Summary
원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 세균 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하여 나노 스케일 해상도를 달성할 수 있습니다. 둘 다, 세포 외 변화의 매핑 (예를 들어, 세포 분열시) 뿐만 아니라 화학 조성의 비교 연구 (예를 들어, 약물 내성에서 발생) 박테리아의 단일 세포 수준에서 수행 될 수있다.
Abstract
원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 나노스케일 분해능을 가진 시료의 물리적 특성과 화학적 조성의 동시 특성화를 가능하게 하는 새로운 결합 기술입니다. AFM과 IR을 결합하여 기존의 IR의 공간 해상도 제한을 극복하고 20-100 nm의 해상도를 달성할 수 있습니다. 이것은 기존의 IR 현미경 검사를 통해 이전에 달성 할 수없는 몇 마이크로 미터보다 작은 샘플을 프로빙으로 IR의 광범위한 응용 프로그램에 대한 문을 엽니 다. AFM-IR은 단일 세포 및 세포 내 수준에서 스펙트럼 및 공간 정보를 모두 제공하는 세균 연구에 매우 적합합니다. 세균 감염에 관하여 증가하는 글로벌 건강 관심사 및 불리한 미래 예측, 특히, 항균 저항의 급속한 발달은, 단세포 및 세포외 수준에서 표면 탐구를 할 수 있는 연구 공구를 위한 긴급한 필요를 만들었습니다. AFM-IR은 단일 박테리아의 화학 성분의 세부 특성화를 가능하게 함으로써 이러한 필요성을 해결할 수 있는 잠재력을 제공합니다. 여기서, 우리는 세균 연구에 대한 AFM-IR의 적용을 위해 단일 스펙트럼 및 매핑 양식의 샘플 준비 및 데이터 수집을위한 완전한 프로토콜을 제공합니다.
Introduction
박테리아는 다양한 모양과 크기에서 발생하는 단일 세포 원핵 생물이며, 전형적으로 수백 나노미터에서 마이크로미터까지의 범위에서 발생합니다. 그들은 다양한 서식지에 존재하며 생명의 존재에 필수적입니다. 인체 내에서, 창 자에 존재 하는 박테리아의 대부분은 무해 하 고 많은 실제로 유익한1. 그러나, 몇몇 세균성 종은 병원성이고 감염증의 범위를 일으키는 원인이 됩니다. 세균성 감염은 패혈증과 패혈증 충격의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다: 생명을 위협하는 상태, 감염에 바디의 반응에서 유래2. 패혈증은 전 세계적으로 높은 보급과 가혹한 사망률을 가진 글로벌 중요한 건강 위협입니다. 2017년에만 전 세계적으로 약 5천만 건의 패혈증이 기록되었으며, 그 중 1,100만 건이 사망(약 20%)으로나타났습니다. 더욱이, 환자의 생존 기회의 감소는, 지연된 치료로 인해, 시간당 방식으로 발생하는 것으로 나타났다3,4.
세균성 감염은 항생제로 취급됩니다. 항균 요법의 빠른 개시의 명확한 중요성과 함께 세균성 혈류 감염 (BSIs)의 잠재적 인 결과의 심각성은 즉각적인 항생제 투여의 필요성을 자극합니다. 그러나, 임상실습(예를 들어, 혈액 배양)에 사용되는 현재진단접근법이 비교적 오랜 시간이 필요하기 때문에, 항생제 투여는 종종 양성 BSI 진단5이전에 발생한다. 이 요인은 항생제의 광범위한 남용으로 이끌어 냅니다- 농업과 같은 그밖 분야에서 과도한 항생제 사용과 더불어 - 항균 저항의 발달을 향한 가혹한 진화압력을 만듭니다 (AMR)6,7. AMR은 현재 가장 시급한 글로벌 건강 문제중 하나이며, 2050년까지 9의 주요사망원인이 될 것으로 예상됩니다. 저항의 발달은, AMR 긴장의 퍼짐과 더불어 놀라운 속도로 일어나고 있습니다7,8,9 및 이상, 지금까지, 새로운 항생제의 발견의 비율10. 새로운 저항표현형은 전 세계적으로 지속적으로 부상하고 있으며,
AMR 관련 변경 사항을 이해하는 데 전념하는 연구는 종종 느리고 사용 가능한 접근법(11)에의해 제한됩니다. 또한, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 및 전체 유전자 염기서열분석(WGS)과 같은 일반적으로 사용되는 방법은 genotypic 변화에만 초점을 맞춥니다. 이들은 저항의 기계장치를 밝히기 에 충분하지 않습니다11,박테리아의 화학 적 조성을 이해할 수 있도록 연구 도구에 대한 긴급한 필요성을 자극.
적외선 분광법(IR)은 시료의 분자 특성화를 제공하므로 현상균 프로빙을 위한 유망한 후보입니다. 초기 응용 프로그램(12)부터,그 사용의 예의 큰 크기는 문학 에서 입증되었다13,14. 여기에는15,종16종, 변형17,18 수준에 대한 박테리아의 페노티픽 기반식별이포함됩니다. 그러나, 종래의 IR의 공간 분해능은 파장 회절 공간 해상도제한(19)으로인해 여러 미크론으로 제한된다. 박테리아의 대다수의 크기는 그 한계 (예를 들어, 황색포도상구균 ≈ 직경400 nm) 아래에 있기 때문에, 기존의 IR은 단세포 또는 세포 내 수준에서 프로빙에 적용되지 않습니다.
공간 해상도 제한은 최근 IR 분광법을 원자력 현미경검사법(AFM-IR)과 결합하여 극복했습니다. 이 경우, IR 흡수는물질(19,20,21,22)의열 팽창을 통해 간접적으로 검출된다. 간단히 말해서 IR 방사선의 흡수로 인해 국도 온도가 증가합니다. 이는 IR흡수(20, 21)에 의해 생성된 힘 충동에서 발생하는 AFM 캔틸레버 프로브의 진동 측정을 통해 직접23또는측정할 수있다. 결합 AFM-IR 기술은 20nm에 접근하는 공간 해상도를 달성할 수 있게 해 주며, 시료(AFM)와 화학적 조성물(AFM-IR)의 현지 물리적 특성에 대한 동시 정보를 제공합니다. 선택한 반점으로부터의 단일 스펙트럼및 선택한 영역 내에서 선택한 파수 값의 강도 매핑이 모두 컬렉션이 가능합니다.
AFM-IR의 달성 가능한 공간 해상도를 고려할 때, 이 기술은 단일 박테리아 세포및 세포내조성물(24)의화학적/페노티픽 프로빙가능성을 열어주는 것이 분명하다. 히체토, 단일 박테리아에 대한 AFM-IR의 적용의 몇 가지 예는문헌(19,20,21, 22,25,26,27,27,28)에서입증되었다. 이들은 단일 스펙트럼분석(19,21,22) 및 세포전 수준19,22,25,26,27,28에서매핑을포함한다. 예를 들어, 단일 박테리아 내의 세포내 지질소포(27) 및바이러스(28)를 검출하는 기능이 설명되었다. 이러한 결과는 단일 박테리아 및 임상적으로 관련된병원균(19)의나노스케일 연구를 위한 AFM-IR의 유용성을 입증한다.
따라서 다층, 단층 및 단세포 세균 샘플의 AFM-IR 데이터를 위한 샘플 준비 및 수집 방법을 제시합니다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은박테리아(22)의 상이한 종과 그들의 화학적 조성물의 변화를 연구하기 위해 적용되었다. 특히, 반코마이신 저항성 및 다토마이신비감수성의 생체내 개발은 S. 아우레우스19의임상쌍에서 조사되었다. 둘 다, S. 아우레우스 (VISA 및 DpR)에 있는 vancomycin 간헐적인 저항 및 daptomycin 비 감수성, 진료소에 이 항생제의 증가한 사용 및 소개에 따라, 중요한 의학 문제를 구성하는, 상대적으로 최근에 나타났습니다. 더욱이, 특히, daptomycin 비 감수성의 메커니즘은 여전히 애매하게 남아 있으며, 대체 약물개발(19,29)을방해하고 있다. 제시된 프로토콜은 실험 목표에 따라 다양한 화학 적 접근법을 사용하여 더 분석 할 수있는 단일 박테리아의 신뢰할 수있는 AFM-IR 스펙트럼의 제공에 초점을 맞추고 있습니다. 또한 세포 내 연구에 적용되는 매핑 접근 법을 포함합니다.
Protocol
병원성 박테리아로 수행되는 모든 작업은 적절한 안전 조치를 취해야 합니다. 여기에는 적절한 생체 안전 수준과 생물 안전 실(PC2)에서 작업할 뿐만 아니라 적절한 소독제(예: 80% 에탄올 용액)가 있는 작업 영역의 신중한 오염 제거가 포함됩니다. 적절한 PPE는 항상 착용해야합니다.
1. 용매 및 재료의 준비
- 용매: 초순수를 용매로 사용하세요. 잠재적인 교차 오염을 피하기 위해 실험 전에 자동화된 정제수를 사용합니다.
- 기판: 이러한 기판중 어느 기판도 AFM-IR, 예를 들어, ZnSe, CaF2,BaF2등으로 사용하십시오. AFM-IR은 원칙적으로 비파괴 기술이므로 동일한 샘플 포스트 AFM-IR 분석에 다양한 다른 연구 도구를 적용할 수 있습니다. 예를 들어, 라만 등급 CaF2 또는 BaF2 슬라이드를 사용하는 경우 라만 분광법과 결과의 상관 관계를 수행할 수 있습니다.
- 플라스틱이 시료를 오염시킬 수 있는 플라스틱 튜브 대신 유리 바이알을 사용하십시오.
2. AFM-IR에 대한 샘플 준비
- 샘플의 성장/인큐베이션
- 액체 매체 또는 고체 플레이트에서 박테리아를 성장시면 됩니다. 조사 중인 박테리아 종의 특정 요구 사항에 따라 중간, 성장 조건(예: 온도, 산소 가용성) 및 성장 시간의 유형을 선택합니다. 예를 들어, S. 아우레우스 심장 주입(HI) 천판의 경우 에어로빅 조건에서 37°C에서 16h의 성장을 통해 사용될 수 있다.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 성장/인큐베이션은 미세 펠릿의 수집을 허용하는 충분한 박테리아를 산출해야 합니다. 식민지 형성 단위 또는 세균 성 세포의 특정 수는 박테리아의 유형 및 크기에 따라 달라 집니다.
- 액체 매체 또는 고체 플레이트에서 박테리아를 성장시면 됩니다. 조사 중인 박테리아 종의 특정 요구 사항에 따라 중간, 성장 조건(예: 온도, 산소 가용성) 및 성장 시간의 유형을 선택합니다. 예를 들어, S. 아우레우스 심장 주입(HI) 천판의 경우 에어로빅 조건에서 37°C에서 16h의 성장을 통해 사용될 수 있다.
- 샘플 증착
- 멸균 루프를 사용하여, 조심스럽게 천판에 식민지에서 박테리아를 수집하고 유리 튜브로 전송합니다. 식민지 꼭대기에서만 박테리아를 수집합니다. 액체 배양으로부터 샘플을 수집하는 경우, 파이펫을 사용하여, 유리 튜브에 세균 현탁액의 약 1 mL을 전송. 부피는 세균 부하에 따라 수정될 수 있습니다.
참고: 식민지 아래에서 임의의 매체를 수집(또는 가능한 한 많이 최소화)하지 않도록 시도하는 것이 중요합니다. 샘플 준비의 후속 단계는 미디어의 잠재적 인 잔류를 제거하는 것을 목표로합니다. 처음부터 잠재적 인 중간 잔류의 최소화는 정제 된 세균 세포에서 데이터의 스펙트럼 수집을 가능하게한다. 단계 2.2.2 및 2.2.3 은 천판에서 제조 된 샘플에 적용됩니다. 액체 매체에서 제조된 시료의 경우 2.2.4단계로 이동하십시오. - 튜브에 1mL의 초순수수를 추가합니다. 수집된 세균성 펠릿이 더 이상 튜브의 바닥에서 볼 수 없을 때까지 소용돌이 (일반적으로 1-2 분).
- 예를 들어, 맥팔랜드 표준을 사용하여 솔루션의 거친 탁도(예: 준비된 솔루션과 McFarland 표준 사이의 시각적 비교30)를 예측합니다. 세균 현탁액의 탁도가 매우 낮은 것으로 나타나면 멸균 루프와 소용돌이를 사용하여 접시에서 더 많은 박테리아를 추가하십시오. 솔루션의 거친 탁도가 McFarland 표준 0.5 및 1과 비교할 때까지 반복합니다. 이것은 일반적으로 세균성 펠릿의 좋은 양을 산출할 것입니다.
- 3, 000 x g에서 세균 현탁액을 5분 동안 원심분리하여 펠릿을 얻습니다.
참고: 원심 분리 매개 변수는 세균성 펠릿을 얻기 위해 수정될 수 있다. 주의 G-힘을 증가 하는 경우, 박테리아의 파손을 유도 하지 (특히 그램 부정적인 박테리아의 경우). - 파이펫을 사용하여 펠릿 위에서 상수체를 부드럽게 제거합니다. 튜브와 소용돌이에 1mL의 초순수수를 추가하여 펠릿을 다시 중단합니다. 이어서, 2.2.4 단계에서 수행된 바와 같이 시료원심분리.
- 세탁 절차(2.2.2 단계 및 2.2.4 단계)를 적어도 세 번 반복하십시오. 액체 매체로부터 초기 시료를 수집하는 경우, 절차를 적어도 4회 반복한다(미디어 제거 후 3개의 세차재가 뒤따릅니다).
- 마지막 세척 후, 상류체를 제거하고, 적어도 2 분 동안 초순수물과 소용돌이를 추가합니다. 이어서, 기판에 샘플의 5 μL을 증착한다(예를 들어, 라만 등급 CaF2).
- 시료의 원하는 두께가 박테리아의 다층인 경우 샘플을 공기 건조로 둡니다.
- 원하는 두께가 단층 또는 개별 박테리아인 경우, 시료를 증착한 직후(단계 2.2.7) 초순수의 20-100 μL을 추가하고 파이펫 팁과 부드럽게 섞는다. 공기 건조에 둡니다.
참고: 정확한 물 량은 많은 요인(예를 들어, 유기체의 크기, 펠릿의 밀도 등)에 의존하기 때문에 실험마다 다를 수 있으며, 따라서 경험적으로 가장 잘 결정됩니다. 초순수의 다양한 부피를 첨가한 일련의 시료를 준비하면 박테리아의 원하는 두께/밀도로 시료를 선택할 수 있습니다. 박테리아의 두께/밀도는 후속 단계에서 AFM을 통해 쉽게 시각화할 수 있다. 단층 및 단일 셀 샘플에서 AFM 이미지의 예는 그림 1A-H에도시된다. - 양면 접착제 테이프를 사용하여 AFM 금속 시편 디스크에 기판을 장착합니다.
- 멸균 루프를 사용하여, 조심스럽게 천판에 식민지에서 박테리아를 수집하고 유리 튜브로 전송합니다. 식민지 꼭대기에서만 박테리아를 수집합니다. 액체 배양으로부터 샘플을 수집하는 경우, 파이펫을 사용하여, 유리 튜브에 세균 현탁액의 약 1 mL을 전송. 부피는 세균 부하에 따라 수정될 수 있습니다.
3. 악기 준비
참고: 여기에 설명된 기악 절차는 재료 표에나열된 기기에 대한 것입니다. AFM-IR 계측기의 최신 모델을 사용하는 경우 상세 기악 절차는 여기에 설명된 절차와 약간 다를 수 있습니다.
- 초기화 버튼을 눌러 기기를 켜고 초기화합니다. 레이저 셔터가 레이저 테스트를 위한 개방형 위치에 있는지 확인합니다.
- 퍼지 시스템이 설정된 경우 N2의흐름을 켜서 N2로 계측기를 제거합니다. 질소 제거를 조정하여 안정적인 습도 수준(예: 20%)을 달성합니다. 측정 중과 배경 및 샘플 데이터 수집 간에 습도가 변동되지 않도록 합니다. 습도 수준이 안정되는 데 약 20분 이내의 방법을 허용하는 것이 좋습니다.
- 로드 버튼을 눌러 샘플을 샘플 챔버에 로드합니다. 샘플 로드는 소프트웨어 마법사를 통해 수행됩니다. 소프트웨어 마법사를 작동하는 동안 먼저 팁에 초점을 맞추고 화살표를 사용하여 Z 방향으로 현미경 단계를 이동하고 다음을 클릭합니다. 둘째, 평면 이동을 안내하는 화살표를 사용하여 데이터 수집 지점을 조정하고 AFM 헤드 상단의 노브를 사용하여 AFM 레이저 및 AFM 검출기를 정렬합니다. 이어서, Z 방향으로 현미경 단계를 이동하여 샘플 표면에 초점을 맞춥니다.
참고: 샘플 로딩의 각 단계에 대한 자세한 그림은 소프트웨어매뉴얼(31)에제공됩니다. 샘플에 초점을 맞추는 것은 주의해야 합니다. Z 방향으로 샘플 표면에 접근할 때 는 느린 모터 속도를 사용합니다. - 접근 버튼을 클릭하여 참여하지 않고 샘플에 접근합니다.
4. 데이터 수집
- 배경
- 데이터 수집 전에 배경을 수집합니다. 배경 컬렉션의 경우 레이저 셔터가 열린 위치에 있는지 확인합니다. 스펙트럼 범위 및 해상도(분석 목표에 따라 다름)와 스캔 수 및 백그라운드 공동 평균 수를 선택합니다. 이들은 일반적으로 높은 것이 좋습니다 (예를 들어, 1024 스캔 및 3 공동 평균).
참고: 일반적으로 스펙트럼 해상도는 4cm-1 또는 8cm-1이고 스펙트럼 범위는 3,200cm-1-1 -2,800cm-1 및 1,800cm-1 -1 -1-900cm-1을 권장합니다. - 배경을 수집한 후 백그라운드 파일을 저장합니다. 파일이 자동으로 저장되지 않습니다. 레이저 셔터 위치를 닫기로 변경합니다.
- 데이터 수집 전에 배경을 수집합니다. 배경 컬렉션의 경우 레이저 셔터가 열린 위치에 있는지 확인합니다. 스펙트럼 범위 및 해상도(분석 목표에 따라 다름)와 스캔 수 및 백그라운드 공동 평균 수를 선택합니다. 이들은 일반적으로 높은 것이 좋습니다 (예를 들어, 1024 스캔 및 3 공동 평균).
- 샘플 – 단일 스펙트럼
- 참여 버튼을 눌러 샘플에 참여합니다. 직접 접촉이 감지될 때까지 시스템은 샘플 표면에 접근하기 시작합니다.
참고: 이 작업에 사용된 설정 점은 0.15-2 V 사이이며 피드백 이득(I Gain 및 P Gain)은 일반적으로 3과 10으로 설정됩니다. NIR2 접촉 프로브는 일반적으로 nanoIR2 시스템 (모델 : PR-EX-nIR2-10, 공명 주파수 (kHz): 13 +/−4 kHz, 스프링 상수 (N/m): 0.07-0.4 Nm-1)와함께 사용됩니다. - 표면을 시각화하기 위해 AFM 이미지를 수집합니다. 첫 번째 인스턴스에서는 더 넓은 영역(예: 50 x 50 μm)을 낮은 공간 해상도(예: 200 x 200점)(그림1I)로스캔합니다.
참고: AFM-IR 데이터는 항상 접촉 모드에서 수집되지만 AFM 데이터는 접촉 또는 탭 모드에서 수집될 수 있습니다. - AFM 높이/편향 이미지에서 특정 관심 영역을 선택하고 더 높은 공간해상도(그림 1J-K)로다시 이미지화합니다. 느린 팁 이동(예: 스캔 속도 0.2-0.4Hz)을 사용하여 데이터 수집 속도가 적절한지 확인합니다.
- 측정 지점(예: 단일 박테리아)을 선택하고 팁을 그 자리로 이동합니다.
- IR 레이저를 정렬합니다. 이를 위해 샘플이 흡수되는 파수를 사용합니다. 생물학적 물질의 경우, 예를 들어, 아미드 I(1655cm-1)일수 있다. 밴드 패스 필터가 꺼져 있는지 확인하고 IR 시작을클릭합니다. 나노IR 미터의 오른쪽 그래프(진폭 대 주파수로 표시되는 편향의 FFT)는 적어도 하나의 명확한 피크를 표시해야 하며 왼쪽 그래프(편향 대 시간)는 주기적인 파형을 가져야 한다. 그렇지 않은 경우 IR 스팟을 최적화하십시오.
참고: 빠른 포리어 변환(FFT) 및 편향이 예상 프로파일을 표시하더라도 밴드가 예상되는 최소 여러 파수에 대해 IR 스팟을 최적화하는 것이 좋습니다. - 선택한 웨이브 번호 값을 사용하여 IR 데이터 수집의 핫스팟을 최적화합니다. 기존의 IR 스펙트럼의 박테리아(예를 들어, 세균성 펠릿의 ATR 스펙트럼)를 사용하여 밴드의 위치를 식별하고 핫스팟을 최적화하는 데 사용하는 것이 유용할 수 있다. 다양한 스펙트럼 영역에서 다양한 파수 값(예: 8-10)을 선택합니다.
참고: AFM-IR 데이터 수집 전에 기존의 IR 스펙트럼을 수집할 수 없는 경우, 문헌에서 사용할 수 있는 세균 스펙트럼은 대략적인 지침으로 사용될 수 있다. IR 스팟의 최적화 결과는 각 x 및 y 위치에 FFT 크기 신호맵을 제공하는 이미지입니다. 가장 큰 신호가 있는 위치는 자동으로 선택됩니다. 이러한 이미지의 예는 소프트웨어매뉴얼(31)에있습니다. - 선택한 파수 값에 대한 IR 스팟을 최적화한 후 스펙트럼 영역, 스펙트럼 해상도, 스캔 수 및 적용 된 전력 및 이를 소프트웨어의 적절한 창에 입력하는 스펙트럼 데이터 수집의 매개 변수를 정의합니다. 스펙트럼 해상도는 배경 해상도와 일치해야 하며 스펙트럼 영역은 배경이 수집된 스펙트럼 영역 내에 있어야 합니다.
참고: 일반적인 초기 매개 변수 세트는 스펙트럼 범위: 3200cm-1-2800cm-1 및 1800cm-1 -1-1 -900cm-1,스펙트럼 해상도: 4cm-1 또는 8cm-1,스캔 횟수: 512-2048. - 필요한 경우 신호에 따라 레이저 전력을 조정합니다. 일반적으로 레이저 전력의 8%~10% 사이의 값은 신호의 품질에 충분해야 합니다. 값이 높을수록 샘플 손상이 발생할 수 있기 때문에 주의해서 사용할 수 있습니다.
참고: 백분율 레이저 전력은 IR 레이저의 유형에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에 주어진 퍼센트 값은 OPO 레이저입니다. - AFM-IR 스펙트럼을 수집하려면 획득을 클릭합니다.
- AFM-IR 스펙트럼을 수집한 후 동일한 영역에서 AFM 데이터를 다시 수집합니다. 이것은 샘플에 대한 잠재적 인 드리프트 및 / 또는 파괴적인 영향을 드러내기 때문에 매우 권장됩니다.
- AFM-IR 스펙트럼이 만족스럽고 샘플에 대한 파괴적인 영향이 관찰되지 않으면 데이터 수집을 진행합니다. 필요한 경우 Array 옵션을 사용하여 데이터 수집을 위한 일련의 점을 정의하고 AFM 높이 또는 편향 이미지를 수집합니다. 이 옵션을 사용하면 단일 스펙트럼에 정의된 동일한 스펙트럼 매개 변수를 사용하여 각 지점에서 스펙트럼을 연속적으로 수집할 수 있습니다.
- AFM-IR 스펙트럼의 수집 후 수집된 AFM 이미지가 샘플(일반적으로 연소된 반점)에 파괴적인 영향을 미치는 경우, 전력을 줄입니다. 다른 지점을 선택하고 4.3.8-4.3.11 단계를 반복합니다.
- AFM-IR 스펙트럼의 신호가 만족스럽지 않은 경우 IR 스팟(Step 4.3.6)의 최적화의 정확성을 확인합니다. 그것이 정확하다면 레이저 전력을 약간 늘리고 4.3.7-4.3.11 단계를 반복하십시오. 이는 만족스러운 신호가 달성될 때까지 반복될 수 있습니다.
- 참여 버튼을 눌러 샘플에 참여합니다. 직접 접촉이 감지될 때까지 시스템은 샘플 표면에 접근하기 시작합니다.
- 샘플 – 이미징 접근 방식
참고: 선택한 파수 값에 대한 강도 분포 이미지를 수집하기 전에 박테리아의 단일 AFM-IR 스펙트럼을 기록하는 것이 좋습니다.- 선택한 샘플 영역의 AFM 이미지를 기록합니다. 이렇게 하려면 먼저 공간 해상도가 낮은 넓은 영역의 AFM 이미지를 수집한 다음(예: 50 x 50 μm, 200 x 200점) 관심 영역을 선택하고 공간 해상도가 증가한 AFM 이미지를 수집합니다(그림 1I-K에도시됨).
- AFM-IR 이미징의 웨이브 번호 값을 선택합니다.
- 레이저의 IR 스팟이 선택한 파수 값(단계 4.3.6)에 최적화되어 있는지 확인합니다. IR 스팟이 일부 파수(명확한 최대 값 없음)에 최적화되지 않으면 최적화합니다.
- 이미지 된 영역의 매개 변수를 정의: 너비와 높이, X 및 Y 방향의 데이터 포인트 수.
참고: 이전 AFM 이미지에서 연속선택된 스팟(그림 1I-K에서설명한 대로)이 적용되면 영역을 표시하면 너비와 높이 필드가 자동으로 채워집니다. - 스펙트럼 신호 획득의 매개 변수를 정의합니다: 파장, 스캔 수 및 레이저 전원.
참고: 검색 수를 이유 내에 보관해야 합니다. 64 또는 32 개의 스캔은 일반적으로 충분한 양의 신호를 허용합니다. - 스캔 속도.를 클릭하여 AFM 팁 이동의 매개 변수를 정의합니다. 이전 단계에서 검색 수가 많고 X 방향으로 데이터 포인트 수가 많을수록 팁 이동속도가 느려집니다. 이러한 매개 변수 간의 조정이 부족하면 팁의 움직임이 너무 빠르게 발생하여 각 지점에서 정의된 검색 수를 실제 획득하지 못하게 됩니다.
참고: 예를 들어 64개의 공동 추가 및 200점을 가진 적절한 IR 신호 모음의 경우 스캔 속도를 0.07kHz로 설정합니다. - IR 이미징 사용 상자가 체크되어 있는지 확인합니다.
- 이미징을 시작합니다. 선택한 파수에서 신호 강도의 AFM-IR은 해당 지역의 AFM 데이터와 동시에 수집됩니다.
참고: OPO 레이저를 사용하는 경우 접촉 공진 피크 주파수 이미지를 동시에 수집할 수 있습니다. 이는 다른 위치에서 샘플의 상대적 강성에 대한 정보를 얻기 위해 사용될 수 있다. - 캡처 시퀀스 창을 사용하여 동일한 매개 변수를 가진 동일한 영역에서 AFM-IR 데이터의 연속 컬렉션을 설정하지만 다른 웨이브 번호 값에 대해 설정합니다. 이렇게 하려면 캡처 시퀀스 창을 열고 각 파수에 입력하고 적용된 레이저 전력(각 파수에 대해)을 정의합니다.
- 수집된 데이터(AFM 및 AFM-IR, 단일 스펙트럼 및 이미징)를 다양한 형식으로 내보내고 특정 연구 목표에 적합한 방법을 사용하여 분석합니다.
Representative Results
설명된 프로토콜은 시료의 초기 농도 및 추가된 물의 양에 따라 기판상에 박테리아의 세포 분포의 범위의 범위를 얻을 수 있게 한다. 도 1은 그람양성(S. 아우레우스)및 그람음성(Escherichia coli)박테리아로부터 기술된 프로토콜을 사용하여 제조된 단층 및 단층으로부터 기록된 AFM 이미지(높이 및 편향)의 예를 보여 준다.
여기에 설명된 프로토콜은 단일 박테리아의 내세포 및 세포 외 구조의 AFM-IR 이미징을 위해 활용될 수 있다. 이 응용 프로그램의 예는 도 2에도시되어, 이는 S. 아우레우스 세포의 분과 중에 발생하는 공간적으로 국소화된 화학적 변화를 모니터링한 결과를 보여줍니다. 공기 건조는 일반적으로 세균 성 제제에 대한 고정 접근법으로 간주되지만, 박테리아는 본질적으로 온도와 같은 외부 요인에 대한 매우 높은 저항성을 나타내고 탈수(32)에서생존하는 것으로 보고되었다. 여기에 제시된 결과는 공기 건조 시료로부터 획득되었다. 세포 분열 이전에 발생하는 중격의 형성은 동일한 영역의 12개의 이미지(20분 ≈ 수집하여 AFM이미징(그림 2A-D)을통해 관찰 및 모니터링하였다. 그림 2A-D는 선택한 4개의 AFM 이미지를 보여 주며, 각 이미지의 컬렉션 사이에약 40분이 있습니다. 형성된 구조물(중격)은 45nm 높이입니다. 형성된 중격은 AFM 높이 및 편향이미지(그림 2E-F)에서선명하게 볼 수 있습니다. 세포 및 중격면적(도 2G, 도 2F에표시된 원산지 점)에서 기록된 AFM-IR 스펙트럼은 비교 전에 amide I 밴드로 정규화되어 데이터 수집 지점 간의 다양한 샘플 두께의 영향을 최소화하였다. 중격의 AFM-IR 스펙트럼은 세포 영역에서 수집된 AFM-IR 스펙트럼에 비해 1240 cm-1에서 대역의 상대강도가 더 높은 것을 특징으로 한다. 이들은 세포벽 성분의 탄수화물 및 인포디스터 그룹(예를 들어, 펩티도글리칸 및 테이초크산을 포함)에 기인한다22.
설명된 프로토콜은 다수의 다른 샘플 간의 단일 스펙트럼 비교에도 사용될 수 있습니다. 결과와 함께 이 응용 프로그램의 예는 그림 3 및 그림 4에표시됩니다. 연구의 목적은 S. 아우레우스 (VISA)에서 반코미신 간헐적 저항의 생체 개발의 결과로 발생하는 화학 적 변화를 결정하는 것입니다. 이를 위해, 임상 쌍의 샘플은 환자에게서 수집되었으며, 병원에 입원할 때 부모와 의한 균주가 분리되어 항생제 치료(vancomycin@s. aureus,VSSA) 및 항생제 및 임상 실패 후 동일한 환자로부터 분리된 딸 균주를 수집하였다. 샘플은 한천 배지에서 더 자라서프로토콜(도 3A-B)에따라 제조하였다. AFM-IR 스펙트럼은 VSSA 및 VISA를 위한 다중 단일 박테리아(및 다중 샘플)로부터 수집되었으며, 이후 여러 화학접근법(그림 3C)을사용하여 분석하였다.
VSSA와 VISA 세포 사이에 형태학적 차이가 관찰되지않았다(그림 4A-C). 그러나, AFM-IR스펙트럼(도 4D,F)과이들의 두 번째 유도체(도4E,G)는내성 및 취약균종 사이의 화학조성에 분명한 차이를 보였다. 세포벽 성분으로부터의 탄수화물 및 인포디스터 그룹과 관련된 밴드의 상대적 강도(특히,1088cm-1의대역)는 민감하기 쉬운 균주에 비해 내성 균주에서 명확하게 증가하였다. 참고의 모든 재코딩 된 스펙트럼 (VISA: 81, VSSA: 88)은 작은 표준 편차를 보여줍니다. 이는 동일한 균주의 다른 샘플에서 기록된 스펙트럼 사이에 차별이 없었기 때문에 동일한 균주에서 제조된 다양한 샘플에서 기록된 데이터의 좋은 재현성을 보여줍니다. 관찰된 차이는 다른 문헌보고서(33,34)와합의된 취약한 대응에 비해 내성 균주에서 세포벽의 두께가 증가한다는 것을 나타냈다.
그림 1: AFM-IR 측정을 위한 다양한 세균 샘플의 대표적인 AFM 이미지. 기판에 희석에 따라, 프로토콜은 박테리아뿐만 아니라 단세포 샘플의 다층 및 단층을 얻을 수 있습니다. 대표적인 AFM 이미지:(A-D)단층및(E-H)단일 세포 샘플(A, B, E, F)그람 양성(S. 아우레우스)및(C, D, G, H)그램 네거티브(E.coli)박테리아. (A, C, E, G)는높이 이미지를 시연하고(B, D, F, H)해당 편향 이미지를 표시합니다. 이미지 영역의 크기:(A-D, G, H)20 x 20 μm,(E,F)50 x 50 μm.(I-K)AFM-IR 매핑을 위한 영역의 연속 선택. 이것은 단일 S. 아우레우스 세포의 예에서 증가하는 공간 해상도를 가진 AFM 화상 진찰을 사용하여 달성됩니다. 각 이미지는 200 x 200점을 샘플링하여 수집되며, 이미지 영역의 크기 감소로 인해 공간 해상도가 증가합니다. 이미지 영역의 크기 :(I)40 x 40 μm,(J) 20 x 20 μm 및(K)2.24 x 2.24 μm. 검은 색 사각형(I)은(J)에이미지 된 영역을 표시합니다. 검은 색 사각형(J)은(K)에서이미지 된 영역을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: AFM-IR을 통해 S. 아우레우스 세포 분열을 모니터링합니다. (A-D)세포 분열 이전의 중격의 형성을 보여주는 S. 아우레우스 세포의 AFM 영상. 이미지 영역의 크기 : 2 x 2 μm. 이미지는 더 큰 시리즈(20분마다 기록된 12개의 이미지)에서 선택되었으며,40분마다 기록된 데이터를 나타내고, AFM-IR 스펙트럼의 현수있는 포인트로 세포 중격 형성의 끝에 기록된 AFM 높이 및 편향 영상을 나타냅니다. 이미지 영역의 크기 1.17 x 1.15 μm. 새로 형성된 구조물의 높이는 45nm이다. (G)세포 영역(black) 및 중격 영역(빨간색)(빨간색)(빨간색)에서기록된 AFM-IR 스펙트럼(1400-900cm-1)에서. 두 스펙트럼모두 아미드 I 대역으로 정규화되었고 중격으로부터 세포벽 성분의 상대적 강도의 증가를 입증했다. 이 수치는 K. 코산 등에서수정되었습니다. 22. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 항균 저항의 AFM-IR 연구를 위한 실험 설계의 개요. (A)샘플 기원 및 초기 준비: 취약한 부모 균주는 항생제 치료 전에 환자로부터 수집되었고, 딸 내성 균주는 항생제 치료 및 임상 실패 후 동일한 환자로부터 공급되었다(생체 내성 개발). 박테리아는 37°C에서 16h의 심장 주입(HI) 천에서 분리및 배양되었다. (B)AFM-IR에 대한 후속 샘플 준비, 샘플 의 수집을 포함하는 다음 세균 성 팔레트 (3×) 및 샘플 증착의 세척. (C)AFM-IR 데이터 수집 및 분석: AFM 높이 및 AFM-IR 스펙트럼(1800-900cm-1). AFM 이미지 영역의 크기: 1.7 x 1.4 μm. AFM-IR 스펙트럼은 셀의 중간에서 수집되었다. 데이터는 계층 적 클러스터 분석을 포함하여 화학 적 접근 방식을 사용하여 이후 분석되었습니다. 이 수치는 K. 코산 등에서수정되었습니다. 19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: AFM 및 AFM-IR 임상 쌍에서 반코미신 성 취약 S. 아우레우스 (VSSA)에 비해 반코미신 중간 S. 아우레우스 (VISA)의 화학 적 변화에 대한 연구의 결과. AFM 이미지(A-B)VISA 및(C)VSSA 단일 셀 샘플. 이미지 영역의 크기:(A, C)40 x 40 μm,(B)2.56 x 2.45 μm.(D-E)평균 AFM-IR 스펙트럼 및 그들의(F-G)두 번째 유도체에 대한 :(D, F)비자 및(E, G)VSSA 세포, 스펙트럼 범위 1800-90cm. 제시된 스펙트럼은 평균 81(VISA) 및 88(VSSA) 개별 스펙트럼이며 표준 편차(SD)와 함께 제공됩니다. 평균은 함께 모든 개별 스펙트럼의 정상화 후 수행되었다. 주요 밴드는(F-G)에표시됩니다. 이 수치는 K. 코산 등에서수정되었습니다. 19. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: S. 아우레우스 셀의 선택한 파수 값에서 AFM-IR 맵의 연속 등록을 통해 이미지가 드리프트됩니다. (상단행):AFM 이미지는 선택한 파수 값에서 IR 신호의 강도를 기반으로해당(하단 행)AFM-IR 맵과 동시에 기록되었다. 파수 값(966, 1055, 1079, 1106, 1234, 1398, 1454, 1540, 1656, 1740 cm-1)이아래쪽 행 위에 부가된다. 각 세트(AFM 이미지 및 AFM-IR 맵)는 이전 이미지(세트당 약 40분)를 기록한 직후에 기록되었습니다. 이미지/매핑된 영역의 크기: 1.54 x 1.57 μm. 이미지 사이에 선명한 드리프트가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
그들의 화학 조성의 맥락에서 생물학적 샘플의 광범위한 특성화를위한 IR 분광법의 유용성은 잘 확립된다. 지난 10년 동안 IR 분광법은 세균 연구를 위한 유망한 도구로 부상하여12,13,14,15,16,17을연구하고 있다. 화학 적 조성을 통해 표화 특성화를 가능하게하는 몇 안되는 기술 중 하나로서 미생물학 분야에 상당한 관심을 계속 받고 있습니다. 이러한 맥락에서, 기존의 FTIR 현미경 검사법의 주요 단점은 제한된 공간 해상도에 있다, 단일 세포와 박테리아의 세포 전 연구를 방지. 사실, 박테리아의 작은 크기는 IR뿐만 아니라 대부분의 기술에 대한 장애를 나타냅니다. 따라서, 박테리아의 단일 세포 및 세포 전 연구에 사용할 수 있는 연구 도구는 상당히 제한. AFM과 IR의 조합은 IR 분광법의 공간 해상도 제한을 극복할 수 있게 해주며, 화학 성분의 나노스케일 프로빙이 가능한 세균 연구를 위한 새로운 도구를 제공합니다.
이 기술은 단일 세포 연구에 국한되지 않으며 두께에 이르기까지 다양한 샘플을 조사 할 수 있습니다. 의심 할 여지없이, 깨끗하고 신중한 샘플 준비는 고품질 이미지를 달성하는 데 중요합니다. 본 명세서에서 프로토콜은 다양한 박테리아의 다층, 단층 및/또는 단일 세포 샘플을 제조하는 방법을제공한다(도 1). 준비된 견본은 기판에 초기 세균제 하중, 세척 후 희석 및 추가 희석을 포함하여 몇몇 요인에 달려 있습니다. 세척된 펠릿을 희석한 후 얻은 샘플의 양은 기판상증전에 전형적으로 수많은 시료의 제조를 허용한다. 따라서, 기판에 샘플의 원하는 분포를 얻기 위해, 종종 그들의 희석에 이르기까지 일련의 샘플을 준비하는 것이 유익하다. 세포외 이미징보다는 AFM-IR 스펙트럼의 수집을 목표로 하는 연구의 경우, 샘플의 양을 수정(예를 들어, 단층에서 다층까지)은 신호의 강도를 증가시키는 데 도움이 될 수 있다.
샘플 준비의 또 다른 중요한 측면은 중간 잔류물의 적절한 제거입니다. 선택한 시료 배양 방법에 따라 샘플은 액체 배지 또는 천판에서 채취됩니다. 두 경우 모두, 배지 잔류는 샘플에 존재할 가능성이 있지만, 한천 플레이트에서 수집할 때 훨씬 적은 정도가 될 수 있다. 세균 성장 매체는 다양한 생물학적 성분의 풍부를 포함하기 때문에, 매체의 적절한 제거를 보장하는 것이 중요합니다. 우리는 한천 플레이트 샘플에 대한 초순수물로 세 개의 세정과 매체에서 수집 된 샘플에 대해 적어도 4 개의 세차재를 권장합니다. 필요한 경우 세하 수를 늘릴 수 있습니다. 그러나 다양한 샘플 간의 비교를 위해 샘플 간에 일관되게 유지하는 것이 중요합니다. 입증된 프로토콜은 인산완충액(PBS) 또는 식염수와 같은 용매가 아닌 물을 사용합니다. PBS와 식염수는 모두 박테리아를 손상시킬 수 있는 공기 건조시 결정의 형성으로 이끌어 줍니다. 또한, 둘 다 강렬한 IR 밴드의 소스, PBS와 함께, 특히, 지문 영역에서 여러 밴드를 포함. 식염수 또는 PBS의 사용에 대 한 능력의 부족, 현재 기술에 대 한 중요 한 한계를 나타냅니다. 전형적으로, 세척을 위한 물의 사용은 박테리아에 어떤 파괴적인 영향을 일으키지 않습니다; 그러나 주의해야 하며, 가능하다면 물 노출 시간을 제한해야 합니다. 시료 준비 프로토콜이 세척 단계에서 일시 중지되어야 하는 경우 물을 제거한 후 샘플을 펠릿 형태로 남기는 것이 좋습니다. 이것은 그람 음성 박테리아에 대 한 특히 중요 한, 그들은 파열 하는 경향이 더 얇은 세포 벽을 포함.
적절하고 고품질의 AFM-IR 데이터를 보장하기 위해 데이터 수집 프로토콜의 여러 측면이 매우 중요합니다. 첫째, 올바른 배경 수집은 데이터 수집에 필수적입니다. 특히 배경 수집과 샘플 수집 을 통해 안정적인 습도 수준을 유지 보수가 필요합니다. 이를 위해 질소로 계측기를 제거하고 습도 수준을 25% 이상 유지 관리하는 것이 좋습니다. 정화의 부족은 특히 습도가 높은 장소에서 상당한 제한을 부과 할 수 있습니다. 둘째, IR 반점의 적절한 최적화의 중요성을 강조해야 합니다. 최상의 결과를 얻으려면 밴드 maxima의 위치에 대한 사전 지식이 도움이 될 수 있습니다. 예를 들어, 세균펠릿의 종래의 IR 스펙트럼을 사용하여 시료로부터 예상되는 대역의 위치를 결정할 수 있다. 취득이 불가능한 경우, 대안적인 접근법으로, 사용자는 문헌에서 사용할 수 있는 IR 스펙트럼을 활용하거나 박테리아에서 기대하는 것이 합리적인 대역 위치를 사용하여 최적화를 시작할 수 있다(예를 들어, 아미드 I 및 amide II). 셋째, 데이터 수집의 경우 파괴적인 효과를 가져올 수 있으므로 신중한 전력 선택(좋은 S/N 비율을 달성할 수 있음)의 중요성을 강조하는 것이 중요합니다. 권장 전력은 샘플의 두께에 따라 달라지며, 계측기수동(31)에서대략적인 지침을 사용할 수 있습니다. AFM 이미지의 수집에 의해 샘플 사후 측정 상태를 경험적으로 테스트하는 것이 좋습니다. 또한 AFM-IR 스펙트럼의 수집 전후와 같은 영역에서 AFM 이미지의 컬렉션은 드리프트가 발생하지 않았으며 스펙트럼이 실제로 셀의 선택된 지점에서 유래한다는 것을 잘 확인하는 역할을 합니다. 선택된 파수 값에서 IR 강도의 연속적인 이미징을 통해 이미징 모달을 적용할 때 드리프트의 가능성이 특히 중요합니다. 이 예제는 그림 5에나와 있습니다. 이미지 영역은 실험 초기에 정의되었으며 모든 파수 값에 대해 일관되게 정의됩니다. 그러나 각 AFM 높이(및 해당 IR 파수 강도) 이미지 사이에 는 명확한 드리프트가 표시되며 각 맵의 획득 시간은 약 40분입니다. 따라서 이미징 데이터를 수집하는 사용자의 경우 관심 샘플보다 약간 큰 영역을 항상 선택하여 드리프트가 존재하더라도 관심 샘플이 이미지 영역 내에 유지되도록 하는 것이 좋습니다.
프로토콜의 잠재적 한계는 위에서 설명한 생리적 솔루션(예를 들어, 식염수 또는 PBS)에서 수화 된 상태에서 데이터를 수집하는 능력의 부족을 포함한다. 또한, 특히 습도가 높은 지역에서는 질소 제거가 필요한 경우가 많습니다. 또한, 이 프로토콜은 작은 구조물에 대한 사용 가능성을 제외하고, 100nm 크기까지 유기체를 탐사할 수 있게 한다. 이것은 다른 레이저(예를 들어, 양자 캐스케이드 레이저)를 사용하여 극복할 수 있지만(예를 들어, 양자 캐스케이드 레이저는 20nm의 공간 해상도를 달성할 수 있음), 제한된 스펙트럼 범위뿐만 아니라 노이즈 비에 좋은 신호를 얻는 데 어려움과 관련이 있다. 마지막으로, 연약한 표면의 프로빙은 표면을 제대로 감지하지 못하고 파손될 때까지 접촉 지점을 넘어서는 팁으로 어려움을 겪을 수 있다. 이것은 일반적으로 세균성 견본에 문제가 되지 않더라도, 더 부드러운 견본의 측정시 생길 수 있습니다. 이러한 경우, 시료에 근접하여 기판의 깨끗한 표면에 관여하는 것이 좋습니다.
설명된 프로토콜은 다양한 샘플 간의 비교 연구뿐만 아니라 세포간 검사사이의 비교 연구를 포함하여 수많은 유형의 세균 연구에 활용할 수 있습니다. 데이터는 연구의 목적에 따라 단일 스펙트럼 및 이미징양식(35)에대한 화학 적 접근 방식을 사용하여 분석 될 수 있습니다. 더욱이, 프로토콜은 또한 고정의 추가를 통해 다른 생물학적 물질(예: 곰팡이, 효모, 세포 등)에 적용을 위해 수정될 수 있다.
Disclosures
우리는 출판 수수료의 지불에 대한 브루커를 인정하고 싶습니다. KK, BRW, AP 및 PH는 접근 방식의 근본적인 측면 중 일부를 설명하는 국제 특허 (PCTIB2020/052339)의 발명가입니다.
Acknowledgments
우리는 브루커의 지지를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 모나시 대학 진보 여성의 성공 보조금에 의해 지원되었다 (K. 코찬). A.Y.P는 호주 국립 보건 의료 연구 위원회 개업자 펠로우십(APP1117940)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 DP180103484에 의해 지원되었다. 핀레이 생크스씨의 기악지원에 감사드리며, 샘플에 대한 기술적인 지원에 대해 제니아 코스툴리아스 씨에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
| Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | model: nanoIR2 | |
| Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | - | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
| Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | - | - |
| Matlab | Mathworks Inc | - | Multivariate data analysis software |
| Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
| NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | - | - |
| PLS toolbox | Mathworks Inc | - | GUI for Matlab |
| Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
| Selected bacterial strain | - | - | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
| Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
| Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | - |
| Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | - |
| Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | - |
| Ultrapure water | - | - | - |
References
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