Summary
Detta protokoll presenterar en förbättrad metod för att erhålla transienta skador hypertrofi med absorberbara sutur, simulera vänster Ventrikulärt hypertrofi minskning efter avlägsnande av tryck överbelastning. Det kan vara värdefullt för studierna om hjärtinfarkt hypertrofisk förkonditionering.
Abstract
Baserat på två gånger tvärgående aorta förträngningar (TACs) hos möss, det är bevisat att skador hypertrofisk förkonditionering (MHP) kan dämpa kardiomyocyt hypertrofi och bromsa progression till hjärtsvikt. För nybörjare är dock MHP-modellen vanligtvis ganska svår att fastställa på grund av de tekniska hindren i ventilatordrift, öppna bröstet upprepade gånger och blödning orsakad av debanding. För att underlätta denna modell, för att öka den kirurgiska framgångsgraden och minska förekomsten av blödning, bytte vi till absorberbara suturer för den första TAC-kamningen med en ventilatorfri teknik. Med hjälp av en 2-veckors absorberbar sutur visade vi att denna procedur kan orsaka betydande skador hypertrofi i 2 veckor. och 4 veckor efter kirurgi, var hjärtinfarkt hypertrofi nästan helt tillbakagång till baslinjen. Med hjälp av det här protokollet kan operatörerna enkelt bemästra MHP-modellen med en lägre driftsdödlighet.
Introduction
Skandinaviska förkonditionering är ett fenomen som inducerar korta icke-dödliga episoder av ischemi och reperfusion till hjärtat och har kapacitet att dramatiskt minska skadorskador 1. Med tanke på de uppenbara kliniska konsekvenserna av skandinaviska förkonditionering, såsom begränsning av hjärtinfarkt storlek2 och undertrycka ventrikulära takyarrhythmias efter skador revascularization3, har det funnits massor av forskning för att dissekera mekanismerna bakom cardio-skyddande effekter framkallas genom att förkonditionera4,5. Däremot har andra icke-ischemiska typer av förkonditionering fått relativt lite uppmärksamhet. Hjärthypertrofi kan vara trubbigt hos patienter med aorta stenos genomgår aorta ventil ersätter6. Varhelst tillståndet för patologiska hjärtinfarkt hypertrofi finns, rapporteras principen om förkonditionering sällan.
År 1991 etablerade Rockman et al. först en musmodell av vänster ventrikulär hypertrofi genom tvärgående aortaförträngning (TAC)7. Genom att använda TAC två gånger hos möss har vi tidigare bevisat att hjärtinfarkt hypertrofisk förkonditionering (MHP) leder till övergående hypertrofisk stimulering i hjärtat och därmed gör hjärtat mer motståndskraftigt mot ihållande hypertrofisk stress iframtiden 8. Egenskaperna hos MHP-modellen har validerats genom ultraljud biomikroskop och hemodynamic bedömning9. Viktiga punkter för att konstruera modellen var att utföra thoracotomi tre gånger, TAC i en vecka, debanding i en vecka och sekundär TAC i 6 veckor. Debanding kan dock orsaka blödning, vilket gjorde det svårt att behärskas av nybörjare och svårt att bli populariserad. Dessutom är det också en teknisk utmaning att intubera möss. Felaktig intubering kan orsaka trakeal skada, pneumothorax, och även död hos möss. Så det är nödvändigt och värdefullt att förbättra vissa procedurer samtidigt som MHP-modellen konstrueras.
För att minska svårigheten med modellen och öka dess framgång bytte vi till absorberbara suturer för den första TAC och övervakade modellens framgång genom att mäta tryckgradienten över den aortaförträngningen under ekokardiografi10. Baserat på vårt preliminära experiment skulle det vara svårt att inducera tillräcklig hjärtinfarkt hypertrofi hos möss med för lågtrycksgradient, medan möss med för högtrycksgradient skulle utveckla akut hjärtsvikt eller till och med dö. Den idealiska tryckgradienten för modellen sträcker sig från 40–80 mmHg11. Dessutom var detta experiment inte beroende av en ventilator, vilket effektivt kunde undvika ventilator-tillhörande teknisk manipulation och skada12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av försöksdjur som offentliggjorts av US National Institutes of Health (NIH-publikation nr 85-23, reviderad 1996). C57BL/6J hanmöss (8–10 veckor, 20–25 g) tillhandahölls av Animal Center of South Medical University.
1. Preoperativ förberedelse
- Nyp av spetsen på en 25 G nål med en nålhållare och trubba den med ett hårt föremål som hållaren.
- Passera en 5–0 absorberbar sutur genom nålen och vrid den sedan till 90° med enhållare 13.
OBS: Enligt olika forskningsändamål kan utredare välja absorberbara linjer med olika absorptionstid. I detta protokoll använde vi en 2-veckors absorberbar sutur för att begränsa aortabågen. - Böj ytterligare 25 G nål till 120° och jämna ut spetsen med en hållare som ska användas som distans i ligatursteget.
OBS: En 25 G nål användes som distans för möss med kroppsvikt (BW) >25 g. Använd en 26 G nål för möss med 19–24 g BW. - Desinficera den operativa platsen med 75% alkohol.
- Justera värmedynans temperatur till 37 °C.
- Förbered steriliserade kirurgiska instrument (inklusive 1 oftalmisk sax, 1 mikrosax, 2 mikrokirurgiska armbågs pincett, 1 nålhållare och 1 mikronålhållare).
2. Induktion av anestesi och rakning
- Söv en mus genom intraperitoneal injektion av en blandning av xyzin (5 mg/kg) och ketamin (100 mg/kg) utspädd i saltlösning (0,9% NaCl). Bekräfta fullständig bedövning med den negativa pedaluttagsreflexen.
- Håll musen i supine position genom att fästa snedställningarna med en sutur och fixa benen med tejp.
- Applicera depilatory cream för att ta bort hår på nacken och xiphoid. Desinficera området med jod följt av 75% alkohol.
3. Kirurgi
- Gör ett snitt över 10 mm i mittlinjen mellan supra-sternal hack och bröst med en skalpell. Separera sedan huden och den ytliga fascian.
- Identifiera det första interkostala utrymmet genom att räkna revbenen från bröstvinkeln. Utför snittet i det första interkostala utrymmet och så nära bröstbenet som möjligt. Penetrera det rakt ut med armbågs pincett för att öppna detta utrymme.
- Separera försiktigt parenkymen och tymusen tills den tvärgående aortabågen är synlig.
OBS: Skada inte parietal pleura för att undvika lungkollaps. - Passera den absorberande suturen 5–0 under aortabågen mellan den brachiocephaliska artären och den vänstra gemensamma halspulsådern med enspärrnål 14. Se till att brachiocephalic gatan, den vänstra gemensamma halsartären och den vänstra subclavian gatan är synliga i driftfältet.
- Placera distansen, förberedd i steg 1.3, på den tvärgående aortan och utför en dubbelknut på distansen med suturen i steg 3.4.
OBS: Distansens spets måste vara trubbig för att undvika att skada den tvärgående aortan när den tas bort. - Ta bort distansen snabbt men försiktigt och skär sedan suturens ändar.
- Stäng det första interkostala utrymmet och huden med 5–0 nylonsuturer. Desinficera huden igen med 75% alkohol.
- Placera musen på värmedynan för att främja återhämtning. Injicera buprenorfin (0, 1 mg/kg, q12h) intraperitoneally under de första 3 dagarna efter operationen.
- Sätt tillbaka musen i buret i ett 12 h ljust /mörkt cykelrum när det återfår medvetandet.
- Utför skenkirurgi som är identisk med alla ovanstående steg men utan förträngning (steg 3.5).
- Utför kirurgi för silkessuturgruppen, identisk med alla ovanstående steg men med en 5-0 silkessutur i steg 1.2.
4. Ekokardiografisk bedömning av framgångsrik ligatur och mätningar
- Utför ekokardiografisk bedömning dag (D) 7 efter operationen.
- Söv musen med 3% isofluran genom inandning för induktion och 1,5% för att bibehålla anestesidjupet, med en syreflödeshastighet på 0,5–1 L/min.
- Placera musen i överläge på plattformen, bibehållen vid 37 °C, och tejpa fast dess lemmar på elektroden.
- Ta bort brösthåret med en depilatorisk kräm och applicera ultraljudskopplingsmedel på musens bröstkorg.
- Utvärdera tvärgående aortaförträngning med en 30 MHz-sond.
- Luta plattformen längst till vänster. Håll sonden i vertikalt läge och sänk den på bröstet längs höger parasternal linje. Manipulera sedan X-axeln och Y-axeln under B-läge tills aortabågen är tydligt synlig.
- Leta reda på förträngningen med B-läge för att få aortabågenvy 11. Använd färgdropparläget och den pulsade vågen för att mäta toppflödeshastigheten och välj möss med en hastighet på mer än 3 000 mm/s som TAC-grupp (värdena baseras på preliminära experiment).
- Beräkna tryckgradienten enligt den modifierade versionen av Bernoullis ekvation11:
tryckgradient = 4 x Vmax2.
OBS: Den idealiska tryckgradienten för tvärgående aortaförträngningsmodell sträcker sig från 40–80 mmHg11. - Spara data och bilder med Cine Store och Frame Store.
- Utvärdera dimensioner och kontraktilitet för vänster ventrikulär (LV) med en 30 MHz sond.
- Återställ plattformen till horisontellt läge. Håll sonden på 30° moturs i förhållande till vänster parasternal linje.
- Använd B-läge och manipulera X och Y för att få en tydlig och hellång axelvy av hjärtat.
- Tryck på M-läge för att visa indikatorlinjen. Hämta bilder med Cine Store och Frame Store för senare mätning av LV-kammarens dimension, fraktionerad förkortning och LV-väggtjocklek.
- När du är klar, stoppa isofluraninandning och låt musen återhämta sig från anestesi. Sätt sedan tillbaka djuret i sin bur i ett 12 h ljust / mörkt cykelrum.
- På D14 och D28 efter operationen, upprepa ovanstående steg för att mäta hjärtparametrarna och skörda sedan hjärtat för histologiska studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denna studie delade vi slumpmässigt in 45 möss i tre grupper, sham, silkes suturgruppen och den absorberbara suturgruppen (antalet av varje grupp på D0 (baslinje), D14 och D28 efter TAC var 15, 10 och 5, respektive). På D7, D14, D21 och D28 efter operationen bestämdes den trängda topphastigheten av ekokardiografi. Vi fann att blodflödets hastighet vid förträngningen fortfarande var större än 3 000 mm/s under den andra veckan efter TAC även om en absorberbar sutur hade använts för att begränsa aortabågen (figur 1A). Dessutom bibehölls tryckgradienten vid förträngningen av den absorberbara suturgruppen över 40 mmHg på 2 veckor(figur 1B). Intressant nog fanns det ingen förträngning under den fjärde veckan efter operationen, vilket tyder på att den absorberbara suturen hade absorberats helt.
Vi fann också att den vänstra Ventrikulärt bakre väggen tjocklek vid slutet-diastole ökade och vänster Ventrikulärt inre diameter vid slutet-diastole minskade något på D14 efter TAC (Figur 2A-C). Det är intressant att den vänstra ventrikulära bakre väggtjockleken vid änddiastolen i den absorberbara suturgruppen återgått väsentligt på D28 efter TAC, som inte hade någon signifikant skillnad från utgångsvärdet. Dessutom påverkade användningen av absorberbar sutur för att göra modellen inte utmatningsfraktionen av den vänstra ventrikeln (figur 2D).
HW / BW-förhållandet mellan silkes suturgruppen och den absorberbara suturgruppen hade ökat med 30% jämfört med sham-gruppen. På D28 efter TAC återgått hjärtinfarkt hypertrofi och förhållandet föll tillbaka till baslinjenivån (figur 3A) i den absorberbara suturgruppen, medan förhållandet ökade med 64% i silkes suturgruppen. Resultaten av H&E-färgning stödde också hjärthypertrofi (figur 3B). Sammanfattningsvis var absorberbar sutur lämplig för att orsaka transient patologiska hypertrofi stimulering, som uppfyllde kraven i den myokard hypertrofa förkonditionering modellen.
Kvantitativa data har presenterats som den genomsnittliga ± SD. Jämförelser mellan bluffen, silkessuturen och den absorberbara suturen utfördes med enkelvägs ANOVA följt av Bonferronis post-hoc.
Figur 1: Dopplerbilder med pulserad våg och resultat av förträngningens topphastighet och tryckgradient. På D0 (baslinje), D7, D14, D21 och D28 efter TAC med silkes sutur eller absorberbar sutur mättes kolorektal arch eller förträngningen av en pulsad våg Doppler. (A) Representativ avbildning av topphastigheten på D0 (baslinjen), D14 och D28 efter operation i silkessuturgruppen och den absorberbara suturgruppen. Blodflödet hastighet av absorberbara sutur gruppen återvände till baslinjen medan hastigheten på silk suture gruppen var fortfarande större än 3,000 mm/s på D28 efter kirurgi. (B) Tryckgradienten beräknades enligt den modifierade Bernoullis ekvation: tryckgradient = 4 x Vmax2 (V= maximal topphastighet). *: p < 0.05 vs sham. #: p < 0,05 vs silkessuturgruppen (antalet i varje grupp på D0 (baslinje), D14 och D28 efter ATT TAC var 15, 10 respektive 5). Data som presenteras som ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Vänster ventrikulära parametrar för struktur och systolisk funktion. (A) M-lägesavbildning från vänster ventrikel (LV) i silkes suturgruppen och den absorberbara suturgruppen på D0 (baslinjen), D14 och D28 efter TAC. Den representativa bilden av LV väggtjocklek vid slutet-diastole var ca 0,70 mm (D0) till 1.089 mm (D28) i silkes sutur gruppen. När det gäller den absorberbara suturgruppen var väggtjockleken ca 0,658 mm (D28), som återvände nästan till baslinjen. B)Vänster ventrikulär bakre väggtjocklek vid änddiastol (LVPWd). C)Vänster ventrikulär innerdiameter vid änddiastol (LVIDd). D)Vänster ventrikulär utmatningsfraktion (EF). *: p < 0,05 vs bluffen samtidigt (antalet i varje grupp på D0 (baslinje), D14 och D28 efter TAC var 15, 10 respektive 5). Data som presenteras som ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Reversibel hjärthypertrofi i modellen av hjärtinfarkt hypertrofisk förkonditionering. A)Förhållandet mellan hjärtvikt (HW) och kroppsvikt (BW). B)Histologiska skivor av hjärta färgade med H&E (skalstång = 50 μm). Kardiomyocyter i silkes sutur gruppen utvidgades avsevärt från D14 till D28 medan storleken på celler mestadels regressed på D28 i absorberbara sutur gruppen. *: p < 0,05 vs bluffen samtidigt (antalet i varje grupp på D0 (baslinje), D14 och D28 efter TAC var 15, 10 respektive 5). Data som presenteras som ± SD. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns fortfarande ett mycket underutforskat område i hjärt icke-skandinaviska förkonditionering. Baserat på våra tidigare studier bytte vi till att använda absorberbara suturer för att förbättra den kortikala hypertrofa förkonditioneringsmodellen.
I tidigare rapporter använde många utredare silkes sutur för att begränsa aortabågen8,14,15. Silk sutur var lätt tillgängliga och användes ofta för kirurgiska sår sutur, vävnad ligatur och vävnad fixering. I detta protokoll ersatte vi silkessutur med absorberbar sutur för den första TAC. Vi fann att blodflödet hastighet i förträngningen fortfarande nådde 3,000 mm/s eller mer och varade i 2 veckor, vilket var tillräckligt för att fungera som en långsiktig hypertrofisk stimulering. Sedan skulle den återgå till baslinjen på D28. Det är dock svårt att kontrollera absorptionstiden för absorberbara suturer. Tiden för absorption är relaterad till materialet och partiet av absorberbar sutur, anpassningsförmåga hos vävnader och täthet vid förträngning. Vi fann tidigare att hårdare förträngning, mindre är absorptionstiden, men samtidigt skulle dödligheten hos möss öka. Därför valde vi topphastighet vid ca 3 000 mm/s som standard, så att absorptionstiden kunde kontrolleras inom 2 veckor och överlevnadsgraden för möss också kunde ökas. En mer signifikant punkt var att användningen av absorberbara suturer kunde minska bröstöppningstiderna till två gånger, vilket minskade svårigheten vid operationen och ökade modellens framgångsgrad.
En ventilator krävs vanligtvis för livsuppehållande av möss under operationen. Det rapporteras att aortabåge av möss kan vara trängd utan ventilator med suprasternal fossa approach15. Detta krävde dock att mössens bröstben klipptes, vilket kan förlänga den kirurgiska återhämtningstiden. I denna studie valde vi detta tillvägagångssätt: förträngning av det första interkostala utrymmet nära bröstbenet, för att utföra operationen. Detta var en minimalt invasiv strategi via laterala thoracotomy14. Överraskande kunde vi utföra TAC utan ventilator om snittet var så nära bröstbenet som möjligt. Detta tillvägagångssätt skulle också effektivt kunna undvika ventilator-tillhörande teknisk manipulation och skada12. Dessutom, att komma in i mediastinum av möss via snittet, visades aorta arch tydligt eftersom det fanns nästan ingen interferens med thymic vävnader och andra blodkärl i det kirurgiska fältet.
Även om det är bekvämt att inte använda en ventilator under hela operationen, medför den förbättrade metoden fortfarande risken för lungkollaps orsakad av pleuraskada. Det finns några förslag, som kan vara användbara för att undvika att skada lungsäcken. Trubba nålens spets så mycket som möjligt. Efter att ha kommit in i mediastinum, håll spetsen på armbågs pincetterna så vertikala som möjligt under hela operationen. Under ligaturen placerar du distansen i mediastinum längs den främre medianlinjen.
Sammanfattningsvis förbättrade vi en musmodell av hjärtinfarkt hypertrofi och regression med hjälp av absorberbara suturer, som kan ha många potentiella tillämpningar för att fastställa modellen av skador hypertrofisk förkonditionering, utforska mekanismen för hypertrofi regression och undersöka tiden för vänster Ventrikulärt reversibel ombyggnad, och så vidare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (81770271; till Y, Liao), de gemensamma fonderna för National Natural Science Foundation of China (U1908205; till Y, Liao) och de kommunala planeringsprojekten för vetenskaplig teknik i Guangzhou (201804020083; till Dr Liao).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Absorbable suture (5-0) | Shandong Kang Lida Medical Products Co., Ltd | 5-0 | Ligation |
| Animal ultrasound system VEVO2100 | Visual Sonic | VEVO2100 | Echocardiography |
| Cold light illuminator | Olympus | ILD-2 | Light |
| Heat pad- thermostatic surgical system (ALC-HTP-S1) | SHANGHAI ALCOTT BIOTECH CO | ALC-HTP-S1 | Heating |
| Isoflurane | RWD life science | R510-22 | Inhalant anaesthesia |
| Matrx VIP 3000 Isofurane Vaporizer | Midmark Corporation | VIP 3000 | Anesthetization |
| Medical nylon suture (5-0) | Ningbo Medical Needle Co. | 5-0 | Close the skin |
| Pentobarbital sodium salt | Merck | 25MG | Anesthetization |
| Precision electronic balance | Denver Instrument | TB-114 | Weighing sensor |
| Self-made spacer | 25-gauge needle | ||
| Silk suture (5-0) | Yangzhou Yuankang Medical Devices Co., Ltd. | 5-0 | Ligation |
| Small animal microsurgery equipment | Napox | MA-65 | Surgical instruments |
| Transmission Gel | Guang Gong pai | 250ML | Echocardiography |
| Veet hair removal cream | Reckitt Benchiser | RQ/B 33 Type 2 | Remove hair of mice |
| Vertical automatic electrothermal pressure steam sterilizer | Hefei Huatai Medical Equipment Co. | LX-B50L | Auto clean the surgical instruments |
References
- Murry, C. E., Jennings, R. B., Reimer, K. A. Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation. 74 (5), 1124-1136 (1986).
- Ban, K., et al. Phosphatidylinositol 3-kinase gamma is a critical mediator of myocardial ischemic and adenosine-mediated preconditioning. Circulation Research. 103 (6), 643-653 (2008).
- Wu, Z. K., Iivainen, T., Pehkonen, E., Laurikka, J., Tarkka, M. R. Ischemic preconditioning suppresses ventricular tachyarrhythmias after myocardial revascularization. Circulation. 106 (24), 3091-3096 (2002).
- Hausenloy, D. J., Yellon, D. M. Preconditioning and postconditioning: underlying mechanisms and clinical application. Atherosclerosis. 204 (2), 334-341 (2009).
- Heusch, G. Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning. Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).
- Lund, O., Emmertsen, K., Dorup, I., Jensen, F. T., Flo, C. Regression of left ventricular hypertrophy during 10 years after valve replacement for aortic stenosis is related to the preoperative risk profile. European Heart Journal. 24 (15), 1437-1446 (2003).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proceedings of the National Academy of Sciiences of the United States of America. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Wei, X., et al. Myocardial hypertrophic preconditioning attenuates cardiomyocyte hypertrophy and slows progression to heart failure through upregulation of S100A8/A9. Circulation. 131 (17), 1506-1517 (2015).
- Huang, J., et al. Ultrasound biomicroscopy validation of a murine model of cardiac hypertrophic preconditioning: comparison with a hemodynamic assessment. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 313 (1), 138-148 (2017).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circulation Research. 98 (6), 837-845 (2006).
- Li, L., et al. Assessment of cardiac morphological and functional changes in mouse model of transverse aortic constriction by echocardiographic imaging. Journal of Visualized Experiments. (112), e54101 (2016).
- Veldhuizen, R. A., Slutsky, A. S., Joseph, M., McCaig, L. Effects of mechanical ventilation of isolated mouse lungs on surfactant and inflammatory cytokines. The European Respiratory Journal. 17 (3), 488-494 (2001).
- Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. Journal of Visualized Experiments. (147), e59431 (2019).
- Eichhorn, L., et al. A closed-chest model to induce transverse aortic constriction in mice. Journal of Visualized Experiments. (134), e57397 (2018).
- Tavakoli, R., Nemska, S., Jamshidi, P., Gassmann, M., Frossard, N. Technique of minimally invasive transverse aortic constriction in mice for induction of left ventricular hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (127), e56231 (2017).
