Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optimering av kristalltillväxt för neutronmakromolekylär kristallografi

Published: March 13, 2021 doi: 10.3791/61685
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1CEA, CNRS, IBS, Université Grenoble Alpes, 2ELVESYS SAS

Summary

Strukturella studier av biomacromolecules genom kristallografi kräver högkvalitativa kristaller. Här demonstrerar vi ett protokoll som kan användas av OptiCrys (ett helautomatiskt instrument utvecklat i vårt labb) och/eller mikrodialysknappar för odling av stora högkvalitativa kristaller baserat på kunskap om kristalliseringsfasdiagrammet.

Abstract

Användningen av neutronmakromolekylär kristallografi (NMX) expanderar snabbt med de flesta strukturer som fastställts under det senaste decenniet tack vare att nya NMX-strållinjer har byggts och ökad tillgång till strukturförfiningsprogram. De neutronkällor som för närvarande finns tillgängliga för NMX är dock betydligt svagare än motsvarande källor för röntgenkristallografi. Trots framsteg inom detta område kommer betydligt större kristaller alltid att krävas för neutrondiffraktionsstudier, särskilt med tendensen att studera allt större makromolekyler och komplex. Ytterligare förbättringar av metoder och instrumentering som lämpar sig för odling av större kristaller är därför nödvändiga för att användningen av NMX ska kunna expandera.

I detta arbete introducerar vi rationella strategier och en kristalltillväxtbänk (OptiCrys) utvecklad i vårt laboratorium som kombinerar realtidsobservation genom en mikroskopmonterad videokamera med exakt automatiserad kontroll av kristalliseringslösningar (t.ex. utfällningskoncentration, pH, tillsats, temperatur). Vi visar sedan hur denna kontroll av temperatur och kemisk sammansättning underlättar sökandet efter optimala kristalliseringsförhållanden med hjälp av modelllösliga proteiner. Grundlig kunskap om kristalliseringsfasdiagrammet är avgörande för att välja startposition och kinetisk väg för alla kristalliseringsexperiment. Vi visar hur ett rationellt tillvägagångssätt kan styra storleken och antalet kristaller som genereras baserat på kunskap om flerdimensionella fasdiagram.

Introduction

Att förstå proteinernas struktur-funktionsförhållande och mekanismen för fysiologiska vägar bygger ofta på att känna till väteatomers (H) positioner och hur laddning överförs inom ett protein1,2. Eftersom väteatomer sprider röntgenstrålar svagt kan deras positioner endast bestämmas med mycket högupplösta röntgendiffraktionsdata (>1 Å)3,4. Omvänt kan neutronkristallografi användas för att erhålla en exakt position av väteatomer i biologiska makromolekyler eftersom väte- och deuteriumatomer (H2, isotop av väte) har spridningslängder av ungefär samma storlek som syre, kväve och kol5. Neutronflödet från tillgängliga neutronkällor är dock svagare än för röntgenstrålar, så detta måste ofta kompenseras för2,3. Detta kan uppnås genom att byta H med H2 och/eller öka volymen av kristaller för att minska den inkonsekventa spridningen av väte och öka signal-till-brusförhållandet för diffraktionsbilder.

Det finns olika kristalliseringsmetoder (motsvarande schematiska fasdiagram visas i figur 1) för att erhålla stora kristaller av hög kvalitet för både röntgen och neutronbiomakromolekylär kristallografi6. Vid ångdiffusion jämställs en droppe som framställs av en blandning av ett protein och en kristalliseringslösning med tiden, genom avdunstning av vatten eller andra flyktiga arter, mot en reservoar som innehåller en högre koncentration av fällning av samma kristalliseringslösning. Ökningen av koncentrationen av protein och fällningsmedel i droppen leder till den övermättnad som krävs för spontan nukleation följt av kristalltillväxt vid dessakärnor 6,7. Även om ångdiffusion är den vanligaste tekniken för odling avkristaller 4,kan kristalliseringsprocessen inte kontrolleras exakt8. I den fria gränssnittsdiffusionsmetoden sprids kristalliseringslösningen till en koncentrerad proteinlösning, vilket mycket långsamt leder systemet mot övermättnad. Denna metod kan betraktas som en batchmetod med en långsam blandningshastighet6,9,10,11,12. I batchmetoden blandas proteinet snabbt med en kristalliseringslösning som leder till snabb övermättnad och i sin tur enhetlig nukleation med många kristaller3,7. Denna metod står för ungefär en tredjedel av alla strukturer som för närvarande deponeras i Protein Data Bank. Dialysmetoden används också för odling av högkvalitativa och väldriffande proteinkristaller. I dialysmetoden sprids molekyler av utfällande diffus från en reservoar genom ett halvgenomsläppligt membran i en separat kammare med proteinlösningen. Jämviktens kinetik beror på olika faktorer, såsom temperatur, membranporstorlek och volym och koncentration av proteinprover och kristalliseringsmedel6.

Kristalliseringsfasdiagram kan användas för att beskriva olika tillstånd hos ett protein som en funktion av olika fysiska eller kemiska variabel3. Som illustreras i figur 1kan varje kristalliseringsteknik visualiseras som att använda en annan kinetisk bana för att nå nukleations- och metastaserbara zoner i ett sådant diagram6,10,13. Detta ger information om proteinlöslighet och proteinkoncentrationen vid vilken en termodynamisk jämvikt mellan kristall och lösning observeras, vilket hittar de optimala förutsättningarna för nukleation och tillväxt3,14. I ett tvådimensionellt fasdiagram ritas proteinkoncentrationen som en funktion av en variabel och de andra variablerna hållskonstanta 15. I ett sådant fasdiagram, när proteinkoncentrationen ligger under löslighetskurvan, är lösningen i den undermättade regionen och ingen nukleation eller kristalltillväxt uppstår. Ovanför denna kurva ligger övermättnadszonen där proteinkoncentrationen är högre än löslighetsgränsen3,14. Detta är vidare indelat i tre regioner: den metastaserbara zonen, den spontana nukleationszonen och nederbördszonen. I den metastaserbara zonen är övermättnad inte tillräcklig för att nukleation ska ske inom rimlig tid men tillväxt av sådda kristaller kan äga rum. Aggregering och nederbörd gynnas i nederbördszonen, där övermättnaden är för hög14,15.

När tillräcklig övermättnad för spontan nukleation uppnås, kommer de första kärnorna att visas10. Tillväxten av kristaller leder till en minskning av proteinkoncentrationen tills gränsen för löslighet uppnås. Så länge övermättnaden stannar i närheten av löslighetskurvan kommer det inte att ske någon betydande förändring i kristallens storlek. Det har dock visat sig att variationer i kristalliseringslösningens temperatur och kemiska sammansättning (till exempel koncentrationen av fällningsmedel) kommer att påverka proteinlösligheten och kan leda till att ytterligare kristalltillväxt8,13,16.

Eftersom dialys är fördelaktigt för kristalltillväxt av god kvalitet, designades och utvecklades OptiCrys kristalliseringsbänk illustrerad i figur 2i vårt laboratorium för att kontrollera kristallisering på ett helautomatiskt sätt8. För detta ändamål skrevs programvara med LabVIEW som möjliggör kontroll och övervakning av temperaturen hos en flytande reservoardialysinställning i kontakt med Peltier-element, via en elektronisk styrenhet och en kylare. Samma programvara reglerar också automatiskt kristalliseringslösningens kemiska sammansättning (till exempel utbyte av kristalliseringsmedel) med hjälp av ett fluidiskt system med flera kanaler. Dessutom används en digitalkamera och ett inverterat mikroskop för att visualisera och spela in kristalliseringsprocessen. Två kristalliseringskammare med 15 μL- och 250 μL-volymer finns tillgängliga för odling av kristaller för olika ändamål. Eftersom kristalliseringsprocessen är reversibel är screening för olika förhållanden möjlig med bara några mikroliter av proteinlösningen så länge provet inte är skadat8. Som ett resultat minimerar användningen av denna metod mängden proteinmaterial som används.

Från tidigare arbete8är det uppenbart att observationer på plats under kristalltillväxtprocessen måste utföras med jämna tidsintervall. Dessa kan variera från några sekunder till flera dagar, beroende på händelsen under observation (nederbörd, nukleation eller kristalltillväxt).

Optimeringen av kristalltillväxt med OptiCrys baseras på temperaturutfällande koncentrationsfasdiagram. När det gäller proteiner med löslighet som en direkt funktion av temperaturen är det möjligt att använda utsaltningssystemet18. Det är här en ökning av lösningens joniska styrka, som kan visualiseras med hjälp av proteinutfällande fasdiagram, minskar proteints löslighet. På samma sätt kan proteiner med omvänd löslighet använda saltningssystemet18. Nukleation sker i nukleationszonen, i närheten av den metastabila zonen, och kristalltillväxt sker sedan i fasdiagrammets metastaserbara zon tills proteinkoncentrationen når löslighetsgränsen. Som visas i figur 3A, med konstant kemisk sammansättningstemperatur kan minskas för att hålla kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen för att förhindra ny nukleation. Kristaller växer tills den andra kristallen / lösningsjämvikten uppnås och därefter observeras ingen ytterligare ökning av kristallens storlek. Temperaturen sänks flera gånger tills kristallerna når önskad storlek. I figur 3B, vid konstant temperatur, håller en ökning av den utfällande koncentrationen lösningen i den metastaserbara zonen. Denna process kan sedan upprepas flera gånger för att få stora kristaller. Att ändra temperaturen och manipulera kristalliseringslösningsförhållandena, genom att kontrollera övermättnadsnivåerna, är två kraftfulla verktyg för att separera kärnor och tillväxt av kristaller som kontrolleras exakt och automatiskt av OptiCrys5,8,14.

Exempel på proteinkristaller som odlas av temperaturkontrollerad, eller temperatur- och utfällbar koncentrationsstyrd kristallisering, samt relativa diffraktionsdata som erhållits finns tillgängliga i litteraturen och PDB. Bland dem finns humant γ-kristalllin E, PA-IIL-ditin, jäst oorganiskt pyrofosfatas, uratoxidas, human kolsyra anhydras II, YchB-kinas och laktatdehydrogenas5,14,17,18.

Även om OptiCrys kommersialiserades av NatX-ray finns det många laboratorier som inte har tillgång till detta instrument eller till den seriella metoden det erbjuder. Alternativet till denna teknik är att använda kommersiellt tillgängliga mikrodialysknappar av plast med olika volymer. Med hjälp av dessa kan temperatur och kemisk sammansättning justeras och varieras manuellt. Inspektion av mikrodialysknappar kan inte göras på plats utan måste istället göras manuellt med ett optiskt mikroskop. Temperaturreglering kan uppnås genom att hålla provet i en vibrationsfri temperaturstyrd inkubator. Det är viktigt att hålla temperaturen konstant för att säkerställa att kristalliseringsexperiment är reproducerbara. Betydande temperaturvariationer kan också leda till skador eller förstörelse av kristaller5.

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll som beskriver provberedning och användning av kontrollprogramvara för tillväxt av stora kristaller av hög kvalitet som är lämpliga för neutronproteinkristallografi. Denna steg-för-steg-procedur utformades för att dra nytta av kristalliseringsfasdiagrammet för att välja en startposition och kinetisk bana för att kontrollera storleken och kvaliteten på de kristaller som genereras. Dessutom presenteras ett detaljerat protokoll för odling av kristaller med mikrodialysknappar som använder samma logik för att få stora kristaller av hög kvalitet.

Protocol

1. Dialysmetod med mikrodialysknappar

  1. Provberedning
    1. Förbered proteinlösningen genom att lösa upp 30 mg kycklingäggvit lysozyme som ett lyofiliiserat pulver i 1 ml CH3COONa-buffert (100 mM natriumacetat, pH 4) för att få en lösning med en slutlig koncentration på 30 mg·mL-1.
    2. Centrifugera provet på 13 000 × g i 10 min vid 277 K. Den här processen hjälper till att ta bort eventuella aggregat innan kristalliseringsprocessen startas.
    3. Kontrollera provets absorbans vid 280 nm och beräkna proteinkoncentrationen med hjälp av Beer-Lambert-ekvationen (A= εcl).
      OBS: Enligt Beer-Lambert-ekvationen är elektronisk absorbans (A) direkt proportionell mot koncentrationen (c, mg·mL-1)hos en absorberande art som ges en konstant optisk pathlength (l, cm). Lutningen av detta linjära förhållande är molar utrotningskoefficienten (ε, för lysozyme vid 280 nm är 2,64 mL ·mg−1·cm−1)19. Sidechains av aromatiska aminosyror (tyrosin, tryptofan och fenylalanin) och disulfidbindningar mellan cysteinrester har stark absorbans vid ~ 280 nm som härrör från spektroskopiskt tillåtna π - π * övergångar. Eftersom majoriteten av proteinerna innehåller dessa rester kan proteinkoncentrationen vanligtvis beräknas enkelt genom att mäta absorbansen vid 280 nm, med tanke på kunskapen om utrotningskoefficienten.
    4. Förbered kristalliseringslösningar enligt figur 4. Filtrera alla lagerlösningar med 0,22 μm Millipore-filter innan du förbereder kristalliseringslösningen.
  2. Kristalltillväxt
    1. Skär ett cellulosadialysmembran med lämplig molekylvikt (6-8 kDa) och blötlägg det i destillerat vatten.
      OBS: Dialysmembranskivor är kommersiellt tillgängliga för mikrodialysknappar, men om dialyssrören används, glöm inte att klippa kanterna för att separera de två skikten av membran från röret för att bara ha enskiktsmembran.
    2. Fyll brunnar på en 24-brunnsbricka med 2 ml kristalliseringslösning i samma ordning som visas i figur 4.
      OBS: Om knappar med större volymer används (t.ex. 200 μL), fyll 50 ml-rör med minst 5 ml kristalliseringslösning för att säkerställa ett effektivt utbyte.
    3. Tillsätt/pipett 35 μL lysozymelösning i mikrodialysknappens kammare enligt figur 5A.
      OBS: För att undvika bildandet av luftbubblor i en 30 μL-dialysknapp när den är stängd måste en extra volym (död volym) på 5 μL ytterligare protein tillsättas, vilket innebär totalt 35 μL proteinprov. Detta ytterligare proteinprov skapar en något kupolform ovanpå kammaren, som visas i figur 5B, vilket förhindrar bildandet av luftbubblor.
    4. Ta en applikator av lämplig storlek och placera den elastiska O-ringen i dess extremitet (figur 5C). Placera sedan membranet, som tidigare var lätt torkat/dränerat med hjälp av ett fiberfritt papper, ovanpå dialysknappens kammare. Var försiktig så att du inte lägger damm i kammaren när du applicerar papperet. Sätt dialysmembranet på plats genom att överföra den elastiska O-ringen från applikatorn till dialysknappens spår (bild 5C).
      OBS: Det kritiska hanteringsmomentet fixar dialysmembranet ovanpå kammaren genom att överföra den elastiska O-ringen från applikatorn till dialysknappens spår. Alla rörelser måste synkroniseras perfekt för att undvika omslutande luftbubblor med provet i proteinkammaren. Det är användbart att öva på att sträcka den elastiska O-ringen före dess tillämpning för att känna till dess styvhet, använda pincett för att hålla en del av membranet under appliceringen och utföra de första testexperimenten med ett modellprotein.
    5. Överför knappen till brunnen eller till 50 ml-röret med pincett(bild 5D).
    6. Täck brunnen med ett täckskydd och tryck försiktigt på fettet för att försegla brunnen (Figur 5E).
      OBS: Om det inte finns något fett ovanpå brunnarna, var noga med att lägga till detta innan du startar experimentet eller använd en bit tejp istället för glaslock. Principen om proteinkristallisering med mikrodialysknappar illustreras i figur 5.
    7. Förvara provet på 293 K i en termoreglerad inkubator. Olika temperaturer kan vara nödvändiga beroende på de protein- och kristalliseringsförhållanden som används.
      OBS: Samma rutnät av kristalliseringsförhållanden som visas i figur 4 (så att koncentrationen av utfällningsvätskan kan varieras) kan avskärmas som en temperaturfunktion. I sådana fall måste samma kristalliseringsplatta reproduceras och varje kopia placeras i en inkubator som regleras vid en annan temperatur. Detta kräver att flera vibrationsfria termoreglerade inkubatorer finns tillgängliga.
    8. Kontrollera brickan eller rören efter kristaller (figur 4) och anteckna regelbundet, vanligtvis dagligen, för att skilja vad som finns i varje bricka. Bra anteckningar är nödvändiga för att undvika falska positiva resultat och för att diskriminera damm från kristaller.

2. Kristalltillväxtprocess med OptiCrys

  1. Provberedning
    1. Bered en proteinlösning och ett dialysmembran enligt beskrivningen i avsnitt 1.
    2. Förbered lagerlösningar av NaCl (4 M) och CH3COONa pH 4 (1 M) och filtrera dem i 50 ml-rör.
    3. Tillsätt proteinlösningen (15 μL lysozym med 30 mg·mL-1)till dialyskammaren i den temperaturkontrollerade reservoardialysinställningen. Se figur 6 för detaljer om den temperaturkontrollerade reservoardialysinställningen. OptiCrys har två dialyskammare, minimivolymen är 15 μL och den maximala volymen är 250 μL.
    4. Täck överkammaren med ett dialysmembran och fixera membranet med den elastiska O-ringen (Figur 6B).
      OBS: Denna inställning skiljer sig från mikrodialysknappar där varje kammare förseglas direkt av ett dialysmembran. I flödescellen är dialysmembranet istället fastsatt på överchambern vilket gör det möjligt att montera kristaller utan att det avlägsnas. För detta ändamål kan överchambern helt enkelt skruvas av från behållaren.
    5. Vänd överkammaren och placera den ovanpå dialyskammaren. Tryck långsamt och försiktigt på den för att avlägsna all luft som fastnat mellan de två delarna och undvika bubblor i kammaren (figur 6C). Övning med ett modellprotein kan vara fördelaktigt när du tränar för att undvika luftbubblor och provförlust.
    6. Fäst behållaren i dess läge genom att försiktigt skruva den ovanpå överkammaren, återigen vara uppmärksam för att undvika att fånga luftbubblor. Överdragning av behållaren kan också bilda bubblor i kristalliseringskammaren (Figur 6D).
    7. Tillsätt kristalliseringslösningen och täck reservoarkammaren med det lufttäta locket. (Figur 6G). Behållarens maximala volym är 1 ml.
    8. Överför denna montering och sätt in den i mässingsstödet. Detta stöd är i kontakt med Peltier-element som används för att kontrollera temperaturen.
    9. Som illustreras i figur 6är det lufttäta locket utrustat med ett optiskt fönster för att möjliggöra toppbelysning av dialyskammaren. Sätt ljuskällan (bild 2) på fönstret så att ljuset kan passera genom kammaren.
    10. Reservoarkammaren kan anslutas till en pump så att den kan fungera som en kontinuerlig flödescell. Anslut slangen ovanpå de 50 ml-rör som innehåller stamlösningarna och detstillerat vatten till rotationsventilen enligt figur 7.
      OBS: Om automatisk förberedelse och byte av kristalliseringslösningar inte önskas under försöket, utelämna steg 2.1.10. I sådana fall måste kristalliseringslösningen beredas och behållaren förfylld manuellt.
  2. Programvara
    1. Slå på datorn och starta programvaran Croissance cristalline [Crystal growth]. Denna kontrollprogramvara är skriven med LabVIEW (http://www.ni.com/labview/) och erbjuder ett användarvänligt grafiskt gränssnitt. Den innehåller 4 olika grafiska gränssnitt (Accueil [Welcome], Paramétrage [Setting], Essai [Test], and Maintenance [Maintenance]) (Figur 8).
      Översättningar från franska finns inom parentes.
    2. Välj underhållsvyn genom att klicka på knappen enligt bild 8. Den här vyn är för närvarande den vanligaste och gör det möjligt för användare att styra de flesta parametrar under experimentet.
      OBS: När du har klickat på underhållsvyn visas ett nytt fönster med olika avsnitt för att styra parametrar som temperatur eller ljus. I figur 8 visas olika delar av den här vyn med pilar och ramar. I följande steg visar vi hur varje parameter styrs med hjälp av programvaran.
    3. Avsnittet Régulateur de température [Temperaturregulator] gör det möjligt att kontrollera och övervaka temperaturen. Klicka på knappen, nummer ett (1) i bild 8, för att slå på den.
      OBS: Temperaturområdet i OptiCrys är 233,0 – 353,0 ± 0,1 K.
    4. Ställ in temperaturen på avsnittet avsänd [börvärde] och tryck på enter (Bild 8(2). Under den här knappen finns ett diagram med 2 spår (rött och gult). Den röda spårningen visar den slutliga (beställda) temperaturen och den gula spårningen visar den aktuella temperaturen. Som visas i figur 8(2)är temperaturen inställd på 20 °C.
      OBS: För att odla en kristall, som förklaras i kristalltillväxtsektionen, måste många temperaturer väljas. Om du vill ändra temperaturen lägger du till varje ny temperatur i avsnittet avsänd [börvärde] och trycker på Retur-knappen på tangentbordet.
    5. Tänd lampan genom att öka ljusstyrkan från avsnittet Lumières [Lights] i figur 8. Luminositeten varierar från 0 till 100, "0" indikerar att ljuset är av och vid "100" är ljuset inställt på maximal intensitet och ljusstyrka. Genom att öka ljuset, i mikroskopsektionen, kan man se inuti dialyskammaren. Under experimentet kan ljusstyrkan i cellen variera. justera parametrarna för att tydligt visualisera inuti dialyskammaren. Förstoring kan också ökas eller minskas med knapparna + och – framför "zoom" för bättre visning.
    6. På höger sida av mikroskopsektionen finns flera avsnitt för lagring av relevant information för varje kristalliseringsexperiment. Varje användare kan skapa en mapp för att lagra information om kristalliseringsförhållanden, proteinnamn och molekylviktsavskärningen av det dialysmembran som används (figur 8(3)).
    7. Användaren kan definiera ett namn för experimentet genom att helt enkelt skriva det på Nom Dossier [Mappnamn]. Om du klickar på knappen Dossier [Mapp] (visas med en grön bildruta i bild 8)öppnas ett nytt fönster. I det här fönstret kommer det att finnas en textfil som innehåller all information som definierats för experimentet. Dessutom sparas tidsstämplade bilder i den här mappen för framtida bearbetning.
    8. I avsnittet NB-bilder väljer du antalet bilder som ska tas under experimentet. Ange antalet bilder på den högra panelen tillsammans med önskat tidsintervall mellan dessa (t.ex. min, timme, dag). Bild 8 visar programvaruinställningarna för att spela in noll bilder på en minut.
      OBS: Använd Pompe [Pump]-sektionen för att blanda stamlösningar och injicera kristalliseringslösning i reservoarkammaren. Se avsnitt 2.1.10 och figur 7 för en förklaring av principen om vätskeblandningssystemet.
    9. Inmatningskoncentrationer av lagerlösningarna i Etape 1 [Steg 1]: lösningslager. För kristalliseringsexperimentet i nästa avsnitt kommer NaCl 4 M och CH3COONa 1 M pH 4 att användas.
      OBS: Koncentrationer av stamlösningar finns i molarenheter.
    10. Definiera den slutliga koncentrationen av varje lösning. Till exempel 0,75 M för NaCl och 0,1 M för CH3COONa pH 4. Mata in dessa i det slutliga koncentrationsavsnittet (figur 8) i Etape 2 [Steg 2]: lösning à préparer [lösning att bereda]. Tryck på knappen Kalkyl [Beräkna], som visas med en röd bildruta i bild 8. Den slutliga volymen av varje stamlösning som ska användas vid blandning visas i volympanelen framför varje koncentrationspanel.
    11. Tryck på knappen Lancer préparation [Launch preparation] (Bild 8). Som illustreras i figur 7tar rotationsventilen varje lagerlösning och injicerar dem i blandningsröret via en strömbrytare.
    12. När kristalliseringslösningen har förberetts klickar du på knappen Entrélösning [Lösningsinmatning] i Etape 3 [Steg 3]: Pumpsektionens flöde (gul ram i figur 8). Strömbrytaren ändras för att injicera den nya kristalliseringslösningen från blandningsröret i reservoarkammaren. Om du vill stoppa utbytesprocessen trycker du på knappen Arrêt-distribution [DistributionStopp].
      OBSERVERA: Observera kristalliseringsprocessen under experimentet och ändra parametrar som temperatur, kristalliseringslösning och zoom, i motsvarande grafiska gränssnitt för övervakningsprogramvaran. Genom att använda programvaran finns det inget behov av att ta bort det lufttäta locket eller flödescellen under experimentet så att den enda variabeln blir den som användaren ändrar genom programvaran.
  3. Stor kristalltillväxt
    1. Tillsätt 15 μL lysozym med en koncentration på 30 mg·mL-1 till dialyskammaren (figur 6A).
      OBS: Förbered proteinprovet enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.
    2. Montera den temperaturkontrollerade reservoardialysinställningen enligt beskrivningen i avsnitt 2.1 och figur 6.
    3. Förbered kristalliseringslösningen. Glöm inte att filtrera alla lagerlösningar före provberedning med 0,22 μm filter. För detta experiment innehåller kristalliseringslösningen 0,75 M NaCl och 0,1 M CH3COONa pH 4. Detta kan läggas till manuellt eller med hjälp av reservoarkammaren och pumpsystemet enligt beskrivningen i avsnitten 2.2.10-2.2.12.
    4. Ställ in temperaturen på 295 K enligt vad som förklaras i avsnitten 2.2.3 och 2.2.4 och visas i bild 8. Under inledande förhållanden kommer jämvikten mellan dialyskammaren och behållaren att uppnås efter cirka 90 minuter och de första synliga kärnorna kommer att visas efter 22 timmar.
    5. Låt kristaller växa tills inga mer synliga förändringar i kristallens storlek observeras(figur 9,panel 1).
      OBS: För att bestämma nukleationstiden och för att mäta variationen i kristallens storlek, spela in bilder var 15 eller 20: e minut, vilket är 4 eller 3 bilder per timme i avsnittet NB-bilder. För in situ observation av protein denaturering, aggregering och nederbörd eller kristall upplösning eller nukleation, vanligtvis mellan några sekunder till några tiotals minuter krävs. Men för kristalltillväxt är detta intervall mellan några minuter och några timmar.
    6. Efter tre dagar, sänk temperaturen till 291 K för att starta om kristalltillväxten. Håll temperaturen konstant och låt kristallen utvecklas (Bild 9, panel 2). För detta skede av experimentet kommer det att räcka att spela in bilder varannan timme och kontrollera var 10 till 12 timme för eventuella förändringar i kristallens storlek. Experimentet kan fortsätta om ingen förändring av kristallens storlek observeras.
      OBS: Beroende på protein- och utfällningskoncentrationerna i kristalliseringslösningen och de volymer protein som används kan den tid som krävs för att nå jämvikten för varje steg variera.
    7. Sänk temperaturen till 288 K för att starta om kristalltillväxten. I det experimentella tillståndet i det fall som presenteras här är en dag tillräckligt för att nå jämvikt(figur 9,panel 3).
    8. Kontrollera kristallens storlek och behåll en konstant temperatur så länge kristallen fortsätter att växa.
    9. Efter 4 dagar, sänk temperaturen till 275 K för att starta om kristalltillväxten(bild 9, panel 4).
      – Under de experimentella förhållanden i det fall som presenteras kommer efter cirka 10 dagar en kristall som är 500 μm i en dimension att erhållas (figur 9).
  4. Kontrollera kristallstorleken
    1. Bered en proteinlösning och den temperaturkontrollerade flytande reservoardialysen enligt beskrivningen i avsnitten 2.3.1 och 2.3.2.
    2. Förbered kristalliseringslösningar med 0,9 M NaCl och 0,1 M CH3COONa pH 4.
    3. Ställ in temperaturen på 291 K och låt kristaller växa. Under de första förhållandena kommer den första nukleationshändelsen att starta efter cirka en timme och många kristaller kommer att växa i dialyskammaren i tre timmar (Figur 10, steg: 1 och 2). Spela in bilder var 20: e minut för att kontrollera kristallens storlek under tillväxtprocessen.
      OBS: Optimeringen av kristalliseringsförhållandena är avgörande för att kontrollera de flesta av de slutliga egenskaperna hos genererade kristaller. Temperaturen och den kemiska sammansättningen av kristalliseringslösningar kan ändras för att lösa upp och återodla kristaller av enhetlig storlek. Det bör också noteras att ett proteinprov inte konsumeras i ett sådant experiment, eftersom villkoren kan vändas för att lösa upp provet igen så länge det inte är denaturerat. När du upplöser kristaller genom att ändra temperaturen och upprätthålla konstant kemisk sammansättning, fortsätt experimentet enligt följande:
    4. När kristaller har vuxit vid 291 K kan dessa lösas upp för att åter växa färre, större kristaller. Öka temperaturen gradvis över 20 min för att nå 313 K. Det tar ungefär en timme att lösa upp alla kristaller inuti dialyskammaren (Bild 10, steg: 3-5). Spela in bilder var 5:e till 15:e minut för att övervaka upplösningsprocessen.
      OBS: Många proteiner är känsliga för höga temperaturer. Var noga med att arbeta inom temperaturområdet där proteinet är stabilt för att undvika skador/denaturering. Förutom proteinlösligheten påverkar temperaturen också buffertlösningen. Till exempel kan buffertens pH ändras med temperaturen, särskilt i Tris-bufferten. I ett sådant fall är det viktigt att ställa in pH-h beroende på temperaturen vid vilken experimentet utförs18. Det bör också noteras att proteinupplösning tar betydligt mindre tid (från några minuter till några timmar) jämfört med proteinkristalltillväxt (från några timmar till några dagar). I allmänhet, under upplösningen av kristallerna, stiger temperaturen gradvis och långsamt (med respekt för den korta totala upplösningstiden), främst vid partiell upplösning av kristallerna för att undvika ökningen av kristallmosaikiteten. När kristallerna växer kan temperaturen snabbt (på mindre än en minut) sjunka till den inställda temperaturen (med respekt för den långa totala tillväxttiden). Regelbunden övervakning av kristalliseringskammaren genom inspelning av bilder är tillrådligt för att förhindra skador på proteinet och hjälpa till att definiera den optimala tiden för upplösning eller tillväxt av kristaller för varje protein som studeras.
    5. När alla kristaller har lösts upp, ställ in temperaturen på 295 K för att initiera en andra nukleationshändelse (Bild 10, steg: 6,7). Spela in bilder var femte minut för att övervaka den andra nukleationsprocessen. I det här steget visas de första kärnorna efter cirka 18 minuter.
      OBS: Vid denna temperatur kommer lösningen att vara i nukleationszonen, i närheten av den metastaserbara zonen. Som ett resultat kommer endast ett fåtal atomkärnor att visas i kristalliseringskammaren.
    6. Fortsätt experimentet med att upprepa optimeringsarbetsflödet som beskrivs i avsnitt 2.3 för odling av större kristaller. Experimentets totala varaktighet i figur 10 är bara några dagar.
      OBS: Om kristallerna uppträder vid olika tidpunkter under nukleationsfasen erhålls kristaller av olika storlekar i kristalliseringskammaren. I sådana fall kommer temperaturökningen (när det gäller proteiner med direkt löslighet) att resultera i snabbare upplösning av de mindre kristallerna. Beroende på den kinetiska mogningseffekten kan det extra proteinet (som erhållits från upplösning) sedan användas för tillväxten av de större kristallerna.
      När du upplöser kristaller vid konstant temperatur genom att ändra kristalliseringslösningens kemiska sammansättning, fortsätt experimentet enligt följande:
      Det är också möjligt att lösa upp kristaller som odlats tidigare genom att ändra kristalliseringslösningens kemiska sammansättning under experimentet för att åter växa en population av jämnt stora kristaller under nya förhållanden.
    7. Förbered proteinlösningen (2.3.1), den temperaturkontrollerade reservoardialysinställningen (2.1) och kristalliseringslösningen (2.4.2) enligt beskrivningen ovan. Under de första förhållandena i nukleationszonen långt från den metastaserbara zonen kommer många små kristaller att dyka upp i kristalliseringskammaren och börja växa (Figur 11, steg: 1,2).
    8. Efter tre timmar, när många medelstora kristaller är synliga i kristalliseringskammaren (Bild 11, steg: 3), minska NaCl-koncentrationen (0,9 M) gradvis för att nå noll. För detta, förbered en ny kristalliseringslösning som endast innehåller buffertlösning med 0,1 M CH3COONa pH 4. Använd pumpsystemet för att byta ut det mot kristalliseringslösningen i reservoarkammaren. Följ steg 2.2.10 till 2.2.12 för beredning och injektion av en ny lösning i reservoarkammaren. Med denna nya lösning, när lösningar byts ut minskar NaCl-koncentrationen i kammaren tills den slutliga lösningen i reservoarkammaren inte innehåller mer än 0,1 M CH3COONa pH 4 och ingen NaCl. Ta bilder var 10:e minut för att spela in upplösningsprocessen.
    9. Låt kristallerna lösas upp helt (Bild 11, steg: 4,5). Upplösningstiden är cirka två timmar för detta experiment. Som tidigare nämnts är upplösningstiden beroende av proteinsystemet, kristalliseringsförhållandena och dialyskammarens volym som används. Regelbunden observation av kristalliseringskammaren (se mikroskopavsnittet) och inspelning av bilder och anteckningar under experimentet är avgörande.
    10. När alla kristaller inuti kammaren är upplösta (Bild 11, steg: 5), använd pumpsystemet igen för att förbereda en ny kristalliseringslösning genom att injicera NaCl vid en lägre koncentration än den tidigare (0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4).
    11. Injicera den nya lösningen i reservoarkammaren (Bild 11, steg: 6,7) och upprepa arbetsflödet för kristalliseringstillväxtoptimering enligt beskrivningen i avsnitt 2.3. En enhetlig population av större kristaller kommer att genereras. Resultaten i figur 11 erhölls efter några dagar.

Representative Results

I avsnitten 2.3 och 2.4 presenteras tre exempel på optimerad kristalltillväxt som visar användning av instrumentet och en experimentell design för odling av stora kristaller. För denna demonstration har vi använt lysozyme som modellprotein, även om kristalltillväxtexperiment framgångsrikt har utförts med många andra proteinsystem med denna metod (se ovan). Genom att använda och behärska protokollet som presenteras här kan man anpassa det för andra proteinkandidater.

I avsnitt 2.3 visade vi att etablerade rationella kristalliseringsstrategier kan vara till nytta för odling av kristaller med tillräckliga spridningsvolymer för neutronproteinkristallografi. Här visar vi att de föreslagna rationella optimeringsstrategierna också möjliggör generering av en enhetlig population av kristaller av någon specifik storlek som krävs för nedströms strukturbestämningsmetoder.

Dessa två experiment är utformade för att betona vikten av fasdiagram för att kontrollera kristallkärnor och tillväxt. Här används kontroll av kristalliseringslösningarnas temperatur och kemiska sammansättning i kombination med övervakning av kristalliseringsprocessen i realtid för att studera det kvalitativa fasdiagrammet. Med denna metod kan nukleation och kristalltillväxt optimeras rationellt på ett reversibelt sätt. Användning av ett sådant seriellt tillvägagångssätt minskar också mängden protein och den tid som krävs för att kontrollera kristallens storlek och kvalitet.

I dialysmetoden separeras en proteinlösning från en kristalliseringslösning med ett halvgenomsläppligtmembran 6 (figur 5). Detta dialysmembran tillåter små molekyler som tillsatser, buffert och joner att passera genom membranet men inte makromolekyler somproteiner 6,20. Med den här funktionen kan kristalliseringslösningen ändras under experimentet6. Utbyte av lösningen kan ske manuellt, till exempel i mikrodialysknappar, eller på ett automatiserat sätt med hjälp av ett instrument som utvecklats för detta ändamål, OptiCrys8.

I den första uppsättningen experiment användes mikrodialysknappar för kristallisering av kyckling äggvit lysozyme. Mikrodialysknappar var nedsänkta i kristalliseringslösningar med olika saltkoncentrationer. I detta enkla kristalliseringsnätsexperiment är den enda variabeln utfällbar koncentration medan temperaturen hålls konstant (293 K). Som visas i figur 4inducerar små variationer i saltkoncentrationen en förändring av storleken och antalet observerade kristaller, vilket möjliggör undersökning av kristalliseringsfasdiagrammet. I figur 4, panel 1, innehåller kristalliseringslösningen 0,7 M NaCl och ett begränsat antal större kristaller har dykt upp i knapparna. Genom att öka saltkoncentrationen från 0,7 till 1,2 M ökar övermättnaden och lösningen i nukleationszonen rör sig bort från den metastaserbara zonen (figur 4, panelerna 1 till 6). Som ett resultat ökar antalet kristaller och deras storlek minskar.

I det första experimentet med ett helautomatiskt instrument som möjliggör temperaturkontrollerad dialyskristallisering, OptiCrys (Figur 9), var kristalltillväxtexperimentet skräddarsytt för att generera stor kristalltillväxt. Experimentet lanserades vid en initial temperatur på 295 K med en kristalliseringslösning som innehåller 0,75 M NaCl och 0,1 M Na acetatbuffert pH 4. Under dessa experimentella förhållanden nådde kristalliseringslösningen nukleationszonen i närheten av fasdiagrammets metastaserbara zon (figur 9, pil 1). Som ett resultat genererades endast ett fåtal atomkärnor under experimentet första steget. För att odla utvalda kristaller ytterligare (visas i figur 9)drevs arbetsflödet för kristalltillväxtoptimering mot den metastaserbara zonen av varierande temperatur så snart kristalllösningens jämvikt nåddes.

Varje gång jämvikt mellan kristall och lösning nåddes sänktes temperaturen, först till 291 K, sedan till 288 K och slutligen till 275 K, för att hålla kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen. Resultatet av detta experiment är en enda stor kristall som lämpar sig för både makromolekylär röntgen och neutronkristallografi.

För de flesta proteiner har det exakta kvantitativa fasdiagrammet (eller bara ett kvalitativt diagram) ännu inte erhållits på grund av bristen på experimentella anordningar som exakt kan mäta proteinkoncentrationen (eller bara observera/upptäcka kristalliseringsprocessen i realtid) under kristalliseringsexperiment18. Som ett resultat är det ofta inte möjligt att utforma experimentet på ett sådant sätt att kristalliseringen börjar i det optimala området i fasdiagrammet, i närheten av den metastaserbara zonen.

Därför måste en kristalliseringsoptimeringsstudie äga rum innan experimentet tillägnad tillväxten av en stor volymkristall genomförs. I denna studie, med hjälp av temperaturvariationer (vid konstant kemisk sammansättning) å ena sidan och variationer i kemisk sammansättning (vid konstant temperatur) å andra sidan, är det nödvändigt att identifiera den metastaserbara zonen och att avgränsa de optimala förutsättningarna för att starta ett stort kristalltillväxtexperiment.

För detta ändamål presenteras två andra experiment som var skräddarsydda för att visa reversibiliteten hos de temperaturkontrollerade dialyskristalliseringsexperimenten med OptiCrys för nukleation, kristalltillväxt, upplösning och återväxt. Arbetsflödet för kristalltillväxtoptimering kontrollerades så att en enhetlig population av färre, större lysozymekristaller odlades, med hjälp av variation av temperatur eller utfällningskoncentration.

I det andra experimentet med OptiCrys hölls kristalliseringslösningens kemiska sammansättning konstant under hela experimentet (0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4) med variabel temperatur. Utgångstemperaturen sattes till 291 K. Resultaten av detta experiment sammanfattas i figur 10. På grund av hög övermättnad uppträdde ett stort antal små kristaller i kristalliseringskammaren (Figur 10, panelerna 1 och 2). I enlighet med begreppet direkt proteinlöslighet, genom att gradvis öka temperaturen till 313 K, löstes alla kristaller upp(figur 10,panelerna 3, 4 och 5). Slutligen, genom att sänka temperaturen till 295 K, inleddes den andra kärnan i närheten av den metastaserbara zonen och tillät kontrollerad bildning av ett lägre antal atomkärnor. Ytterligare kristalltillväxt resulterade i en enhetlig generation av en population av större kristaller(figur 10,panel 7).

Som visas i figur 11kan variation av kristalliseringslösningens kemiska sammansättning, vid en konstant temperatur av 291 K, också användas för att erhålla en enhetlig population av större kristaller. I likhet med det tidigare experimentet var det ursprungliga tillståndet 0,9 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4. NaCl-koncentrationen sänktes sedan gradvis från 0,9 M till noll för att lösa upp kristallerna(figur 11,panelerna 4 och 5). Vid denna tidpunkt ersattes NaCl helt av en buffertlösning på 0,1 M CH3COONa pH 4. Att minska saltkoncentrationen håller lösningen i fasdiagrammets undermättade zon, vilket leder till upplösning av kristallerna. Sedan injicerades en ny kristalliseringslösning med lägre jonisk styrka, vid 0,75 M NaCl i 0,1 M CH3COONa pH 4, i reservoarkammaren. Vid denna fällningskoncentration uppträdde de första kärnorna(figur 11, panel 6) efter 90 minuter. Antalet genererade kristaller var lägre och kristallerna når en större volym(bild 11,panel 7) än tidigare.

Figure 1
Bild 1: Schematiskt fasdiagram. Kinetiska banor för tre kristalliseringstekniker representeras i en saltning-out regim. Varje metod uppnår kärnor och kristallisering på olika sätt, visualiseras av en annan kinetisk väg genom fasdiagrammet för att nå nukleations- och metastaserbara zoner. Löslighetskurvan separerar undersaturerings- och övermättnadsområden. Supersaturation är indelad i tre zoner: metastaserbar, nukleation och nederbörd. I nukleationszonen sker spontan nukleation medan i den metastaserbara zonen sker kristalltillväxt. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Schematisk representation av kristalliseringsbänken (OptiCrys). LED-ljuskällan är placerad ovanpå den temperaturkontrollerade dialysflödescellen. Ett inverterat mikroskop och digitalkameran visas längst upp till höger på bilden med den röda pilen. Den röda cirkeln representerar kylslangens placering. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Schematiskt tvådimensionellt proteinkristalliseringsfasdiagram som en funktion av temperatur (A) och utfällningskoncentration (B). a) Vid ett protein med direkt löslighet håller temperatursänkningen kristalliseringslösningen i den metastaserbara zonen. Temperaturvariation kan upprepas flera gånger för att styra kristalltillväxtprocessen tills kristaller med önskad volym erhålls. (B) Ändring av koncentrationen av den utfällbara lösningen kan också användas för att hålla kristalliseringslösningen i metastaserzonen för odling av kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Kristaller av lysozym som erhålls med dialysmetoden. Detta experiment utfördes vid en konstant temperatur av 293 K i 0,1 M natriumacetatbuffert pH 4. Att öka NaCl-koncentrationen från 0,7 M till 1,2 M ökar nukleeringshastigheten och resulterar i ett större antal kristaller. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 5
Figur 5: Översikt över proteinkristalliseringsprocessen med dialysmetoden. A) Genom att tillsätta proteinet i dialysknappens kammare skapas (B) en kupolform på kammarens översida. c) En applikator används för att överföra O-ringen till dialysknappens spår för att fixera dialysmembranet på plats. (D) Dialysknappen är klar för nedsänkning i reservoarlösningen. (E) Kristalliseringslösningen passerar genom det halvgenomsläppliga membranet och kristaller börjar bildas inuti kammaren. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 6
Bild 6: Schematisk vy över den temperaturkontrollerade flytande dialysinställningen. A) Proteinprovet tillsätts dialyskammaren. B) Dialysmembranet är fastsatt på överkammaren med en O-ring med hjälp av en applikator. C) Överchambern vänds och fixeras på toppen av dialyskammaren. Vita pilar anger var skruvar placeras på överkammaren. D) Reservoarkammaren vänds medurs (E) och fixeras ovanpå överkammaren. F) Reservoarkammaren är täckt av ett lufttätt lock med kontakter till ett pumpsystem och (G) flödescellen placeras i mässingsstödet. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 7
Figur 7: Förberedelse och injektion av kristalliseringslösningen i behållaren med det fluidiska systemet (A). Rör som innehåller salt och vatten ansluts till tryck-/vakuumregulatorn (B) och till rotationsventilen (C). Genom att använda trycket skapar tryck-/vakuumregulatorn ett konstant flöde av vätskorna från rören till rotationsventilen. Varje vätska som passerar genom flödesmätaren (D) och strömbrytaren injiceras i blandningsröret (F). När alla vätskor har tillsatts blandningsröret injicerar omkopplaren genom vissa modifieringar den slutliga lösningen från blandningsröret i behållaren (G). Vätskan flödar genom systemet i pilarnas riktning i diagrammet markerat i stigande ordning (från 1 till 6). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 8
Figur 8: Underhållsvy av övervakningsprogramvaran. Den här vyn används för att styra olika parametrar som temperatur, ljus, kristalliseringslösning och zoom. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figure 9
Figur 9: Fasdiagrammet som en funktion av temperaturen (valda bilder ska spåras i stigande ordning). En enda stor lysozymekristall erhålls genom att systematiskt ändra temperaturen från 295 K till 275 K. Vid varje steg stoppas kristalltillväxten när den når löslighetskurvan. Att minska temperaturen genom att hålla lösningen i den metastaserbara zonen startar om kristalltillväxten. Bilderna har olika nivåer av förstoring. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10: Optimering av kristalltillväxt vid konstant kemisk sammansättning med hjälp av temperaturkontroll (utvalda bilder ska spåras i stigande ordning). Att starta nukleationsprocessen i nukleationszonen vid 291 K, långt från den metastaserbara zonen, resulterar i bildandet av många kristaller. Att öka temperaturen till 313 K löser sedan upp kristallerna tills inga synliga kärnor ses i dialyskammaren. Slutligen, att minska temperaturen till 295 K startar om nukleationsprocessen för andra gången vilket leder till ett begränsat antal större kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 11
Figur 11: Optimering av kristalltillväxten vid konstant temperatur med hjälp av variationer i utfällningskoncentrationen (utvalda bilder ska spåras i stigande ordning). Genom att minska den utfällande koncentrationen från 0,9 M till 0 M löses de kristaller som erhålls under den första nukleationshändelsen. Kristalliseringsprocessen startas om genom injektion av samma fällningsmedel men vid lägre jonisk styrka, 0,75 M, vilket leder till bildandet av några större kristaller. Denna siffra är anpassad från Junius et al. 8,18Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Olika fysiska, kemiska och biologiska variabler påverkar proteinkristallisering genom att påverka proteinlösligheten21. Bland dessa variabler används kristalliseringslösningens temperatur och kemiska sammansättning här i kombination med dialysteknik för att förbättra och odla stora högkvalitativa kristaller av biomacromolecules för neutrondiffraktionsstudier. Genom att använda kunskap om fasdiagram blir kristalliseringen mer förutsägbar. Även om screening av olika kristalliseringsförhållanden i ett seriellt tillvägagångssätt också är möjligt, är huvudsyftet med att använda de rationella metoder som presenteras att separera och kontrollera kinetiken av kristallkärna och tillväxt.

I likhet med alla kristalliseringsstudier ökar högkvalitativa rena och homogena proteinprover och dammfria kristalliseringslösningar experimentet. Filtrering och centrifugering av lösningar är viktiga steg i de beskrivna protokollen. Att känna till de fysikaliskkemiska egenskaperna hos de studerade proteinerna, såsom molekylvikten (för att välja lämpligt dialysmembran), är den isoelektriska punkten och proteinlösligheten avgörande för utformningen av ett optimalt kristalltillväxtexperiment. Man måste också överväga proteinstabilitet vid olika temperaturer eller med olika kemikalier för att förhindra provförlust och öka sannolikheten för framgång. Med tanke på temperaturområdet för OptiCrys (233,0–353,0 ± 0,1 K) kan ett brett spektrum av proteiner kristalliseras med hjälp av det. Men det är värt att betona att proteiner som främst är termostabila, såsom proteiner från termofila källor, skulle gynnas mest i temperaturkontrollerade kristalltillväxtexperiment med stor volym som erbjuds av detta instrument.

Med hjälp av en dialyskammare med låg volym (vid användning av OptiCrys) eller mikrodialysknappar och screening av flera temperaturer och kristalliseringsförhållanden (t.ex. rutnät med utfällningskoncentration eller pH) är det möjligt att få information om platsen för gränsen för den metastaserbara zonen (kinetisk jämvikt mellan nukleation och metastaserbara zoner). Detta är ovärderligt när man utformar ett framgångsrikt kristalltillväxtexperiment speciellt för nya proteinkandidater i kristallisering. Utan denna information kan experiment börja från ett område i fasdiagrammet med hög övermättnad, för långt från gränsen för den metastaserbara zonen för att enkelt kontrollera kristallkärnan. Även om upplösning av proteinutfällningen kan försökas, till exempel genom att öka temperaturen vid direkt löslighet, för proteiner med minskad termostabilitet, kan det göra proteinutfällningen oåterkallelig genom att hålla provet vid hög temperatur under en längre tid. Således består den bästa strategin av att använda ett initialt tillstånd med lägre övermättnad som ligger nära gränsen för metastabilitet, där nukleation kan kontrolleras och proteinutfällning undviks. I linje med detta minskar kristalliseringsförscreening chansen att ha ett proteinutfällning i dialyskammaren och ökar experimentet.

Efter att ha designat ett experiment är det ett annat viktigt steg att förbereda dialyskammare (OptiCrys) eller mikrodialysknappar. Att förhindra luftbubblabildning i dialyskammaren/knappen ökar risken för framgångsrik kristallisering, särskilt när små volymer används. Förekomsten av luftbubblor i dialyskammaren kan också förändra kristalliseringsprocessens kinetik och minska experimentet (eftersom proteinet/lösningens kontaktyta har modifierats). Inte bara protein utan också kristalliseringslösning kan påverka experimentens framgång. Att använda nya 50 ml-rör till pumpsystemet varje gång man vill starta ett nytt experiment och tvättslangar efter varje experiment minskar risken för förorening och undviker att saltkristaller skapas i apparaten.

Användningen av mikrodialysknappar är ett alternativ när OptiCrys inte är tillgängligt. De strategier för optimering av kristallisering och övervakning av kristalltillväxt som nämns ovan måste utföras manuellt. Vanligtvis kräver detta att vara utanför en termoreglerad inkubator, vilket kan vara problematiskt när temperaturreglering är ett kritiskt steg i den beskrivna metoden. Detta underlättar inte att ändra kristalliseringslösningarnas kemiska sammansättning eller övervaka kristalltillväxt genom avbildning, så kristalltillväxtprocessen kan inte kontrolleras i realtid.

Kunskap om fasdiagrammet ligger till grund för att använda kristalliseringsbänken OptiCrys för att systematiskt odla stora kristaller av hög kvalitet på ett automatiserat sätt. Kontroll av fysikalisk-kemiska parametrar som temperatur, utfällningskoncentration och pH under kristallisering flyttar proteinlösningens jämvikt i en väldefinierad kinetisk bana över fasdiagrammet. Detta kompletteras med användning av ett dialysmembran för att justera masstransporten och skapa en kontrollerad gradient i kristalliseringskammaren som påverkar kristallernas storlek och kvalitet. Därför är det viktigt att använda både termodynamiska data och kinetiska banor för att kontrollera kristalliseringsprocessen för att odla högkvalitativa kristaller. Tack vare OptiCrys kan systematiska fasdiagram i ett flerdimensionellt utrymme studeras med ett seriellt tillvägagångssätt med betydligt mindre material än tidigare. För att demonstrera denna metodik ger vi här en fallstudie med ett modellprotein, kyckling äggvita lysozyme. Genom att använda och behärska protokollet som presenteras här kan man anpassa det för riktiga proteinsystem5,14,17,18.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

MBS bekräftar stödet från LABEX VALO GRAL enligt kontraktet 2015. NJ uppmärksammar CEA:s internationella forskarutbildning (Irtelis) för forskarstipendiet. Författarna erkänner finansieringen från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-bidragsavtal nummer 722687. Författarna är också tacksamma mot Dr Esko Oksanen (ESS, Lund) och Dr Jean-Luc Ferrer (IBS, Grenoble) för hjälpsamma samtal och insikter. IBS erkänner integrationen i Grenobles tvärvetenskapliga forskningsinstitut (IRIG, CEA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 µl Dialysis Button Hampton Research HR3-330 Dialysis button
24 well plates Jena Bioscience CPL-132 Crystallization plate
2-Switch FLUIGENT 2SW001 Switch
30 μl Dialysis Button Hampton Research HR3-324 Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes Sigma-Aldrich CLS430828-500EA Centrifuge tubes
Acetic acid Sigma-Aldrich S2889 Chemical
Chicken Egg White Lysozyme Sigma-Aldrich L6876 Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO Spectrum 132478 Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO Spectrum 132650T Dialysis membrane
Microcentrifuge Eppendorf Minispin Bench-top centrifuge
Flow Unit FLUIGENT FLU-XL Flow meter
Flowboard FLUIGENT FLB Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ FLUIGENT EZ-01000002 Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters Millipore GSWP04700 0.22 μm pore size filter
M-Switch FLUIGENT MSW002 Rotary valve
Opticrys NatX-ray PRT008 Crystallization bench
Siliconized circle cover slides Hampton Research HR3-231 Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99% Sigma-Aldrich 746398 Chemical
Switchboard FLUIGENT SWB002 Switchboard
Thermoregulated incubator Memmert IPP30 Thermoregulated incubator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
  2. Snell, E. H., Van Der Woerd, M. J., Damon, M., Judge, R. A., Myles, D. A. A., Meilleur, F. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
  3. Ng, J. D., Baird, J. K., Coates, L., Garcia-Ruiz, J. M., Hodge, T. A., Huang, S. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
  4. O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
  5. Oksanen, E., Blakeley, M. P., Bonneté, F., Dauvergne, M. T., Dauvergne, F., Budayova-Spano, M. Large crystal growth by thermal control allows combined X-ray and neutron crystallographic studies to elucidate the protonation states in Aspergillus flavus urate oxidase. Journal of the Royal Society Interface. 6, (2009).
  6. Krauss, I. R., Merlino, A., Vergara, A., Sica, F. An overview of biological macromolecule crystallization. International Journal of Molecular Sciences. 14 (6), 11643-11691 (2013).
  7. Chayen, N. E. Comparative Studies of Protein Crystallization by Vapour-Diffusion and Microbatch Techniques. REVIEW Acta Cryst. , doi: 10.1107/S0907444997005374 (1998).
  8. Junius, N., Oksanen, E., Terrien, M., Berzin, C., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. A crystallization apparatus for temperaturecontrolled flow-cell dialysis with real-time visualization. Journal of Applied Crystallography. 49, 806-813 (2016).
  9. Salemme, F. R. A free interface diffusion technique for the crystallization of proteins for X-ray crystallography. Archives of Biochemistry and Biophysics. 151 (2), 533-539 (1972).
  10. Chayen, N. E., Saridakis, E. Protein crystallization: From purified protein to diffraction-quality crystal. Nature Methods. 5 (2), 147-153 (2008).
  11. Otálora, F., Gavira, J. A., Ng, J. D., García-Ruiz, J. M. Counterdiffusion methods applied to protein crystallization. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 101 (1-3), 26-37 (2009).
  12. Garciá-Ruiz, J. M. Counterdiffusion Methods for Macromolecular Crystallization. Methods in Enzymology. 368, 130-154 (2003).
  13. Budayova-Spano, M., Koruza, K., Fisher, Z. Large crystal growth for neutron protein crystallography. Methods in Enzymology. 634, 21-46 (2020).
  14. Budayova-Spano, M., Dauvergne, F., Audiffren, M., Bactivelane, T., Cusack, S. A methodology and an instrument for the temperature-controlled optimization of crystal growth. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 63 (3), 339-347 (2007).
  15. Asherie, N. Protein crystallization and phase diagrams. Methods. 34 (3), 266-272 (2004).
  16. Astier, J. P., Veesler, S. Using temperature to crystallize proteins: A mini-review. Crystal Growth and Design. 8 (12), 4215-4219 (2008).
  17. Budayova-Spano, M., et al. A preliminary neutron diffraction study of rasburicase, a recombinant urate oxidase enzyme, complexed with 8-azaxanthin. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 62 (3), 306-309 (2006).
  18. Junius, N., Vahdatahar, E., Oksanen, E., Ferrer, J. L., Budayova-Spano, M. Optimization of crystallization of biological macromolecules using dialysis combined with temperature control. Journal of Applied Crystallography. 53 (3), (2020).
  19. Grimsley, G. R., Pace, C. N. Spectrophotometric Determination of Protein Concentration. Current Protocols in Protein Science. 33 (1), 1-9 (2003).
  20. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (1), 2-20 (2014).
  21. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34 (3), 254-265 (2004).

Tags

Biologi Nummer 169 Dialys Neutron makromolekylär kristallografi OptiCrys Fasdiagram Temperaturkontroll Kristalltillväxt Proteinlöslighet
Optimering av kristalltillväxt för neutronmakromolekylär kristallografi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova … More

Vahdatahar, E., Junius, N., Budayova - Spano, M. Optimization of Crystal Growth for Neutron Macromolecular Crystallography. J. Vis. Exp. (169), e61685, doi:10.3791/61685 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter