Belysningen af virkningsmåden for et nyt antibiotikum er en udfordrende opgave i lægemiddelopdagelsesprocessen. Målet med den metode, der er beskrevet her, er anvendelsen af isotermisk mikrocalortri ved hjælp af calScreener i antibakterielle profilering for at give yderligere indsigt i lægemiddel-mikrobe interaktioner.
På grund af den globale trussel om stigende antimikrobiel resistens er der et presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøger naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til sådanne nye forbindelser. En flaskehals i processen er typisk belysning af deres virkningsmåde. Vi har for nylig etableret isotermisk mikrocalortri som en del af en rutinemæssig profilering rørledning. Denne teknologi gør det muligt at undersøge effekten af antibiotika eksponering på den samlede bakterielle metaboliske respons, herunder processer, der er afkoblet fra biomasse dannelse. Det er vigtigt, at bakterostatiske og bakteriidseffekter let kan skelnes uden brugerindgriben under målingerne. Isotermisk mikrocalortri er imidlertid en ret ny tilgang, og anvendelsen af denne metode på forskellige bakteriearter kræver normalt forudgående vurdering af passende målebetingelser. Der er nogle reference termogrammer til rådighed for visse bakterier, i høj grad lette fortolkningen af resultaterne. Da puljen af referencedata vokser støt, forventer vi, at metoden vil have stigende virkning i fremtiden, og forventer, at den giver mulighed for dybdegående fingeraftryksanalyser, der gør det muligt at differentiere antibiotikaklasser.
Formålet med denne metode er at anvende isotermisk mikrocalortri (IMC) som en medium gennemløbsanalyse i virkningsform (MoA) profilering af nye antibakterielle forbindelser. Denne metode afslører data om aktiviteten af forbindelser på bakteriearter og giver oplysninger om den bakteriedræbende eller bakteriostatiske karakter af selve forbindelsen.
Fremkomsten af nye antimikrobiel resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger af almindelige infektioner med kendte antibiotika1. Men, søgen efter nye forbindelser og lægemidler, der kan erstatte eller arbejde i kombination med kendte antibiotika er i gang, og dette er bygget på forskellige tilgange. Naturlige produkter er en central aktør i de nuværende drug discovery kampagner og især i anti-infektiøs lægemiddel opdagelse2. Det er imidlertid en langvarig og økonomisk krævende proces at identificere nye blystrukturer for udvikling afantibiotika. Således er de tidlige opdagelsestrin ekstremt vigtige for at filtrere på de fleste lovende stilladser allerede på et tidligt tidspunkt. Indledende trin i naturlige produkt stof opdagelse omfatter opnåelse af en forbindelse struktur, bestemmelse af aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikation. De fleste vellykkede forbindelser er berettiget til yderligere udvikling bør vise et gunstigt spektrum af aktivitet (dvs. bredspektret aktivitet i tilfælde af antibakterielle stoffer) og en roman MoA, som allerede eksisterende AMR kan overvindes. Lovende stilladser screenes derefter typisk i sekundære analyser, som omfatter in vivo biotilgængelighed, toksicitet og stofskifte4. Ud over de finansielle bekymringer, naturlige produkt stof opdagelse står over for yderligere udfordringer med hensyn til omkostninger og tekniske vanskeligheder i forbindelse med sammensatte isolation og rensning, som igen kan gøre det vanskeligt at opnå multi-milligram eller endda gram beløb i de tidlige stadier af opdagelsenproces 5,6. Derfor er det af største betydning i forskning i naturlige produkter at kunne udføre state-of-the-art primær screening med minimale sammensatte mængder for at træffe en velinformeret beslutning om yderligere investeringer for at gøre et nyt naturprodukt tilgængeligt for præklinisk udvikling. Med brugen af IMC til antibakteriel profilering reduceres mængden af den nødvendige mængde forbindelse betydeligt i forhold til standardmetoder. Teknikken giver også mere dybdegående information om samspillet mellem nye lægemidler med det mikrobielle samfund7.
IMC er en veletableret metode til måling af den samlede energi som følge af alle biologiske, fysiske og biokemiske processer og reaktioner i et biologisk system. Bakteriel energi frigivelse er proportional med den samlede metaboliske reaktioner8. Inden for et lukket system, såsom det anvendte mikrokalatormeter, kan varmeniveauerne måles i mikrowatt-området for at studere de metaboliske kinetikafbakterier9,10,,11,12. Den varme (energi), der frigives af bakterier er knyttet til cellulære funktioner, der ligger til grund for deres stofskifte, og som ikke nødvendigvis er proportional med den cellulære biomasse.
I første omgang har anvendeligheden af isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser været begrænset på grund af dens lave gennemløb og høje testmængder. Men det anvendte mikrokalorimeter er unikt, da det kombinerer fordelene ved isotermisk kalorimetri med øget gennemløb og lavere sammensatte krav, hvilket gør det til et værdifuldt værktøj til drug discovery applikationer10. Endvidere giver instrumentet yderligere fordele i forhold til alternative metoder til måling af bakterievækstkinetik, såsom standard turbiditetsmetoden, som er baseret på måling af optisk tæthed ved 600 nm (OD<600). Måling af OD600 er baseret på den antagelse, at øget optisk tæthed er lig med mikrobiel vækst, hvorved tilstedeværelsen af ikke-levedygtige celler forsømmes. Denne metode er også blevet kritiseret, da den udelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I modsætning hertil giver IMC mulighed for real-time observation af enhver form for levedygtige celler. Hvis cellerne er i dvale, udviser de stadig metabolisk aktivitet, og de kan således detekteres af IMC, mens sådanne fænomener ikke kan påvises ved standard turbiditetsmetoden11. Andre fordele ved IMC omfatter en kortere antimikrobiel følsomhed testtid, måling af lægemiddelinteraktioner i et komplekst samfund og standard analysemetoder uden at ødelæggeprøven 7.
IMC-teknologien er blevet implementeret i en lang række undersøgelser, lige fra mikrobiologi til termogenese og kræftbiologi13,14,15,16,17. De mikrobielle anvendelser omfatter bestemmelse af minimale hæmmende koncentrationer (MIC) af forbindelser mod forskellige bakteriestammer. Der er udført flere undersøgelser, og det er blevet konkluderet, at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for størstedelen af bakteriearterne hurtigere kan opnås , og resultaterne svarer til andre (standard) metoder tilMIC-bestemmelse 12,18,19. Yderligere anvendelser af IMC omfatter observere samspillet mellem narkotika og kombination af narkotika behandlinger med komplekse bakterielle samfund såsom biofilm11. En undersøgelse med fokus på MoA profilering viste, at mikrokalorimet kan påvise en forskel i første- og andengeneration cephalosporiner, mens forskellige antibiotika med samme MoA udviser en lignende varmestrømskurve sammenlignet medhinanden 18.
Her beskriver vi brugen af IMC til MoA profilering af nye naturlige produkter ved hjælp af det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrument. Metoden anvendes til at bestemme effektive antibiotikakoncentrationer og til at beskrive antibiotikas karakteristika i form af baktericid eller bakterostatiske mekanismer. Metoden kan gennemføres bredt i MoA profilering af forbindelser, og den kan erstatte eller i det mindste supplere standardmikrobiologiske metoder. Fremtidige undersøgelser vil omfatte dybdegående fingeraftryksanalyser, der vil gøre det muligt at differentiere antibiotikaklasser baseret på målmekanismer.
Isotermisk mikrocalortri måler energi, der udsendes fra en prøve over tid, og denne energiudsætning er et resultat af alle biologiske, fysiske og (bio)kemiske processer. Den målte varmestrøm kan udnyttes til at evaluere eller bestemme antibakterielle virkninger af stoffer, da det muliggør kontinuerlig real-time overvågning af metabolisk aktivitet.
For at opnå pålidelige analysedata skal korrekte startkolonidannende enheder (CFU) bestemmes individuelt for hver anvendte art eller stamme. Hvis CFU-optællingen er for lav, fører det til en langvarig forsinkelsesfase, da det tager længere tid for systemet at nå en kritisk mængde biomasse, der producerer nok varme til at blive opdaget. I tilfælde af CFU tælle er for høj lag fase vil være meget kort, og mængden af varme produceret kan forårsage varmeoverførsel til tilstødende sensor celler (reference og eksperimentelle brønde) og forårsage forvrængninger af termogrammer. Et stort antal CFU vil også føre til en hurtigere iltsvind og skifte til anaerobe forhold. Det skal også tages i betragtning, at det i løbet af eksperimentets første 30 minutter, når systemet er ligevægt, ikke er muligt at indsamle data, og at den faktiske registrering af virkningerne er forsinket. Desuden fører ukorrekt CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som i sidste ende påvirker eksperimentet og de observerede ændringer25. Et andet kritisk punkt er den korrekte bestemmelse af basislinjen. Normalt vælges basissignalet i lagfasen, når varmeflowsignalet er nul, og ideelt set er tidsintervallet for baselinedefinition >30 min. Dette er dog ikke altid muligt, da den tid, bakterierne har brug for for at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, varierer mellem stammer og arter. Nogle arter eller stammer kræver mere end 30 minutter at nå varmesignaldetekteringsgrænsen, mens andre stammer eller arter når den inden for de første 30 minutter. I så fald er det muligt at vælge grundsignalet i slutningen af forsøget, når alle varmesignalerne er faldet tilbage til nul og forbliver stabile. Alternativt kan baselines fra andre forsøg med samme bakteriestamme anvendes, hvilket dog ikke anbefales.
Systemet giver mulighed for en vis fleksibilitet med hensyn til design og optimering af eksperimenter og fejlfinding. De anvendte mængder er inden for intervallet 100-300 μL ved brug af plastindsatser og 100-600 μL ved brug af titaniumkopper uden plastindsatser. Producentens anbefalede arbejdsvolumen er 120 μL. Brugen af forskellige volumener i forbindelse med oprettelsen af en ny forsøgsserie og samtidig med at der er fundet optimale målbetingelser, har hovedsagelig indvirkning på to parametre. Ved at bruge lavere mængder, mængden af nødvendige testforbindelse kan reduceres, hvilket er særligt vigtigt for forbindelser, som kun er tilgængelige i små mængder. Desuden påvirker den anvendte volumen direkte ilttilgængelighed under målingen med lavere volumener, der øger mængden af tilgængelig ilt, der kræves til bakterievækst. Iltsvind er en af de vigtigste faktorer, der bidrager til den størst mulige varighed af forsøget. Vigtigere er det muligt at bruge faste medier, ikke kun flydende medier. Dette er især vigtigt for langsomt voksende mikroorganismer, da vækst på grænsefladen mellem fast- og gasfasen giver bedre adgang til ilt9.
IMC er et nyttigt analytisk værktøj til at opdage ukendte processer med applikationer inden for fysik, kemi og biologi. Metoden måler varmeudvekslingen inden for et lukket system, og analyse af den registrerede varmeudveksling giver yderligere oplysninger, som ikke altid kan opnås ved hjælp af standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en af de største fordele ved IMC er dens evne til at skelne mellem levende, døde og vedvarende eller sovende celler, hvilket ikke er muligt ved hjælp af standard turbiditet metoder11. Desuden er IMC meget følsom, og det kan detektere varmeemissioner fra så få som 104-105 celler9. En anden fordel er, at den eksperimentelle opsætning er hurtig og nem, og det giver mulighed for kontinuerlig, real-time tracking med minimal til ingen brugerinterferens. Desuden er IMC ikke-destruktiv, hvilket muliggør yderligere analyse af prøver. Dataanalyse giver mulighed for afkobling af biomassedannelse indtil slutningen af eksponentiel eller tidlig stationær fase og metabolisk aktivitet i stationær fase.
Ud over de nye og spændende ansøgning funktioner, der er nævnt ovenfor, er der også ulemper ved denne metode. Den største begrænsning er, at IMC-instrumenter måler den samlede varme, der produceres og frigives i et specifikt system, som også omfatter ikke-specifikke signaler. Dette understreger vigtigheden af eksperimentel planlægning med passende styringer for at kunne vurdere de ændringer i varmesignalet , der måles ved registrering af varmestrømmen9,20.
I vores hænder er IMC et vigtigt redskab til at studere antibakterielle virkninger af nye naturlige produkter og til at bestemme effektive koncentrationsserier. Bortset fra at differentiere bakterostatiske og bakteriid virkninger, det kunne anvendes i fremtiden som en del af mål identifikation undersøgelser og MoA bestemmelse. Dette kan gøres ved at sammenligne termogrammer af forskellige antibiotikaklasser med termogrammer af nye aktive forbindelser som vist her. Det skal dog stadig undersøges, om visse kvantificerbare parametre, der kan udtrækkes fra de målte data, er tilstrækkelige til sådanne sammenligninger, eller om det vil være nødvendigt at arbejde på algoritmer, der giver fingeraftryk baseret på fuld termogram. En anden mulig anvendelse inden for antibiotisk forskning er sammenligningen af wildtype til resistente kloner, kombineret med hele genom sekventering, som kan hjælpe med at belyse tilstanden-of-resistens (MoR) af nye antibakterielle lægemidler. På grund af metodens statiske karakter kan undersøgelse af nye agensers effektivitet på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerede biofilm føre til en bedre forståelse af den biologiske proces og virkningen af udvalgte agenser på mikrober i forskellige stadier af hvile. IMC registrerer den samlede energi, der frigives i form af varme, hvilket gør det til en egnet metode til også at undersøge subhæmmende virkninger af aktive stoffer, der kan kobles til transskriptionomics. Denne metode kan også anvendes i kliniske miljøer til påvisning af kontaminering af prøver eller til bestemmelse af antibiogrammer, der hjælper med hurtigt at træffe beslutning om endelig behandling af patienterne11.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke symcels team for frugtbare diskussioner, og vi vil gerne anerkende den store støtte fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også gerne takke Daniel Kohnhäuser for at levere det naturlige produkt og Stefanie Schmidt for dygtig teknisk support.
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |