Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Metabolische profilering om bactericide of bacteriostatische effecten van nieuwe natuurlijke producten te bepalen met behulp van isothermale microcalorimetrie

doi: 10.3791/61703 Published: October 29, 2020
* These authors contributed equally

Summary

De opheldering van de werkingsmodus van een nieuw antibioticum is een uitdagende taak in het drugsontdekkingsproces. Het doel van de hier beschreven methode is de toepassing van isothermale microcalorimetrie met calScreener in antibacteriële profilering om extra inzicht te geven in interacties tussen geneesmiddelen microbe.

Abstract

Vanwege de wereldwijde dreiging van toenemende antimicrobiële resistentie zijn nieuwe antibiotica dringend nodig. We onderzoeken natuurlijke producten van Myxobacteria als een innovatieve bron van dergelijke nieuwe verbindingen. Een knelpunt in het proces is meestal de opheldering van hun werkingsmodus. We hebben onlangs isothermale microcalorimetrie opgericht als onderdeel van een routineprofileringspijplijn. Deze technologie maakt het mogelijk om het effect van blootstelling aan antibiotica op de totale bacteriële metabole respons te onderzoeken, inclusief processen die zijn losgekoppeld van biomassavorming. Belangrijk is dat bacteriostatische en bactericide effecten gemakkelijk te onderscheiden zijn zonder tussenkomst van de gebruiker tijdens de metingen. Echter, isothermale microcalorimetrie is een vrij nieuwe aanpak en de toepassing van deze methode op verschillende bacteriële soorten vereist meestal pre-evaluatie van geschikte meetomstandigheden. Er zijn enkele referentie thermogrammen beschikbaar van bepaalde bacteriën, sterk vergemakkelijken interpretatie van de resultaten. Aangezien de pool van referentiegegevens gestaag groeit, verwachten we dat de methodologie in de toekomst een steeds grotere impact zal hebben en verwachten we dat deze diepgaande vingerafdrukanalyses mogelijk zal maken die de differentiatie van antibioticaklassen mogelijk maken.

Introduction

Het doel van deze methode is om isothermale microcalorimetrie (IMC) toe te passen als een medium doorvoertest in mode-of-action (MoA) profilering van nieuwe antibacteriële verbindingen. Deze methode onthult gegevens over de activiteit van verbindingen op bacteriële soorten en geeft informatie over de bactericide of bacteriostatische aard van de verbinding zelf.

De opkomst van opkomende antimicrobiële resistentie (AMR) is een wereldwijd probleem en het leidt tot minder effectieve behandelingen van veelvoorkomende infecties met bekende antibiotica1. Echter, het zoeken naar nieuwe verbindingen en geneesmiddelen die kunnen vervangen of werken in combinatie met bekende antibiotica zijn aan de gang en dit is gebouwd op diverse benaderingen. Natuurlijke producten zijn een belangrijke speler in de huidige drug discovery campagnes en in het bijzonder in anti-infectieve drug discovery2. Het identificeren van nieuwe loodstructuren voor de ontwikkeling van antibiotica is echter een langdurig en financieel veeleisend proces3. Dus, de eerste stappen van ontdekking zijn uiterst belangrijk om te filteren op de meeste veelbelovende steigers al in een vroeg stadium. De eerste stappen in de ontdekking van natuurlijke producten zijn het verkrijgen van de structuur van een verbinding, het bepalen van de activiteit in vitro samen met MoA en doelidentificatie. De meeste succesvolle verbindingen die in aanmerking komen voor verdere ontwikkeling moeten een gunstig spectrum van activiteit vertonen (d.w.z. breedspectrumactiviteit in het geval van antibacteriële stoffen) en een nieuw MoA waarmee reeds bestaande AMR kan worden overwonnen. Veelbelovende steigers worden dan meestal gescreend in secundaire tests, waaronder in vivo biologische beschikbaarheid, toxiciteit en metabolisme4. Naast de financiële zorgen wordt de ontdekking van natuurlijke geneesmiddelen nog meer uitdagingen met betrekking tot de kosten en technische problemen in verband met samengestelde isolatie en zuivering, die het op zijn beurt moeilijk kunnen maken om in de vroege stadia van het ontdekkingsproces5,6. Daarom is het van het grootste belang in het onderzoek naar natuurlijke producten om state-of-the-art primaire screening met minimale samengestelde bedragen uit te voeren om een goed geïnformeerde beslissing te nemen over verdere investeringen om een nieuw natuurproduct toegankelijk te maken voor preklinische ontwikkeling. Met het gebruik van IMC voor antibacteriële profilering wordt de benodigde hoeveelheid verbinding aanzienlijk verminderd in vergelijking met standaardmethoden. De techniek biedt ook meer diepgaande informatie over de interactie van nieuwe geneesmiddelen met de microbiële gemeenschap7.

IMC is een gevestigde methode voor het meten van totale energie als gevolg van alle biologische, fysische en biochemische processen en reacties in een biologisch systeem. Bacteriële energie-release is evenredig aan de totale metabolische reacties8. Binnen een gesloten systeem, zoals de gebruikte microcalorimeter, kunnen de warmteniveaus worden gemeten in het microwattbereik om de metabolische kinetiek van bacteriën9,10,11,12te bestuderen . De warmte (energie) die vrijkomt door bacteriën is gekoppeld aan cellulaire functies die ten grondslag liggen aan hun metabolisme en die niet noodzakelijkerwijs evenredig zijn met de cellulaire biomassa.

Aanvankelijk is de toepasbaarheid van isothermale calorimetrie voor microbiologische tests beperkt vanwege de lage doorvoer en hoge testvolumes. Echter, de gebruikte microcalorimeter is uniek omdat het de voordelen van isothermale calorimetrie combineert met verhoogde doorvoer en lagere samengestelde vereisten, waardoor het een waardevol hulpmiddel is voor toepassingen voor het ontdekken van geneesmiddelen10. Bovendien biedt het instrument verdere voordelen ten opzichte van alternatieve methoden voor het meten van bacteriële groeikinetiek, zoals de standaard troebelheidsmethode, die is gebaseerd op de meting van de optische dichtheid bij 600 nm (OD<600). Het meten van OD600 is gebaseerd op de veronderstelling dat de toegenomen optische dichtheid gelijk is aan microbiële groei, waardoor de aanwezigheid van niet-levensvatbare cellen wordt verwaarloosd. Deze methode is ook bekritiseerd omdat het kleine kolonievarianten en persister cellen11 uitsluit. IMC maakt daarentegen de real-time observatie van elk type levensvatbare cellen mogelijk. Als cellen slapend zijn, vertonen ze nog steeds metabolische activiteit en kunnen ze dus door IMC worden gedetecteerd, terwijl dergelijke verschijnselen niet kunnen worden gedetecteerd door de standaard troebelheidsmethode11. Andere voordelen van IMC zijn een kortere antimicrobiële gevoeligheidstesttijd, het meten van interacties met geneesmiddelen in een complexe gemeenschap en standaard analysemethoden zonder het monster te vernietigen7.

De IMC-technologie is geïmplementeerd in een breed scala aan studies, variërend van microbiologie tot thermogenese en kankerbiologie13,14,15,16,17. De microbiële toepassingen omvatten de bepaling van minimale remmende concentraties (MIC) van verbindingen tegen verschillende bacteriële stammen. Er zijn verschillende studies uitgevoerd en er is geconcludeerd dat MIC-gegevens uit isothermale calorimetrie voor de meeste bacteriële soorten sneller kunnen worden verkregen en dat de resultaten vergelijkbaar zijn met andere (standaard)methoden voor MIC-bepaling12,18,19. Andere toepassingen van IMC omvatten het observeren van de interactie van geneesmiddelen en de combinatie van medicamenteuze behandelingen met complexe bacteriële gemeenschappen zoals biofilms11. Een studie gericht op MoA-profilering toonde aan dat de microcalorimeter een verschil in eerste- en tweede generatie cefalosporines kan detecteren, terwijl verschillende antibiotica met hetzelfde MoA een vergelijkbare warmtestroomcurve vertonen in vergelijking met elkaar18.

Hier beschrijven we het gebruik van IMC voor MoA profilering van nieuwe natuurlijke producten met behulp van het nieuwe isothermale microcalorimetrie instrument. De methode wordt gebruikt om effectieve antibioticaconcentraties te bepalen en om kenmerken van antibiotica te beschrijven in termen van bactericide of bacteriostatische mechanismen. De methode kan in grote lijnen worden geïmplementeerd in MoA-profilering van verbindingen en kan standaard microbiologische methoden vervangen of op zijn minst aanvullen. Toekomstige studies zullen diepgaande vingerafdrukanalyses omvatten die de differentiatie van antibioticaklassen op basis van doelmechanismen mogelijk maken.

Protocol

OPMERKING: De temperatuur van het instrument moet worden ingesteld op basis van de bacterie die ten minste een dag van tevoren wordt gebruikt om de stabiliteit van het systeem te garanderen. Hier worden Acinetobacter baumannii DSM30008 monsters uitgevoerd op 30 °C.

1. Cultuurvoorbereiding

  1. Streep de stam uit die onderzocht wordt (hier: A. baumannii)op een CASO agarplaat en broeder 's nachts in een statische couveuse bij 30 °C.
  2. Bereid een nachtelijke cultuur voor door een enkele kolonie in MHB (Mueller-Hinton bouillon) in te en inculeren op een schuddende couveuse bij 180 rpm bij 30 °C.

2. Bereiding van monsters

  1. Gebruik buizen van 1,5 mL om het concentratiebereik van geselecteerde geneesmiddelen of verbindingen voor te bereiden (bijvoorbeeld door 1,5 μL 100x voorraadoplossingen in DMSO toe te voegen; zie stap 2.3).
  2. Verdun de nachtcultuur in MHB-medium.
    1. Meet de optische dichtheid van de nachtcultuur met behulp van een spectrofotometer op een golflengte van 600 nm.
    2. Verdun de cultuur om 5 x 105 kolonievormende eenheden (CFU)/mL in vers MHB-medium te verkrijgen. Een OD600 van een is ongeveer 5 x 108 CFU/mL (bijvoorbeeld Escherichia coli, Staphylococcus aureus, A. baumannii).
      OPMERKING: Het is belangrijk om de conversiefactor OD600 te kalibreren naar CFU/mL voor elke individuele bacteriestam onder de toegepaste kweekomstandigheden.
  3. Voeg 150 μL van de cellen toe aan de in stap 2.1 bereide reageerbuizen, zodat de uiteindelijke concentratie van getest medicijn of verbinding correct wordt en de uiteindelijke celconcentratie correct wordt.
  4. Meng de verbinding met de cellen door vortexing.
    OPMERKING: De monsterplaat (zie tabel met materialen)heeft zes rijen, elk met acht putten, in totaal 48 putten; Rij A en Rij F zijn de thermodynamische referentie. Daarom kunnen er geen monsters in die putten worden geladen, overeenkomstige media worden in die putten geladen. 32 testmonsters kunnen per run worden gemeten met behulp van putten in rijen B-E. Het individuele testmonster moet minimaal in tweevoud worden uitgevoerd (hier: alle monsters zijn uitgevoerd als driedubbele). Er moeten groeicontroles worden opgenomen.

3. Invoegen voorbereiding

  1. Breng 120 μL van het mengsel bereid in stap 2.4 naar de plastic inzetstukken.
    OPMERKING: Gebruik reverse pipetting in stap 3.1 om te voorkomen dat er vloeistof op de zijkanten van de kunststof wisselplaten spuit, wat kan leiden tot interferentie met de juiste signaaluitlezing.
  2. Plaats alle titanium flesjes in de houders (zie Tabel van Materialen) met een pincet.
  3. Breng de inzetstukken voorzichtig in de titanium flacons in de houderplaat.
  4. Plaats los titanium deksels op alle titanium flesjes.

4. Invoegen

  1. Breng de houder met titanium bekers op het monsterstation en plaats op het aangewezen gebied.
  2. Gebruik de koppelsleutel, ingesteld op 40 cNm kracht, om alle deksels aan te draaien.

5. Lopende monsters

  1. Start in calView-software een nieuw experiment(supplementisch figuur 1).
  2. Trek de invoegarm van het monster uit het instrument.
  3. Plaats de bekerhouder op de "brug", kolom 8 naar de opening van het monster en duw de bekerhouder voorzichtig in het instrument op de aangewezen "Positie 1". Wacht 10 minuten tot het systeem is gestabiliseerd. Label de experimentele putten.
  4. Duw de invoegarm tot de bekerhouder zich op de aangewezen "Positie 2" bevindt. Wacht 20 minuten tot het systeem is gestabiliseerd.
  5. Duw de invoegarm van het monster in "Positie 3" en trek de invoegarm in totdat deze zich op de "Looppositie" bevindt. Markeer alle putten in de software en selecteer Reaction Start (Supplemental Figuur 4).
  6. Voer het experiment uit totdat de warmte-emissie leest zijn stabiel terug op nul.
    LET OP: Zorg ervoor dat alle putten zich in deze stappen hetzelfde gedragen. Aanvullende figuur 5 illustreert wat moet worden waargenomen als de putten correct worden geladen. Als deze verkeerd is geladen, herhaalt u stap 5.2-5.4.

6. Verwijder de bekerhouder

  1. Selecteer in de software Stop (Supplementaal figuur 6). De software zal dan vragen of "u zeker bent", selecteer Ja (Supplemental Figuur 7) en sla het experiment op een station of desktop voor data-analyse (Supplemental Figuur 8).
  2. Steek de invoegarm volledig in het instrument en schakel de magneten in om de bekerhouder op te halen.
  3. Maak de deksels los, verwijder de inzetstukken en plaats de flesjes en deksels in glazen houders en plaats gedurende 4 uur bij 180 °C, gevolgd door het plaatsen van de flacons en deksels in een desiccator om ervoor te zorgen dat deksels en flesjes droog zijn.

7. Analyseren van gegevens

  1. Open de software (Supplemental figuur 9), selecteer Experiment openen in de linkerbovenhoek(Supplemental figuur 10). Selecteer in het pop-upvenster het interesseexperiment en druk op Openen (Aanvullende figuur 11). De toepassing opent het experiment in de standaardputtenweergave(supplementisch figuur 12).
  2. Druk op Alles selecteren of Ctrl+A (aanvullende figuur 13).
  3. Druk op Basislijn definiëren, deze parameter normaliseert de gegevens in elke positie(supplement figuur 14). Selecteer in het pop-upvenster een periode van >30 min in de vertragingsfase (de warmtestroom moet laag zijn, tussen nul en tien μW; Aanvullend figuur 15). Na de selectie van de basislijnperiode wordt de gekozen basislijn in het groen in het thermogram weergegeven. Sluit het venster Basislijnsectie definiëren.
  4. Druk op Opslaan of Ctrl+S en sluit de software (Supplemental figuur 16).
  5. Open webgebaseerde Symcel Calorimetry analyse applicatie (https://symcel.shinyapps.io/symcel_calorimetricgrowth/).
  6. Als u het bestand wilt uploaden naar de calorimetrieanalysetoepassing, drukt u op Bladeren (Supplementaal figuur 17),selecteert u het experiment en drukt u op Openen (Supplementaal figuur 18). De metabolische parameters worden automatisch berekend voor de 32 monsters in de webapplicatie(supplementisch figuur 19).
  7. Om de warmtestroomgegevens te passen aan Gompertz en/of Richard's groeimodellen klik op Groeifunctie. De fit van groeimodellen wordt weergegeven in de sectie "Cumulatief", ook in vergelijking met de ruwe gegevens in de sectie "Flow" (Supplementaal figuur 20).
  8. Als u alle berekende parameters wilt downloaden, drukt u op Downloadmaatjes. Selecteer de bestandslocatie en druk op Opslaan (Supplemental figuur 21). Het bestand wordt geëxporteerd naar een spreadsheet voor verdere berekeningen.

Representative Results

Er is voldoende bacteriën nodig die warmte produceren om het instrument een warmtesignaal te laten registreren. Als er een vertraging in de tijd totdat een warmtestroom detecteerbaar is, betekent dit dat de bacteriën nog geen warmtesignaal boven de detectielimiet produceren. De detectie van vrijgekomen warmte uit het bacteriële monster is daarom direct gerelateerd aan toenemende bacteriële activiteit, waaronder bacteriële groei. Bacteriële groei en andere metabole activiteiten zijn bekend dat sterk worden beïnvloed door de toevoeging van een antibacteriële drug. Om te bepalen of een nieuw onderzocht natuurproduct bactericide of bacteriostatische effecten of een combinatie van beide MoA's uitoefent, hebben we gekozen voor een kleine set referentiegeneesmiddelen en hebben we thermogrammen geregistreerd waaraan we gegevens uit experimenten met het natuurlijke product vergeleken. Op basis van de potentie van geselecteerde antibiotica werd een reeks concentraties geselecteerd die dicht bij de minimale remmende concentratie (MIC) waren, zoals bepaald door microbrothverdunning.

Ciprofloxatine richt zich op bacteriële DNA gyrase en topoisomerase IV en vertoont bijgevolg een bactericide MoA. Echter, bacteriële doden geïnduceerd door ciprofloxatine is concentratie-afhankelijk en wanneer het wordt gesedansed bij onvoldoende concentraties kan het ook een bacteriostatisch effect21. Tetracycline en chloorampfenicol richten zich op het ribosoom op respectievelijk de 30S en 50S subunit, en ze werken bacteriostatisch als gevolg van remming van eiwitsynthese22,23. Rifampicin werkt door het remmen van DNA-afhankelijke RNA polymerase en het kan zowel bactericide als bacteriostatische effecten hebben, afhankelijk van de gebruikte dosis24. Het natuurlijke product dat we hier onderzoeken was geïsoleerd van Myxobacteria en het toonde krachtige activiteit tegen gram-negatieve en gram-positieve bacteriële pathogenen. Tijdens het onderzoek naar het MoA en het moleculaire doel, waren we geïnteresseerd in het bepalen of het nieuwe natuurlijke product bactericide en/of bacteriostatische effecten uitoefent en of de warmteprofielen van behandelde Acinetobacter baumannii vergelijkbaar zijn met thermogrammen van bacteriën die werden behandeld met de hierboven genoemde referentiegeneesmiddelen.

De thermogrammen verkregen door A. baumannii DSM-30008 bloot te stellen aan ciprofloxatine in seriële verdunning worden weergegeven in figuur 1A. Concentraties tussen 0,005 μM en 0,1 μM hebben een minimaal effect op de groei en stofwisseling van A. baumannii. De behandeling van de cellen met 0,5 μM ciprofloxatine leidt echter tot een aanzienlijke verschuiving in de duur van de vertragingsfase en een lagere maximale warmtestroom. Deze twee veranderingen samen beïnvloeden de time-to-peak(figuur 1C),die wordt verhoogd met ongeveer 6 uur. In figuur 1Bwordt de cumulatieve vrijgekomen warmte uitgezet tegen de tijd. Hier zien we het effect van concentraties, wat wordt weerspiegeld door een hellingshelling. Kwantificering van de helling van het thermogram geeft ons de maximale stofwisseling van A. baumannii in aanwezigheid van ciprofloxatine zoals weergegeven in figuur 1D,waar we een gelijktijdige afname van de stofwisseling van cellen die met 0,5 μM ciprofloxatine worden behandeld, kunnen waarnemen. Veranderingen in de stofwisseling van cellen behandeld met lagere concentraties zijn minimaal. Dit experiment zou verder kunnen worden verbeterd door de toevoeging van tussenliggende concentraties die het 0,1-1 μM-bereik bestrijken om een meer uitgesproken geleidelijke verandering te waarnemen tussen de concentraties die geen effect hebben en een concentratie die resulteert in een aanzienlijke vertraging van de vertragingsfase en de stofwisseling. Echter, de trends van verandering ondersteunen een bactericide MoA van ciprofloxaline.

Figure 1A
Figuur 1A: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 1B
Figuur 1B: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 1C
Figuur 1C: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 1D
Figuur 1D: Effect van ciprofloxatine op A. baumannii DSM-30008 groei en metabolisme. (A) Thermogrammen die worden weergegeven als warmtestroom (μW) vs. tijd (h) voor wild type (WT) A. baumannii DSM-30008, niet behandeld en blootgesteld aan ciprofloxatine. (B) Cumulatieve warmte (mJ) vs. tijd (h). (C) Time to peak (h) met foutbalken (standaarddeviatie). (D) Stofwisseling (μW) met foutbalken (standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

In het geval van tetracycline hebben we geen significante veranderingen in de thermogrammen waargenomen voor alle concentraties die tot laat exponentieel worden getest vanaf 8 uur (zie figuur 2A). Niettemin worden grote veranderingen waargenomen bij stationaire fasewarmte-emissie, waarbij de tweede piek van warmtestroom aanzienlijk wordt verlaagd voor A. baumannii behandeld met 5 μM en 10 μM tetracycline. De lagere concentraties hadden ook een effect, dat nochtans minder uitgesproken was. Dit effect zorgt er ook voor dat een verlenging in de tijd piekt zoals weergegeven in figuur 2C. De cumulatieve vrijgegeven warmtecurven (figuur 2B) tonen aan dat niet-behandelde en behandelde cellen geen significante verschillen vertonen in de algehele curvevorm, maar door de tendens neemt de helling van de krommen af bij hogere concentraties van tetracycline. Dit vertaalt zich ook in gekwantificeerde stofwisselingscijfers weergegeven in figuur 2D, waar een concentratieafhankelijk effect (d.w.z. een afname van de stofwisseling bij toenemende antibioticaconcentraties) wordt waargenomen. Deze bevindingen ondersteunen het feit dat tetracycline een bacteriostatisch effect heeft.

Figure 2A
Figuur 2A: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2B
Figuur 2B: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2C
Figuur 2C: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2D
Figuur 2D: Effect van tetracycline op A. baumannii DSM-30008 groei en metabolisme. (A) Thermogrammen die worden weergegeven als warmtestroom (μW) vs. tijd (h) voor wild type (WT) A. baumannii DSM-30008, niet behandeld en blootgesteld aan tetracycline. (B) Cumulatieve warmte (mJ) vs. tijd (h). (C) Time to peak (h) met foutbalken (standaarddeviatie). (D) Stofwisseling (μW) met foutbalken (standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Nog meer uitgesproken effecten kunnen worden waargenomen bij de behandeling van A. baumannii met de eiwitsynthese remmer chloramphenicol dat zich richt op de 50S ribosomale subunit. Blootstelling aan toenemende concentraties chlooramfenicol leidt tot verlenging van de vertragingsfase en significante veranderingen van de metabolische activiteit in de stationaire fase(figuur 3A en figuur 3B). Er wordt geen verandering in de stofwisseling waargenomen voor de laagst geteste concentratie en de hoogste gekozen testconcentratie (50 μM) voorkomt de meeste energie-afgifte van het monster. Kijkend naar de tussenliggende testconcentraties (5 μM en 10 μM), wordt de tijd tot piek aanzienlijk verhoogd met ongeveer 8-9 uur(figuur 3C). Tegelijkertijd wordt de stofwisseling van de behandelde cellen aanzienlijk verminderd, waarbij 50 μM dodelijk is (figuur 3D). Over het algemeen komen de veranderingen waargenomen bij concentraties tot 10 μM chlooramfenicol overeen met een bacteriostatisch effect van deze antibioticaklasse.

Figure 3A
Figuur 3A: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3B
Figuur 3B: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3C
Figuur 3C: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3D
Figuur 3D: Effect van chlooramfenicol op A. baumannii DSM-30008 groei en metabolisme. (A) Thermogrammen die worden weergegeven als warmtestroom (μW) vs. tijd (h) voor wild type (WT) A. baumannii DSM-30008, niet behandeld en blootgesteld aan chlooramphenicol. (B) Cumulatieve warmte (mJ) vs. tijd (h). (C) Time to peak (h) met foutbalken (standaarddeviatie). (D) Stofwisseling (μW) met foutbalken (standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Rifampicin behandeling in het geselecteerde concentratiebereik heeft een dramatisch effect op de thermogrammen van A. baumannii DSM-30008 in verband met de duur van de vertragingsfase en de effecten op de groei tot de late stationaire fase (figuur 4A). Een aanzienlijke vermindering van de warmte-emissie kan worden gezien in figuur 4B dat samen gaat met een afname van de metabole activiteit. Figuur 4C en figuur 4D illustreren de invloed van de verlenging van de vertragingsfase en veranderingen van de metabolische activiteit in de stationaire fase. Figuur 4C toont een duidelijke toename van de tijd tot piek voor alle gebruikte concentraties. Figuur 4D illustreert de afname van de stofwisseling veroorzaakt door de afname van de helling voor alle concentraties die meestal worden toegeschreven aan een bactericide-effect. Als gevolg van door antibiotica geïnduceerde doden van bacteriële cellen, de metabolische activiteit zal naar verwachting lager zijn als gevolg van een kleiner aantal actieve bacteriën aanwezig. De verzamelde gegevens zijn in overeenstemming met het feit dat rifampicine bactericide en bacteriostatische werking kan hebben, en de hier gepresenteerde gegevens ondersteunen voornamelijk bactericide effecten van de gekozen concentraties.

Figure 4A
Figuur 4A: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4B
Figuur 4B: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4C
Figuur 4C: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4D
Figuur 4D: Effect van rifampicin op A. baumannii DSM-30008 groei en metabolisme. (A) Thermogrammen die worden weergegeven als warmtestroom (μW) vs. tijd (h) voor wild type (WT) A. baumannii DSM-30008, niet behandeld en blootgesteld aan rifampicine. (B) Cumulatieve warmte (mJ) vs. tijd (h). (C) Time to peak (h) met foutbalken (standaarddeviatie). (D) Stofwisseling (μW) met foutbalken (standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

De laagst geselecteerde testconcentratie van het natuurproductantibioticum (0,25 μM) heeft geen of slechts marginale effecten op het thermogram van A. baumannii DSM-30008. Andere geteste concentraties vertonen echter enig effect op de duur van de vertragingsfase en beïnvloeden de groei tot de late stationaire fase(figuur 5A). Het meest voor de hand liggende effect is de aanzienlijke vermindering van de warmte-emissie in de stationaire fase. Gegevens weergegeven in figuur 5B tonen duidelijk aan dat de vrijgekomen energie aanzienlijk is afgenomen voor alle effectieve concentraties en de helling is ook afgenomen. Deze effecten vertalen zich in een daling van de tijd tot piek (figuur 5C) en nog belangrijker, een significante en duidelijk dosisafhankelijke daling van de stofwisseling wordt waargenomen (figuur 5D). Het onderzoek van het nieuwe myxobacteriële natuurlijke product bracht een gecombineerd bacteriostatisch en bactericidaal effect aan het licht.

Figure 5A
Figuur 5A: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5B
Figuur 5B: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5C
Figuur 5C: Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5D
Figuur 5D: Effect van een nieuw antibacterieel natuurproduct op A. baumannii DSM-30008 groei en metabolisme. (A) Thermogrammen die worden weergegeven als warmtestroom (μW) vs. tijd (h) voor wilde type (WT) A. baumannii DSM-30008, niet behandeld en blootgesteld aan het natuurlijke product. (B) Cumulatieve warmte (mJ) vs. tijd (h). (C) Time to peak (h) met foutbalken (standaarddeviatie). (D) Stofwisseling (μW) met foutbalken (standaarddeviatie). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Het selecteren van een nieuw experiment in de software-interface. In een rood vierkant wordt de stap om een nieuw experiment te selecteren weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Het benoemen van een nieuw experiment in de software-interface. In een rood vierkant wordt de stap om het nieuwe experiment te noemen en te bevestigen afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 3: Het starten van een nieuw experiment in de software-interface. In een rood vierkant wordt de stap om een nieuw experiment te starten afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 4: Goed selectie en reactie start in software-interface. Alle reactieputten zijn geselecteerd (putten gekleurd in diepblauwe kleur, knop Selecteer alle afgebeeld in een rood vierkant) en reactie start is geselecteerd (afgebeeld in een rood vierkant). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Correct laden van bekerhouder. Referentieputten worden geselecteerd (diepblauwe kleur, rood vierkant) en thermogrammen worden weergegeven in een pop-upvenster. Wanneer de belasting correct wordt uitgevoerd, zien we een steile daling van de warmte-emissie signaal gedetecteerd dat moet een plateau fase te bereiken en blijven in deze fase voor ongeveer 2-3 min, daarna het signaal keert terug naar het startpunt. Wanneer dit wordt waargenomen is het laden van de bekerhouder correct. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 6: Einde van het experiment. In het rood wordt de knop Stoppen in het experiment weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 7: Bevestiging van het einde van het experiment. In het rood wordt de knop Ja weergegeven om het einde van het uitvoerende experiment te bevestigen. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Het experimentbestand opslaan. Er wordt een pop-upvenster weergegeven met bestandsopties opslaan en in het rood wordt de knop Opslaan weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 9: Software-interface. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 10: Toegang tot opgeslagen experimenten. In het rood wordt de knop Openen voor toegang tot opgeslagen experimenten weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 11: Openen van geselecteerd experimentbestand. In het rood wordt de knop Openen afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 12: Standaardputtenweergave. Alle experimentele put en bijbehorende thermogrammen zijn zichtbaar. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 13: Het selecteren van putten voor analyse. In het rood wordt de knop Selecteren alles afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 14: Het definiëren van de basislijn. In het rood wordt de knop Definiëren weergegeven. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 15: Het basislijnsignaal selecteren. Minimaal 30 min signaal in de vertragingsfase is geselecteerd (rood vak). Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 16: Wijzigingen in het experimentele bestand opslaan. In het rood wordt de knop Opslaan afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 17: Web gebaseerde Calorimetry analyse applicatie. De online software interface en bestand upload route wordt getoond. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullende figuur 18: Uploaden van geselecteerd experimenteel bestand. In het rood wordt de knop Openen afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 19: Analyse van de thermogrammen. Metabole parameters berekend voor elke experimentele put worden weergegeven in het rood. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 20: De experimentele gegevens aanpassen aan theoretische groeimodellen. Warmtestroomgegevens worden op een Gompertz of op het groeimodel van een Richard gemonteerd. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Aanvullend figuur 21: Exporteren van de metingen. In het rood worden de knoppen Download Measures en Save afgebeeld. Klik hier om dit cijfer te downloaden.

Discussion

Isothermale microcalorimetrie meet de energie die in de loop van de tijd uit een monster wordt uitgestoten en deze energieafgifte is het resultaat van alle biologische, fysische en (bio)chemische processen. De gemeten warmtestroom kan worden benut om antibacteriële effecten van stoffen te evalueren of te bepalen, omdat het een continue real-time monitoring van metabolische activiteit mogelijk maakt.

Om betrouwbare gegevens voor analyse te verkrijgen, moeten voor elke gebruikte soort of stam de juiste startkolonievormende eenheden (CFU) afzonderlijk worden bepaald. In het geval dat het CFU-aantal te laag is, leidt dit tot een langdurige vertragingsfase omdat het langer duurt voordat het systeem een kritische hoeveelheid biomassa bereikt die voldoende warmte produceert om te detecteren. In het geval dat de CFU telling is te hoog de vertraging fase zal zeer kort zijn, en de hoeveelheid warmte geproduceerd kan leiden tot warmteoverdracht naar naburige sensorcellen (referentie en experimentele putten) en veroorzaken vervormingen van de thermogrammen. Hoge aantallen CFU zal ook leiden tot een snellere zuurstofuitputting en overschakelen naar anaërobe omstandigheden. Er moet ook rekening mee worden gehouden dat tijdens de eerste 30 minuten van het experiment, wanneer het systeem in evenwicht is, het verzamelen van gegevens niet mogelijk is en de feitelijke registratie van effecten wordt vertraagd. Bovendien leidt onjuiste CFU-bepaling tot valse MIC-bepaling, wat uiteindelijk van invloed is op het experiment en de waargenomen veranderingen25. Een ander kritiek punt is de juiste bepaling van de basislijn. Meestal wordt het basislijnsignaal geselecteerd tijdens de vertragingsfase wanneer het warmtestroomsignaal nul is en idealiter is het tijdsbereik voor basislijndefinitie >30 min. Dit is echter niet altijd mogelijk omdat de tijd die de bacteriën nodig hebben om de detectielimiet voor warmtesignalen te bereiken, verschilt tussen stammen en soorten. Sommige soorten of stammen hebben meer dan 30 minuten nodig om de detectielimiet voor warmtesignaal te bereiken, terwijl andere stammen of soorten het binnen de eerste 30 minuten bereiken. In dat geval is het mogelijk om het basislijnsignaal aan het einde van het experiment te selecteren wanneer alle warmtesignalen zijn teruggevallen naar nul en stabiel blijven. Als alternatief kunnen basislijnen van andere experimenten met dezelfde bacteriestam worden gebruikt, wat echter niet wordt aanbevolen.

Het systeem zorgt voor enige flexibiliteit op het gebied van ontwerp en optimalisatie van experimenten en probleemoplossing. De gebruikte volumes zijn in het bereik van 100-300 μL bij gebruik van kunststof inzetstukken en 100-600 μL bij het gebruik van titanium bekers zonder de plastic inzetstukken. Het aanbevolen werkvolume van de fabrikant is 120 μL. Het gebruik van verschillende volumes bij het opzetten van een nieuwe experimentele serie, en het vinden van optimale omstandigheden voor metingen, heeft vooral invloed op twee parameters. Door het gebruik van lagere volumes kan de hoeveelheid vereiste testverbinding worden verminderd, wat vooral belangrijk is voor verbindingen, die slechts in kleine hoeveelheden beschikbaar zijn. Bovendien heeft het gebruikte volume direct invloed op de beschikbaarheid van zuurstof tijdens de meting, waarbij lagere volumes de hoeveelheid beschikbare zuurstof verhogen die nodig is voor bacteriële groei. Zuurstofuitputting is een van de belangrijkste factoren die bijdragen aan de maximale duur van het experiment. Belangrijk is dat het mogelijk is om vaste media te gebruiken, niet alleen vloeibare media. Dit is vooral belangrijk voor langzaam groeiende micro-organismen, omdat groei op het raakvlak tussen vaste en gasfase een betere zuurstoftoegang mogelijk maakt9.

IMC is een nuttig analytisch instrument om onbekende processen te ontdekken met toepassingen in de natuurkunde, chemie en biologie. De methode meet de warmte-uitwisseling binnen een gesloten systeem en de analyse van de geregistreerde warmte-uitwisseling levert aanvullende informatie op die niet altijd met standaardmethoden kan worden verkregen. In microbiologie en antibiotica onderzoek, een van de grootste voordelen van IMC is het vermogen om onderscheid te maken tussen levende, dode en aanhoudende of slapende cellen, die niet mogelijk is met behulp van standaard troebelheid methoden11. Bovendien is IMC zeer gevoelig en kan het warmte-emissie detecteren van slechts 104-105 cellen9. Een ander voordeel is dat de experimentele setup is snel en eenvoudig, en het zorgt voor continue, real-time tracking met minimale tot geen interferentie van de gebruiker. Verder is IMC niet-destructief, wat verdere analyse van monsters mogelijk maakt. Data-analyse maakt het mogelijk om biomassavorming te ontkoppelen tot laat exponentieel of vroeg stationaire fase en metabolische activiteit in stationaire fase.

Naast de nieuwe en spannende applicatie functies hierboven vermeld, zijn er ook nadelen aan deze methode. De belangrijkste beperking is dat IMC-instrumenten de totale warmte meten die binnen een specifiek systeem wordt geproduceerd en vrijgegeven, waaronder ook niet-specifieke signalen. Dit onderstreept het belang van experimentele planning met passende controles om de veranderingen in het warmtesignaal te kunnen beoordelen die worden gemeten door de warmtestroom9,20vastte leggen .

In onze handen is IMC een belangrijk hulpmiddel om antibacteriële effecten van nieuwe natuurlijke producten te bestuderen en effectieve concentratiebereiken te bepalen. Afgezien van het onderscheiden van bacteriostatische en bactericide effecten, kan het in de toekomst worden gebruikt als onderdeel van doelidentificatiestudies en MoA-bepaling. Dit kan worden gedaan door thermogrammen van verschillende antibioticaklassen te vergelijken met thermogrammen van nieuwe actieve verbindingen zoals hier weergegeven. Er moet echter nog worden onderzocht of bepaalde kwantificeerbare parameters die uit de gemeten gegevens kunnen worden gehaald, voldoende zijn voor dergelijke vergelijkingen of dat het nodig zal zijn om te werken aan algoritmen die vingerafdrukken geven op basis van volledige thermogrammen. Een andere mogelijke toepassing op het gebied van antibioticaonderzoek is de vergelijking van wildtype met resistente klonen, in combinatie met hele genoomsequencing, die kan helpen bij het ophelderen van de resistentiemodus (MoR) van nieuwe antibacteriële stoffen. Vanwege de statische aard van de methode kan onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe agentia op biofilmvorming of op reeds gevestigde biofilms leiden tot een beter begrip van het biologische proces en het effect van geselecteerde agentia op microben in verschillende stadia van de slaapstand. IMC registreert totale energie die vrijkomt in de vorm van warmte waardoor het een geschikte methode is om ook subremmende effecten van werkzame stoffen die kunnen worden gekoppeld aan transcriptie te onderzoeken. Deze methode kan ook worden gebruikt in klinische omgevingen om besmetting van monsters op te sporen of voor de bepaling van antibiogrammen die helpen om snel te beslissen over een definitieve behandeling van de patiënten11.

Disclosures

Het project werd uitgevoerd in samenwerking met Symcel, ontwikkelaar van de calScreener technologie. De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs willen het team van Symcel bedanken voor vruchtbare discussies en we willen de grote steun van Ganna Oliynyk en Wilhelm Paulander erkennen. We willen ook Daniel Kohnhäuser bedanken voor het leveren van het natuurlijke product en Stefanie Schmidt voor bekwame technische ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acinetobacter baumannii DSMZ DSM-30008 reference strain used in this study
calPlate Symcel 1220093 48-well plate for titanium cups to be inserted
calScreener Symcel 1200001 isothermal microcalorimetry instrument
calView software Symcel collection and analysis software
calWell Symcel 1901004 micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups
CASO agar Carl Roth X937.1 isolation and cultivation of microorganisms
Chloroamphenicol Sigma-Aldrich C0378 antibiotic
Ciprofloxacin Sigma-Aldrich 17850 antibiotic
Cuvettes Brand 759015 1.5 mL cuvettes
Disposable inoculation loops Sarsted 86.1562.050 10 µL inoculation loops
Dimethylsulfoxid (DMSO) Thermo Fisher Scientific 85190
Eppendorf tubes Eppendorf 30120086 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes
Ethanol Thermo Fisher Scientific 10428671
Falcon Tubes Sarsted 62.554.502 15 mL falcon tubes
Hydrochloride (HCL) Thermo Fisher Scientific 10316380
Methanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Mueller Hinton Broth Sigma-Aldrich 70192 liquid medium for antibiotic susceptibility studies
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media Sigma-Aldrich 90922 Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2
Petri dishes LABSOLUTE 7696404
Pipette 100 - 1000 µL Brand 705880
Pipette 2 - 20 µL Brand 705872
Pipette 20 - 200 µL Brand 705878
Pipette tips 100 - 1000 L Brand 732032
Pipette tips 2 - 200 µL Brand 732028
Polymyxin B sulfate Sigma-Aldrich P0972 antibiotic
Rifampicin Sigma-Aldrich R3501 antibiotic
Serological pipette Thermo Fisher Scientific 170356N 10 mL Nunc serological pipette
Spectrophotometer Eppendorf AG 6135 000.017
Sterile filters Minisart 16534----------K 0.2 µm pore size sterile filters
Syringe 50 mL NORM-JECT 22778
Tetracycline Sigma-Aldrich 87128 antibiotic
Titanium cups Symcel 1220089 inserted in 48-well titanium calPlate
Titanium lids Symcel 1220091 screwed and tightend to the titanium cups
Trimethroprim Sigma-Aldrich T7883 antibiotic
Tweezers Symcel 1900602

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World Health Organization (WHO). Antibiotic resistance. World Health Organization (WHO). Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/antibiotic-resistance (2018).
  2. Herrmann, J., Abou Fayad, A., Müller, R. Natural products from myxobacteria: novel metabolites and bioactivities. Natural Product Reports. 34, (2), 135-160 (2017).
  3. Cassar, S., et al. Use of Zebrafish in Drug Discovery Toxicology. Chemical Research in Toxicology. 33, (1), 95-118 (2020).
  4. Bhusnure, O. G., et al. Drug Target Screening and its Validation by Zebrafish as a Novel Tool. Pharmaceutica Analytica Acta. 6, (10), 426 (2015).
  5. Kraus, J., Tobin, G., Development, Discovery, Deveopment, and Regulation of Natural Products. Using Old Solutions to New Problems - Natural Drug Discovery in the 21st Century. Kulka, M. InTech. Rijeka, HR. 4-36 (2013).
  6. Tabassum, N., Tai, H., Jung, D., Williams, D. R. Fishing for Nature's Hits: Establishment of the Zebrafish as a Model for Screening Antidiabetic Natural Products. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2015, (1), 287847 (2015).
  7. Antimicrobial Development. Symcel. Available from: https://symcel.com/applications/microbiology/antimicrobials-development (2019).
  8. Robador, A., LaRowe, D. E., Finkel, S. E., Amend, J. P., Nealson, K. H. Changes in Microbial Energy Metabolism Measured by Nanocalorimetry during Growth Phase Transitions. Frontiers in Microbiology. 2018, (9), 109 (2018).
  9. Braissant, O., Wirz, D., Göpfert, B., Daniels, A. U. Use of isothermal microcalorimetry to monitor microbial activities. FEMS Microbiology Letter. 303, (1), 1-8 (2010).
  10. Braissant, O., et al. Isothermal microcalorimetry accurately detects bacteria, tumorous microtissues, and parasitic worms in a label-free well-plate assay. Biotechnology Journal. 10, (3), 460-468 (2015).
  11. Butini, M. E., Abbandonato, G., Di Rienzo, C., Trampuz, J., Di Luca, M. Isothermal microcalorimetry detects the presence of persister cells in a Staphylococcus aureus biofilm after vancomycin treatment. Frontiers in Microbiology. 25, (10), 332 (2019).
  12. Tellapragda, C., et al. Isothermal microcalorimetry minimal inhibitory concentration testing in extensively drug resistant Gram-negative bacilli - A multicenter study. Clinical Microbiology and Infection. (2020).
  13. Abdillahi, S., et al. Collagen VI Contains Multiple Host Defense Peptides with Potent In Vivo Activity. The Journal of Immunology. 201, (3), 1007-1020 (2018).
  14. Astasov-Frauenhoffer, M., et al. Exopolysaccharides regulate calcium flow in cariogenic biofilms. PLoS ONE. 12, (10), 1-14 (2017).
  15. Gros, S., et al. Personalized Treatment Response Assessment for Rare Childhood Tumors Using Microcalorimetry-Exemplified by Use of Carbonic Anhydrase IX and Aquaporin 1 Inhibitors. International Journal of Molecular Sciences. 20, (20), 4984 (2019).
  16. Kriszt, R., et al. Optical visualisation of thermogenesis in stimulated single-cell brown adipocytes. Scientific Reports. 7, (1), 1-14 (2017).
  17. Wadsö, I., et al. A well-plate format isothermal multi-channel microcalorimeter for monitoring the activity of living cells and tissues. Thermochimica Acta. 652, (1), 141-149 (2017).
  18. von Ah, U., Wirz, D., Daniels, A. U. Isothermal micro calorimetry - a new method for MIC determinations: results for 12 antibiotics and reference strains of E. coli and S. aureus. BMC Microbiology. 9, (106), (2009).
  19. Howell, M., Wirz, D., Daniels, A. U., Braissant, O. Application of a Microcalorimetric Method for Determining Drug Susceptibility in Mycobacterium Species. Journal of Clinical Microbiology. 50, (1), (2012).
  20. Wadsö, I. Isothermal Microcalorimetry: Current problems and prospects. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry. 64, (2001), 75-84 (2001).
  21. LeBel, M. Ciprofloxacin: chemistry, mechanism of action, resistance, antimicrobial spectrum, pharmacokinetics, clinical trials, and adverse reactions. Pharmacotherapy. 8, (1), 3-33 (1988).
  22. Chopra, I., Roberts, M. Tetracycline antibiotics: mode of action, applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65, (2), 232-260 (2001).
  23. Allison, J. L., et al. Mode of action of chloramphenicol. VII. Growth and multiplication of Escherichia coli in the presence of chloramphenicol. Journal of Bacteriology. 83, (3), 609-615 (1962).
  24. Wehrli, W. Rifampin: mechanisms of action and resistance. Reviews of Infectious Diseases. 5, Suppl 3 407-411 (1983).
  25. Hancock, R. E. W., et al. Agar and broth methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3, (2), 163-175 (2008).
Metabolische profilering om bactericide of bacteriostatische effecten van nieuwe natuurlijke producten te bepalen met behulp van isothermale microcalorimetrie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).More

Cirnski, K., Coetzee, J., Herrmann, J., Müller, R. Metabolic Profiling to Determine Bactericidal or Bacteriostatic Effects of New Natural Products using Isothermal Microcalorimetry. J. Vis. Exp. (164), e61703, doi:10.3791/61703 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter