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Biology

중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

결정학에 의한 생체 거대 분자의 구조 적 연구는 고품질의 결정이 필요합니다. 여기에서는 OptiCrys(실험실에서 개발된 완전 자동화 기기) 및/또는 미세diadiasis 버튼에서 결정화 단계 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 큰 고품질 결정을 개발하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 시연합니다.

Abstract

중성자 대분자 결정학(NMX)의 사용은 새로운 NMX 빔라인이 구축되고 구조 개선 소프트웨어의 가용성을 증가시키기 때문에 지난 10년 동안 결정된 대부분의 구조로 빠르게 확장되고 있습니다. 그러나, NMX에 현재 유효한 중성자 근원은 X 선 결정학을 위한 동등한 근원 보다는 현저하게 약합니다. 이 분야의 진보에도 불구하고, 중성자 회절 연구에는 항상 훨씬 더 큰 결정이 필요하며, 특히 거대 분자와 복합체를 연구하는 경향이 있습니다. 따라서 더 큰 결정 성장에 적합한 방법과 계측의 추가 개선이 필요하며, 따라서 NMX를 확장하려면 필요합니다.

이 작품에서는 현미경 장착 비디오 카메라를 통해 실시간 관찰을 결합한 합리적인 전략과 결정화 솔루션(예: 침전제 농도, pH, 첨가제, 온도)을 정밀하게 제어할 수 있는 합리적인 전략과 크리스탈 성장 벤치(OptiCrys)를 소개합니다. 그런 다음 온도 및 화학 조성의 이러한 제어가 모델 용해성 단백질을 사용하여 최적의 결정화 조건을 찾는 방법을 보여줍니다. 결정화 단계 다이어그램에 대한 철저한 지식은 결정화 실험에 대한 시작 위치 및 운동 경로를 선택하는 데 매우 중요합니다. 당사는 합리적인 접근 방식이 다차원 위상 다이어그램에 대한 지식을 기반으로 생성된 결정의 크기와 수를 어떻게 제어할 수 있는지 보여줍니다.

Introduction

단백질의 구조 기능 관계와 생리적 경로의 메커니즘을 이해하는 것은 종종 수소 원자 (H)의 위치와 전하가 단백질1,2내에서 전달되는 방법을 아는 데 의존합니다. 수소 원자가 X선을 약하게 분산시키기 때문에, 그들의 위치는 매우 고해상도 X선 회절 데이터(>1 Å)3,4로만결정할 수 있다. 반대로, 중성자 결정예학은 수소 및 중수소(H2, 수소 의 동위원소) 원자가산소, 질소 및 탄소5와거의 동일한 크기의 분란 길이를 가지는 것과 같은 생물학적 거대 분자에서 수소 원자의 정확한 위치를 획득하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 사용 가능한 중성자 소스에서 중성자 플럭스는 X 선 빔의 것보다 약하므로 종종2,3에대해 보상해야합니다. 이는 H를H2와 교환하거나 결정의 부피를 증가시켜 수소의 일관되지 않은 산란을 줄이고 회절 이미지의 신호 대 잡음 비율을 증가시킴으로써 달성될 수 있다.

X선 및 중성자 바이오-거대 분자 결정학6모두에 대해 크고 고품질의 결정을 얻기 위한 다양한 결정화 접근법(그림 1에해당 회로도 도면 다이어그램이 도시됨)이 있다. 증기 확산에서, 단백질과 결정화 용액의 혼합물로부터 제조된 액적물은 시간이 지남에 따라, 물 또는 다른 휘발성 종의 증발을 통해, 동일한 결정화 용액의 높은 농도를 포함하는 저수지에 대해 평형화된다. 액적에서 단백질과 침전제의 농도가 증가하면 이러한 핵6,7에서결정 성장을 거쳐 자발적인 핵형성에 필요한 대체성으로 이어집니다. 증기 확산은 결정4를성장시키는 데 가장 자주 사용되는 기술이지만 결정화 공정은 정확하게 제어할 수 없습니다8. 자유 인터페이스 확산 방법에서 결정화 용액은 농축 된 단백질 용액으로 확산되어 시스템을 매우 느리게 대체로 안내합니다. 이 방법은 느린 혼합 속도6,9,10,11,12를가진 배치 방법으로 간주 될 수있다. 배치 방법에서, 단백질은 빠르게 결정화 용액과 혼합되어 신속한 과포화를 초래하고 차례로 많은 결정3,7을가진 균일한 핵형성을 이끈다. 이 방법은 현재 단백질 데이터 뱅크에 증착된 모든 구조물의 약 1/3을 차지합니다. 투석 방법은 고품질의 잘 확산되는 단백질 결정을 재배하는 데도 사용됩니다. 투석 방법에서, 반 투과성 멤브레인을 통해 저수지로부터 침전제 확산의 분자는 단백질 용액을 가진 별도의 챔버로. 평형의 역학은 온도, 막 모공 크기 및 단백질 샘플 및 결정화 제의 부피 및 농도와 같은 다양한 요인에 의존한다6.

결정화 상 다이어그램은 단백질의 상이한 상태를 상이한 물리적 또는 화학적 가변3의함수로서 설명하기 위해 사용될 수 있다. 도 1에도시된 바와 같이, 각 결정화 기술은 이러한 다이어그램6,10,13의핵 및 메타스터블 영역에 도달하기 위해 상이한 운동 궤적을 사용하는 것으로 시각화될 수 있다. 이는 결정과 용액 사이의 열역학 평형이 관찰되는 단백질 용해도 및 단백질 농도에 대한 정보를 제공하여 핵형성 및 성장을 위한 최적의 조건을찾아3,14를제공한다. 2차원 상 다이어그램에서, 단백질 농도는 하나의 변수의 함수로 플롯되고 다른 변수는 상수15를유지한다. 이러한 위상 다이어그램에서, 단백질 농도가 용해도 곡선 이하일 때, 용액은 저포화 영역에 있으며 핵형성 이나 결정 성장이 발생하지 않는다. 이 곡선 위에는 단백질 농도가 용해도 제한3,14보다높은 미차 영역이 있다. 이것은 메타안정 영역, 자발적핵영역 및 강수영역의 세 가지 영역으로 더 나뉩니다. 메타스터블 영역에서, 중화는 핵형성이 적당한 시간 내에 발생하기에 충분하지 않지만 종자 결정의 성장이 일어날 수 있다. 집계 및 침전은 강수영역에서 선호되며, 과포화가14,15로너무 높다.

자발적인 핵형성에 대한 충분한 대체성이 달성되면, 제1핵은10이나타난다. 결정의 성장은 용해도의 한계에 도달할 때까지 단백질 농도의 감소로 이끌어 냅니다. 고용성 곡선 부근에 미숙성이 머무르는 한, 결정의 크기에 큰 변화가 없을 것입니다. 그러나 결정화 용액의 온도 및 화학 조성물의 변이(예를 들어, 침전제의 농도)는 단백질 용해도에 영향을 미치고 추가 결정 성장8,13,16의개시로 이어질 수 있음을 보여주었다.

투석이 양호한 품질의 결정 성장에 유리하기 때문에 그림 2에도시된 OptiCrys 결정화 벤치는 완전히 자동화된 방식으로 결정화를 제어하기 위해 실험실에서 설계 및 개발되었습니다8. 이를 위해 소프트웨어는 LabVIEW로 작성되어 전자 컨트롤러와 냉각기를 통해 펠티에 요소와 접촉하여 흐르는 저수지 투석 설정의 온도를 제어하고 모니터링할 수 있습니다. 동일한 소프트웨어는 또한 다중 채널 유체 시스템을 사용하여 결정화 용액(예: 결정화 제의 교환)의 화학 조성을 자동으로 조절합니다. 또한 디지털 카메라와 반전된 현미경을 사용하여 결정화 프로세스를 시각화하고 기록합니다. 15 μL 및 250 μL 부피를 가진 두 개의 결정 챔버는 다른 목적을 위해 크리스탈을 성장시키는 데 사용할 수 있습니다. 결정화 과정이 가역적이기 때문에, 샘플이 손상되지 않는 한 단백질 용액의 마이크로리터가 몇 개만 으로 상이한 조건에 대한 스크리닝이 가능하다8. 그 결과, 이 방법을 사용하면 사용되는 단백질 물질의 양을 최소화할 수 있습니다.

이전 작업8에서,결정 성장 과정에서, 현장에서 관찰을 정기적으로 수행 할 필요가 있음을 분명하다. 이들은 관찰하에 있는 사건 (강수량, 핵형성, 또는 결정 성장)에 따라 몇 초에서 며칠까지 다양할 수 있습니다.

OptiCrys를 통해 결정 성장의 최적화는 온도 침전성 농도 위상 다이어그램을 기반으로 합니다. 온도의 직접적인 기능으로서 용해도가 있는 단백질의 경우, 염염기(18)를 사용할수 있다. 이것은 단백질 침전물 상 다이어그램을 사용하여 시각화될 수 있는 용액의 이온 강도를 증가시켜 단백질의 용해도를 감소시키는 곳입니다. 마찬가지로, 역용성을 가진 단백질은 염염기18을사용할 수 있다. 핵형성은 핵형성 영역에서 발생하며, 메타안정 영역 부근에서 결정성장이 이루어지며, 단백질 농도가 용해도 한계에 도달할 때까지 위상 다이어그램의 메타안정 영역에서 결정성장이 일어난다. 도 3A에도시된 바와 같이, 일정한 화학 조성 온도로 새로운 핵형성을 방지하기 위해 메타안정 구역내결정화 용액을 유지할 수 있다. 결정은 제 2 크리스탈 /용액 평형이 달성 될 때까지 성장하고 그 후, 결정의 크기가 더 이상 증가관찰되지 않습니다. 결정이 원하는 크기에 도달할 때까지 온도가 여러 번 감소합니다. 도 3B에서,일정한 온도에서, 강수량 농도를 증가시켜 메타안정 구역내용을 유지한다. 이 과정은 큰 결정을 얻기 위해 여러 번 반복 될 수있다. 온도를 변경하고 결정화 용액 조건을 조작하여, 과포화 수준을 제어함으로써, OptiCrys5,8,14에의해 정확하고 자동으로 제어되는 결정의 핵 형성 및 성장을 분리하기위한 두 가지 강력한 도구이다.

온도 조절, 또는 온도 및 침전제 농도 제어 결정화에 의해 성장된 단백질 결정의 예뿐만 아니라 얻어진 상대적 회절 데이터는 문헌 및 PDB에서 사용할 수 있다. 그 중 인간 γ 결정린 E, PA-IIL 렉틴, 효모 무기 파이로포스파타제, 우레이트 산화효소, 인간 탄산 탄성 안수드라제 II, YchB 키나아제, 젖산 탈수소효소5,14,17,18이있다.

OptiCrys는 NatX-ray에 의해 상용화되었지만,이 악기 또는 제공하는 직렬 접근 방식에 액세스 할 수없는 많은 실험실이 있습니다. 이 기술의 대안은 다양한 볼륨으로 시판되는 플라스틱 미세 투석 버튼을 사용하는 것입니다. 이를 이용하여, 온도 및 화학 조성물은 수동으로 조정되고 변화할 수 있다. 미세 투석 버튼의 검사는 자리에서 수행 할 수 없으며 대신 광학 현미경으로 수동으로 수행해야합니다. 온도 제어는 진동이 없는 온도 제어 인큐베이터에 샘플을 유지함으로써 달성될 수 있습니다. 결정화 실험이 재현가능한지 확인하기 위해 온도를 일정하게 유지하는 것이 필수적입니다. 온도의 상당한 변화는 또한결정5의손상 또는 파괴로 이어질 수 있습니다.

여기서 우리는 중성자 단백질 결정학에 적합한 크고 고품질의 결정의 성장을 위한 시료 준비 및 제어 소프트웨어의 사용을 설명하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 단계별 절차는 생성된 결정의 크기와 품질을 제어하는 시작 위치 및 운동 경로를 선택하기 위해 결정화 상 다이어그램을 활용하도록 설계되었습니다. 또한 미세 투석 버튼이있는 커지는 결정을 위한 자세한 프로토콜이 제시되어 동일한 근거를 사용하여 크고 고품질의 결정을 얻습니다.

Protocol

1. 미세 투석 버튼투석 방법

  1. 샘플 준비
    1. 최종 농도30mg/mL-1의 용액을 얻기 위해CH3COONa 버퍼(100mM 나트륨 아세테이트, pH 4)의 1mL에서 리오필화 된 분말로 닭고기 달걀 흰자 리소지메 30 mg을 용해시켜 단백질 용액을 준비한다.
    2. 원심 분리기는 277 K에서 10 분 동안 13,000 × g에서 샘플을 원심 분리합니다. 이 프로세스는 결정화 프로세스를 시작하기 전에 모든 집계를 제거하는 데 도움이 됩니다.
    3. 280 nm에서 샘플의 흡광도를 확인하고 맥주 램버트 방정식 (A = θcl)을 사용하여 단백질 농도를 계산합니다.
      참고: 맥주-램버트 방정식에 따르면, 전자 흡광도(A)는 일정한 광학 경로길이(l, cm)를 부여한 흡수 종의 농도(c,mg·mL-1)에직접 비례한다. 이 선형 관계의 그라데이션은 어금니 소멸 계수(ε, 280nm에서 리소지메의 경우 2.64mL/mg-1·cm-1)19이다. 방향족 아미노산 (티로신, 트립토판 및 페닐알라닌)과 시스테인 잔류물 사이의 이황화 결합의 사이드 체인은 분광 허용 π 발생 ~ 280 nm에서 강한 흡수성을 가지고 - π * 전환. 단백질의 대다수가 이러한 잔류물을 포함하기 때문에, 단백질 농도는 전형적으로 멸종 계수에 대한 지식을 감안할 때 280 nm에서 흡광도를 측정하여 쉽게 계산될 수 있다.
    4. 도 4에도시된 바와 같이 결정화 솔루션을 준비한다. 결정화 용액을 준비하기 전에 0.22 μm 밀리포어 필터로 모든 스톡 솔루션을 필터링합니다.
  2. 크리스탈 성장
    1. 적절한 분자량 차단(6-8 kDa)으로 셀룰로오스 투석 막을 자르고 증류수에 담급니다.
      참고: 투석막 디스크는 미세 투석 버튼에 상용화되어 있지만 투석 튜브를 사용하는 경우 두 층의 멤브레인을 튜브에서 분리하여 단일 층 멤브레인만 가지도록 가장자리를 자르는 것을 잊지 마십시오.
    2. 도 4에표시된 것과 동일한 순서로 결정화 용액 2mL로 24웰 트레이의 웰을 채우는 다.
      참고: 볼륨이 큰 버튼(예: 200 μL)을 사용하는 경우 효율적인 교환을 위해 최소 5mL 결정화 솔루션으로 50mL 튜브를 채웁니다.
    3. 그림 5A에도시된 바와 같이 마이크로투아실 버튼의 챔버에 리소지메 용액의 피펫 35 μL을 추가한다.
      참고: 30 μL 투석 버튼에서 기포가 형성되는 것을 피하려면 5μL의 추가 단백질을 추가해야 하며, 이는 총 35μL의 단백질 시료를 의미합니다. 이 추가 단백질 샘플은 기포의 형성을 방지하는 도 5B에도시된 바와 같이 챔버 위에 약간 돔형 모양을 만듭니다.
    4. 적절한 크기의 어플리케이터를 가지고 탄성 O 링을 극단(도 5C)에놓습니다. 그런 다음 이전에 가볍게 닦아 / 투석 버튼의 챔버 위에 섬유가없는 종이 조각을 사용하여 배수 멤브레인을 놓습니다. 용지를 적용할 때 챔버에 먼지를 넣지 않도록 주의하십시오. 투석버튼(도 5C)의홈으로 어플리케이터에서 탄성 O-링을 이송하여 투석 막을 제자리에 놓는다.
      참고: 처리의 중요한 순간은 어플리케이터에서 투석 버튼의 홈으로 탄성 O 링을 전송하여 챔버 위에 투석 막을 고정하는 것입니다. 모든 움직임은 단백질 챔버의 샘플과 기포를 둘러싸는 것을 피하기 위해 완벽하게 동기화되어야합니다. 그것의 강성을 알고, 그것의 응용 프로그램 하는 동안 멤브레인의 일부를 잡고 모델 단백질과 첫 번째 테스트 실험을 수행 하는 핀셋을 사용 하 여 그것의 강성을 알고 그것의 응용 프로그램 전에 탄성 O-링을 스트레칭 연습 하는 것이 유용 하다.
    5. 핀셋(도5D)을사용하여 버튼을 우물 또는 50mL 튜브로 전송합니다.
    6. 커버슬립으로 웰을 덮고, 그리스에 부드럽게 눌러 우물을밀봉합니다(그림 5E).
      참고: 우물 위에 기름이 없는 경우 실험을 시작하기 전에 이 것을 추가하거나 유리 커버슬립 대신 테이프를 사용해야 합니다. 미세 투석 버튼을 사용하여 단백질 결정화의 원리는 도 5에도시된다.
    7. 열조절인인293K에서 샘플을 보관하십시오. 사용되는 단백질 및 결정화 조건에 따라 다른 온도가 필요할 수 있습니다.
      참고: 도 4에 도시된 결정화 조건의 동일한 그리드(침전제의 농도가 다양하도록 허용)는 온도의 함수로서 스크리니션될 수 있다. 이 경우 동일한 결정화 플레이트를 재현해야 하며 각 복사본을 다른 온도로 조절하는 인큐베이터에 배치해야 합니다. 이를 위해서는 진동이 없는 열조절인이 몇 개 있어야 합니다.
    8. 트레이 나 튜브를 확인(그림 4)각 트레이에 있는 것을 구별하기 위하여, 일반적으로 매일, 매일, 정기적으로 메모를 하십시오. 좋은 노트는 거짓 긍정적 인 결과를 피하고 결정에서 먼지를 구별하는 데 필수적입니다.

2. OptiCrys를 사용하여 크리스탈 성장 프로세스

  1. 샘플 준비
    1. 섹션 1.1에 설명된 바와 같이 단백질 용액및 투석 막을 준비한다.
    2. NaCl(4M)과 CH3COONa pH 4(1M)의 스톡 솔루션을 준비하고 50mL 튜브로 필터링합니다.
    3. 단백질 용액(30mg·mL-1을가진 리소지메 15μL)를 온도 조절 유동 저수지 투석 설정의 투석챔버에 넣습니다. 온도 제어 흐르는 저수지 투석 설정에 대한 자세한 내용은 그림 6을 참조하십시오. OptiCrys는 두 개의 투석 챔버를 가지고 있으며, 최소 부피는 15 μL이고 최대 부피는 250 μL입니다.
    4. 투석 막으로 챔버를 덮고 탄성 O 링(도 6B)으로멤브레인을 고정합니다.
      참고: 이 설정은 각 챔버가 투석 막에 의해 직접 밀봉되는 미세 투석 버튼과 다릅니다. 유동 셀에서 투석 막은 대신 오버 챔버에 고정되어 제거하지 않고 결정의 장착을 허용합니다. 이를 위해 오버챔버는 단순히 저수지에서 풀려나일 수 있습니다.
    5. 상공 을 뒤집어 투석 챔버 위에 놓습니다. 천천히 부드럽게 눌러 두 조각 사이에 갇힌 모든 공기를 제거하고 챔버(도 6C)에서거품을 피하십시오. 모델 단백질을 이용한 연습은 기포와 시료 손실을 피하기 위해 훈련할 때 유리할 수 있다.
    6. 저수지를 오버챔버 위에 부드럽게 나사로 고정하고, 다시 한 번 기포를 포획하지 않도록 염두에 두십시오. 저수지의 과다 체결은 결정화챔버(도 6D)에서기포를 형성할 수도 있다.
    7. 결정화 용액을 추가하고 밀폐 캡으로 저수지 챔버를 덮습니다. (그림6G). 저수지의 최대 부피는 1mL입니다.
    8. 이 어셈블리를 전송하여 황동 지지대에 삽입합니다. 이 지원은 온도를 제어하는 데 사용되는 Peltier 요소와 접촉합니다.
    9. 도 6에도시된 바와 같이, 밀폐캡에는 투석실의 최고 조명을 허용하는 광학 창이 장착되어 있습니다. 빛이 챔버를 통과할 수 있도록 창에 광원(도2)을놓습니다.
    10. 저수지 챔버는 펌프에 연결하여 연속 유동 셀로 작동할 수 있습니다. 도 7에도시된 바와 같이 스톡 솔루션과 증류수를 포함하는 50mL 튜브 위에 튜브를 로터리 밸브에 연결합니다.
      참고: 실험 중에 결정화 솔루션의 자동 준비 및 변경이 필요하지 않은 경우 2.1.10 단계를 생략합니다. 이 경우 결정화 용액을 준비해야 하며 저장소를 수동으로 미리 채우어야 한다.
  2. 소프트웨어
    1. 컴퓨터를 켜고 소프트웨어 크로아산 스크탤린 [크리스탈 성장]을시작합니다. 이 제어 소프트웨어는LabVIEW(http://www.ni.com/labview/)로작성되었으며 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스를 제공합니다. 그것은 포함 4 다른 그래픽 인터페이스(Accueil [환영], 파라메토리 [설정], Essai [테스트], 유지 보수 [유지 보수])(그림 8).
      참고: 프랑스어번역은 괄호안에 있습니다.
    2. 그림 8에표시된 대로 단추를 클릭하여 유지 관리 보기를 선택합니다. 이 보기는 현재 가장 자주 사용되며 사용자가 실험 중에 대부분의 매개 변수를 제어할 수 있습니다.
      참고: 유지 관리 뷰를 클릭하면 온도 또는 라이트와 같은 매개 변수를 제어하기 위한 섹션이 다른 새 창이 나타납니다. 그림 8에서 이 뷰의 다른 부분은 화살표와 프레임으로 표시됩니다. 다음 단계에서는 소프트웨어를 사용하여 각 매개 변수를 제어하는 방법을 보여 줍니다.
    3. 레굴라투르 드 템페레투르 [온도 컨트롤러] 섹션은 온도를 제어하고 모니터링할 수 있습니다. 그림 8의버튼 1(1)을 클릭하여 켭니다.
      참고: OptiCrys의 온도 범위는 233.0 ~ 353.0 ± 0.1 K입니다.
    4. 위탁 [setpoint] 섹션에 온도를 설정하고 enter기(그림8(2).. 이 단추 아래에는 2개의 추적(빨간색과 노란색)이 있는 그래프가 있습니다. 빨간색 추적은 최종(정렬된) 온도를 표시하고 노란색 추적은 현재 온도를 표시합니다. 도 8(2)에도시된 바와 같이, 온도는 20°C로 설정된다.
      참고: 크리스탈 성장 구간에서 설명한 대로 크리스탈을 성장시키기 위해서는 많은 온도를 선택해야 합니다. 온도를 변경하려면 위탁 [setpoint] 섹션에 새 온도를 각각 추가하고 키보드의 Enter 버튼을 누릅니다.
    5. 그림 8의 Lumières [조명] 섹션에서 광도를 높여 빛을 켭니다. 광도는 0에서 100까지, "0"은 빛이 꺼지고 "100"에서 빛이 강도와 밝기의 최대로 설정되어 있음을 나타냅니다. 빛을 증가시켜 현미경 섹션에서 투석실 내부에서 볼 수 있습니다. 실험 중에 셀의 밝기가 다를 수 있습니다. 매개 변수를 조정하여 투석 챔버 내부를 명확하게 시각화합니다. 또한 더 나은 보기를 위해 "줌"앞의 버튼인 +와 버튼을 사용하여 배율을 증가하거나 감소시킬 수 있습니다.
    6. 현미경 섹션의 오른쪽에는 각 결정화 실험에 대한 관련 정보를 저장하기 위한 여러 섹션이 있습니다. 각 사용자는 사용되는 투석막의 결정화 조건, 단백질 이름 및 분자량 차단에 대한 정보를 저장하는 폴더를 만들 수있다(도 8(3)..
    7. 사용자는 Nom Dossier [폴더 이름]에입력하기만 하면 실험 이름을 정의할 수 있습니다. Dossier [폴더 버튼]을 클릭하면 그림 8의녹색 프레임으로 표시됨이 새 창을 엽니다. 이 창에는 실험에 정의된 모든 정보가 포함된 텍스트 파일이 있습니다. 또한 타임스탬프가 찍힌 이미지는 향후 처리를 위해 이 폴더에 저장됩니다.
    8. NB 이미지 섹션에서 실험 중에 수행해야 하는 이미지 수를 선택합니다. 오른쪽 패널의 이미지 수를 이러한 시간 간격과 함께 지정합니다(예: 최소, 시간, 일). 그림 8은 1분 안에 0개의 이미지를 기록하는 소프트웨어 설정을 보여 주어 있다.
      참고: 폼페 [펌프] 섹션을 사용하여 스톡 솔루션을 혼합하고 결정화 솔루션을 저수지 챔버에 주입하십시오. 유체 혼합 시스템의 원리에 대한 설명은 섹션 2.1.10 및 도 7을 참조하십시오.
    9. Etape 1 [1단계]에서 주식 솔루션의 입력 농도: 솔루션 주식. 다음 섹션에서 결정화 실험을 위해 NaCl 4 M 및 CH3COONa 1 M pH 4가 사용됩니다.
      참고: 재고 솔루션의 농도는 어금니 단위로 되어 있습니다.
    10. 각 솔루션의 최종 농도를 정의합니다. 예를 들어 NaCl용 0.75M, CH3COONa pH 4의 경우 0.1 M. 최종 농도 섹션(도8)에 입력하여 2단계 [2단계]: 솔루션 à préparer [준비용액]. 그림 8에빨간색 프레임으로 표시된 계산 [계산] 버튼을 누릅니다. 혼합에 사용되는 각 스톡 솔루션의 최종 볼륨은 각 농도 패널 앞의 볼륨 패널에 표시됩니다.
    11. 랜서 프레파리션【발사 준비】 버튼(그림8)을누릅니다. 도 7에도시된 바와 같이, 로터리 밸브는 각 스톡 용액을 가져와 스위치를 통해 믹싱 튜브에 주입합니다.
    12. 결정화 용액이 준비된 후, Etape 3 [단계 3]의 Entrée 솔루션 [솔루션 입력] 버튼을 클릭합니다: 펌프 섹션의 플럭스(그림 8의노란색 프레임). 스위치는 튜브를 혼합하여 저수지 챔버로 전환하여 새로운 결정화 용액을 주입합니다. 교환 프로세스를 중지하려면 Arrêt 배포 [배포 중지] 버튼을 누릅니다.
      참고: 실험 중에 결정화 공정을 관찰하고 감독 소프트웨어의 해당 그래픽 인터페이스에서 온도, 결정화 솔루션 및 줌과 같은 매개 변수를 수정합니다. 소프트웨어를 사용하면 실험 중에 밀폐 캡이나 유동 셀을 제거할 필요가 없으므로 유일한 변수는 사용자가 소프트웨어를 통해 변경하는 변수가 됩니다.
  3. 큰 결정 성장
    1. 투석챔버(도6A)에30 mg·mL-1 농도로 리소지메 15μL을 첨가한다.
      참고: 섹션 1.1에 설명된 바와 같이 단백질 샘플을 준비합니다.
    2. 섹션 2.1 및 도 6에설명된 바와 같이 온도 조절 된 흐르는 저수지 투석 설정을 조립한다.
    3. 결정화 용액을 준비합니다. 0.22 μm 필터로 샘플 준비 전에 모든 스톡 솔루션을 필터링하는 것을 잊지 마십시오. 이 실험의 경우 결정화 용액에는 0.75 M NaCl 및 0.1 M CH3COONa pH 4가 포함되어 있습니다. 이는 2.2.10 ~ 2.2.12 섹션에 설명된 바와 같이 수동으로 또는 저수지 챔버 및 펌핑 시스템을 사용하여 첨가할 수 있다.
    4. 2.2.3 및 2.2.4 섹션에서 설명한 대로 온도를 295 K로 설정하고 이미지 8에 도시되어 있습니다. 초기 조건하에서, 투석실과 저수지 사이의 평형은 약 90분 후에 도달되고 첫 번째 눈에 보이는 핵은 22시간 후에 나타날 것이다.
    5. 결정의 크기에 더 이상 눈에 보이는 변화가 관찰될 때까지 결정이 자라도록 허용한다(도9,패널 1).
      참고: 핵형성 시간을 결정하고 결정의 크기 변화를 측정하기 위해, NB 이미지 섹션에서 시간당 각각 4 또는 3 개의 이미지인 15 또는 20 분마다 이미지를 기록합니다. 단백질 성축의 시상 관찰을 위해, 응집 및 침전 또는 결정 용해 또는 핵형성, 전형적으로 몇 초에서 몇 분 사이에 필요합니다. 그러나, 결정 성장에 대 한, 이 범위는 몇 분 에서 몇 시간 사이.
    6. 3일 후, 온도를 291K로 낮추어 크리스탈 성장을 다시 시작합니다. 온도를 일정하게 유지하고 결정이 개발하게하십시오(그림 9,패널 2). 실험의 이 단계에 대해, 2시간마다 이미지를 기록하고 10~12시간마다 결정의 크기 변화에 대해 확인하는 것으로 충분할 것이다. 결정의 크기변화가 관찰되지 않으면 실험을 계속할 수 있다.
      참고: 결정화 용액및 사용되는 단백질의 양에서 단백질 과 침전 농도에 따라 각 단계에 대한 평형에 도달하는 데 필요한 시간이 다를 수 있습니다.
    7. 온도를 288K로 줄이면 크리스탈 성장을 다시 시작하십시오. 여기에 제시된 사례의 실험 조건에서, 어느 날은 평형에 도달하기에충분하다(도 9,패널 3).
    8. 결정의 크기를 확인하고 결정이 계속 증가하는 한 일정한 온도를 유지합니다.
    9. 4일 후, 결정 성장을 다시 시작하기 위해 온도를 275K로 감소시다(그림9,패널 4).
      – 제시된 케이스의 실험 조건에서, 약 10일 후에 1차원으로 500 μm인 결정이 얻어질것이다(도 9).
  4. 크리스탈 크기 제어
    1. 2.3.1 및 2.3.2 항에 설명된 바와 같이 설정된 단백질 용액 및 온도 조절 유동 저수지 투석을 준비한다.
    2. 0.9 M NaCl 및 0.1 M CH3COONa pH 4로 결정화 솔루션을 준비합니다.
    3. 온도를 291 K로 설정하고 결정이 자랄 수 있도록 합니다. 초기 조건하에서, 첫 번째 핵형성 이벤트는 약 1시간 후에 시작되며, 수많은 결정이 3시간 동안 투석실에서 자랍니다(그림10,단계: 1 및 2). 성장 과정에서 결정의 크기를 확인하기 위해 20 분마다 이미지를 기록합니다.
      참고: 결정화 조건의 최적화는 생성된 결정의 대부분의 최종 특성을 제어하는 데 매우 중요합니다. 결정화 용액의 온도 및 화학 조성물은 균일한 크기의 결정을 용해하고 재성장하도록 변경할 수 있습니다. 또한 단백질 샘플이 이러한 실험에서 소비되지 않는다는 점에 유의해야 하며, 이는 변성되지 않는 한 시료를 재용해 두기 위한 조건이 역전될 수 있기 때문에. 온도를 변경하고 일정한 화학 적 조성을 유지하여 결정을 용해할 때 다음과 같이 실험을 계속하십시오.
    4. 결정이 291 K에서 성장하면, 이들은 더 적은, 더 큰 결정을 다시 성장하기 위해 용해 될 수있다. 313K에 도달하기 위해 20 분 이상 점차적으로 온도를 증가시다. 투석실 내부의 모든 결정을 용해하는 데 약1시간이 걸립니다(그림 10,단계: 3-5). 5~15분마다 이미지를 기록하여 용해 프로세스를 모니터링합니다.
      참고: 많은 단백질은 고온에 민감합니다. 단백질이 안정된 온도 범위 내에서 작동하여 손상/저하를 피하십시오. 단백질 용해도 외에도 온도는 완충액에 영향을 미칩니다. 예를 들어 버퍼의 pH는 특히 Tris 버퍼에서 온도와 함께 변경될 수 있습니다. 이러한 경우, 실험이 수행되는 온도에 따라 pH를 설정하는 것이 중요하다18. 또한 단백질 용해는 단백질 결정 성장에 비해 훨씬 적은 시간(몇 분에서 몇 시간)이 소요된다는 점에 유의해야합니다 (몇 시간에서 며칠까지). 일반적으로, 결정의 용해 시, 온도가 서서히 천천히 증가(짧은 총 용해 시간을 존중함), 주로 결정모사이드의 증가를 피하기 위해 결정의 부분용해의 경우. 결정이 커지면 온도가 설정된 온도(긴 총 성장 시간을 존중)로 빠르게(1분 미만)까지 감소할 수 있습니다. 이미지를 기록하여 결정화 챔버의 정기적인 모니터링은 단백질의 손상을 방지하고 연구된 각 단백질에 대한 결정의 용해 또는 성장을 위한 최적의 시간을 정의하는 데 도움이 되는 것이 좋습니다.
    5. 모든 결정이 용해된 후 온도를 295 K로 설정하여 제2 핵형성 이벤트를 개시하였다(도10,단계: 6,7). 두 번째 핵 형성 과정을 모니터링하기 위해 5분마다 이미지를 기록합니다. 이 단계에서, 첫번째 핵은 약 18 분 후에 나타납니다.
      참고: 이 온도에서 용액은 메타스터블 구역 부근의 핵형성 영역에 있을 것이다. 그 결과, 결정화 챔버에 몇 가지 핵만 나타납니다.
    6. 더 큰 결정을 성장하기 위해 섹션 2.3에 설명된 최적화 워크플로우를 반복하는 실험을 계속합니다. 도 10에 표시되는 실험의 총 지속 시간은 며칠밖에 되지 않습니다.
      참고: 핵화 단계에서 결정이 서로 다른 시간에 나타나면 결정화 챔버에서 상이한 크기의 결정이 얻어진다. 이러한 경우 온도의 증가(직접 용해도가 있는 단백질의 경우)는 더 작은 결정의 더 빨리 용해될 것입니다. 운동 성숙 효과에 따라, 여분의 단백질 (용해에서 얻은)은 더 큰 결정의 성장에 사용될 수 있습니다.
      결정화 용액의 화학 적 조성물을 변경하여 일정한 온도에서 결정을 용해할 때 다음과 같이 실험을 계속하십시오.
      또한 실험 중 결정화 용액의 화학적 조성물을 변경하여 이전에 재배한 결정을 용해하여 새로운 조건하에서 균일하게 크기의 결정의 인구를 재성장시킬 수도 있다.
    7. 전술한 바와 같이 단백질 용액(2.3.1), 온도 조절 유동 저수지 투석 설정(2.1) 및 결정화 용액(2.4.2)을 준비한다. 메타스터블 존에서 멀리 떨어진 핵형성 영역의 초기 조건하에서, 수많은 작은 결정이 결정화 챔버에 나타나고 성장하기시작합니다(도 11,단계: 1,2).
    8. 3시간 후, 결정화챔버(도 11,step: 3)에서 많은 중형 결정이 보이면 NaCl 농도(0.9M)를 점진적으로 감소하여 0에 도달한다. 이를 위해 0.1 M CH3COONa pH 4로 버퍼 용액만 을 포함하는 새로운 결정화 솔루션을 준비하십시오. 펌핑 시스템을 사용하여 저수지 챔버의 결정화 용액과 교환합니다. 2.2.10 ~ 2.2.12 단계를 수행하여 저수지 챔버에 새로운 용액을 준비하고 주입하십시오. 이 새로운 솔루션을 사용하면, 용액이 교환될 때 저수지 챔버의 최종 용액이 CH3COONa pH 4의 0.1 M 이하를 포함하지 않고 NaCl이 없을 때까지 챔버내의 NaCl 농도가 감소합니다. 10분마다 이미지를 캡처하여 용해 프로세스를 기록합니다.
    9. 결정이 완전히 용해되도록 허용합니다(그림 11,단계 : 4,5). 용해 시간은 이 실험의 경우 약 2시간입니다. 앞서 언급했듯이, 용해 시간은 단백질 시스템, 결정화 조건 및 투석 챔버 부피에 의존한다. 결정화 챔버의 정기적 인 관찰 (현미경 섹션 참조) 및 실험 중에 이미지와 노트를 기록하는 것은 필수적입니다.
    10. 챔버 내부의 모든 결정이 용해되면(도11,step: 5), 펌핑 시스템을 다시 사용하여 이전 보다 낮은 농도로 NaCl을 주입하여 새로운 결정화 용액을 준비한다(0.75 M NaCl in 0.1 M CH3COONa pH 4).
    11. 새로운 용액을 저수지 챔버에주입(도 11,단계: 6,7) 섹션 2.3에 설명된 바와 같이 결정화 성장 최적화 워크플로우를 반복한다. 더 큰 결정의 균일 한 인구가 생성됩니다. 도 11에 표시된 결과는 며칠 후에 얻어졌다.

Representative Results

섹션 2.3 및 2.4에서는 최적화된 결정 성장의 세 가지 예가 제시되어 계측기의 사용과 대형 결정 성장을 위한 실험 적 설계를 보여 주어 있습니다. 이 데모를 위해, 우리는 이 방법을 사용하여 많은 다른 단백질 시스템으로 결정 성장 실험이 성공적으로 수행되었지만 리소지메를 모델 단백질로 사용했습니다(위 참조). 여기에 제시된 프로토콜을 사용하고 마스터함으로써 다른 단백질 후보에 적응할 수 있다.

섹션 2.3에서 우리는 확립 된 합리적인 결정화 전략이 중성자 단백질 결정학을위한 충분한 산란 볼륨으로 결정 성장에 도움이 될 수 있음을 입증했습니다. 여기서, 제안된 합리적 최적화 전략은 또한 다운스트림 구조 결정 접근에 필요한 특정 크기의 결정의 균일한 인구의 생성을 허용한다는 것을 보여줍니다.

이 두 가지 실험은 결정 핵 형성 및 성장을 제어하는 위상 다이어그램의 중요성을 강조하기 위해 고안되었습니다. 여기서, 결정화 공정을 실시간으로 모니터링하는 조합으로 결정화 용액의 온도 및 화학조성의 제어는 질적 위상 다이어그램을 연구하는 데 사용된다. 이 방법을 사용하여 핵 형성 및 결정 성장은 가역적 인 방식으로 합리적으로 최적화 될 수 있습니다. 이러한 직렬 접근법을 사용하면 결정의 크기와 품질을 제어하는 데 필요한 단백질의 양과 시간이 줄어듭니다.

투석 방법에서, 단백질 용액은 반투과성 멤브레인6(도 5)에의해 결정화 용액으로부터 분리된다. 이 투석 막은 첨가제, 완충 및 이온과 같은 작은 분자가 단백질6,20과같은 거대 분자는 막을 통과하지만 막을 통과할 수 있게 한다. 이 기능을 사용하면 실험6을진행하는 동안 결정화 솔루션을 수정할 수 있습니다. 솔루션의 교환은 마이크로 투석 버튼, 또는 이러한 목적을 위해 개발 된 악기를 사용하여 자동화 된 방식으로 수동으로 수행 할 수 있습니다, OptiCrys8.

실험의 첫 번째 세트에서, 미세 투석 버튼은 닭 계란 - 흰자 리소지메의 결정화에 사용되었다. 미세 투석 버튼은 다른 염분 농도를 가진 결정화 솔루션에 침지되었습니다. 이 간단한 결정화 그리드 실험에서, 유일한 변수는 침전성 농도이며 온도는 일정하게 유지됩니다(293 K). 도 4에도시된 바와 같이, 염 농도의 약간의 변화는 관찰된 결정의 크기와 수의 변화를 유도하여 결정화 상 다이어그램의 조사를 가능하게 한다. 도 4에서,패널 1에서, 결정화 용액은 0.7 M NaCl을 포함하고 더 큰 결정의 제한된 수는 버튼에 나타났다. 염 농도를 0.7에서 1.2M로 증가시킴으로써, 핵형성 영역내의 과포화가 증가하고 용액이 메타스터블 존에서 멀리 이동한다(도4,패널 1 에서 6). 그 결과, 결정의 수가 증가하고 그 크기는 감소합니다.

온도 조절 투석 결정화를 가능하게 하는 완전 자동화된 계측기를 가진 첫번째 실험에서 OptiCrys(도 9)는, 결정 성장 실험은 큰 결정 성장을 생성하도록 조정되었다. 이 실험은 0.75 M NaCl 및 0.1 M Na 아세테이트 버퍼 pH 4를 포함하는 결정화 용액으로 295 K의 초기 온도에서 시작되었습니다. 이러한 실험 조건하에서, 결정화 용액은 위상 다이어그램의 메타안정 영역 부근의 핵형성 영역에 도달하였다(도9,화살표 1). 그 결과, 실험의 첫 번째 단계에서 는 몇 가지 핵만이 생성되었다. 선택된 결정을 더욱 성장시키기 위해(도 9에도시됨) 결정 성장 최적화 워크플로우가 결정용 평형에 도달하는 즉시 다양한 온도로 메타스터블 영역으로 구동되었다.

결정과 용액 사이의 평형에 도달할 때마다 온도가 먼저 291K로, 288K로, 마지막으로 275K로 낮아져 메타스터블 영역에서 결정화 용액을 유지했습니다. 이 실험의 결과는 거시분자 X선과 중성자 결정학 모두에 적합한 단일 대형 결정이다.

대부분의 단백질의 경우, 정확한 정량적 위상 다이어그램(또는 다만 질적 다이어그램)은 결정화 실험 동안 단백질 농도(또는 실시간으로 결정화 공정을 관찰/검출하는 것만으로) 단백질 농도를 정확하게 측정할 수 있는 실험 장치의 부족으로 인해 아직 얻어지지않았다. 그 결과, 메타스터블 영역 부근에서 위상 다이어그램의 최적 영역에서 결정화가 시작되는 방식으로 실험을 설계하는 것이 종종 불가능합니다.

따라서, 대용량 결정의 성장에 전념하는 실험이 착수되기 전에 결정화 최적화 연구가 이루어져야 한다. 본 연구에서는, 한편으로는 온도 변화(일정한 화학 조성물에서)를 사용하고 화학 조성물의 변화(일정한 온도)를 사용하여, 메타안정 영역을 식별하고 큰 결정 성장 실험을 시작하기 위한 최적의 조건을 묘사할 필요가 있다.

이를 위해, 핵형성, 결정 성장, 용해 및 재성장을 위한 OptiCrys를 사용하여 온도 제어 투석 결정화 실험의 가역성을 입증하기 위해 맞춤화된 두 가지 다른 실험이 제시되었다. 결정 성장 최적화 워크플로우는 온도 또는 침전성 농도의 변화를 사용하여 더 적은, 더 큰 리소지메 결정의 균일한 인구가 성장되도록 제어되었다.

OptiCrys를 가진 두 번째 실험에서, 결정화 용액의 화학 조성은 가변 온도를 가진 실험 전반에 걸쳐 일정하게 유지되었다(0.9 M NaCl in 0.1 MCH3COONa pH 4) 가변 온도를 가진. 초기 온도는 291 K로 설정되었습니다. 이 실험의 결과는 그림 10으로요약됩니다. 높은 과포화로 인해 결정화 챔버(도 10,패널 1 및 2)에 많은 수의 작은 결정이 나타났습니다. 직접 단백질 용해도의 개념에 따라, 온도를 313K로 점진적으로 증가시킴으로써, 모든 결정이 용해되었다(도10,패널 3, 4 및 5). 마지막으로, 온도를 295K로 낮추어, 제2 핵형성은 메타안정 영역 부근에서 개시되었고, 더 적은 수의 핵의 제어형성을 허용했다. 추가 결정 성장은 더 큰 결정의 인구의 균일 한 생성을 초래(도 10,패널 7).

도 11에도시된 바와 같이, 결정화 용액의 화학조성의 변화는, 291K의 일정한 온도에서, 마찬가지로 더 큰 결정의 균일한 집단을 얻기 위해 사용될 수 있다. 이전 실험과 마찬가지로, 초기 조건은 0.1 M CH3COONa pH 4에서 0.9 M NaCl이었다. NaCl 농도는 0.9M에서 0으로 점진적으로 낮아져 결정을 용해시켰다(도11,패널 4 및 5). 이 시점에서 NaCl은 0.1 M CH3COONa pH 4의 버퍼 솔루션으로 완전히 대체되었습니다. 염 농도를 줄이면 해법의 저포화 영역에서 용액이 유지되어 결정의 용해로 이어집니다. 이어서, 0.75 M NaCl에서 0.1 M CH3COONa pH 4에서 이온 강도가 낮은 새로운 결정화 용액을 저수지 챔버에 주입되었다. 이 침전 농도에서, 첫 번째 핵이 나타났다(도 11,패널 6) 후 90 분. 생성된 결정의 수는 이전보다 낮았고 결정이 이전보다 더 큰 부피(도11,패널 7)에 도달하였다.

Figure 1
그림 1: 회로도 상 다이어그램. 세 가지 결정화 기술에 대한 운동 궤적은 염질 아웃 정권으로 표현된다. 각 방법은 핵형성 및 결정화를 다르게 달성하며, 핵형성 및 메타안정 영역에 도달하기 위해 위상 다이어그램을 통해 상이 다른 운동 경로에 의해 시각화된다. 용해도 곡선은 저조도 및 과포화 영역을 구분합니다. 과포화는 세 가지 영역으로 나뉩니다: 메타스터마안정, 핵형성 및 침수. 핵형성 영역에서, 메타안정 구역 결정 성장이 일어나는 동안 자발적인 핵화가 발생한다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 결정화 벤치(OptiCrys)의 회로도 표현. LED 광원은 온도 조절 투석 흐름 셀 위에 있습니다. 반전된 현미경과 디지털 카메라가 빨간색 화살표로 이미지의 오른쪽 상단에 표시됩니다. 빨간색 원은 냉각기 튜브의 위치를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
도 3: 온도(A) 및 침전성 농도(B)의 함수로서 회로도 2차원 단백질 결정화 상 다이어그램. (A) 직접 용해도가 있는 단백질의 경우, 온도를 낮추면 메타스터마스터블 영역에서 결정화 용액을 유지합니다. 온도 변화는 원하는 부피를 가진 결정이 얻어질 때까지 결정 성장 과정을 제어하기 위해 여러 번 반복될 수 있다. (b) 침전액의 농도를 변경하면 결정화가 커지는 것을 위한 메타안정 구역에서 결정화 용액을 유지하는 데도 사용될 수 있다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: 투석 방법을 사용하여 얻은 리소지메의 결정. 본 실험은 0.1M 아세테이트 버퍼 pH 4에서 293 K의 일정한 온도에서 수행하였다. NaCl 농도를 0.7M에서 1.2M로 증가시켜 핵형성 속도를 증가시키고 더 많은 수의 결정을 초래한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
도 5: 투석 방법에 의한 단백질 결정화 공정의 개요. (A) 투석 버튼의 챔버에 단백질을 첨가함으로써, (B) 돔 형상이 챔버의 상단에 생성된다. (C) 어플리케이터는 투석 막을 제자리에 고정시키기 위해 투석 버튼의 홈으로 O-링을 전송하는 데 사용됩니다. (D) 투석 버튼은 저수지 용액에 침지 할 준비가되어 있습니다. (E) 결정화 용액은 반과성 멤브레인을 통과하고 결정은 챔버 내부로 형성되기 시작합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6: 온도 조절 투석 설정의 회로도. (A) 단백질 샘플은 투석 챔버에 첨가된다. (B) 투석막은 어플리케이터를 사용하여 O-링으로 실내로 고정된다. (C) 상공 챔버가 돌기및 투석 실의 상단에 고정됩니다. 흰색 화살표는 나사가 챔버에 배치되는 위치를 나타냅니다. (D) 저수지 챔버는 시계 방향으로 (E) 회전하고 상공 회의소 의 상단에 고정됩니다. (F) 저수지 챔버는 펌핑 시스템에 커넥터가 있는 밀폐 캡으로 덮여 있으며 (G) 유량 셀은 황동 지지체에 배치된다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: 유체 계(A)에 의한 저수지내 결정화 용액의 제조 및 주입. 소금과 물을 포함하는 튜브는 압력/진공 컨트롤러(B)와 로터리 밸브(C)에 연결됩니다. 압력/진공 컨트롤러는 압력을 사용하여 튜브에서 로터리 밸브로 액체의 일정한 흐름을 생성합니다. 유량계(D)를 통과하는 각 액체와 스위치는 혼합 튜브(F)에 주입된다. 모든 액체가 혼합 튜브에 추가되면 일부 수정에 의한 스위치는 혼합 튜브에서 저수지 (G)로 최종 용액을 주입합니다. 액체는 오름차순으로 표시된 다이어그램의 화살표 방향으로 시스템을 통해 흐릅니다(1에서 6). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 감독 소프트웨어의 유지 보수 보기입니다. 이 뷰는 온도, 빛, 결정화 솔루션 및 줌과 같은 다양한 매개 변수를 제어하는 데 사용됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 9
그림 9: 온도의 함수로서의 위상 다이어그램(선택한 이미지는 오름차순으로 추적되어야 합니다). 하나의 큰 리소지메 결정은 체계적으로 온도를 295 K에서 275 K로 변경하여 얻어진다. 각 단계에서 는 용해도 곡선에 도달하면 결정 성장이 중단됩니다. 메타스터블 존에 용액을 유지하여 온도를 감소시켜 결정 성장을 다시 시작합니다. 이미지는 배율의 다른 수준을 가지고있다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 10
도 10: 온도 제어를 사용하여 일정한 화학 조성에서 결정 성장의 최적화(선택된 이미지는 오름차순으로 추적되어야 한다). 메타안정 영역에서 멀리 떨어진 291 K에서 핵형성 영역에서 핵형성 공정을 시작하면 수많은 결정의 형성이 초래한다. 온도를 313 K로 늘린 다음 투석 실에서 눈에 보이는 핵이 보이지 않게 될 때까지 결정을 용해시게 됩니다. 마지막으로, 온도를 295 K로 낮추면 핵형성 공정이 두 번째로 다시 시작하여 제한된 수의 더 큰 결정으로 이어진다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 11
도 11: 침전 농도의 변화를 사용하여 일정한 온도에서 결정 성장의 최적화(선택된 이미지는 오름차순으로 추적되어야 한다). 침전수 농도를 0.9M에서 0M로 낮추면 제1 핵형성 이벤트 동안 얻어진 결정이 용해됩니다. 결정화 과정은 동일한 침전제의 주입에 의해 다시 시작되지만 낮은 이온 강도, 0.75 M로, 이는 몇 가지 더 큰 결정의 형성으로 이어진다. 이 그림은 주니우스 외에서적응된다. 8,18이그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

상이한 물리적, 화학적 및 생물학적 변수는 단백질용해도(21)에영향을 줌으로써 단백질 결정화에 영향을 미친다. 이러한 변수 중, 결정화 용액의 온도 및 화학 조성은 중성자 회절 연구를 위한 생체 거대 분자의 큰 고품질 결정을 개선하고 성장시키기 위해 투석 기술과 함께 여기에 사용된다. 위상 다이어그램에 대한 지식을 사용하여 결정화는 더욱 예측 가능하게 됩니다. 직렬 접근법에서 다른 결정화 조건의 선별도 가능하지만, 제시된 합리적 접근법을 사용하는 주요 목적은 결정 핵형성 및 성장의 역학을 분리하고 제어하는 것이다.

모든 결정화 연구와 마찬가지로 고품질순수및 균일성 단백질 샘플및 먼지가 없는 결정화 솔루션은 실험성공률을 높입니다. 솔루션의 여과 및 원심분리는 설명된 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 분자량(적절한 투석막을 선택하기 위해), 동전점 및 단백질 용해도와 같이 연구된 단백질의 물리화학적 특성을 아는 것은 최적의 결정 성장 실험의 설계에 매우 중요합니다. 또한, 샘플 손실을 방지하고 성공 가능성을 높이기 위해 다른 온도 또는 다른 화학 물질에서 단백질 안정성을 고려해야합니다. OptiCrys의 온도 범위(233.0-353.0 ± 0.1 K)를 고려할 때, 이를 사용하여 광범위한 단백질을 결정화할 수 있습니다. 그러나 열성 성 공급원의 단백질과 같이 주로 열안정성 단백질이 이 기기에서 제공하는 온도 조절 대용량 결정 성장 실험에서 가장 큰 혜택을 누릴 수 있다는 점을 강조할 가치가 있습니다.

저용량 투석실(OptiCrys를 사용할 때) 또는 미세투석 버튼을 사용하고 여러 온도 및 결정화 조건(예: 침전제 농도 또는 pH의 그리드)을 사용하여, 대사구역(핵과 메타안정 구역 간의 역학 평형)의 한계에 대한 정보를 얻을 수 있다. 이것은 결정화에 있는 새로운 단백질 후보에 대한 성공적인 결정 성장 실험을 디자인할 때 특히 귀중합니다. 이러한 정보 실험없이 는 고과포화를 가진 위상 다이어그램의 영역에서 시작하여, 메타스터블 영역의 한계로부터 너무 멀리 떨어져 결정 핵형성을 용이하게 제어할 수 있다. 단백질 침전물의 용해는 시도될 수 있지만, 예를 들어 직접적인 용해도의 경우 온도를 증가시킴으로써, 열안정성이 감소한 단백질의 경우, 샘플을 더 오랜 기간 동안 고온에서 유지하면 단백질 침전이 돌이킬 수 없게 될 수 있다. 따라서, 최선의 전략은 핵형성을 조절하고 단백질 강수량을 피할 수 있는 메타안정성의 한계 에 가까운 낮은 과포화를 가진 초기 상태를 사용하는 것으로 구성된다. 이에 따라, 결정화 전검사는 투석 챔버에서 단백질 침전을 가질 가능성을 감소시키고 실험의 성공률을 증가시킨다.

실험을 설계한 후 투석실(OptiCrys) 또는 미세투석 버튼을 준비하는 것이 또 다른 중요한 단계입니다. 투석 챔버/버튼에서 기포 형성을 방지하면 특히 소량이 사용될 때 성공적인 결정화의 가능성이 증가합니다. 투석챔버에 기포가 존재하면 결정화 과정의 운동성을 변화시키고 실험의 재현성을 감소시킬 수 있다(단백질/용액 접촉 표면이 변형되었기 때문). 단백질뿐만 아니라 결정화 용액은 실험의 성공에 영향을 미칠 수 있습니다. 각 실험 후 새로운 실험을 시작하고 튜브를 세척하고자 할 때마다 펌핑 시스템에 새로운 50mL 튜브를 사용하면 오염 의 가능성이 감소하고 장치에 소금 결정의 생성을 방지합니다.

OptiCrys를 사용할 수 없을 때 마이크로 투석 버튼의 사용은 대안입니다. 위에서 언급한 결정화 및 모니터링 결정 성장을 최적화하기 위한 전략은 수동으로 수행해야 합니다. 일반적으로 이것은 온도 조절이 설명된 방법론에서 중요한 단계일 때 문제가 될 수 있는 열조절 인큐베이터 외부에 있어야 합니다. 이는 결정화 용액의 화학적 조성을 변화시키지 못하거나, 이미징에 의한 결정 성장을 모니터링하므로, 결정 성장 공정은 실시간으로 제어될 수 없다.

위상 다이어그램에 대한 지식은 결정화 벤치인 OptiCrys를 사용하여 자동화된 방식으로 크고 고품질의 결정을 체계적으로 성장시키는 기초입니다. 결정화 시 온도, 침전성 농도 및 pH와 같은 물리화학 적 파라미터의 제어는 위상 다이어그램을 통해 잘 정의 된 운동 궤적에서 단백질 용액 평형을 이동합니다. 이것은 질량 수송을 조정하고 결정의 크기 그리고 질에 영향을 미치는 결정화 챔버에 통제된 그라데이션을 만들기 위하여 투석 막의 사용에 의해 보완됩니다. 따라서, 열역학 데이터와 운동 궤적을 모두 사용하여 고품질의 결정을 성장시키기 위해 결정화 공정을 제어하는 데 필수적이다. OptiCrys 덕분에 다차원 공간의 체계적인 위상 다이어그램은 이전보다 훨씬 적은 재료를 사용하여 직렬 접근 방식으로 연구할 수 있습니다. 이 방법론을 보여주기 위해, 우리는 여기에 모델 단백질, 닭 계란 흰자 리소지메와 사례 연구를 제공합니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하고 마스터함으로써 실제 단백질시스템에 적응할 수 있다5,14,17,18.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

MBS는 2015년 계약에 따라 LABEX VALO GRAL의 지원을 인정합니다. NJ는 CEA의 국제 박사 과정 연구 프로그램 (Irtelis)을 박사 학위 펠로우십에 대해 인정합니다. 저자는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 번호 722687에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 인정합니다. 저자는 또한 에스코 옥사넨 박사 (ESS, 룬드)와 박사 장 - 루크 페러 (IBS, 그르노블) 도움이 대화와 통찰력에 감사드립니다. IBS는 그르노블의 학제 간 연구소 (IRIG, CEA)에 통합을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

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References

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생물학 문제 169 투석 중성자 대분자 결정학 OptiCrys 위상 다이어그램 온도 제어 크리스탈 성장 단백질 용해도
중성자 대분자 결정학을 위한 결정 성장의 최적화
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Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

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