रूप में चरण आरेख (चयनित छवियों को आरोही क्रम में ट्रैक किया जाना है)। एक बड़े lysozyme क्रिस्टल व्यवस्थित रूप से 295 K से 275 K तापमान को बदलकर प्राप्त किया जाता है। प्रत्येक चरण में, क्रिस्टल विकास को घुलनशीलता वक्र तक पहुंचने पर रोक दिया जाता है। मेटास्टेबल जोन में समाधान रखकर तापमान को कम करने से क्रिस्टल विकास फिर से शुरू होता है। छवियों में आवर्धन के विभिन्न स्तर हैं। यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8,18कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 10
चित्रा 10: तापमान नियंत्रण का उपयोग करके निरंतर रासायनिक संरचना में क्रिस्टल विकास का अनुकूलन (चयनित छवियों को आरोही क्रम में ट्रैक किया जाना है)। मेटास्टेबल जोन से दूर 291 K में न्यूक्लियेशन जोन में न्यूक्लियेशन प्रोसेस शुरू करने से कई क्रिस्टल ्स का गठन होता है। ३१३ कश्मीर के लिए तापमान में वृद्धि तो क्रिस्टल घुल जब तक कोई दिखाई नाभिक डायलिसिस कक्ष में देखा जाता है । अंत में, तापमान को 295 K तक कम करने से दूसरी बार नाभिक प्रक्रिया फिर से शुरू होती है जिससे सीमित संख्या में बड़े क्रिस्टल होते हैं। यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8,18कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 11
चित्रा 11: स्थिर तापमान पर क्रिस्टल वृद्धि का अनुकूलन तेज़ एकाग्रता में भिन्नता का उपयोग करके (चयनित छवियों को आरोही क्रम में ट्रैक किया जाना है)। 0.9 मीटर से 0 मीटर तक तेज़ एकाग्रता को कम करने से पहली नाभिक घटना के दौरान प्राप्त क्रिस्टल घुल जाते हैं। क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को एक ही तेज़ के इंजेक्शन द्वारा पुनः आरंभ किया जाता है, लेकिन कम आयनिक ताकत, 0.75 एम पर, जो कुछ बड़े क्रिस्टल के गठन की ओर जाता है। यह आकृति जुनियस एट अलसे अनुकूलित है। 8,18कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

विभिन्न भौतिक, रासायनिक और जैविक चर प्रोटीन घुलनशीलता को प्रभावित करके प्रोटीन क्रिस्टलीकरण को प्रभावित करते हैं21. इन चरों में, क्रिस्टलीकरण समाधान के तापमान और रासायनिक संरचना का उपयोग यहां डायलिसिस तकनीक के संयोजन में किया जाता है ताकि न्यूट्रॉन विवर्तन अध्ययनों के लिए बायोमैक्रोमोलेक्यूल्स के बड़े उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को बेहतर और विकसित किया जा सके। चरण आरेखों के ज्ञान का उपयोग करके, क्रिस्टलीकरण को अधिक पूर्वानुमानित बनाया जाता है। हालांकि धारावाहिक दृष्टिकोण में विभिन्न क्रिस्टलीकरण स्थितियों की स्क्रीनिंग भी संभव है, लेकिन प्रस्तुत तर्कसंगत दृष्टिकोणों का उपयोग करने का मुख्य उद्देश्य क्रिस्टल नाभिक और विकास के काइनेटिक्स को अलग और नियंत्रित करना है।

सभी क्रिस्टलीकरण अध्ययनों के समान, उच्च गुणवत्ता वाले शुद्ध और सजातीय प्रोटीन नमूने, और धूल मुक्त क्रिस्टलीकरण समाधान प्रयोग की सफलता दर में वृद्धि करते हैं। निस्पंदन और समाधान के अपकेंद्रित्र वर्णित प्रोटोकॉल में आवश्यक कदम हैं । प्रोटीन के भौतिक रसायन गुणों को जानना जैसे आणविक वजन (उचित डायलिसिस झिल्ली का चयन करने के लिए), आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट, और प्रोटीन घुलनशीलता एक इष्टतम क्रिस्टल विकास प्रयोग के डिजाइन के लिए महत्वपूर्ण हैं। इसके अलावा, नमूना हानि को रोकने और सफलता की संभावना को बढ़ाने के लिए विभिन्न तापमानों पर या विभिन्न रसायनों के साथ प्रोटीन स्थिरता के लिए विचार किया जाना चाहिए। ऑप्टीक्रिस्ट (233.0-353.0 ± 0.1 K) के तापमान सीमा को ध्यान में रखते हुए, प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग करके क्रिस्टलीकृत किया जा सकता है। लेकिन यह तनाव के लायक है कि प्रोटीन है कि मुख्य रूप से थर्मो स्थिर हैं, जैसे थर्मोफिलिक स्रोतों से प्रोटीन, तापमान में सबसे अधिक लाभ होगा बड़ी मात्रा में क्रिस्टल विकास इस उपकरण द्वारा की पेशकश प्रयोगों को नियंत्रित ।

कम मात्रा वाले डायलिसिस कक्ष (ऑप्टिक्रिस्टिस का उपयोग करते समय) या माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग करना और कई तापमान और क्रिस्टलीकरण की स्थिति (उदाहरण के लिए, तेज़ एकाग्रता या पीएच के ग्रिड) की स्क्रीनिंग करना, मेटास्टेबल जोन (नाभिक और मेटास्टेबल क्षेत्रों के बीच गतिज संतुलन) की सीमा के स्थान के बारे में जानकारी प्राप्त करना संभव है। यह अमूल्य है जब विशेष रूप से क्रिस्टलीकरण में नए प्रोटीन उम्मीदवारों के लिए एक सफल क्रिस्टल विकास प्रयोग डिजाइन। इस जानकारी के बिना प्रयोग उच्च सुपरसैचुरेशन के साथ चरण आरेख के क्षेत्र से शुरू हो सकते हैं, आसानी से क्रिस्टल नाभिक को नियंत्रित करने के लिए मेटास्टेबल क्षेत्र की सीमा से बहुत दूर। हालांकि प्रोटीन वर्षा के विघटन का प्रयास किया जा सकता है, उदाहरण के लिए प्रत्यक्ष घुलनशीलता के मामले में तापमान में वृद्धि करके, कम थर्मोस्थायिटी वाले प्रोटीन के लिए, नमूने को लंबे समय तक उच्च तापमान पर रखने से प्रोटीन वर्षा अपरिवर्तनीय हो सकती है। इस प्रकार, सबसे अच्छी रणनीति में मेटास्टेबिलिटी की सीमा के पास स्थित कम अतिसंवता के साथ एक प्रारंभिक स्थिति का उपयोग करना होता है, जहां नाभिक को नियंत्रित किया जा सकता है और प्रोटीन वर्षा से बचा जा सकता है। इसके अनुरूप, क्रिस्टलीकरण प्रीस्क्रीनिंग डायलिसिस कक्ष में प्रोटीन होने की संभावना को कम कर देता है और प्रयोग की सफलता दर को बढ़ाता है।

एक प्रयोग डिजाइन करने के बाद, डायलिसिस कक्षों (ऑप्टीक्रिस्ट) या माइक्रोडायलिसिस बटन तैयार करना एक और महत्वपूर्ण कदम है। डायलिसिस कक्ष/बटन में हवा बुलबुला गठन को रोकने के सफल क्रिस्टलीकरण की संभावना बढ़ जाती है, खासकर जब छोटी मात्रा का उपयोग किया जाता है । डायलिसिस कक्ष में हवा के बुलबुले की उपस्थिति क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया के गतिज को भी बदल सकती है और प्रयोग की प्रजनन क्षमता को कम कर सकती है (क्योंकि प्रोटीन/समाधान संपर्क सतह को संशोधित किया गया है)। न केवल प्रोटीन बल्कि क्रिस्टलीकरण समाधान भी प्रयोग की सफलता को प्रभावित कर सकता है। पंपिंग प्रणाली के लिए नए 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करना हर बार एक नया प्रयोग शुरू करना चाहता है और प्रत्येक प्रयोग के बाद टयूबिंग धोने से संदूषण की संभावना कम हो जाती है और उपकरण में नमक क्रिस्टल के निर्माण से बचा जाता है।

जब ऑप्टीक्रिस्टे उपलब्ध नहीं होता है तो माइक्रोडायलिसिस बटन का उपयोग एक विकल्प है। ऊपर उल्लिखित क्रिस्टलीकरण और निगरानी क्रिस्टल विकास के अनुकूलन के लिए रणनीतियों को मैन्युअल रूप से किया जाना चाहिए। आमतौर पर यह एक थर्मोरैलेनियमित इनक्यूबेटर के बाहर होने की आवश्यकता होती है, जो समस्याग्रस्त हो सकता है जब तापमान विनियमन वर्णित पद्धति में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह क्रिस्टलीकरण समाधानों की रासायनिक संरचना को बदलने, या इमेजिंग द्वारा क्रिस्टल विकास की निगरानी करने की सुविधा नहीं देता है, इसलिए क्रिस्टल विकास प्रक्रिया को वास्तविक समय में नियंत्रित नहीं किया जा सकता है।

चरण आरेख का ज्ञान एक स्वचालित फैशन में बड़े, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल को व्यवस्थित रूप से विकसित करने के लिए क्रिस्टलीकरण बेंच, ऑप्टीक्रिस्ट का उपयोग करने का आधार है। क्रिस्टलीकरण के दौरान तापमान, तेज़ एकाग्रता और पीएच जैसे भौतिक रसायनीय मापदंडों का नियंत्रण प्रोटीन-समाधान संतुलन को चरण आरेख में एक अच्छी तरह से परिभाषित गतिज प्रक्षेपवक्र में ले जाता है। यह बड़े पैमाने पर परिवहन को समायोजित करने और क्रिस्टलीकरण कक्ष में एक नियंत्रित ढाल बनाने के लिए डायलिसिस झिल्ली के उपयोग से पूरित होता है जो क्रिस्टल के आकार और गुणवत्ता को प्रभावित करता है। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल विकसित करने के लिए क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए थर्मोडायनामिक डेटा और गतिज पथ दोनों का उपयोग करना आवश्यक है। ऑप्टीक्रिस्ट के लिए धन्यवाद, बहुआयामी अंतरिक्ष में व्यवस्थित चरण आरेखों का अध्ययन धारावाहिक दृष्टिकोण के साथ पहले की तुलना में काफी कम सामग्री का उपयोग करके किया जा सकता है। इस पद्धति को प्रदर्शित करने के लिए, हम यहां एक मॉडल प्रोटीन, चिकन अंडे-सफेद lysozyme के साथ एक मामला अध्ययन प्रदान करते हैं । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग करके और उसमें महारत हासिल करके कोई भी इसे वास्तविक प्रोटीन प्रणालियों5, 14,17,18केलिए अनुकूलित कर सकता है ।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

एमबीएस अनुबंध 2015 के तहत लैबेक्स वैलो जीआरएएल से समर्थन को स्वीकार करता है। एनजे पीएचडी फैलोशिप के लिए सीईए के इंटरनेशनल डॉक्टोरल रिसर्च प्रोग्राम (Irtelis) को स्वीकार करता है । लेखक मैरी Skłodowska-क्यूरी अनुदान समझौते संख्या ७२२६८७ के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन स्वीकार करते हैं । लेखक सहायक बातचीत और अंतर्दृष्टि के लिए डॉ एस्को ओक्सैन (ईएसएस, लुंड) और डॉ जीन-ल्यूक फेरर (आईबीएस, ग्रेनोबल) के आभारी भी हैं। आईबीएस ग्रेनोबल के अंतःविषय अनुसंधान संस्थान (IRIG, सीईए) में एकीकरण को स्वीकार करता है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

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References

  1. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  2. Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  3. Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  4. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  5. Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase. Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).
  6. Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).
  7. Chayen, N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques. REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).
  8. Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  9. Salemme, F. R. A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).
  10. Chayen, N. E., Saridakis, E. Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).
  11. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  12. Garciá-Ruiz, J. M. Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization. Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).
  13. Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).
  14. Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).
  15. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  16. Astier, J. P., Veesler, S. Using temperature to crystallize proteins: A mini-review. Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).
  17. Budayova-Spano, M., et al. A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).
  18. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).
  19. Grimsley, G. R., Pace, C. N. Spectrophotometric Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).
  20. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  21. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34 (3), 254-265 (2004).

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Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

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