Oppklaringen av handlingsmåten til et nytt antibiotika er en utfordrende oppgave i narkotikaoppdagelsesprosessen. Målet med metoden som er beskrevet her er anvendelsen av isotermisk mikrocalorimetry ved hjelp av calScreener i antibakteriell profilering for å gi ytterligere innsikt i interaksjoner mellom stoff og mikrobe.
På grunn av den globale trusselen om økende antimikrobiell resistens, er det presserende behov for nye antibiotika. Vi undersøker naturlige produkter fra Myxobacteria som en innovativ kilde til slike nye forbindelser. En flaskehals i prosessen er vanligvis belysningen av deres handlingsmodus. Vi har nylig etablert isotermisk mikroberegning som en del av en rutinemessig profileringsrørledning. Denne teknologien gjør det mulig å undersøke effekten av antibiotikaeksponering på den totale bakterielle metabolske responsen, inkludert prosesser som er koblet fra biomassedannelse. Viktigere, bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter er lett å skilles uten brukermedvirkning under målingene. Imidlertid er isotermisk mikrocalorimetry en ganske ny tilnærming, og bruk av denne metoden på forskjellige bakterielle arter krever vanligvis forhåndsevaluering av egnede måleforhold. Det er noen referanse termogrammer tilgjengelig for visse bakterier, sterkt tilrettelegge tolkning av resultater. Etter hvert som utvalget av referansedata vokser jevnt og trutt, forventer vi at metodikken vil ha økende innvirkning i fremtiden og forventer at den tillater grundige fingeravtrykksanalyser som muliggjør differensiering av antibiotikaklasser.
Målet med denne metoden er å bruke isotermisk mikrokalorimetri (IMC) som en middels gjennomstrømningsanalyse i handlingsmodus (MoA) profilering av nye antibakterielle forbindelser. Denne metoden avslører data om aktiviteten til forbindelser på bakterielle arter og gir informasjon om den bakteriedrepende eller bakteriostatiske naturen til selve forbindelsen.
Fremveksten av fremvoksende antimikrobiell resistens (AMR) er et globalt problem, og det fører til mindre effektive behandlinger av vanlige infeksjoner med kjente antibiotika1. Imidlertid er søket etter nye forbindelser og legemidler som kan erstatte eller fungere i kombinasjon med kjente antibiotika pågående, og dette er bygget på ulike tilnærminger. Naturlige produkter er en sentral aktør i dagens narkotikaoppdagelseskampanjer og spesielt i anti-infeksiøs narkotikaoppdagelse2. Å identifisere nye blystrukturer for antibiotikautvikling er imidlertid en lang og økonomisk krevende prosess3. Dermed er de tidlige trinnene i oppdagelsen ekstremt viktig for å filtrere på de mest lovende stillasene allerede på et tidlig stadium. Innledende trinn i naturlig produkt narkotika funn inkluderer å skaffe en sammensatt struktur, bestemme aktiviteten in vitro sammen med MoA og mål identifikasjon. De fleste vellykkede forbindelser som er kvalifisert for videre utvikling bør vise et gunstig spekter av aktivitet (det vil si bredspektret aktivitet i tilfelle av antibakterielle) og en roman MoA som eksisterende AMR kan overvinnes. Lovende stillas blir deretter vanligvis screenet i sekundære analyser, som inkluderer in vivo biotilgjengelighet, toksisitet, og metabolisme4. Foruten de økonomiske bekymringene står naturlig produktstofffunn overfor ytterligere utfordringer om kostnadene og tekniske vanskeligheter knyttet til sammensatt isolasjon og rensing, noe som igjen kan gjøre det vanskelig å få flere milligram eller gram mengder i de tidlige stadiene avoppdagelsesprosessen 5,,6. Derfor er det av største betydning i naturlig produktforskning å kunne utføre toppmoderne primærscreening med minimale sammensatte mengder for å ta en godt informert beslutning om ytterligere investeringer for å gjøre et nytt naturlig produkt tilgjengelig for preklinisk utvikling. Ved bruk av IMC for antibakteriell profilering reduseres mengden sammensatt som trengs betydelig i forhold til standardmetoder. Teknikken gir også mer detaljert informasjon om samspillet mellom nye legemidler med mikrobiell samfunn7.
IMC er en veletablert metode for måling av total energi som følge av alle biologiske, fysiske og biokjemiske prosesser og reaksjoner i et biologisk system. Bakteriell energiutløsning er proporsjonal med de totale metabolske reaksjonene8. Innenfor et lukket system, for eksempel det brukte mikrokalorimeteret, kan varmenivåene måles i mikrowattområdet for å studere metabolsk kinetikk av bakterier9,,10,,11,,12. Varmen (energien) som frigjøres av bakterier er knyttet til cellulære funksjoner som ligger til grunn for stoffskiftet, og som ikke nødvendigvis er proporsjonal med cellulær biomasse.
I utgangspunktet har anvendeligheten av isotermisk kalorimetri for mikrobiologiske analyser vært begrenset på grunn av lav gjennomstrømning og høye testvolumer. Det brukte mikrokalorimeteret er imidlertid unikt da det kombinerer fordelene med isotermisk kalorimetri med økt gjennomstrømning og lavere sammensatte krav, noe som gjør det til et verdifullt verktøy for narkotikaoppdagelsesapplikasjoner10. Videre gir instrumentet ytterligere fordeler fremfor alternative metoder for måling av bakteriell vekstkinetikk, for eksempel standard turbiditetsmetode, som er basert på måling av optisk tetthet ved 600 nm (OD<600). Måling av OD600 er basert på antagelsen om at økt optisk tetthet er lik mikrobiell vekst, og dermed forsømmer tilstedeværelsen av ikke-levedyktige celler. Denne metoden har også blitt kritisert da den utelukker små kolonivarianter og persisterceller11. I motsetning tillater IMC sanntidsobservasjon av alle typer levedyktige celler. Hvis cellene er sovende, viser de fortsatt metabolsk aktivitet, og de kan dermed oppdages av IMC, mens slike fenomener ikke kan oppdages ved standard turbiditetsmetode11. Andre fordeler med IMC inkluderer en kortere antimikrobiell følsomhetstesttid, måling av legemiddelinteraksjoner i et komplekst fellesskap og standard analysemetoder uten å ødeleggeprøven 7.
IMC-teknologien er implementert i et bredt spekter av studier, alt fra mikrobiologi til termotilblivelsen og kreftbiologi13,,14,,15,,16,,17. De mikrobielle applikasjonene inkluderer bestemmelse av minimum hemmende konsentrasjoner (MIC) av forbindelser mot ulike bakterielle stammer. Flere studier er gjort, og det har blitt konkludert med at MIC-data fra isotermisk kalorimetri for de fleste bakterielle arter kan oppnås raskere og resultatene er like sammenlignet med andre (standard) metoder for MIC bestemmelse12,18,19. Videre anvendelser av IMC inkluderer å observere samspillet mellom narkotika og kombinasjon av narkotikabehandlinger med komplekse bakterielle samfunn som biofilmer11. En studie med fokus på MoA profilering viste at mikrocalorimeter kan oppdage en forskjell i første- og andregenerasjons cefalosporiner, mens forskjellige antibiotika med samme MoA viser en lignende varmestrømningskurve sammenlignet med hverandre18.
Her beskriver vi bruken av IMC for MoA profilering av nye naturlige produkter ved hjelp av det nye isotermiske mikrokalorimetriinstrumentet. Metoden brukes til å bestemme effektive antibiotikakonsentrasjoner og for å beskrive egenskapene til antibiotika når det gjelder bakteriedrepende eller bakteriostatiske mekanismer. Metoden kan implementeres bredt i MoA profilering av forbindelser, og det kan erstatte eller i det minste utfylle standard mikrobiologiske metoder. Fremtidige studier vil omfatte grundige fingeravtrykksanalyser som vil muliggjøre differensiering av antibiotikaklasser basert på målmekanismer.
Isotermisk mikrokalorimetri måler energi som slippes ut fra en prøve over tid, og denne energiutgivelsen er et resultat av alle biologiske, fysiske og (bio-)kjemiske prosesser. Den målte varmestrømmen kan utnyttes til å evaluere eller bestemme antibakterielle effekter av stoffer som det muliggjør kontinuerlig sanntidsovervåking av metabolsk aktivitet.
For å få pålitelige data for analyse, må korrekte startkolonidannende enheter (CFU) bestemmes individuelt for hver art eller belastning som brukes. Hvis CFU-tellingen er for lav, fører dette til en lengre forsinkelsesfase, da det tar lengre tid før systemet når en kritisk mengde biomasse som produserer nok varme til å bli oppdaget. Hvis CFU-tellingen er for høy, vil forsinkelsesfasen være svært kort, og mengden varme som produseres kan føre til varmeoverføring til nærliggende sensorceller (referanse og eksperimentelle brønner) og forårsake forvrengninger av termogrammene. Høyt antall CFU vil også føre til en raskere oksygenuttømming og bytte til anaerobe forhold. Det må også tas hensyn til at i løpet av de første 30 minuttene av eksperimentet, når systemet er likevekt, er datainnsamling ikke mulig og selve opptaket av effekter er forsinket. I tillegg fører feil CFU-bestemmelse til falsk MIC-bestemmelse, som til slutt påvirker eksperimentet og endringene observert25. Et annet kritisk punkt er riktig bestemmelse av grunnlinjen. Vanligvis velges grunnlinjesignalet under forsinkelsesfasen når varmestrømssignalet er null, og ideelt sett er tidsintervallet for baselinedefinisjon > 30 min. Dette er imidlertid ikke alltid mulig da tiden bakteriene krever for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen varierer mellom stammer og arter. Noen arter eller stammer krever mer enn 30 minutter for å nå varmesignaldeteksjonsgrensen, mens andre stammer eller arter når den i løpet av de første 30 minuttene. I så fall er det mulig å velge grunnlinjesignalet på slutten av eksperimentet når alle varmesignalene har falt tilbake til null og forblir stabile. Alternativt kan baselines fra andre eksperimenter med samme bakterielle belastning brukes, noe som imidlertid ikke anbefales.
Systemet gir en viss fleksibilitet når det gjelder design og optimalisering av eksperimenter og feilsøking. Volumer som brukes er i området 100-300 μL ved bruk av plastinnsatser og 100-600 μL ved bruk av titankopper uten plastinnsatsene. Det anbefalte arbeidsvolumet fra produsenten er 120 μL. Bruken av ulike volumer i å sette opp en ny eksperimentell serie, og samtidig som de finner optimale forhold for målinger, har det hovedsakelig innvirkning på to parametere. Ved hjelp av lavere volumer, mengden av nødvendig test sammensatte kan reduseres, noe som er spesielt viktig for forbindelser, som er tilgjengelig bare i små mengder. I tillegg påvirker det brukte volumet direkte oksygentilgjengeligheten under målingen med lavere volumer som øker mengden tilgjengelig oksygen som kreves for bakteriell vekst. Oksygenuttømming er en av de viktigste faktorene som bidrar til maksimal mulig varighet av eksperimentet. Viktigere er det mulig å bruke faste medier, ikke bare flytende medier. Dette er spesielt viktig for sakte voksende mikroorganismer som vekst på grensesnittet mellom fast og gass fase gir bedre oksygen tilgang9.
IMC er et nyttig analytisk verktøy for å oppdage ukjente prosesser med applikasjoner i fysikk, kjemi og biologi. Metoden måler varmeutvekslingen i et lukket system, og analyse av den registrerte varmeutvekslingen gir ytterligere informasjon som ikke alltid kan oppnås med standardmetoder. I mikrobiologi og antibiotika forskning, en av de største fordelene med IMC er dens evne til å skille mellom levende, døde og persister eller sovende celler, som ikke er mulig ved hjelp av standard turbiditet metoder11. I tillegg er IMC svært følsom, og det kan oppdage varmeutslipp fra så få som 104-105 celler9. En annen fordel er at det eksperimentelle oppsettet er raskt og enkelt, og det gir mulighet for kontinuerlig sanntidssporing med minimal eller ingen brukerforstyrrelser. Videre er IMC ikke-destruktiv, noe som muliggjør videre analyse av prøver. Dataanalyse gjør det mulig å koble fra biomassedannelse til sen eksponentiell eller tidlig stasjonær fase og metabolsk aktivitet i stillefasen.
Foruten romanen og spennende applikasjonsfunksjoner nevnt ovenfor, er det også ulemper med denne metoden. Den store begrensningen er at IMC-instrumenter måler den totale varmen som produseres og frigjøres i et bestemt system, som også inkluderer ikke-spesifikke signaler. Dette understreker viktigheten av eksperimentell planlegging med egnede kontroller for å kunne vurdere varmesignalendringene som måles ved å registrere varmestrøm9,20.
I våre hender er IMC et viktig verktøy for å studere antibakterielle effekter av nye naturlige produkter og for å bestemme effektive konsentrasjonsområder. Bortsett fra differensiering bakteriostatiske og bakteriedrepende effekter, kan den brukes i fremtiden som en del av målidentifikasjonsstudier og MoA-bestemmelse. Dette kan gjøres ved å sammenligne termogrammer av ulike antibiotikaklasser med termogrammer av nye aktive forbindelser som vises her. Det må imidlertid fortsatt undersøkes om visse kvantifiserbare parametere som kan hentes ut fra de målte dataene, er tilstrekkelige for slike sammenligninger, eller om det vil være nødvendig å jobbe med algoritmer som gir fingeravtrykk basert på fulle termogrammer. En annen mulig anvendelse innen antibiotikaforskning er sammenligningen av wildtype til resistente kloner, kombinert med hele genomsekvensering, som kan bidra til å belyse resistensmodus (MoR) av nye antibakterielle. På grunn av metodens statiske natur kan undersøkelse av effekt av nye midler på enten biofilmdannelse eller på allerede etablerte biofilmer føre til bedre forståelse av den biologiske prosessen og effekten av utvalgte midler på mikrober i forskjellige stadier av dvalen. IMC registrerer total energi utgitt i form av varme, noe som gjør det til en passende metode for å undersøke også sub-hemmende effekter av aktive stoffer som kan være koplet til transkripsjonsmikromer. Denne metoden kan også brukes i kliniske omgivelser for å oppdage forurensning av prøver eller for bestemmelse av antibiogrammer som bidrar til å raskt bestemme bestemt behandling av pasientene11.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke symcelteamet for fruktbare diskusjoner, og vi vil gjerne anerkjenne den store støtten fra Ganna Oliynyk og Wilhelm Paulander. Vi vil også takke Daniel Kohnhäuser for å ha gitt det naturlige produktet og Stefanie Schmidt for dyktig teknisk støtte.
Acinetobacter baumannii | DSMZ | DSM-30008 | reference strain used in this study |
calPlate | Symcel | 1220093 | 48-well plate for titanium cups to be inserted |
calScreener | Symcel | 1200001 | isothermal microcalorimetry instrument |
calView software | Symcel | collection and analysis software | |
calWell | Symcel | 1901004 | micro-bio grade (non-active) 48-well plate with plastic inserts which are inserted into the titanium cups |
CASO agar | Carl Roth | X937.1 | isolation and cultivation of microorganisms |
Chloroamphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | antibiotic |
Ciprofloxacin | Sigma-Aldrich | 17850 | antibiotic |
Cuvettes | Brand | 759015 | 1.5 mL cuvettes |
Disposable inoculation loops | Sarsted | 86.1562.050 | 10 µL inoculation loops |
Dimethylsulfoxid (DMSO) | Thermo Fisher Scientific | 85190 | |
Eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL eppendorf safe-lock tubes |
Ethanol | Thermo Fisher Scientific | 10428671 | |
Falcon Tubes | Sarsted | 62.554.502 | 15 mL falcon tubes |
Hydrochloride (HCL) | Thermo Fisher Scientific | 10316380 | |
Methanol | Thermo Fisher Scientific | A412-500 | |
Mueller Hinton Broth | Sigma-Aldrich | 70192 | liquid medium for antibiotic susceptibility studies |
Mueller Hinton Broth II cation adjusted media | Sigma-Aldrich | 90922 | Mueller Hinton Broth cation-adjusted to 1.25 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2 |
Petri dishes | LABSOLUTE | 7696404 | |
Pipette 100 – 1000 µL | Brand | 705880 | |
Pipette 2 – 20 µL | Brand | 705872 | |
Pipette 20 – 200 µL | Brand | 705878 | |
Pipette tips 100 – 1000 L | Brand | 732032 | |
Pipette tips 2 – 200 µL | Brand | 732028 | |
Polymyxin B sulfate | Sigma-Aldrich | P0972 | antibiotic |
Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
Serological pipette | Thermo Fisher Scientific | 170356N | 10 mL Nunc serological pipette |
Spectrophotometer | Eppendorf AG | 6135 000.017 | |
Sterile filters | Minisart | 16534———-K | 0.2 µm pore size sterile filters |
Syringe 50 mL | NORM-JECT | 22778 | |
Tetracycline | Sigma-Aldrich | 87128 | antibiotic |
Titanium cups | Symcel | 1220089 | inserted in 48-well titanium calPlate |
Titanium lids | Symcel | 1220091 | screwed and tightend to the titanium cups |
Trimethroprim | Sigma-Aldrich | T7883 | antibiotic |
Tweezers | Symcel | 1900602 |