Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) ger en kraftfull plattform för bakteriestudier, vilket gör det möjligt att uppnå nanoskalaupplösning. Båda, kartläggning av subcellulära förändringar (t.ex. vid celldelning) samt jämförande studier av kemisk sammansättning (t.ex. som härrör från läkemedelsresistens) kan utföras på en enda cellnivå i bakterier.
Atomic Force Microscopy-Infrared Spectroscopy (AFM-IR) är en ny kombinatorisk teknik som möjliggör samtidig karakterisering av fysiska egenskaper och kemisk sammansättning av prov med nanoskalaupplösning. Genom att kombinera AFM med IR övervinns den rumsliga upplösningsbegränsningen för konventionell IR, vilket gör det möjligt att uppnå en upplösning på 20–100 nm. Detta öppnar dörren för ett brett spektrum av nya tillämpningar av IR mot sondering av prover som är mindre än flera mikrometer, tidigare ouppnåeliga med hjälp av konventionell IR-mikroskopi. AFM-IR är i högsta grad lämplig för bakterieforskning och ger både spektral- och rumslig information på encellig och intracellulär nivå. De ökande globala hälsoproblemen och den ogynnsamma framtida förutsägelsen om bakteriella infektioner, och särskilt den snabba utvecklingen av antimikrobiell resistens, har skapat ett akut behov av ett forskningsverktyg som kan fenotypisk sondering på encellig och subcellulär nivå. AFM-IR erbjuder potential att tillgodose detta behov genom att möjliggöra detaljerad karakterisering av kemisk sammansättning av en enda bakterie. Här tillhandahåller vi ett komplett protokoll för provberedning och datainsamling av enstaka spektra och kartläggningsmodalitet, för tillämpning av AFM-IR mot bakteriestudier.
Bakterier är encelliga prokaryota organismer, som förekommer i olika former och storlekar, vanligtvis i intervallet flera hundra nanometer till mikrometer. De finns i en mängd olika livsmiljöer och är avgörande för livets existens. Inom människokroppen är majoriteten av bakterierna som finns i tarmen ofarliga och många är faktiskt fördelaktiga1. Flera bakteriearter är dock patogena och orsakar en rad infektionssjukdomar. Bakteriella infektioner kan leda till utveckling av sepsis och septisk chock: ett livshotande tillstånd, som härrör från kroppens svar på en infektion2. Sepsis är ett globalt stort hälsohot, med hög prevalens över hela världen och svår dödlighet. Bara under 2017 registrerades uppskattningsvis 50 miljoner fall av sepsis över hela världen, och 11 miljoner av dem ledde till döden (cirka 20 %)2. Dessutom visade sig en minskning av patientens överlevnadschanser, på grund av fördröjd behandling, inträffa på etttimligt sätt 3,4.
Bakteriella infektioner behandlas med antibiotika. Svårighetsgraden av potentiella konsekvenser av bakteriella blodomlopp infektioner (BSIs), tillsammans med en tydlig betydelse av snabb inledandet av antimikrobiell terapi, uppmanar behovet av omedelbar antibiotika administration. Men eftersom de nuvarande diagnostiska metoderna som används i klinisk praxis (t.ex. blododling) kräver en relativt lång tid, sker antibiotika administrering ofta före positiv BSI-diagnos5. Denna faktor leder till omfattande överanvändning av antibiotika, vilket tillsammans med överdriven antibiotikaanvändning inom andra sektorer som jordbruk skapar ett allvarligt evolutionärt tryck mot utvecklingen av antimikrobiell resistens (AMR)6,7. Amr är för närvarande en av de mest akuta globalahälsoproblemen 7,8 och beräknas 2050 bli den ledande dödsorsaken9. Utvecklingen av resistens, tillsammans med spridningen av ANTIR-stammar sker i en alarmerandetakt 7,8,9 och överstiger överlägset upptäcktshastigheten för nya antibiotika10. Nya resistenta fenotyper växer ständigt fram över hela världen, medan
forskning som är avsedd att förstå de förändringar som rör den nya forskningen ofta är långsam och begränsad av tillgängliga metoder11. Dessutom fokuserar de vanliga metoderna, såsom polymeraskedjereaktion (PCR) och hela gensekvensering (WGS), endast på genotypiska förändringar. Dessa är inte tillräckliga för att avslöja mekanismerna för resistens11, vilket leder till ett brådskande behov av ett forskningsverktyg som gör det möjligt att förstå bakteriernas kemiska sammansättning.
Infraröd spektroskopi (IR) ger en molekylär karakterisering av provet och är därmed en lovande kandidat för fenotypisk bakteriell sondering. Sedan dess tidigatillämpningar 12, visades en stor magnitud av exempel på dess användning ilitteraturen 13,14. Dessa inkluderar fenotypisk-baserad identifiering av bakterier påsläkte 15,art16, och stam17,18 nivå. Den rumsliga upplösningen av konventionell IR är dock begränsad till flera mikron på grund av våglängdsdiffraktionsgränsen för rumsligupplösning 19. Eftersom storleken på majoriteten av bakterierna ligger under den gränsen (t.ex. Staphylococcus aureus ≈ 400 nm i diameter) är konventionell IR inte tillämplig för sondering på encellig eller intracellulär nivå.
Begränsningen av rumslig upplösning övervanns nyligen genom att kombinera IR-spektroskopi med Atomic Force Microscopy (AFM-IR). I det här fallet detekteras IR-absorptionen indirekt, genom termisk expansion av materialet19,20,21,22. I korthet resulterar absorptionen av IR-strålning i en lokal temperaturökning. Detta kan mätas antingen direkt23 eller genom mätning av svängning av AFM-kantileversonden, som härrör från kraftimpuls skapad av IR-absorption20,21. Den kombinatoriska AFM-IR-tekniken gör det möjligt att uppnå rumslig upplösning som närmar sig 20 nm, vilket ger samtidig information om lokala fysiska egenskaper hos ett prov (AFM) och dess kemiska sammansättning (AFM-IR). Samling av båda, enstaka spektra från utvalda platser och kartläggning av intensiteten hos valda vågnummervärden inom ett valt område är möjliga.
Med tanke på den uppnåeliga rumsliga upplösningen av AFM-IR är det uppenbart att tekniken öppnar möjligheten till kemisk/ fenotypisk sondering av enstaka bakterieceller och deras intracellulära sammansättning24. Hittills har flera exempel på tillämpningen av AFM-IR för enskilda bakterier visats i litteraturen19,20,21,22,25,26,27,28. Dessa omfattar enkelspektral analys19,21,22 och kartläggning på subcellulärnivå 19,22,25,26,27,28. Till exempel har förmågan att upptäcka intracellulära lipid vesiklar27 och virus28 inom enstaka bakterie beskrivits. Dessa resultat visar nyttan av AFM-IR för nanoskala studier av enskilda bakterier och kliniskt relevanta patogener19.
Därför presenterar vi en provberednings- och insamlingsmetod för AFM-IR-data av multilager,monoskikt och encelliga bakteriella prover. Protokollet som beskrivs häri tillämpades för att studera olika arter av bakterier22 och förändringarna i deras kemiska sammansättning. I synnerhet undersöktes in vivo utveckling av vancomycin resistens och daptomycin icke-mottaglighet i kliniska par av S. aureus19. Båda, vancomycin intermittent resistens och daptomycin icke-mottaglighet i S. aureus (VISA och DpR) framkom relativt nyligen, efter ökad användning och införande av dessa antibiotika till kliniker, utgör ett betydande medicinskt problem. Dessutom är mekanismen för daptomycin icke-mottaglighet fortfarande svårfångad, vilket hinder för alternativ läkemedelsutveckling19,29. Det presenterade protokollet fokuserar på tillhandahållande av tillförlitliga AFM-IR-spektra av enskilda bakterier, som ytterligare kan analyseras med hjälp av en mängd olika kemometriska metoder, enligt de experimentella målen. Det inkluderar dessutom kartläggningsmetoden, som är tillämplig för intracellulära studier.
Nyttan av IR-spektroskopi för karakterisering av ett brett spektrum av biologiska prover i samband med deras kemiska sammansättning är väl etablerad. Under det senaste decenniet har IR-spektroskopi dykt upp som ett lovande verktyg för bakteriestudier12,13,14,15,16,17. Det fortsätter att locka stort intresse inom mikrobiologi, som en av de få tekniker som möjliggör en fenotypisk karakterisering genom den kemiska kompositionen. I detta sammanhang ligger den största nackdelen med konventionell FTIR-mikroskopi i begränsad rumslig upplösning, vilket förhindrar encelliga och subcellulära studier av bakterier. Faktum är att den lilla storleken på bakterier utgör ett hinder inte bara för IR, men för de allra flesta tekniker. Således är de tillgängliga forskningsverktygen för encelliga och subcellulära studier av bakterier signifikant begränsade. Kombinationen av AFM med IR gör det möjligt att övervinna den rumsliga upplösningsbegränsningen för IR-spektroskopi, vilket ger ett nytt verktyg för bakterieforskning, som kan avläsa den kemiska sammansättningen i nanoskala.
Tekniken är inte begränsad till encellsstudier och gör det möjligt att undersöka en mängd olika prover, som sträcker sig i tjocklek. Utan tvekan är ren och noggrann provberedning avgörande för att uppnå högkvalitativa bilder. Protokollet häri ger en metod för att förbereda flerskikts-, monoskikts- och/eller enstaka cellprover av olika bakterier (figur 1). Det beredda provet beror på flera faktorer, inklusive den ursprungliga bakteriebelastningen, utspädning efter tvättning samt ytterligare utspädning på substratet. Den mängd prov som erhålls efter utspädning av de tvättade pelletsen och före nedfallet på substratet gör det vanligtvis möjligt att beredningen av många prover. För att få önskad fördelning av provet på substratet är det därför ofta fördelaktigt att förbereda en serie prover, som sträcker sig i utspädningen. För studier som syftar till insamling av AFM-IR-spektra snarare än subcellulär avbildning kan det vara fördelaktigt att ändra mängden prov (t.ex. från monoskikt till flerskikt) för att öka signalens intensitet.
En annan kritisk aspekt vid provberedning är lämplig avlägsnande av medelstora rester. Beroende på de valda provodlingsmetoderna samlas provet antingen från flytande medium eller från en agarplatta. I båda fallen är det troligt att medelstor resthalt finns i provet, om än i mycket mindre utsträckning vid insamling från agarplattor. Eftersom bakteriella tillväxtmedier innehåller ett överflöd av olika biologiska komponenter är det viktigt att säkerställa lämplig borttagning av medium. Vi rekommenderar tre tvättar med ultrapurevatten för agarplatta prover och minst fyra tvättar för prover som samlats in från medium. Antalet tvättar kan ökas vid behov; För jämförelse mellan olika prover är det dock viktigt att hålla det konsekvent mellan proverna. Det demonstrerade protokollet använder vatten, snarare än lösningsmedel som fosfatbuffertlösning (PBS) eller saltlösning. Både PBS och saltlösning leder till bildandet av kristaller vid lufttorkning, vilket kan skada bakterierna. Dessutom är båda en källa till intensiva IR-band, med PBS, i synnerhet, som innehåller flera band i fingeravtrycksregionen. Bristen på förmåga att använda saltlösning eller PBS, representerar för närvarande en viktig begränsning för tekniken. Vanligtvis orsakar användningen av vatten för tvätt inte någon destruktiv inverkan på bakterierna; Försiktighet bör dock tas, och om möjligt bör tidpunkten för vattenexponeringen begränsas. Om provberedningsprotokollet måste pausas vid tvättningsstadiet, rekommenderas att lämna provet i pelletiserad form efter att vattnet har avlägsnats. Detta är särskilt viktigt för gramnegativa bakterier, som innehåller en tunnare cellvägg eftersom de är mer benägna att brista.
För att säkerställa korrekta och högkvalitativa AFM-IR-data är flera aspekter i datainsamlingsprotokoll av avgörande betydelse. För det första är korrekt insamling av bakgrund avgörande för datainsamling. I synnerhet är det nödvändigt att upprätthålla stabila fuktighetsnivåer under hela bakgrundsinsamlingen samt mellan bakgrunds- och provsamling. För att säkerställa detta rekommenderar vi att instrumentet renas med kväve och att fuktighetsnivåerna bibehålls inte högre än 25 %. Brist på rensning kan medföra en betydande begränsning, särskilt på platser med hög luftfuktighet. För det andra bör vikten av korrekt optimering av IR-fläckar betonas. För bästa resultat kan en förkunskap om band maximas position vara till nytta. Till exempel kan ett konventionellt IR-spektrum av bakteriepellet användas för att bestämma positioner för band som förväntas från ett prov. Om det inte är möjligt att som ett alternativt tillvägagångssätt förvärva kan användaren använda IR-spektra som finns i litteraturen eller börja optimeringen med hjälp av en bandposition som är rimlig att förvänta sig i bakterien (t.ex. mitt i I och mitt ii). För det tredje, för datainsamling är det viktigt att lyfta fram betydelsen av noggrant kraftval (vilket gör det möjligt att uppnå ett bra S/N-förhållande), eftersom det kan ha en destruktiv effekt. Den rekommenderade kraften beror på provets tjocklek, med grov vägledning tillgänglig i instrumenthandboken31. Vi rekommenderar att empiriskt testa tillståndet för provet efter mätning genom insamling av en AFM-bild, eftersom det kommer att avslöja något destruktivt inflytande. Dessutom fungerar samlingen av AFM-bilder från samma område före och efter insamling av AFM-IR-spektra som en bra bekräftelse på att ingen drift har inträffat och spektrat kommer faktiskt från den valda punkten i cellen. Möjligheten till drift är särskilt viktig vid tillämpning av bildframställningsmodaliteten, genom på varandra följande avbildning av IR-intensitet vid valda vågnumbervärden. Ett exempel på detta illustreras i figur 5. Det avbildade området definierades i början av experimentet och är avsett att vara konsekvent för alla vågnummervärden. En tydlig drift är dock synlig mellan varje AFM-höjd (och motsvarande IR-vågnummerintensitet), med förvärvstid för varje karta på cirka 40 minuter. På grund av detta rekommenderar vi för användare som samlar in bilddata att alltid välja ett område som är något större än urvalet av intresse, för att säkerställa att även vid drift kommer urvalet av intresse att förbli inom det bildade området.
Protokollets potentiella begränsningar inkluderar bristen på förmåga att samla in data i ett hydratiserat tillstånd i fysiologiska lösningar (t.ex. saltlösning eller PBS) som beskrivs ovan. Dessutom, särskilt i områden med hög luftfuktighet, finns det ofta ett behov av kväverening. Dessutom gör protokollet det möjligt att undersöka organismer ner till 100 nm i storlek, med undantag för möjligheten att använda den för mindre strukturer. Även om detta kan övervinnas med hjälp av en annan laser (t.ex. kvantkaskaskalaser som gör det möjligt att uppnå den rumsliga upplösningen på 20 nm), är det också förknippat med begränsat spektralområde samt svårigheter att få en bra signal-till-brusförhållande. Slutligen kan sondering av mjuka ytor utgöra en utmaning med spetsen som inte känner av ytan ordentligt och fortsätter utanför kontaktpunkten tills den går sönder. Även om detta vanligtvis inte är ett problem med bakterieprover, kan det uppstå vid mätningar av mjukare prover. I sådana fall rekommenderas att försöka engagera sig på ren yta av substratet i närheten av provet.
Det beskrivna protokollet kan användas för många typer av bakteriell forskning, inklusive jämförande studier mellan olika prover samt subcellulär undersökning. Data kan analyseras med hjälp av kemometriska metoder för enstaka spektra- och bildframställningsmetoder35, beroende på forskningens syfte. Dessutom kan protokollet också ändras för applicering på annat biologiskt material (såsom svampar, jäst, celler etc.), genom tillsats av fixering.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Bruker för deras stöd. Detta arbete stöddes av Monash University Advanceing Women’s Success Grant (K. Kochan). A.Y.P bekräftar stöd från Australian National Health and Medical Research Council Practitioner Fellowship (APP1117940). Detta arbete finansierades av australian Research Council Discovery Project DP180103484. Vi vill tacka Mr. Finlay Shanks för hans instrumentala stöd och Ms Xenia Kostoulias för hennes tekniska hjälp med proverna.
AFM metal specimen disc | PST ProSciTech Pty Ltd | GA530-15 | Recommended 15 mm |
Anasys AFM-IR nanoIR2 | Anaysys Instruments | 0 | model: nanoIR2 |
Contact mode NIR2 Probes for nanoIR 2 | Bruker / Anasys Instruments | – | Model: Model: PR-EX-NIR2 |
Heraeus Pico 17 Microcentrifuge | Thermo Scientific | – | – |
Matlab | Mathworks Inc | – | Multivariate data analysis software |
Micro-centrifuge tubes, 1.5 mL | Heathrow Scientific | HEA4323 | Can be replaced with any other micro-centrifuge tube |
NanoIR 2 instrument | Bruker / Anasys Instruments | – | – |
PLS toolbox | Mathworks Inc | – | GUI for Matlab |
Selected bacterial medium (e.g. HBA Columbia Plates) | Thermo Fisher | PP2001 | Provided type of medium is an example and can be replaced by others, depending on the type of experiment |
Selected bacterial strain | – | – | The source depends on the aim of research (patient isolates, ATCC strains, etc.) |
Substrate (e.g. Raman grade CaF2) | Crystran | CAFP13-2R | Recommended size: 13 mm Ø x 2.0 mm |
Tip pipette 1000 µl | Axygen | T-1000-B | – |
Tip pipette 200 µl | Axygen | T-200-C | – |
Tip pipette 0.5-10 µl | Axygen | T-300-R | – |
Ultrapure water | – | – | – |