Summary
Presentamos un método in vitro de alto rendimiento para cuantificar la deposición pulmonar regional a nivel del lóbulo utilizando modelos pulmonares impresos en 3D derivados de tomografía computarizada con perfiles de flujo de aire ajustable.
Abstract
El desarrollo de terapias específicas para enfermedades pulmonares está limitado por la disponibilidad de métodos de prueba preclínicos con la capacidad de predecir el suministro regional de aerosoles. Aprovechando la impresión 3D para generar modelos pulmonares específicos del paciente, delineamos el diseño de una configuración experimental in vitro de alto rendimiento para cuantificar la deposición pulmonar lobular. Este sistema está fabricado con una combinación de componentes impresos 3D y disponibles comercialmente y permite controlar de forma independiente el caudal a través de cada lóbulo del pulmón. La entrega de aerosoles fluorescentes a cada lóbulo se mide mediante microscopía de fluorescencia. Este protocolo tiene el potencial de promover el crecimiento de la medicina personalizada para enfermedades respiratorias a través de su capacidad para modelar una amplia gama de estados de demografía y enfermedades de los pacientes. Tanto la geometría del modelo pulmonar impreso en 3D como el ajuste del perfil de flujo de aire se pueden modular fácilmente para reflejar datos clínicos de pacientes con diferentes edades, raza y género. Los dispositivos de administración de fármacos clínicamente relevantes, como el tubo endotraqueal que se muestra aquí, se pueden incorporar a la configuración de pruebas para predecir con mayor precisión la capacidad de un dispositivo para dirigir el parto terapéutico a una región enferma del pulmón. La versatilidad de esta configuración experimental permite personalizarla para reflejar multitud de condiciones de inhalación, mejorando el rigor de las pruebas terapéuticas preclínicas.
Introduction
Muchas enfermedades pulmonares como el cáncer de pulmón y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) presentan diferencias regionales en las características de la enfermedad; sin embargo, hay una falta de técnicas terapéuticas disponibles para el tratamiento de fármacos dirigidos a sólo las regiones enfermas del pulmón1. Múltiples modelos dinámicos de fluido computacional (CFD) han demostrado que es posible modular los perfiles de deposición de fármacos mediante la identificación de agilizaciónes específicas en el pulmón2,3. El desarrollo tanto de inhaladores como de adaptadores de tubo endotraqueal (ET) con capacidades de segmentación regionales está en marcha en nuestro laboratorio para controlar la distribución de aerosoles a las regiones pulmonares enfermas. La extensión de estos principios al uso clínico está limitada por la capacidad actual de pruebas preclínicas. La ubicación precisa de un medicamento deposita dentro del pulmón se sabe que es el mejor predictor de eficacia; sin embargo, las evaluaciones farmacéuticas actuales de las terapias inhalables se predicen con mayor frecuencia utilizando correlaciones in vitro-in vivo del tamaño de las partículas para limitarse a aproximar la deposición4. Esta técnica no permite ningún análisis espacial para determinar los efectos de diferentes geometrías de las vías respiratorias en la distribución regional a través de los diversos lóbulos del pulmón. Además, esta prueba carece de geometrías pulmonares anatómicamente precisas, que los investigadores han demostrado que pueden tener un impacto significativo en los perfiles de deposición5. Se han hecho algunos esfuerzos para incorporar geometrías pulmonares específicas del paciente en los protocolos de prueba a través de la adición de las vías respiratorias superiores; sin embargo, la mayoría de estos enfoques muestra la entrega de aerosoles a varias generaciones del pulmón en lugar de cada lóbulo pulmonar6,7,8. El siguiente protocolo presenta un método de alto rendimiento para generar modelos pulmonares específicos del paciente con capacidad para cuantificar la deposición relativa de partículas en cada uno de los cinco lóbulos del pulmón9.
Los pulmones modelo anatómicamente precisos son generados por la impresión 3D de tomografía computarizada (TC) del paciente. Cuando se utiliza junto con un sistema de flujo fácilmente ensamblado, los caudales relativos a través de cada uno de los lóbulos del pulmón modelo se pueden controlar y adaptar de forma independiente para imitar los de diferentes estados de demografía y/o enfermedad de los pacientes. Con este método, los investigadores pueden probar la eficacia de los métodos terapéuticos potenciales en una geometría pulmonar relevante y correlacionar el rendimiento de cada método con la progresión de la morfología enferma. Aquí, dos diseños de dispositivos desarrollados en nuestro laboratorio son probados por su capacidad para aumentar la deposición en un lóbulo pulmonar deseado mediante el control de la ubicación de la liberación de aerosoles en la boca o la tráquea. Este protocolo también tiene el potencial de afectar significativamente el desarrollo de procedimientos personalizados para los pacientes facilitando la rápida predicción de la eficacia del tratamiento en un pulmón modelo específico de los datos de la tomografía computarizada de ese paciente.
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Protocol
1. Preparación de componentes experimentales impresos en 3D
NOTA: Todo el software utilizado en el protocolo se indica en la Tabla de materiales. Además, el software de corte utilizado es específico de la impresora 3D que aparece en la Tabla de Materiales; sin embargo, este protocolo se puede extender a una amplia gama de impresoras 3D de estereolitografía (SLA).
- Convierta las tomografías computarizadas del paciente en objetos 3D (archivos .stl).
NOTA: Para una discusión más detallada de las características geométricas del modelo pulmonar específico utilizado en estos estudios, consulte Feng et al.5.- Renderice tomografías computarizadas en un objeto 3D mediante un software de tomografía computarizada (consulte Tabla de materiales). Abra la tomografía computarizada y cree una máscara en el espacio aéreo utilizando la herramienta Umbral con un ajuste en el rango de -800 a -1000. Con la herramienta Vista previa 3D, vea la representación 3D y exporte el objeto (Archivo | Export )como un archivo .stl.
- Importación de los archivos en el software de edición de malla (consulte Tabla de materiales),elimine las operaciones irregulares mediante la herramienta Seleccionar (Esculpir | Pinceles: | "Encogimiento/Suavizado" Propiedades: Resistencia (50), Tamaño (10), Profundidad(0)). Suavizar la superficie(Ctrl+A | Deformar | | suave Suavizado (0.2), Escala de suavizado (1)).
- En el software de edición de malla, extienda la pared de estos objetos 2 mm(Ctrl+A | Editar | Desfase) y permita que el objeto interno permanezca hueco de tal forma que sólo quede el muro. Cortar el objeto (Seleccione | Editar | Corte plano) en la tráquea para formar una entrada y en las generaciones 2 o 3 donde el objeto se ramifica a cada lóbulo para crear salidas (Figura 1A).
NOTA: El espesor de 2 mm se eligió en función de los tamaños de función aceptables especificados por el fabricante de la impresora 3D que aparece en la Tabla de materiales. Este espesor se puede ajustar en función de las especificaciones de la impresora 3D disponibles si se mantiene la geometría interior del modelo.
- Modifique las geometrías de salida del modelo pulmonar del paciente para que sean compatibles con los componentes de la tapa de salida del lóbulo previamente diseñados(Figura 1B,C)enumerados en la Tabla de Materiales.
- Importar el objeto 3D, que replica la tomografía computarizada en el interior, tiene un espesor de pared de 2 mm, y está abierto en la entrada y las salidas, en el software de modelado 3D (ver Tabla de materiales)como cuerpo sólido(abierto | Archivos de malla | Opciones | Cuerpo sólido).
- Crear un plano basado en una cara en cada una de las salidas (Insertar | Geometría de referencia | Plano). Con la herramienta de empalme, trace la pared interior y la pared exterior de la toma de corriente en un croquis del plano(Croquis | Spline).
- Loft un cilindro (OD 18,5 mm, ID 12,5 mm, H 15,15 mm) para conectarse a la pared interior y exterior del modelo, extendiendo así la salida para que sea uniforme en cada lóbulo(características | Jefe/Base Elevado). Agregue una muesca alrededor del borde de la toma de corriente para que coincida con la tapa(operaciones | Corte extruido | Desplazamiento).
NOTA: La tapa (Figura 1D) es un cilindro hueco que coincide con las dimensiones de las salidas y tiene un estante que se interconecta con la muesca de la salida del modelo. Un extremo de la tapa se bloquea de tal forma que el ID es más pequeño que el resto de la pieza, esto garantiza un ajuste ajustado alrededor de la conexión de tubo de púas (Figura 1E). La conexión de tubo de púas es una forma de cono de púas de tal manera que el púas se ajusta a través de la abertura de la tapa, pero el resto de la pieza no, lo que permite que la conexión de tubo se ajuste de forma segura en la tapa. Por lo tanto, la tapa se ajusta firmemente alrededor tanto de la conexión de tubo de púas como del modelo pulmonar(Figura 1F,G). - Modifique la entrada del modelo pulmonar en función de las condiciones experimentales deseadas. Las regiones de garganta y glottal se pueden incluir para imitar a un paciente que puede respirar por sí solo(Figura 1B). Las regiones por encima de la tráquea se pueden quitar utilizando un corte extruido para imitar a un paciente intubado en el soporte del respirador(características | Corte extruido) (Figura 1C).
- Oriente y admita componentes experimentales en el software de corte proporcionado por el fabricante de impresoras 3D.
- Importe archivos de pieza 3D en el software de corte de impresora 3D y elija la resina adecuada. Utilice una resina dura para imprimir los modelos pulmonares y las conexiones de tubo de púas, y una resina suave para imprimir las tapas.
NOTA: La resina utilizada para imprimir las tapas debe tener propiedades elásticas para permitirle estirarse sobre la salida del lóbulo y crear un sello hermético. - Establezca la orientación de la pieza de forma que se minimicen las "islas" y los volúmenes no ventilados. La mejor orientación para los modelos pulmonares es con las salidas de lóbulo mirando lejos de la plataforma de impresión. Asegúrese de que tanto las conexiones de tubo de púas como las tapas tengan las partes más anchas que dan a la plataforma de impresión.
NOTA: Se pueden ver sectores individuales para comprobar la apariencia de "islas", secciones de la pieza que aparecen por primera vez en un sector sin estar conectadas al cuerpo principal de la pieza. La función de revisión se puede utilizar para comprobar si hay rodajas con volúmenes no ventilados, áreas donde la resina no curada puede quedar atrapada dentro de la pieza durante la impresión. Tanto los volúmenes "islands" como los no ventilados disminuyen la calidad de impresión y podrían provocar un fallo en la impresión. - Al ver cada sector individualmente, agregue soportes a las "islas" restantes de la pieza, así como a cualquier área con voladizos significativos. Exporte y vea los sectores de la impresión para comprobar que todas las áreas son compatibles correctamente.
- Importe archivos de pieza 3D en el software de corte de impresora 3D y elija la resina adecuada. Utilice una resina dura para imprimir los modelos pulmonares y las conexiones de tubo de púas, y una resina suave para imprimir las tapas.
- Imprima componentes experimentales y complete el postprocesamiento según las instrucciones del fabricante.
NOTA: Todos los pasos posteriores al procesamiento descritos a continuación son específicos de la impresora 3D que aparece en la Tabla de materiales. Al utilizar impresoras o materiales alternativos, ajuste estos pasos para reflejar las instrucciones del fabricante.- Para piezas impresas en resina blanda, lave con ≥99% de pureza de alcohol isopropílico (IPA) para eliminar el exceso de resina no curada y cura térmica en un horno de convección durante 8 h de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
NOTA: Las piezas impresas en resina blanda pueden ser muy delicadas inmediatamente después de la impresión, por lo que se debe tener especial cuidado durante los pasos de limpieza. La exposición al IAP debe mantenerse por debajo del límite de exposición al disolvente del material para evitar la degradación de las piezas. - Para piezas impresas en resina dura, lávese con IPA para eliminar el exceso de resina sin curar y curar en un horno UV (luz de 365 nm a 5-10 mW/cm2)durante 1 min por lado.
NOTA: Para evaluar la precisión de la réplica impresa en 3D, se recomienda utilizar el escaneo μCT de la pieza impresa y el software de tomografía computarizada para comparar, cuantitativamente, las variaciones entre la representación 3D original y la réplica impresa en 3D.
- Para piezas impresas en resina blanda, lave con ≥99% de pureza de alcohol isopropílico (IPA) para eliminar el exceso de resina no curada y cura térmica en un horno de convección durante 8 h de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
2. Montaje del sistema de tubos para el control del caudal
- Atornille los accesorios de tubo de púas de 1/4" en el lado del colector con 6 puertos(Figura 2A-6)y un tubo de púas de 3/8" que se ajuste al puerto restante.
- Corte el tubo de 1/4" a las longitudes deseadas e inserte en cada extremo de las válvulas push-to-connect(Figura 2A-5). Conecte cada válvula a uno de los accesorios de 1/4" insertados en el colector.
- Conecte un medidor de flujo(Figura 2A-4)al otro extremo de cada válvula.
- Coloque el sistema de tubos en la parte superior de la tabla de madera de modo que el accesorio único de 3/8" del colector se extienda más allá del borde del tablero. Para fijar en su lugar, añadir dos tornillos a un lado de la placa de madera y fijar el colector a los tornillos utilizando alambre.
- Añadir cuatro tornillos colocados alrededor de cada una de las válvulas y medidores de flujo y utilizar alambre para fijar cada uno de ellos a la placa de madera(Figura 2E).
- Con aproximadamente 6" de tubo de identificación de 3/8", conecte el colector a un filtro de grado de vacío de tamaño de poro de 0,1 μm en línea. Conecte el otro extremo del filtro al controlador de flujo utilizando otro tubo de ID de 6" de 3/8"
NOTA: El sistema de tubos solo debe montarse una vez.
3. Montaje de tapas de salida de lóbulo con modelo pulmonar del paciente
NOTA: Esta parte del protocolo debe completarse antes de cada ejecución experimental.
- Inserte la conexión de tubo de púas en la tapa con boquilla que sobresale a través de la abertura en la base de la tapa. En primer lugar, inserte un extremo de la base ovalada de conexión de tubo de púas en la tapa. Luego, estira cuidadosamente la tapa flexible sobre el otro extremo de la base ovalada, teniendo especial cuidado de no romper la base delgada.
NOTA: Las tapas recién impresas pueden ser más rígidas de lo deseado y se pueden estirar corriendo dos dedos a lo largo del interior de la tapa. - Corte el papel filtrante de 10 μm de forma que sea ligeramente más grande que el área de salida. Doble el papel de filtro sobre la toma del lóbulo y sujete en su lugar con una mano.
- Por otro lado, utilice pinzas para estirar la tapa con conexión de tubo de púas sobre la salida. Presione la tapa hacia abajo hasta que la muesca de la tapa coincida con la muesca correspondiente en la salida del lóbulo (Figura 2C).
NOTA: Rasgar el papel filtrante en este paso puede invalidar los resultados, por lo que se debe tener especial cuidado para evitar la fuerza excesiva al presionar la tapa en la salida. - Repita para todas las salidas de lóbulos restantes (Figura 2D).
4. Generación de perfil de flujo de aire clínicamente relevante
NOTA: Esta parte del protocolo debe completarse antes de cada ejecución experimental.
- Conecte cada salida del lóbulo modelo pulmonar al tubo del medidor de flujo y la válvula correspondientes, teniendo cuidado de no aplicar demasiada presión lateral a la conexión de tubo de púas. Conecte el medidor de flujo electrónico a la entrada de boca del modelo pulmonar para medir el caudal total de aire al modelo pulmonar.
- Encienda el controlador de flujo(Figura 2A-7)y la bomba de vacío (Figura 2A-8). Seleccione el ajuste "configuración de prueba" en el controlador de flujo y aumente lentamente el caudal hasta que el medidor de flujo electrónico muestre el caudal total deseado.
- Con las válvulas(Figura 2E-5),ajuste el caudal a través de cada uno de los cinco lóbulos pulmonares: Superior derecho (RU), Medio derecho (RM), Inferior derecho (RL), Superior izquierdo (LU) e Inferior izquierdo (LL). Una vez que los caudales del lóbulo mostrados en los medidores de flujo(Figura 2E-4)sean constantes al valor deseado, compruebe de nuevo el caudal total en el medidor de flujo electrónico para verificar que no hay fugas en el sistema.
- Si hay una discrepancia en el caudal total, baje el caudal con el controlador de flujo, fije todas las válvulas a la configuración completamente abierta y repita los pasos 4.2 y 4.3.
NOTA: Los resultados presentados aquí se obtuvieron utilizando perfiles de flujo de aire basados en datos reportados por Sul et al.10 Estas fracciones de flujo de barra de lobar se calcularon utilizando imágenes de tomografía computarizada en rodajas finas de pulmones de pacientes a plena inspiración y expiración, comparando los cambios relativos en el volumen de cada lóbulo pulmonar. Los resultados se presentan para dos condiciones de flujo distintas, ambas a un caudal total de entrada de 1 L/min. El perfil de flujo de salida del lóbulo pulmonar sano se distribuye a cada toma por el siguiente porcentaje del flujo de entrada: LL-23,7%, LU-23,7%, RL-18,7%, RM-14,0%, RU-20,3%. El perfil de flujo de salida del lóbulo COPD se distribuye entre cada toma por el siguiente porcentaje del flujo de entrada: LL-10,0%, LU-29,0%, RL-13,0%, RM-5,0%, RU-43,0%9,10.
- Si hay una discrepancia en el caudal total, baje el caudal con el controlador de flujo, fije todas las válvulas a la configuración completamente abierta y repita los pasos 4.2 y 4.3.
- Salga de la función " configuración deprueba" del controlador de flujo, pero deje la bomba de vacío encendida.
NOTA: Apagar la bomba de vacío entre ajustar los caudales y realizar el experimento de deposición puede provocar imprecisiones en el perfil de flujo generado. Se recomienda dejar la bomba de vacío encendida una vez que se establezcan los caudales deseados para completar las pruebas de deposición de aerosoles.
5. Entrega de aerosol al modelo pulmonar
NOTA: Los experimentos deben realizarse en una campana de humo con la faja cerrada para minimizar la exposición a cualquier aerosol generado por el nebulizador.
- Llene el nebulizador con la solución de las partículas fluorescentes deseadas(Figura 2A-1)y conéctese a la entrada del modelo pulmonar (Figura 2B).
NOTA: Los resultados presentados aquí se obtuvieron utilizando 30 ml de una dilución de 1:100 de partículas de poliestireno fluorescente de 1 μm en metanol.- Para validar la configuración experimental, conecte el nebulizador directamente a la entrada del modelo pulmonar sin ningún dispositivo de segmentación.
- Para medir la eficacia de un dispositivo de segmentación, conecte el nebulizador al dispositivo e inserte el dispositivo en el modelo pulmonar.
- Conecte la línea de aire comprimido al nebulizador y cierre la faja del capó del humo tanto como sea posible.
- Establezca el controlador de flujo para que se ejecute para una prueba de 10 s. Antes de pulsar el inicio, abra ligeramente la válvula de aire comprimido para comenzar a generar un aerosol dentro del nebulizador.
- Pulse start en el controlador de flujo y abra inmediatamente la válvula de aire comprimido completamente. Una vez que el controlador de flujo alcance aproximadamente 9 s, comience a cerrar la válvula de aire comprimido.
- Una vez que la válvula de aire comprimido esté completamente cerrada, desconecte el nebulizador de la línea de aire comprimido, cierre completamente la faja del capó del humo, apague la bomba de vacío y deje que los aerosoles se despejen de la campana del humo durante unos 10 minutos.
NOTA: Es importante apagar la bomba de vacío después de completar una carrera para evitar que se acumule un vacío dentro del sistema de tuberías. - Después de esperar una cantidad suficiente de tiempo, desconecte el modelo pulmonar del sistema de tuberías, teniendo especial cuidado de no romper las conexiones de tubo de púas.
- Retire las tapas de salida del lóbulo ejecutando un par de pinzas debajo del borde de la tapa y levantándola suavemente del modelo pulmonar.
- Retire el papel filtrante de la tapa y colóquelo en una placa de 24 pozos con el lado en el que las partículas depositadas están en la parte inferior mirando hacia el pozo de la placa. Repita para las salidas restantes y etiquete el pozo correspondiente a cada lóbulo.
NOTA: Para evitar que cualquier deposición de partículas residuales afecte a experimentos posteriores, es importante enjuagar tanto el modelo pulmonar como los componentes de la tapa con IPA o disolvente adecuado entre carreras. Esto se puede recoger e incluir en el análisis como se desee. Además, se mantiene un registro para asegurarse de que todas las réplicas utilizadas se han expuesto mínimamente a IPA para mantener la integridad de la pieza y se recomienda la inspección de piezas visuales antes de su uso.
6. Imagen del papel filtrante de salida
- Coloque la placa del pozo en el microscopio digital de fluorescencia y ajuste el microscopio a una ampliación de 4x y al canal de fluorescencia adecuado.
- Identifique visualmente qué papel filtrante del lóbulo tiene la mayor cantidad de deposición de partículas y utilice la función"Exponer automáticamente". Tome nota de los valores de tiempo de exposición e integración resultantes.
- Aplique esta exposición a todos los filtros para la ejecución y evalúe si la configuración produce una imagen satisfactoria para todas las áreas de alta deposición de los filtros.
NOTA: La configuración de enfoque se puede cambiar de filtro a filtro; sin embargo, todos los filtros para una ejecución determinada deben analizarse en la misma configuración de exposición. Sólo es posible tener un marco de enfoque a la vez, por lo que las curvas o desgarros en el papel filtrante pueden evitar que todas las partículas depositadas en la vista estén enfocadas. Esto se puede evitar asegurándose de que el papel filtrante esté plano contra la parte inferior de la placa del pozo. - Tome al menos tres imágenes del papel filtrante de cada lóbulo en ubicaciones aleatorias y guárdelas como archivos de .tiff.
7. Cuantificación de la deposición de partículas
- Importe todas las imágenes de papel de filtro para una ejecución determinada en una sesión de ImageJ.
- Cambie el tipo de cada imagen a 8 bits seleccionando Imagen | Tipo | 8 bits.
- Abra la imagen con la mayor fluorescencia y seleccione Imagen | Ajustar | Umbral para abrir una ventana de umbral. Ajuste los valores de umbral para minimizar la señal de fondo del papel filtrante y defina claramente los bordes de las partículas. Consulte la Figura 3 para obtener representaciones de umbrales de buena calidad y mala calidad.
NOTA: Para los filtros con altos niveles de deposición, se puede observar una "corona" de fluorescencia, causada por la difracción de la luz por las fibras de papel filtrante, alrededor de grandes agrupaciones de partículas. Al umbral de estas imágenes, un rango demasiado grande muestra pequeños puntos o formas "similares a plumas" alrededor de estas agrupaciones, como se observa en las imágenes de umbral "pobres" en la Figura 3. Esto se puede mejorar aumentando gradualmente el límite inferior del umbral hasta que la señal de las fibras de papel filtrante se minimice sin ocultar la señal de las propias partículas. - Propague los ajustes de umbral de la imagen de fluorescencia más alta a todas las demás imágenes.
- Cuantifique el número de partículas y el área fluorescente total seleccionando Analizar | Analizar partículas.
NOTA: Los conjuntos de datos se comparan con la prueba de comparaciones múltiples de Sidak y una ANOVA bidireccional. Además, la deposición en solo el lóbulo de interés se compara con una prueba T de estudiante que asume la misma varianza.
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Representative Results
Las partículas en este rango de tamaño (1-5 μm) y las condiciones de flujo (1-10 L/min) siguen las líneas de flujo de fluidos basadas tanto en su número teórico de Stokes como en los datos in vivo; por lo tanto, en ausencia de un dispositivo de entrega dirigido, se espera que las partículas liberadas en el modelo pulmonar se depositen de acuerdo con el porcentaje de flujo de aire total desviado a cada lóbulo. Las cantidades relativas de administración de partículas a cada lóbulo se pueden comparar con los datos del caudal del lóbulo clínico obtenidos mediante el análisis de tomografía computarizada de alta resolución específica del paciente (HRCT) explora10. Una configuración experimental validada producirá un perfil de deposición de partículas no dirigido que no tiene ninguna diferencia estadísticamente significativa con respecto al perfil de flujo de aire clínico. Se presentan datos de validación para dos condiciones de flujo distintas: 1 L/min en un pulmón sano(Figura 4A)y 1 L/min en un pulmón afectado por EPOC (Figura 4B). En ambas condiciones, el perfil de deposición determinado experimentalmente no era estadísticamente diferente de los datos clínicos, lo que demuestra que la configuración imita con precisión la distribución del flujo de aire a cada uno de los lóbulos pulmonares. Estos perfiles de deposición de línea base sirvieron como control contra el que se comparan los perfiles de deposición de partículas dirigidos.
Para ilustrar la capacidad de este protocolo para cuantificar los cambios en la deposición pulmonar regional, se incluyeron datos para la prueba de dos dispositivos de segmentación diferentes: un tubo endotraqueal modificado (ET) (Figura 5B) y un dispositivo de cilindro concéntrico (Figura 5E). Ambos dispositivos presentaban una salida de identificación de 2 mm con ubicación ajustable para la liberación de partículas objetivo. El tubo ET modificado fue evaluado con el modelo pulmonar intubado por su capacidad para apuntar a la deposición de partículas tanto al lóbulo inferior izquierdo (LL) como al lóbulo inferior derecho (RL). En comparación con el perfil de deposición de partículas no objetivo, este dispositivo generó un aumento de casi cuatro veces en la entrega de Lóbulos LL (T-test p=0.004, n=3) además de desviar más del 96% de las partículas entregadas al pulmón izquierdo (T-test p=0.0001, n=3) (Figura 5A). Alterando la configuración de ubicación de liberación para dirigirse al lóbulo RL, este dispositivo generó más del doble de entrega de partículas al lóbulo RL (T-test p=0.02, n=3) y desvió el 94% de las partículas entregadas al pulmón derecho (T-test p=0.0005, n=3) (Figura 5C). Esto indica que el dispositivo tiene mucho éxito en la producción de la modulación de perfil de deposición prevista. El dispositivo de cilindro concéntrico se probó en el modelo pulmonar completo con un objetivo previsto del lóbulo superior izquierdo (LU). En comparación con el perfil de deposición de partículas no objetivo, este dispositivo causó un aumento de casi tres veces en la entrega de Lóbulo LU (T-test p=0.0003, n=3) además de desviar más del 87% de las partículas entregadas al pulmón izquierdo (T-test p=0.002, n=3) (Figura 5D). La eficiencia de segmentación también se puede observar cualitativamente comparando las imágenes del filtro del lóbulo de destino con los demás filtros de salida. Como se muestra en la Figura 3,el método de segmentación más eficaz producirá una alta deposición de partículas en el lóbulo de interés previsto y baja deposición en las salidas de lóbulos restantes. Para más demostraciones de las capacidades de este protocolo, consulte los experimentos realizados por Kolewe et al9.
Figura 1: Componentes experimentales impresos en 3D. (A) Tomografía computarizada del paciente convertida en archivo de pieza 3D utilizando tomografía computarizada y software de edición de malla. (B) Modelo pulmonar con modificaciones de salida de lóbulo realizadas en edición de malla y software de modelado 3D. (C) Modelo pulmonar con entrada modificada en software de modelado 3D para reflejar a un paciente intubado. (D) Conexión de tubo de púas y tapa (E) diseñada en software de modelado 3D. (F) Sección transversal del modelo 3D que representa la naturaleza entrelazada de las salidas del modelo pulmonar con la tapa y la conexión de tubo de púas. (G) Vista explosionada del conjunto de la tapa de salida del modelo pulmonar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Montaje de la configuración experimental. (A) Esquema de configuración experimental incluyendo (1) nebulizador, (2) modelo de pulmón, (3) tapas de salida, (4) medidores de flujo, (5) válvulas, (6) colector, (7) controlador de flujo y (8) una bomba de vacío. (B) Configuración totalmente montada. (C) Primer plano de salida de lóbulo con tapa ensamblada. (D) Modelo pulmonar con todas las tapas añadidas. (E) Primer plano de la red de tuberías para ajustar los caudales de salida del lóbulo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Filtrar el procesamiento de imágenes de papel. Las imágenes crudas presentadas fueron recogidas durante un experimento para dirigirse al pulmón izquierdo usando partículas de poliestireno fluorescente de 1 μm a 1 L/min bajo un perfil de respiración saludable. Las imágenes de deposición "alta" y "baja" representan los filtros LL y RU Lobe, respectivamente. El umbral "bueno", aplicado con un rango de 43 a 255, mantiene los bordes definidos entre partículas individuales y evita la detección de fibras de papel filtrante. El umbral "pobre", aplicado con un rango de 17 a 255, oscurece los bordes de partículas individuales y sobreestima el área fluorescente del filtro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Validación de configuración experimental. (A) Resultados de validación para pacientes sanos y (B) un paciente de EPOC a 1 L/min. Todos los datos presentados son medias ± SD con tres réplicas (excepto datos clínicos de EPOC, donde solo se informó a un paciente). Se obtuvieron datos de referencia clínica para pacientes sanos y con EPOC de Sul, et al10. Los conjuntos de datos se compararon mediante la prueba de comparaciones múltiples de Sidak y todas las diferencias no son significativas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Ejemplo de datos para los experimentos de segmentación. (A) Lóbulo inferior izquierdo y (C) Objetivo del lóbulo inferior derecho logrado utilizando (B) un sistema de entrega de tubo ET modificado. (D) Objetivo del lóbulo superior izquierdo logrado utilizando (E) un sistema de entrega de tubos concéntricos. Para los tres conjuntos de datos, el anillo interno representa el perfil de deposición no dirigido obtenido durante la validación de la configuración y el anillo externo representa el perfil de deposición producido con la adición del dispositivo de destino indicado. Se muestran los medios de tres réplicas para cada configuración. Los conjuntos de datos se compararon mediante la prueba de comparaciones múltiples de Sidak y una prueba T del alumno asumiendo la misma varianza. Las tres configuraciones produjeron un aumento significativo en la entrega al lóbulo de interés: LL Lobe (T-test p=0.004, n=3), RL Lobe (T-test p=0.02, n=3) y LU Lobe (T-test p=0.0003, n=3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El dispositivo actual de última generación para pruebas farmacéuticas pulmonares de una dosis completa de inhalación es el Next Generator Impactr (NGI), que mide el diámetro aerodinámico de un aerosol4. Estos datos de tamaño se utilizan entonces para predecir la generación pulmonar a la que el aerosol se depositará en función de una correlación desarrollada para un macho adulto sanode 11años. Desafortunadamente, este método es limitado en su capacidad para evaluar las diferencias en la deposición pulmonar regional, determinar los efectos de las condiciones de la enfermedad en el parto farmacéutico, y predecir perfiles de deposición para varios grupos de edad, razas, y géneros12,13,14. El protocolo descrito aquí tiene la capacidad de satisfacer estas necesidades de prueba al permitir a los investigadores generar modelos pulmonares atunesíbles y anatómicamente precisos con la capacidad de cuantificar la deposición relativa a nivel del lóbulo, basándose en el comportamiento del flujo de fluidos previamente demostrado en los modelos computacionales3,5,15. Utilizando este método, dosis farmacéutica y parto se puede evaluar mejor para geometrías pulmonares pediátricas y enfermas antes de entrar en ensayos clínicos.
Como se muestra en las Figuras 4 y la Figura 5,la deposición a nivel de lóbulo se puede medir con precisión y rapidez para aerosoles de inhalación dirigidos y no dirigidos. En ausencia de un dispositivo de segmentación, las partículas en este rango de tamaño (1-5 μm) y las condiciones de flujo (1-10 L/min) siguen los agilizaciones del fluido y el perfil total de flujo de aire desviado a cada lóbulo (Figura 4). En particular, se pueden desarrollar varios dispositivos inhaladores y accesorios de tubo ET para concentrar los medicamentos inhalados en lugares controlados del lóbulo. Como se describe en nuestro trabajo reciente y los de otros, muchas características del dispositivo inhalador, el perfil de flujo y la geometría de las vías respiratorias contribuyen al comportamiento de deposición dirigido2,3,9,16. En general, la orientación regional eficiente, como lo demuestran nuestros modelos in vitro únicos, requiere una distribución estrecha del tamaño del aerosol y bajos caudales de inhalación para evitar las turbulencias de las vías respiratorias que se encuentran específicamente dentro de la tráquea. La inclusión de las vías respiratorias superiores completas dentro de nuestro modelo in vitro permite una recreación precisa de estos patrones de flujo de aire que se sabe que influyen en la distribución de nivel de lóbulo aguas abajo9. Debido a estos flujos complejos, el trabajo reciente ha demostrado una mayor orientación desde debajo de los glottis9. Nuestros resultados en la Figura 5 ponen de relieve específicamente el beneficio de utilizar un adaptador de tubo ET para dirigirse regionalmente a lóbulos individuales desde su liberación por debajo de los glottis, con una orientación eficiente específica del lóbulo que se muestra para los lóbulos de los pulmones derecho e izquierdo a eficiencias que oscilan entre el 62-74% de la dosis total. Esto representa un aumento con respecto a la eficiencia de la orientación regional de liberación bucal reportada previamente experimentalmente y es una vía importante para la implementación clínica de este enfoque9. Es importante destacar que el protocolo permite mediciones experimentales de distribución de lóbulos de una dosis farmacéutica completa de una amplia gama de dispositivos potenciales de orientación regional más allá de los demostrados aquí.
Con solo una tomografía computarizada, un modelo pulmonar específico del paciente se puede imprimir rápidamente en 3D para probar un posible método de parto terapéutico. Este protocolo no sólo proporcionará un enfoque experimental a escala de laboratorio para apoyar el diseño de nuevos dispositivos inhalares, sino que también creará oportunidades para dispositivos de inhalación personalizados bajo demanda en la práctica clínica. La resina dura utilizada en este protocolo cuesta ~$0.12/mL; por lo tanto, los hospitales con infraestructura de impresión 3D existente podrían imprimir un modelo pulmonar por tan solo $15 en materiales17 y montar una vía aérea personalizada en menos de un día. En particular, los tiempos de impresión y los costes de material en la fabricación aditiva siguen disminuyendo rápidamente, aumentando la viabilidad general de este enfoque. Nuestra configuración experimental se puede modificar fácilmente para reflejar una serie de condiciones de flujo de aire mediante la utilización de un modelo pulmonar diferente o un ajuste de distribución del flujo de aire, después de la validación experimental que se muestra en la Figura 4. Las diferencias en los perfiles y geometrías del flujo pulmonar debido a características como la edad, la raza y el sexo están bien documentadas en la literatura y se pueden incorporar fácilmente a nuestro enfoque de modelado18,19,20. En concreto, las variaciones geométricas en la laringe, faringe y tráquea de los modelos pulmonares pueden tener un impacto significativo en el flujo de aire y los posteriores patrones de deposición regional15,21,22,que este protocolo está bien equipado para detectar. Así, se espera que la incorporación de este enfoque de modelado personalizado tenga un impacto significativo en el desarrollo de terapias de inhalación personalizadas.
Aquí, los caudales del lóbulo se modificaron para reflejar los de un estado de enfermedad de epoC caracterizado por una disminución del flujo de aire a los lóbulos inferiores(Figura 4B),pero las tomografías computarizadas derivadas del paciente de EPOC también podrían utilizarse para imitar con mayor precisión la arquitectura pulmonar enferma y las posibles obstrucciones23. Con una biblioteca de modelos pulmonares de pacientes y perfiles de flujo, se pueden investigar los efectos de la progresión de la enfermedad en la eficiencia del parto. Hay una amplia gama de exploraciones de código abierto disponibles en organizaciones, como los Institutos Nacionales de Salud (NIH) y el Cancer Imaging Archive (TCIA)24. Si bien estos modelos actualmente solo pueden replicar la geometría del paciente hasta la segunda o tercera generación para medir adecuadamente la distribución a nivel del lóbulo, se está trabajando en el desarrollo de modificaciones que puedan incorporar las vías respiratorias inferiores para un análisis más detallado. Este protocolo también puede incorporar dispositivos de administración de fármacos clínicamente relevantes, como un tubo ET como se muestra en la Figura 5B. Los investigadores pueden evaluar múltiples dispositivos de entrega para revelar características que pueden aumentar o disminuir la eficiencia del tratamiento. Por ejemplo, la eficacia de la segmentación se reduce cuando se intenta en el modelo pulmonar completo en lugar del modelo pulmonar intubado (Figura 5). Esta diferencia indica que omitir la región glottal evita áreas de mezcla turbulenta que disminuyen la capacidad de segmentación.
Este protocolo está limitado por su incapacidad para imitar con precisión la interfaz biológica aire-líquido. Como resultado, los aerosoles que normalmente se depositan por impacto inercial pueden rebotar en las paredes rígidas del pulmón modelo25. Para mejorar esto, las direcciones futuras incluyen explorar modificaciones superficiales y recubrimientos para imitar la capa mucosa del epitelio pulmonar. Se han investigado recubrimientos como el aceite de silicio y la glicerina para la prevención del rebote de partículas en un NGI y podrían incorporarse fácilmente a los modelos pulmonares impresos en 3D26. Otras técnicas como la bioimpresión y el cultivo de células en modelos impresos en 3D están siendo investigadas por su capacidad para incorporar una respuesta celular en el protocolo27. Además, este protocolo utiliza equipos optimizados para caudales de 1-15 L/min; en el futuro, los caudales más altos de 30-60 L/min, el rango normal de caudales inspiratorios máximos, podrían utilizarse cambiando las válvulas de control y los medidores de flujo para los adecuados para el rango de caudal deseado28,29. Con el modelo de controlador de flujo utilizado, el sistema sólo es capaz de modelar la inspiración en lugar de un ciclo de respiración cíclico completo. La incorporación de patrones respiratorios transitorios mediante el uso de un respirador o un sistema de flujo más complejo probablemente mejoraría la precisión de los resultados experimentales con respecto a la eficiencia de deposición de partículas30. Por último, los experimentos de deposición sólo se han realizado con esferas de poliestireno fluorescente monodispersa que varían en tamaño de 1-5 μm. La cuantificación de la deposición se basa en la fluorescencia del aerosol, por lo que el uso de este protocolo con aerosoles no fluorescentes puede requerir la incorporación de una etiqueta fluorescente como el isotiocyanato de fluoresceína (FITC) para el análisis31. Sin embargo, se podrían aplicar técnicas analíticas adicionales para analizar el filtro en función de la composición del aerosol, como la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) o la espectrometría de masas.
Nuestro protocolo demuestra la primera configuración experimental in vitro con la capacidad de cuantificar la deposición pulmonar lobular en una geometría pulmonar específica del paciente. Se espera que la consecución de la distribución controlada a nivel del lóbulo aumente la eficacia terapéutica de las terapias de inhalación, que sólo se lograrán a través de avances en mediciones in vitro de dosis enteras. Con el creciente interés por la medicina personalizada, este protocolo tiene el potencial de estimular el desarrollo de nuevas terapias pulmonares dirigidas al permitir predicciones más precisas de la eficacia potencial del tratamiento.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Yu Feng, a la Dra. Jenna Briddell, Ian Woodward y Lucas Attia por sus útiles discusiones.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K111 | |
| 10 um Filter Paper | Fisher | 1093-110 | |
| 1um Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 15702-10 | |
| 1um Non-Fluorescent Polystyrene Particles | Polysciences | 8226 | |
| 2-Propanol | Fisher | A516-4 | Referred to in protocol as "IPA" |
| 3/8" Plastic Barbed Tube Fitting | McMaster Carr | 5372K117 | |
| Air Flow Meter (1 - 280 mL/min) | McMaster Carr | 41695K32 | Referred to in protocol as "flow meter" |
| Carbon M1 3D Printer | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/, Associated software referred to in protocol as "slicing software" | |
| Collison Jet Nebulizer | CH Technologies | ARGCNB0008 (CN-25) | 6 Jet MRE style horizontal collision with glass jar, Referred to in protocol as "nebulizer", http://chtechusa.com/Manuals/MRE_Collison_Manual.pdf |
| Convection Oven | Yamato | DKN602 | |
| Copley Critical Flow Controller TPK2000 Reve 120V | MSP Corp | 0001-01-9810 | Referred to in protocol as "flow controller" |
| Copley High Capacity Pump Model HCP5 | MSP Corp | 0001-01-9982 | Referred to in protocol as "vacuum pump" |
| Cytation | BioTek | CYT5MPV | Multifunctional Spectrophotometer/Fluorescent imager equiped with 4x/20x/40x objectives and DAPI/GFP/TexasRed laser/filter cubes |
| EPU40 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/epu-elastomeric-polyurethane/, Referred to in protocol as "soft resin" | |
| Filter for vacuum pump | Whatman | 6722-5000 | |
| Flow Meter Model DFM 2000 | MSP Corp | 0001-01-8764 | Referred to in protocol as "electronic flow meter" |
| ImageJ Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Inline Air Flow Control Valve (Push-to-Connect) | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "valve" |
| Inline Filter Devices | Whatman | WHA67225000 | |
| Marine-Grade Plywood Sheet | McMaster Carr | 62005K333 | Referred to in protocol as "wooden board" |
| Materialise Mimics Software | Materialise | https://www.materialise.com/en/medical/mimics-innovation-suite, Referred to in protocol as "CT scan software" | |
| Meshmixer Software | Autodesk | http://www.meshmixer.com/, Referred to in protocol as "mesh editing software" | |
| Methanol | Fisher | A454-4 | |
| Opticure LED Cube | APM Technica | 102843 | Referred to in protocol as "UV oven" |
| PR25 Resin | Carbon 3D | https://www.carbon3d.com/materials/uma-urethanemethacrylate, /Referred to in protocol as "hard resin" | |
| PVC Tube for Chemicals | McMaster Carr | 5231K161 | 1/4" ID |
| Screws | |||
| SolidWorks Software | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation | https://www.solidworks.com/, Referred to in protocol as "3D modeling software" | |
| Straight Flow Rectangular Manifold | McMaster Carr | 1125T31 | |
| Tubing to Flow Controller | McMaster Carr | 5233K65 | 3/8" ID |
| Wire |
References
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