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Bioengineering

이더말 미세칼로리메트리를 사용하여 새로운 천연 제품의 박테리시달 또는 박테리오정성 효과를 결정하는 대사 프로파일링

doi: 10.3791/61703 Published: October 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

새로운 항생제의 행동 모드의 해명은 약물 발견 과정에서 도전적인 작업입니다. 여기에 설명된 방법의 목표는 약물-미생물 상호 작용에 대한 추가적인 통찰력을 제공하기 위해 항균 프로파일링에서 calScreener를 사용하여 이더스말 미세칼량의 적용입니다.

Abstract

항균 저항상승의 글로벌 위협으로 인해 새로운 항생제가 절실히 필요합니다. 우리는 이러한 새로운 화합물의 혁신적인 소스로 Myxobacteria에서 천연 제품을 조사. 프로세스의 한 병목 현상은 일반적으로 행동 모드의 해명입니다. 우리는 최근에 일상적인 프로파일링 파이프 라인의 일환으로 이더실 미세 종량제 측정을 설립했습니다. 이 기술은 바이오매스 형성에서 분리되는 프로세스를 포함하여 총 세균 대사 반응에 대한 항생제 노출의 효과를 조사할 수 있게 합니다. 중요한 것은, 박테리오정성 및 박유병 효과는 측정 중에 사용자 개입 없이 쉽게 구별할 수 있다. 그러나, 이소성 미세탈량법은 다소 새로운 접근법이며 이 방법을 상이한 세균종에 적용하는 것은 일반적으로 적합한 측정 조건의 사전 평가를 필요로 한다. 특정 박테리아의 몇 가지 참조 열화상이 있다, 크게 결과의 해석을 촉진. 기준 데이터 풀이 꾸준히 증가함에 따라, 우리는 방법론이 미래에 점점 더 큰 영향을 미칠 것으로 예상하고 항생제 클래스의 차별화를 가능하게 하는 심층 지문 분석을 허용할 것으로 기대합니다.

Introduction

이 방법의 목적은 새로운 항균 화합물의 행동 모드 (MoA) 프로파일링에서 중간 처리량 분석으로 이더실 미세 칼량법 (IMC)을 적용하는 것입니다. 이 방법은 세균성 종에 대한 화합물의 활성에 관한 데이터를 밝히고 화합물 자체의 살균 또는 박테리오정성 특성에 대한 정보를 제공한다.

신흥 항균 저항(AMR)의 상승은 세계적인 문제이며 알려진 항생제1을가진 일반적인 감염의 덜 효과적인 처리로 이어집니다. 그러나, 새로운 화합물 및 알려진된 항생제와 함께 작동 할 수 있는 약물에 대 한 검색 진행 중이며이것은 다양 한 접근에 내장 되어. 천연 제품은 현재 약물 발견 캠페인, 특히 항 감염 약물 발견2의핵심 플레이어입니다. 그러나, 항생제 발달을 위한 새로운 지도 구조물을 확인하는 것은 길고 재정적으로 까다로운 프로세스3입니다. 따라서 발견의 초기 단계는 이미 초기 단계에 있는 대부분의 유망한 비계를 필터링하기 위해 매우 중요합니다. 천연 제품 약물 발견의 초기 단계는 화합물의 구조를 획득, MoA 및 대상 식별과 함께 시험관 내 활성을 결정하는 것을 포함한다. 추가 개발을 받을 자격이 있는 가장 성공적인 화합물은 유리한 활동 스펙트럼(즉, 항균의 경우 광범위한 스펙트럼 활동)과 기존 AMR을 극복할 수 있는 새로운 MoA를 표시해야 합니다. 유망한 발판은 전형적으로 생체 생체 이용률, 독성 및 신진 대사4를포함하는 이차 적인 애약에서 스크리밍됩니다. 재정적 인 문제 외에도 천연 제품 약물 발견은 복합 격리 및 정화와 관련된 비용 및 기술적 어려움에 관한 추가 과제에 직면하고 있으며, 이는 차례로 발견 과정의 초기 단계에서 다중 밀리그램 또는 그램 양을 얻기 가 어려울 수 있습니다5,,6. 따라서, 새로운 천연 제품을 임상 전 개발에 접근할 수 있도록 추가 투자에 대한 정보에 입각한 결정을 내리기 위해 최소한의 화합물 양으로 최첨단 1차 검진을 수행할 수 있도록 천연 제품 연구에서 가장 중요합니다. 항균 프로파일링을 위해 IMC를 사용하면 표준 방법에 비해 필요한 화합물의 양이 현저히 감소합니다. 이 기술은 또한 미생물공동체7과의신약의 상호 작용에 관한 보다 심층적인 정보를 제공한다.

IMC는 생물학적 시스템의 모든 생물학적, 물리적 및 생화학 적 과정 및 반응의 결과로 총 에너지를 측정하는 잘 확립 된 방법입니다. 세균성 에너지 방출은 총 대사반응에비례8. 사용된 마이크로칼로리미터와 같은 폐쇄된 시스템 내에서, 열수준은 마이크로와트 범위에서 측정되어 박테리아9,,10,,11,,12의대사 역학을 연구할 수 있다. 박테리아에 의해 방출되는 열 (에너지)는 그들의 물질 대사의 기초가 되는 세포 기능에 연결되고 그 반드시 세포 biomass에 비례하지 않습니다.

처음에, 미생물 분석학을 위한 isothermal 열량의 적용성은 낮은 처리량 및 높은 시험 부피 때문에 제한되었습니다. 그러나, 사용된 마이크로칼로리미터는 이더스말 열량계의 장점을 처리량 증가 및 낮은 화합물 요구 사항과 결합하여 약물 발견 응용프로그램(10)에유용한 도구입니다. 또한, 이 계측기는 600nm(OD&600)에서 광학 밀도의 측정을 기반으로 하는 표준 탁도 방법과 같은 세균600성장 운동학을 측정하는 대체 방법에 비해 추가적인 이점을 제공한다. OD600을 측정하는 것은 증가된 광학 밀도가 미생물 성장과 동일하다는 가정에 기초하여, 따라서 실행 불가능한 세포의 존재를 소홀히 한다. 이 방법은 또한 작은 식민지 변이체및 persister cells(11)를배제하기 때문에 비판을 받고 있다. 대조적으로, IMC는 실행 가능한 세포의 모든 모형의 실시간 관찰을 허용합니다. 세포가 휴면 상태인 경우, 그들은 여전히 대사 활성을 나타내며 IMC에 의해 검출될 수 있으며, 이러한 현상은 표준 탁도법(11)에의해 검출될 수 없다. IMC의 다른 장점은 샘플7을파괴하지 않고 복잡한 지역 사회에서 약물 상호 작용을 측정하고 표준 분석 방법을 측정, 짧은 항균 감수성 테스트 시간을 포함한다.

IMC 기술은 미생물학에서 열발생 및 암 생물학,13,,14,15,16,,17에이르는 광범위한 연구에서 구현되었다., 미생물 응용 프로그램은 다양한 세균균에 대한 화합물의 최소 억제 농도 (MIC)의 결정을 포함한다. 여러 연구가 수행되었으며 대부분의 세균종에 대한 이더스말 열량에서 얻은 MIC 데이터가 더 빨리 얻을 수 있으며 결과는,MIC결정(12,18,19)에대한 다른 (표준) 방법에 비해 유사하다는 결론을 내렸다., IMC의 추가 응용 프로그램은바이오필름(11)과같은 복잡한 세균공동체와 약물의 상호작용과 약물의 조합을 관찰하는 것을 포함한다. MoA 프로파일링에 초점을 맞춘 연구는 마이크로칼로이미터가 1세대 및 2세대 세팔로스포린의 차이를 감지할 수 있는 반면, 동일한 MoA를 가진 다른 항생제는 서로 유사한 열 흐름 곡선을 나타내고있는 반면, 18.

여기에서는 새로운 비다른 미세 탈량계 계측기를 사용하여 새로운 천연 제품의 MoA 프로파일링을 위한 IMC의 사용을 설명합니다. 이 방법은 효과적인 항생제 농도를 결정하고 살균 또는 박테리오정성 메커니즘의 관점에서 항생제의 특성을 설명하는 데 사용됩니다. 이 방법은 화합물의 MoA 프로파일링에서 광범위하게 구현될 수 있으며 표준 미생물 방법을 대체하거나 적어도 보완할 수 있습니다. 향후 연구에는 표적 메커니즘에 따라 항생제 클래스의 분화를 가능하게 하는 심층 지문 분석이 포함됩니다.

Protocol

참고: 계측기 온도는 시스템의 안정성을 보장하기 위해 적어도 하루 전에 사용되는 박테리아에 따라 설정해야합니다. 여기서, 아신토박터 바우마니 DSM30008 샘플은 30°C에서 실행된다.

1. 문화 준비

  1. CASO 한천 판에 조사 중인 변형(여기: A. baumannii)을펼치고 30°C의 정적 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
  2. MHB(뮬러-힌튼 국물)의 단일 식민지를 접종하여 하룻밤 문화를 준비하고 30°C에서 180rpm에 흔들리는 인큐베이터에 배양한다.

2. 샘플 준비

  1. 1.5mL 튜브를 사용하여 선택된 약물 또는 화합물의 농도 범위를 준비합니다(예: DMSO에 100배 스톡 솔루션의 1.5 μL을 추가하여; 단계 2.3 참조).
  2. MHB 배지에서 하룻밤 문화를 희석시.
    1. 600 nm의 파장에서 분광계를 사용하여 야간 배양의 광학 밀도를 측정합니다.
    2. 배양을 희석하여 신선한 MHB 배지에서 5 x 105 콜로니 형성 유닛(CFU)/mL을 얻습니다. 하나의 OD600은 약 5 x 108 CFU/mL(예: 에슈리치아 대장균, 황색포도상구균, A. baumannii)와같습니다.
      참고: 적용된 배양 조건 하에서 각 개별 세균 균주에 대해 전환인자 OD600에서 CFU/mL로 보정하는 것이 중요합니다.
  3. 2.1 단계에서 준비된 시험관에 세포의 150 μL을 추가하여 테스트 된 약물 또는 화합물의 정확한 최종 농도를 보장하고 최종 세포 농도를 수정합니다.
  4. 화합물을 세포와 혼합하여 소용돌이를 가합니다.
    참고 : 샘플 플레이트 (재료의 표참조) 각각 8 개의 우물, 총 48 웰을 포함하는 여섯 행이 있습니다; 행 A와 행 F는 열역학 참조입니다. 따라서, 어떤 샘플도 그 우물에로드 할 수 없습니다, 해당 미디어는 그 우물에로드됩니다. B-E 행의 우물을 사용하여 실행당 32개의 테스트 샘플을 측정할 수 있습니다. 개별 테스트 샘플은 최소한 중복으로 실행되어야 합니다(여기: 모든 샘플은 트리플리케이트로 실행되었습니다). 성장 컨트롤을 포함해야 합니다.

3. 삽입 준비

  1. 2.4단계에서 제조된 혼합물에서 플라스틱 인서츠로 120 μL을 옮김한다.
    참고: 3.1 단계에서 역파이프를 사용하여 액체가 플라스틱 인서트 측면에 분사되는 것을 방지하여 올바른 신호 판독을 방해할 수 있습니다.
  2. 모든 티타늄 바이알을 핀셋으로 홀더에 넣습니다(재료 참조).
  3. 홀더 플레이트의 티타늄 바이알에 인서트를 부드럽게 전달합니다.
  4. 티타늄 뚜껑을 모든 티타늄 바이알에 느슨하게 놓습니다.

4. 인서드 로딩

  1. 티타늄 컵으로 홀더를 샘플 스테이션으로 옮기고 지정된 구역에 배치합니다.
  2. 40cNm 힘으로 설정된 토크 렌치를 사용하여 모든 뚜껑을 조입니다.

5. 샘플 실행

  1. calView 소프트웨어에서 새로운 실험을시작합니다(추가 그림 1).
  2. 계측기에서 샘플 삽입 암을 철회합니다.
  3. 컵 홀더를 "브리지"에 놓고, 샘플 삽입 개구부를 향한 열 8을 지정한 "위치 1"에서 컵 홀더를 악기에 부드럽게 밀어 넣습니다. 시스템이 안정화될 때까지 10분 간 기다립니다. 실험용 우물에 라벨을 지정합니다.
  4. 컵 홀더가 지정된 "위치 2"에 될 때까지 샘플 삽입 팔을 밀어 넣습니다. 시스템이 안정화될 때까지 20분 간 기다립니다.
  5. 샘플 삽입 암을 "위치 3"로 밀어 "실행 위치"에 있을 때까지 샘플 삽입 암을 철회합니다. 소프트웨어의 모든 우물을 강조하고 반응 시작 (보충 도 4)을선택합니다.
  6. 열 방출 판독이 0으로 안정적으로 돌아올 때까지 실험을 실행합니다.
    참고: 모든 우물이 이 단계 내에서 유사한 작동하는지 확인합니다. 보충 도 5는 우물이 올바르게 로드되면 관찰해야 할 내용을 보여 줍니다. 잘못 로드된 경우 5.2-5.4단계를 반복합니다.

6. 컵 홀더 제거

  1. 소프트웨어에서 정지(보충 도 6)를선택합니다. 그런 다음 소프트웨어는 "확실하다"고 묻고 (보충 도 7)를선택하고 데이터 분석을 위해 드라이브 또는 데스크톱에 실험을 저장합니다(보충 도 8).
  2. 샘플 삽입 암을 기기에 완전히 삽입하고 자석을 사용하여 컵 홀더를 검색합니다.
  3. 뚜껑을 풀고, 유리 홀더에 인서트와 유리 홀더를 제거하고 180 °C에서 4 시간 동안 배치한 다음 유리와 뚜껑을 건조기에 배치하여 뚜껑과 바이알이 건조하도록하십시오.

7. 데이터 분석

  1. 소프트웨어열기(보충도 9)왼쪽 위 모서리에서 열린 실험을 선택합니다(보충도도 10). 팝업 창에서 관심의 실험을 선택하고 열기(보충 도 11)를누릅니다. 응용 프로그램은 기본 우물 보기(보충 도 12)에서실험을 엽니 다.
  2. 모든 또는 Ctrl+A(보충 그림 13)를 선택합니다.
  3. 기준선 정의를누르면 이 매개 변수는 각 위치에서 데이터를 정규화합니다(추가도 14). 팝업 창에서 지연 단계에 위치한 >30분의 기간을 선택합니다(열 흐름은 0과 10 μW 사이로 낮아야 한다; 보충 도 15). 기본 선 기간을 선택하면 선택한 기준선이 열람에 녹색으로 표시됩니다. 기준선 정의 단면 창을 닫습니다.
  4. 저장 또는 Ctrl +S를 누르고 소프트웨어를 닫습니다(보충 그림 16).
  5. 웹 기반 Symcel Calorimetry 분석 응용 프로그램(https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/)을 엽니다.
  6. 열량 분석 응용 프로그램에 파일을 업로드하려면, 탐색(보충 도 17)을눌러, 실험을 선택하고 열기를 누릅니다 (보충 도 18). 대사 매개 변수는 웹 응용분야(보충 도 19)에서32개의 샘플에 대해 자동으로 계산됩니다.
  7. Gompertz 및/또는 Richard의 성장 모델에 열 흐름 데이터에 맞게 성장 기능을 클릭합니다. 성장 모델에 맞는 섹션 "누적"에 표시됩니다, 또한 섹션 "흐름"(보충도 20)의원시 데이터와 비교.
  8. 계산된 모든 매개 변수를 다운로드하려면 다운로드 측정값을누릅니다. 파일 위치를 선택하고 저장(추가 그림 21)을누릅니다. 추가 계산을 위해 파일을 스프레드시트로 내보낼 것입니다.

Representative Results

열 신호를 기록하기 위해 기기에 열을 생성하는 박테리아의 충분한 수가 필요합니다. 열 흐름이 감지될 때까지 시간이 지연되면 박테리아가 검출 한계 를 초과하여 열 신호를 아직 생성하지 않는다는 것을 의미한다. 따라서 세균성 시료로부터 방출된 열의 검출은 세균 성장을 포함한 세균 활성 증가와 직접적으로 관련이 있다. 세균성장 및 기타 대사활동은 항균제의 첨가에 의해 강하게 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 조사 중인 새로운 천연 제품이 질충성 또는 박테리오정성 효과 또는 두 MoA의 조합을 발휘하는지 여부를 결정하기 위해, 우리는 작은 참조 약물 세트를 선택했으며 실험에서 얻은 데이터를 천연 제품과 비교한 열사진을 기록했습니다. 선택된 항생제의 효능에 기초하여 미생물 희석에 의해 결정되는 최소 억제 농도(MIC)를 닫는 농도의 범위가 선택되었다.

Ciprofloxacin은 세균성 DNA 자이라제와 토포이솜라기 IV를 표적으로 하고 결과적으로, 그것은 bactericidal MoA를 전시합니다. 그러나, ciprofloxacin에 의해 유도된 세균성 살인은 농도에 의존적이고 불충분한 농도로 투약될 때 또한 박테리오성효과(21)를가질 수 있다. 테트라사이클린과 클로람페니콜은 각각 30S 및 50S 서브유닛에서 리보솜을 표적으로 하고, 단백질 합성22,,23의억제로 인한 세균성 작용한다. 리팜피신은 DNA 의존성 RNA 폴리머라아제를 억제함으로써작용하며, 24개투여용량에 따라 박테리시달과 박테리오정성 효과를 모두 가질 수 있다. 우리가 여기에서 조사하고 있는 천연 제품은 Myxobacteria에서 분리되고 그람 음성 및 그람 양성 세균성 병원체에 대하여 강력한 활동을 보여주었습니다. 그것의 MoA 와 분자 표적을 조사하는 동안, 우리는 새로운 천연 제품이 bactericidal 및/또는 박테리오정효과를 발휘하는지 여부 및 처리된 Acinetobacter baumannii의 열 프로파일이 위에서 언급한 참조 약으로 취급된 박테리아에서 열화상과 유사한지 여부를 결정하는 데 관심이 있었습니다.

A. baumannii DSM-30008을 직렬 희석시 시프로플로삭신에 노출시킴으로써 얻은 열화상은 도 1A에표시됩니다. 0.005 μM과 0.1 μM 사이의 농도는 A. baumannii의 성장과 신진 대사에 최소한의 영향을 미칩니다. 그러나, 0.5 μM ciprofloxacin로 세포를 취급하는 것은 지연 단계 지속시간 및 낮은 최대 열 흐름에 있는 중요한 교대로 이끌어 냅니다. 이 두 가지 변화는 함께 피크(그림 1C)에영향을 미치며 약 6 시간 증가합니다. 도 1B에서누적 방출 열은 시간에 대해 플롯됩니다. 여기서는 경사경사에 의해 반사되는 농도의 효과를 볼 수 있습니다. 써모그램의 경사면의 정량화는 도 1D에표시된 시프로플로삭신의 존재시 A. baumannii의 최대 대사 율을 제공하며, 여기서 우리는 0.5 μM ciprofloxacin으로 치료된 세포의 대사속도의 수반적 감소를 관찰할 수 있다. 낮은 농도로 치료 하는 세포의 신진 대사 속도의 변화는 최소한의. 이러한 실험은 0.1-1 μM 범위를 포함하는 중간 농도의 첨가에 의해 더욱 개선될 수 있고, 이는 효과가 없는 농도와 농도 사이의 점진적변화를 관찰하여 지연단계와 대사속도의 유의한 지연을 초래한다. 그러나 변화의 경향은 시프로플로신의 살균 모A를 지원합니다.

Figure 1A
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Figure 1B
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Figure 1C
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Figure 1D
그림 1D: A. baumannii DSM-30008 성장과 신진 대사에 시프로플로신의 효과. (A)열흐름(μW) 대 시간(h)으로 도시된 열그램(WT) A. 바우마니 DSM-30008, 비처리 및 시프로클로사신에 노출된다. (B)누적 열(mJ) vs. 시간(h). (C)오류 막대(표준 편차)로 피크(h)까지의 시간입니다. (D)오류 막대(표준 편차)가 있는 대사속도(μW). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

테트라사이클린의 경우, 8시간 후에 시작되는 후기 기하급수상까지 테스트된 모든 농도에 대한 열화상에 대한 유의한 변화를 관찰하지 않았다(그림 2A참조). 그럼에도 불구하고, 5 μM 및 10 μM 테트라사이클린으로 처리된 A. baumannii에 대해 두 번째 열 흐름피크가 현저히 낮아지는 고정상 열 방출에서 큰 변화가 관찰된다. 낮은 농도뿐만 아니라 효과가 있었다, 그러나 덜 발음했다. 이 효과도 그림 2C에표시된 대로 시간의 연장이 최고조에 달하게 됩니다. 누적 방출 열곡선(도 2B)은처리되지 않은 세포가 전체 곡선 모양에 상당한 차이를 보이지 않지만 경향에 따라 곡선의 경사가 더 높은 농도의 테트라사이클린에서 감소한다는 것을 보여준다. 이는 또한 도 2D에표시되는 정량화된 대사율로 변환되며, 여기서 농도 의존성 효과(즉, 항생 농도 증가시 대사율의 감소)가 관찰된다. 이 사실 인정은 테트라사이클린이 박테리오정성 효력이 있다는 사실을 지원합니다.

Figure 2A
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Figure 2B
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그림 2D: A. baumannii DSM-30008 성장 및 신진 대사에 테트라사이클린의 효과. (A)열흐름(μW) 대 시간(h)으로 도시된 열그램(WT) A. 바우마니 DSM-30008, 비처리 및 테트라사이클린에 노출된다. (B)누적 열(mJ) vs. 시간(h). (C)오류 막대(표준 편차)로 피크(h)까지의 시간입니다. (D)오류 막대(표준 편차)가 있는 대사속도(μW). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

50S 리보소말 서브유닛을 대상으로 하는 단백질 합성 억제제 클로람페니콜로 A. baumannii를 치료할 때 더욱 뚜렷한 효과를 관찰할 수 있다. 클로람페니콜의 농도 증가에 노출하면 정지된 단계에서 대사 활성의 지연 단계 및 대사 활동의 중요한 변화가 연장됩니다(도3A도 3B). 가장 낮은 시험 농도에 대한 신진 대사 속도의 변화는 관찰되지 않으며 선택된 가장 높은 시험 농도(50 μM)는 시료의 대부분의 에너지 방출을 방지합니다. 중간 시험 농도(5μM 및 10 μM)를 살펴보면, 피크 시간은 약 8-9시간(도3C)에의해 크게 증가한다. 동시에, 처리된 세포의 신진대사율은 50μM가 치명적입니다(도3D)와함께 현저하게 감소된다. 전반적으로, 최대 10 μM 클로람페니콜 농도에서 관찰된 변화는 이 항생제 클래스의 세균성 효과와 일치한다.

Figure 3A
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그림 3D: A. baumannii DSM-30008 성장 및 신진 대사에 클로람페니콜의 효과. (A)열흐름(μW) 대 시간(h)으로 도시된 열그램(WT) A. 바우마니 DSM-30008, 비처리 및 클로람페니콜에 노출된다. (B)누적 열(mJ) vs. 시간(h). (C)오류 막대(표준 편차)로 피크(h)까지의 시간입니다. (D)오류 막대(표준 편차)가 있는 대사속도(μW). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

선택된 농도 범위에서 리팜피신 치료는 지연 단계 지속 시간 및 후기 정지 단계까지 성장에 미치는 영향과 관련된 A. baumannii DSM-30008의 열화상에 극적인 영향을미친다(도 4A). 열 방출의 유의한 감소는 신진 대사 활동의 감소와 함께 가는 도 4B에서 볼 수 있습니다. 도 4C도 4D는 고정된 단계에서 대사 활성의 지연 단계 및 변화의 연장의 영향을 예시한다. 도 4C는 사용되는 모든 농도에 대해 피크에 대한 시간의 명확한 증가를 나타낸다. 도 4D는 일반적으로 bactericidal 효과에 기인하는 모든 농도에 대한 경사의 감소에 기인하는 신진 대사 속도의 감소를 보여줍니다. 세균 세포의 항생제 유도 된 살인으로 인해, 신진 대사 활성 존재 활성 박테리아의 작은 수로 인해 낮은 것으로 예상 된다. 수집된 데이터는 리팜피신이 살균및 세균성 행동을 할 수 있다는 사실에 동의하며, 여기에 제시된 데이터는 주로 선택한 농도의 살균 효과를 지원합니다.

Figure 4A
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Figure 4B
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Figure 4C
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그림 4D: A. baumannii DSM-30008 성장 및 신진 대사에 리팜피신의 효과. (A)열흐름(μW) 대 시간(h)으로 도시된 열그램(WT) A. 바우마니 DSM-30008, 비처리 및 리팜피신에 노출된다. (B)누적 열(mJ) vs. 시간(h). (C)오류 막대(표준 편차)로 피크(h)까지의 시간입니다. (D)오류 막대(표준 편차)가 있는 대사속도(μW). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

천연물 항생제(0.25 μM)의 가장 낮은 시험 농도는 A. baumannii DSM-30008의 열람에 미미한 영향을 전혀 또는 전혀 없다. 그러나, 다른 시험된 농도는 지연 단계 지속에 어느 정도 영향을 미치고, 후기 고정단계(그림 5A)까지의성장에 영향을 미친다. 가장 명백한 효과는 고정 단계에서 열 방출의 상당한 감소입니다. 도 5B에 표시된 데이터는 방출된 에너지가 모든 유효 농도에 대해 현저히 감소하고 경사도 감소한다는 것을 명확하게 보여줍니다. 이러한 효과는피크(도 5C)에대한 시간의 감소로 변환되며, 더 중요한 것은 대사율의 유의하고 명백한 용량 의존적 감소가 관찰된다는 것이다(도5D). 새로운 myxo균 천연 물의 조사는 결합 된 박테리오정성 및 박테리시달 효과를 밝혀냈다.

Figure 5A
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Figure 5B
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그림 5D: A. baumannii DSM-30008 성장 및 신진 대사에 새로운 항균 천연 제품의 효과. (A)열흐름(μW) 대 시간(h)으로 도시된 열화상(WT) A. 바우만니 DSM-30008, 비처리 및 천연제품에 노출된다. (B)누적 열(mJ) vs. 시간(h). (C)오류 막대(표준 편차)로 피크(h)까지의 시간입니다. (D)오류 막대(표준 편차)가 있는 대사속도(μW). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 1: 소프트웨어 인터페이스에서 새 실험을 선택합니다. 빨간색 사각형에서 새 실험을 선택하는 단계가 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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추가 그림 3: 소프트웨어 인터페이스에서 새 실험을 시작합니다. 빨간색 사각형에서 새로운 실험을 시작하는 단계가 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 4: 잘 선택 및 반응 소프트웨어 인터페이스에서 시작. 모든 반응 우물이 선택됩니다 (깊은 파란색으로 착색 된 우물, 버튼 은 빨간색 사각형에 묘사 된 모든 것을 선택) 반응 시작 (빨간색 사각형에 묘사). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 5: 컵 홀더의 올바른 로딩. 참조 우물(딥 블루 컬러, 빨간색 사각형)이 선택되고 열화상이 팝업 창에 표시됩니다. 로딩이 올바르게 수행되면 고원에 도달해야 하며 약 2-3분 동안 이 단계에 머물러야 하는 열 방출 신호가 급격히 감소하는 것을 관찰한 후 신호가 시작점으로 돌아갑니다. 이 것을 관찰하면 컵 홀더의 하중이 정확합니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 6: 실험 종료. 빨간색으로 실험의 중지 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 7: 실험의 끝 확인. 빨간색에서는 실행 중인 실험의 끝을 확인하는 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 8: 실험 파일 저장. 저장 파일 옵션이 있는 팝업 창이 표시되고 빨간색으로 사용자 저장 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 9: 소프트웨어 인터페이스. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 10: 저장된 실험에 액세스합니다. 빨간색으로 는 저장된 실험에 액세스하기 위한 단추 열기 실험이 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 11: 선택한 실험 파일의 열기. 빨간색으로 열기 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 12: 기본 우물 보기. 모든 실험우물과 해당 열화상이 보입니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 13: 분석을 위해 우물을 선택합니다. 빨간색으로 버튼 선택 모든 것이 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 14: 기준선을 정의합니다. 빨간색으로 단추 정의 기준선이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 도 15: 기준신호 선택. 지연 단계에서 최소 30분의 신호가 선택됩니다(빨간색 상자). 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 16: 실험 파일의 변경 내용을 저장합니다. 빨간색으로 저장 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 17: 웹 기반 열량 분석 응용 프로그램. 온라인 소프트웨어 인터페이스 및 파일 업로드 경로가 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 18: 선택한 실험 파일 업로드. 빨간색으로 열기 버튼이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 도 19: 열화상 분석. 각 실험적 우물에 대해 계산된 대사 매개 변수는 빨간색으로 묘사됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 도 20: 실험 데이터를 이론적 성장 모델에 맞게 맞습니다. 열 흐름 데이터는 곰퍼츠 또는 리처드의 성장 모델에 장착됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 그림 21: 측정내보내기. 빨간색으로 버튼 다운로드 측정값저장이 표시됩니다. 이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이소더말 미세탈량법은 시간이 지남에 따라 시편에서 방출되는 에너지를 측정하며, 이 에너지 방출은 모든 생물학적, 물리적 및 (바이오) 화학 공정의 결과입니다. 측정된 열 흐름은 신진 대사 활성의 지속적인 실시간 모니터링을 가능하게 하기 때문에 물질의 항균 효과를 평가하거나 결정하기 위해 악용될 수 있다.

분석을 위해 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면 올바른 시동 식민지 형성 유닛(CFU)을 사용하는 각 종 또는 균주에 대해 개별적으로 결정해야 합니다. CFU 수가 너무 낮은 경우, 시스템이 감지할 충분한 열을 생성하는 바이오매스의 임계 량에 도달하는 데 시간이 오래 걸리기 때문에 지연 단계가 연장됩니다. CFU 수가 너무 높은 경우 지연 상이 매우 짧고, 생성된 열의 양은 인접한 센서 셀(참조 및 실험 우물)으로 열 전달을 유발하고 열화상의 왜곡을 유발할 수 있다. CFU의 높은 숫자는 또한 더 빠른 산소 고갈로 이끌어 내고 혐기성 조건으로 전환할 것입니다. 또한 실험의 처음 30분 동안 시스템이 평형화될 때 데이터 수집이 불가능하고 실제 효과 기록이 지연된다는 점을 고려해야 합니다. 또한, 잘못된 CFU 판정은 잘못된 MIC 결정으로 이어지며 궁극적으로 실험에 영향을 미치고관찰된 변화(25). 또 다른 중요 점은 기준선의 올바른 결정입니다. 일반적으로, 기준선 신호는 열 흐름 신호가 0이고 이상적으로, 기준선 정의에 대한 시간 범위는 >30 분일 때 지연 단계 동안 선택됩니다. 그러나, 이것은 박테리아가 열 신호 검출 한계에 도달하는 것을 필요로 하는 시간으로 항상 가능하지 않으며 긴장과 종 사이 다릅니다. 일부 종 또는 균주는 열 신호 감지 한계에 도달하는 데 30 분 이상이 필요하지만 다른 균주 또는 종은 처음 30 분 이내에 도달합니다. 이 경우, 모든 열 신호가 다시 0으로 떨어졌을 때 실험이 끝날 때 기준신호를 선택하고 안정적으로 유지할 수 있다. 양자 택일로, 동일한 세균 성 균주를 가진 다른 실험에서 기준선 사용할 수 있습니다., 그러나 권장 하지 않습니다.

이 시스템을 통해 실험 및 문제 해결의 설계 및 최적화 측면에서 유연성을 확보할 수 있습니다. 사용되는 부피는 플라스틱 인서트없이 티타늄 컵을 사용할 때 플라스틱 인서트와 100-600 μL을 사용할 때 100-300 μL의 범위에 있습니다. 제조업체에서 권장하는 작업 량은 120 μL입니다. 새로운 실험 시리즈를 설정하는 데 다양한 볼륨을 사용하고 측정에 최적의 조건을 찾는 동안 주로 두 매개 변수에 영향을 미칩니다. 낮은 볼륨을 사용 하 여, 필요한 테스트 화합물의 양을 감소 시킬 수 있습니다., 화합물에 대 한 특히 중요 한, 소량에서만 사용할 수 있는. 또한, 사용된 부피는 측정 중에 산소 가용성에 직접적인 영향을 미치며, 적은 부피가 세균 성장에 필요한 산소의 양을 증가시다. 산소 고갈은 실험의 가능한 최대 지속기간에 기여하는 주요 요인 중 하나입니다. 중요한 것은 액체 매체뿐만 아니라 고체 매체를 사용할 수 있다는 것입니다. 이것은 고체와 가스 단계 사이의 인터페이스에 성장이 더 나은 산소 접근을 가능하게 하기 때문에 느린 성장 미생물에 특히 중요합니다9.

IMC는 물리학, 화학 및 생물학 분야에서 알 수없는 프로세스를 발견하는 유용한 분석 도구입니다. 이 방법은 폐쇄 된 시스템 내의 열 교환을 측정하고 기록 된 열 교환의 분석은 항상 표준 방법으로 얻을 수없는 추가 정보를 제공합니다. 미생물학 및 항생제 연구에서 IMC의 가장 큰 장점 중 하나는 표준 탁도 방법을 사용할 수 없는 살아있는, 죽은 및 인내 또는 휴면 세포를 구별하는능력입니다(11). 또한, IMC는 매우 민감하며 104-105셀 9의소수로부터 열 방출을 검출할 수 있다. 또 다른 장점은 실험적인 설정이 빠르고 쉬우며 사용자 간섭없이 연속적이고 실시간 추적을 할 수 있다는 것입니다. 또한 IMC는 비파괴적이며 시료를 추가로 분석할 수 있습니다. 데이터 분석은 정지 단계에서 늦은 기하급수적 또는 초기 고정 단계 및 대사 활동까지 바이오 매스 형성의 분리를 허용합니다.

위에서 언급 한 새롭고 흥미로운 응용 프로그램 기능 외에도이 방법에 대한 단점도 있습니다. 주요 제한 사항은 IMC 계측기가 특정 시스템 내에서 생산되고 방출되는 총 열을 측정한다는 것입니다. 이는 열 흐름9,,20을기록하여 측정되는 열 신호 변화를 평가할 수 있도록 적절한 컨트롤을 사용하여 실험 계획의 중요성을 강조한다.

우리의 손에, IMC는 새로운 천연 제품의 항균 효과를 연구 하 고 효과적인 농도 범위를 결정 하는 중요 한 도구. 세균성 및 박시성 효과를 차별화하는 것 외에도, 대상 식별 연구 및 MoA 결정의 일환으로 미래에 사용될 수 있습니다. 이것은 여기에 표시된 새로운 활성 화합물의 열그램에 다른 항생제 클래스의 열그램을 비교하여 수행 할 수 있습니다. 그러나 측정된 데이터에서 추출할 수 있는 특정 정량화 가능한 매개 변수가 이러한 비교에 충분한지 또는 전체 열도그램을 기반으로 지문을 제공하는 알고리즘에서 작업해야 하는지 여부를 조사해야 합니다. 항생제 연구 분야에서 또 다른 가능한 응용 프로그램은 새로운 항균제의 저항 모드 (MoR)를 해명하는 데 도움이 될 수있는 전체 게놈 시퀀싱과 결합 된 내성 클론에 야생 형을 비교하는 것입니다. 이 방법의 정적 특성 으로 인해 생물막 형성 또는 이미 확립 된 생물막에 대한 새로운 에이전트의 효능에 대한 조사는 생물학적 과정의 더 나은 이해와 사용 된 에이전트가 휴면 상태의 다른 단계에서 미생물에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있습니다. IMC는 열 의 형태로 방출 된 총 에너지를 기록하여 전사학에 결합 될 수있는 활성 물질의 하위 억제 효과를 조사하는 적절한 방법입니다. 이 방법은 또한 임상 설정에서 샘플의 오염을 감지하거나 항바이오그램의 측정을 위해환자(11)의명확한 치료를 신속하게 결정하는 데 사용될 수 있다.

Disclosures

이 프로젝트는 calScreener 기술 개발업체인 Symcel과 공동으로 수행되었습니다. 저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 유익한 토론에 대한 심셀의 팀에 감사하고 싶습니다 우리는 간나 올리니크와 빌헬름 폴란더의 큰 지원을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한 자연 제품을 제공하고 숙련 된 기술 지원을 위한 스테파니 슈미트를 제공 다니엘 Kohnhäuser 감사드리고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

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References

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Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

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