Summary
Traditionella modeller för fototrombotisk stroke (PTS) inducerar huvudsakligen täta trombocytaggregat med hög resistens mot vävnadsplasminogenaktivator (tPA)-lytisk behandling. Här introduceras en modifierad murin PTS-modell genom saminjektion av trombin och ljuskänsligt färgämne för fotoaktivering. Den trombinförstärkta PTS-modellen ger blandade blodplättar-fibrin-koaguler och är mycket känslig för tPA-trombolys.
Abstract
En idealisk tromboembolisk strokemodell kräver vissa egenskaper, inklusive relativt enkla kirurgiska ingrepp med låg mortalitet, en konsekvent infarktstorlek och infallsplats, utfällning av blodplättar-fibrin-blandade blodproppar liknande dem hos patienter och en adekvat känslighet för fibrinolytisk behandling. Den färgämnesbaserade fototrombotiska strokemodellen uppfyller de två första kraven men är mycket resistent mot tPA-medierad lytisk behandling, förmodligen på grund av dess blodplättsrika, men fibrinfattiga koagelsammansättning. Vi resonerar att kombinationen av RB-färgämne (50 mg/kg) och en subtrombotisk dos av trombin (80 E/kg) för fotoaktivering riktad mot den proximala grenen av mellersta hjärnartären (MCA) kan ge fibrinberikade och tPA-känsliga blodproppar. Faktum är att den trombin- och RB (T+RB)-kombinerade fototrombosmodellen utlöste blandade blodplättar-fibrinblodproppar, vilket visades genom immunfärgning och immunbloter, och bibehöll konsekventa infarktstorlekar och platser plus låg dödlighet. Dessutom minskade intravenös injektion av tPA (Alteplas, 10 mg/kg) inom 2 timmar efter fotoaktivering signifikant infarktstorleken vid T+RB-fototrombos. Således kan den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen vara en användbar experimentell modell för att testa nya trombolytiska terapier.
Introduction
Endovaskulär trombektomi och tPA-medierad trombolys är de enda två behandlingar av akut ischemisk stroke som godkänts av U.S. Food and Drug Administration (FDA) och som drabbar ~700 000 patienter årligeni USA. Eftersom tillämpningen av trombektomi är begränsad till ocklusion av stora kärl (LVO), medan tPA-trombolys kan lindra ocklusioner av små kärl, är båda värdefulla terapier av akut ischemisk stroke2. Dessutom förbättrar kombinationen av båda behandlingarna (t.ex. initiering av tPA-trombolys inom 4,5 timmar efter strokedebut, följt av trombektomi) reperfusionen och de funktionella resultaten3. Att optimera trombolys är därför fortfarande ett viktigt mål för strokeforskningen, även i trombektomins tidevarv.
Tromboemboliska modeller är ett viktigt verktyg för preklinisk strokeforskning som syftar till att förbättra trombolytiska behandlingar. Detta beror på att mekaniska vaskulära ocklusionsmodeller (t.ex. intraluminal sutur MCA-ocklusion) inte ger blodproppar, och dess snabba återhämtning av cerebralt blodflöde efter avlägsnande av mekanisk ocklusion är alltför idealiserad 4,5. Hittills inkluderar de viktigaste tromboembolimodellerna fototrombos 6,7,8, topikal järnklorid (FeCl3) applicering 9, mikroinjektion av trombin i MCA-grenen 10,11, injektion av ex vivo (mikro)emboli i MCA eller gemensam halspulsåder (CCA)12,13,14 och övergående hypoxi-ischemi (tHI)15,16, 17,18. Dessa strokemodeller skiljer sig åt i den histologiska sammansättningen av efterföljande blodproppar och känsligheten för tPA-medierad lytisk terapi (tabell 1). De varierar också i det kirurgiska behovet av kraniotomi (som behövs för trombininjektion in situ och topikal applicering av FeCl3), konsistensen av infarktens storlek och läge (t.ex. CCA-infusion av mikroemboli ger mycket varierande resultat) och globala effekter på det kardiovaskulära systemet (t.ex. tHI ökar hjärtfrekvensen och hjärtminutvolymen för att kompensera för hypoxi-inducerad perifer vasodilatation).
Den RB-färgbaserade fototrombotiska strokemodellen (PTS) har många attraktiva egenskaper, inklusive enkla kraniotomifria kirurgiska ingrepp, låg dödlighet (vanligtvis < 5 %) och en förutsägbar storlek och plats för infarkt (i MCA-försörjningsområdet), men den har två stora begränsningar. 8 Den första invändningen är svagt till noll svar på tPA-medierad trombolysbehandling, vilket också är en nackdel med FeCl3 modell 7,19,20. Den andra invändningen mot PTS- och FeCl 3-taktsmodeller är att de efterföljande tromberna består av tätt packade trombocytaggregat med en liten mängd fibrin, vilket inte bara leder till dess motståndskraft mot tPA-lytisk behandling, utan också avviker från mönstret av blandade trombocyter:fibrintrombi hos patienter med akut ischemisk stroke21,22. Däremot består in situ trombin-mikroinjektionsmodellen huvudsakligen av polymeriserat fibrin och ett osäkert innehåll av trombocyter10.
Givet ovanstående resonemang antog vi att blandning av RB och en subtrombotisk dos av trombin för MCA-riktad fotoaktivering genom förtunnad skalle kan öka fibrinkomponenten i den resulterande trombin och öka känsligheten för tPA-medierad lytisk behandling. Vi har bekräftat denna hypotes,23 och här beskriver vi detaljerade procedurer för den modifierade (T+RB) fototrombotiska strokemodellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll är godkänt av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Virginia och följer National Institutes of Health Guideline for Care and Use of Laboratory Animals. Figur 1A visar sekvensen av kirurgiska ingrepp i detta protokoll.
1. Upplägg för kirurgi
- Placera en värmedyna med en temperaturinställning på 37 °C på smådjursadaptern minst 15 minuter före operationen. Förbered en nosklämma för adapter som gör det möjligt för djurhuvudet att rotera. Bered bedövningsmedlen Ketamin (60 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg).
- Sterilisera de kirurgiska verktygen inklusive sax, pincett, mikronålhållare, hemostater, bomullspinnar och suturer med autoklav (121 °C vid 15 psi i 60 min). Förbered vävnadslim och ögonsalva. Förbered 532 nm laserskyddsglasögon för kirurger.
OBS: Detta protokoll beskriver en större överlevnadskirurgisk procedur och bör utföras med aseptisk teknik. - Ställ in belysningssystemet med en 532 nm laserkälla. Förbered en tandläkarborr.
- Bered Rose Bengal-lösningen i koksaltlösning (10 mg/ml). Placera en alikvot bovint trombin (0,1 E/μL) på ishinken.
- Injicera ketoprofen (4,0 mg/kg) subkutant i musen som smärtlindring 30 minuter före operationen eller använd den smärtstillande behandling som rekommenderas av de lokala institutionella riktlinjerna.
2. Ligering av den ipsilaterala gemensamma halspulsådern
- Bedöva 10-14 veckor gamla C57BL/6NCrl-möss som väger 22 till 30 g genom intramuskulär injektion av ketamin (60 mg/kg) och xylazin (10 mg/kg).
OBS: Hela det kirurgiska ingreppet, som omfattar ligering av den ipsilaterala gemensamma halspulsådern genom övervakning av cerebralt blodflöde, förväntas ta ~120 min. Anestesiregimen kommer vanligtvis att vara effektiv under hela denna varaktighet, men anestesidjupet bör omvärderas minst var 15:e minut. När du lär dig dessa procedurer kan det vara nödvändigt att dosera om anestesin. - Utför ett nyp i tårna för att säkerställa att djuret är helt bedövat. Ta bort håret på vänster nacke för CCA-ligering och huvudet för skallförtunning med hårborttagningskrämen.
- Placera musen på smådjursadaptern i ryggläge. Sterilisera operationsområdet genom att torka huden med tre omväxlande svep av povidonjod och 70 % etanol.
- Fäst mushuvudet med öronstänger. Under ett dissektionsmikroskop gör du ett 0,5 cm vänster cervikalt snitt med hjälp av en mikrosax och rak pincett cirka 0,2 cm lateralt om mittlinjen.
- Använd en fin tandad pincett för att dra isär mjukvävnaden och fascian för att exponera den vänstra gemensamma halspulsådern (LCCA). Separera försiktigt vänster CCA från vagusnerven med hjälp av en fin slät pincett.
- Placera en permanent dubbelknutsutur runt LCCA med 5-0 silkessutur skuren i 20 mm segment och stäng sedan såret med sterila sårklämmor.
3. Skallförtunning ovanför MCA-grenen och fotoaktivering
- Vänd musen till bukläge på smådjursadaptern. Vrid nosklämmans rulle i 15°. Sterilisera operationsområdet genom att torka huden med tre omväxlande svep betadin och 70 % etanol.
- Gör ett 0,8 cm långt snitt i hårbotten med hjälp av en mikrosax och en rak pincett längs vänster öga och öra för att exponera temporalismuskeln, som ligger mellan ögat och örat (Figur 1B).
- Under dissektionsmikroskopet gör du ett 0,5 cm snitt längs kanten av temporalismuskeln på vänster parietalben med en fin tandad pincett. Gör ett andra 0,3 cm vertikalt snitt på temporalismuskeln med en mikrosax. Dra tillbaka tinningmuskeln för att exponera kanten på parietalbenet och squamosalbenet. Se till att visualisera landmärket för koronal sutur mellan frontal- och parietalbenen (Figur 1B, C).
- Fukta skallen genom att applicera steril koksaltlösning för att avslöja vänster MCA. Markera den proximala MCA-grenen på skivepitelbenet med en tuschpenna. Rita försiktigt en cirkel med en diameter på cirka 1 mm som omger det markerade området med den pneumatiska tandläkarborren (gradhastigheten är inställd på 50 % av hastighetsregulatorn) och tunna sedan ut skallen cirka 0.2 mm på djupet utan att vidröra undersidan. Avbryt borrningen tills ett mycket tunt lager ben finns kvar.
- Blanda trombin (T, 0,1 E/μL, 80 E/kg) och Rose bengal (RB, 10 mg/ml, 50 mg/kg) lösning baserat på musens kroppsvikt. Till exempel, för en mus med en kroppsvikt på 25 g, blanda 20 μL trombin (0,1 E/μL) och 125 μL RB (10 mg/ml).
- Injicera långsamt T+RB-lösning (145 μl per 25 g kroppsvikt) i retroorbital sinus med en insulinspruta (#31G nål).
OBS: I pilotförsök undersöktes mortaliteten för ökande doser av trombin blandat med standarddosen av RB-färgämne (50 mg/kg) för fotoaktivering. Mortaliteten var 0 % för 80 E/kg trombin (n=13), 43 % för 120 E/kg trombin (n=7) och 100 % för både 160 E/kg (n=5) och 200 E/kg trombin (n=5). En dos på 80 E/kg trombin valdes därför för denna modell. Laserspeckelkontraktsavbildning användes också för att utesluta möjligheten av skenande blodkoagulering nära orbitalhålan efter retroorbital sinusinjektion av T+RB (tilläggsfigur 1), liksom utbredd fibrinavsättning i den kontralaterala hemisfären som inte utsattes för laserbelysning (tilläggsfigur 2). - Applicera ögonsalva på båda ögonen för att förhindra torrhet.
- Applicera belysningen med ett 532 nm laserljus (med 0.5 mW energi) på den borrade platsen med 2-tums avstånd i 20 min. Visualisera belysningen på den proximala grenen av MCA genom en laserskyddsglasögon (Figur 1C,D).
OBS: MCA med 532 nm belysning visar röd fluorescens under glasögonen. Den distala MCA försvinner efter 10 minuters belysning. Uteslut djuret om det distala MCA-flödet fortfarande finns kvar efter 20 minuters belysning. - Stoppa laserbelysningen efter 20 min. Stäng såret med sterila sårklämmor.
4. Intravital avbildning (valfritt)
OBS: För att karakterisera trombbildningen in vivo, använd intraviral avbildning med en spin-disk konfokal med fotoaktiveringssystem23.
- Gör ett kranialfönster ~3 mm i diameter på skallbenet.
- Placera ett täckglas på kranialfönstret och placera den distala MCA (~50 μm i diameter) under ett 20x vattennedsänkningsobjektiv.
- Märk det cirkulerande blodplätten genom svansveninjektion av DyLight488-konjugerad anti-GPIbβ-antikropp (0,1 mg/kg) 5 minuter före avbildning.
- Injicera blandningslösningen av trombin (80 E/kg) och Rose bengal (50 mg/kg) retroorbital 5 minuter före avbildning.
- Fotoaktivera MCA med ett 561 nm lasersystem med laserstråle med en diameter på 10 μm och spela in bilden tills tromben bildas.
5. tPA-administrering
- Placera det sövda djuret på en 37 °C varm dyna. Vid den valda tidpunkten efter fotoaktiveringen, fukta en gasbinda med ~45 °C varmt vatten och linda den på svansen i 1 min.
- Injicera rekombinant human tPA (10 mg/kg) genom svansvenen med 50 % bolus och 50 % under 30 minuter med infusionspump.
OBS: Även om den kliniska dosen av rekombinant human tPA för akut ischemisk strokebehandling är 0,9 mg/kg, används ofta en högre dos (10 mg/kg) till gnagare för att kompensera för minskad tPA-reaktivitet mellan arter. Vi följde också standardprotokollet för tPA-administrering i prekliniska strokemodeller, med 50 % som bolus och 50 % infunderas genom svansvenen under 30 minuter.24
6. Övervakning av cerebralt blodflöde (CBF)
OBS: För att bekräfta CBF-återhämtning efter tPA-behandling, använd ett tvådimensionellt laserfläckkontrastbildsystem15 och spela in omedelbart efter fototrombos (steg 3.9) eller 24 timmar efter tPA-behandling.
- Placera det sövda djuret i bukläge och gör ett snitt i mitten av hårbotten med skallen exponerad.
- Återfukta skallen med steril koksaltlösning och applicera försiktigt ultraljudsgelen på skallen. Undvik hår och bubblor i gelen, vilket kommer att störa CBF-signalen.
- Övervaka CBF i båda hjärnhalvorna med laserspeckelkontrastkamera i 10 min.
- Efter att ha spelat in CBF-bilden, stäng hårbotten med vävnadslim och sätt tillbaka djuret i buren.
- Analysera CBF i de valda regionerna och beräkna CBF-återvinningsprocenten jämfört med den kontralaterala regionen.
- Placera sedan tillbaka djuret i en varm bur för återhämtning. Övervaka mössen i 5-10 minuter tills de återhämtar sig från narkosen. Lägg den våta maten i buren och lämna tillbaka den till djurvårdsanläggningen.
OBS: Ge postoperativ smärtlindring enligt rekommendationerna i de lokala institutionella riktlinjerna.
7. Mätning av infarktvolym genom trefenyltetrazoliumklorid (TTC) färgning
- Tjugofyra timmar efter fototrombos, söva djuret djupt enligt de lokala institutionella riktlinjerna för icke-överlevnadskirurgi.
OBS: Vi administrerar tribrometanol (avertin) 250 mg/kg via intraperitoneal (IP) injektion. - Utför transkardiell perfusion med PBS, samla in färsk hjärna och bädda in i 3% agargel.
- Snitta hjärnskivan med 1 mm tjocklek med vibratom och inkubera i 2% TTC-lösning i 10 min.
- Kvantifiera den totala infarktvolymen från 6 hjärnskivor som den absoluta volymen med ImageJ-programvara.
OBS: Hjärnödem användes inte som ett utfallsmått av två skäl. För det första mäter TTC-färgningen vävnadens viabilitet (via mitokondriell reduktionsaktivitet) vilket är en allvarligare konsekvens än ödem. För det andra, när infarkten fortskrider, uppstår både vasogent och cytotoxiskt ödem och kan inte lätt särskiljas med standardmetoderna för mätning av hjärnödem. Vi har dock använt anti-immunoglobin (IgG)-märkning för att bedöma integriteten hos blod-hjärnbarriären (BBB) och fann jämförbar IgG-extravasering 6 timmar efter fotoaktivering i både RB- och T+RB-strokemodeller (kompletterande figur 3).
8. Mätning av trombbildning
OBS: För att mäta trombbildningen, samla in hjärnan 1 timme och 2 timmar efter fototrombos för trombmätning i MCA med immunkemi (IHC) respektive för fibrinmätning i hjärnhalvan med immunoblot.
- Utför IHC för karakterisering av koagelsammansättning. Fixera hjärnan med 4 % paraformaldehyd över natten och torka sedan ut hjärnan med 30 % sackaros för OCT-inbäddningen.
- Snitta hjärnan med sagittal orientering i 20 μm tjocklek och utför IHC med specifika antikroppar mot fibrinogen, trombocyter (glykoprotein IIb), röda blodkroppar (TER119) och blodkärl (isolektin GS-IB4).
- Utför mätning av fibrin i hjärnhalvan med immunoblot med en antikropp mot fibrinogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Först jämförde vi fibrinhalten i RB kontra T+RB fototrombosinducerade blodproppar. Möss avlivades genom transkardiell perfusion av fixeringsmedel 2 timmar efter fotoaktivering, och hjärnor avlägsnades för immunofluorescensfärgning av MCA-grenen i längsgående och tvärgående plan. Vid RB-fototrombos var MCA-grenen tätt packad med CD41+-blodplättar och lite fibrin (Figur 2A,C). Däremot var MCA-grenen i T+RB-fototrombos ockluderad av slumpmässigt blandade trombocyter:fibrin-koaguler (Figur 2B,D, n>3 för varje). Vi använde också immunoblots för att jämföra fibrin(ogen)-nivån i hjärnbarken mellan de två modellerna, efter transkardiell perfusion med koksaltlösning 2 timmar efter fotoaktivering. Denna analys visade > tvåfaldig ökning av fibrindeposition i den ipsilaterala hemisfären i T+RB än RB-fototrombos (Figur 2E, p=0,027 med oparat t-test; n=3 för varje grupp). I vår ursprungliga rapport använde vi också konfokalmikroskopbaserad fotoaktivering av ett kärl och intravital avbildning för att jämföra beteendet hos FITC-konjugerade anti-GP1bβ-märkta blodplättar. 23 Dessa experiment visade att intravenös injektion av 80 E/kg trombin inte kunde inducera trombocytaggregat ens under laserbelysning (figur 3A) och att trombocyter bildar homogena blodproppar i RB-fototrombosmodellen (figur 3B), men ojämna aggregat med flera ljussvaga områden i T+RB-fototrombos (figur 3C). Dessa resultat tyder på att T+RB-fototrombos ökar fibrinhalten i den efterföljande trombinen.
Därefter jämförde vi effekterna av akut intravenös tPA-behandling (10 mg/kg Alteplas, 30 min efter fotoaktivering) på återhämtning av cerebralt blodflöde (CBF) mellan de två modellerna. CBF för samma mus vid behandling före och 24 timmar efter behandling med tPA kontra vehikel mättes med laserfläckkontrastavbildning och normaliserades till den kontralaterala hemisfären (Figur 4A,B). Vid RB-fototrombos ledde tPA-behandlingen till en trend av CBF-återhämtning, särskilt i det ischemiska gränsområdet, jämfört med vehikelbehandlade möss (Figur 4C, vehikel 51 ± 9 % jämfört med tPA 65 ± 7 %, p=0,3 vid oparat t-test, n=4 för varje). Vid T+RB-fototrombos var återhämtningen av CBF hos tPA-behandlade möss mer framträdande, och de proximala MCA-grenarna blev ofta synliga efter 24 timmar (Figur 4D, vehikel 55 ± 3 % jämfört med tPA 81 ± 7 %, p=0,02 vid oparat t-test, n=6 för varje grupp). Dessa resultat tyder på större känslighet för tPA-lytisk behandling med T+RB än RB-fototrombos.
Slutligen använde vi TTC-färgning för att kvantifiera effekterna av tPA-behandling på infarktstorlek i RB- och T+RB-modellerna för fototrombotisk stroke. Vid RB-fototrombos upptäcktes en liknande infarktstorlek hos vehikelbehandlade (18 ± 2,80 mm 3, n=6) och tPA-behandlade möss (18 ± 1,95 mm3, n=10; 10 mg/kg tPA injicerades 30 minuter efter fotoaktivering) (Figur 5A). Däremot minskade den tPA-lytiska behandlingen signifikant infarkten när tPA injicerades vid 0,5 timmar (7 ± 2,1 mm 3, n=9), 1 timme (4,6 ± 1 mm 3, n=10) eller 2 timmar (6,4 ± 1,5 mm 3, n=8 ), men inte vid 6 timmar efter fotoaktivering (15,2 ± 3,1 mm 3, n=7), jämfört med vehikelbehandlade möss (14,8 ± 2 mm 3, n=19) (Figur 5B, p-värdet bestämt av oparat t-test). Dessa resultat indikerar att T+RB fototrombotisk strokemodell har känslighet för tPA-lytisk behandling i.
Figur 1: Översikt över förfarandena. (A) Flödesschemat över de viktigaste kirurgiska ingreppen i T+RB fototrombotisk strokemodell. Ligering av den ipsilaterala gemensamma halspulsådern (CCA) är valfritt, men vi fann att det gör infarktstorleken mer konsekvent, förmodligen på grund av minskad kollateral cirkulation. (B) Ovanifrån och från sidan av mushjärnan i förhållande till skallen. Ögon, öra, temporalismuskel, mellersta hjärnartären (MCA) och grenar är också indicerade, koronal sutur och laserbelysningsstället. (C) Visualisering av den riktade MCA-grenen under den förtunnade skallen (C1) och under laserbelysning (C2), och upphörande av blodflödet efter fotoaktivering (C3). Notera förhållandet mellan MCA-grenen och koronalsuturen. (D) Inställningen av en mus under laserbelysning på den vänstra MCA-grenen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Olika fibrinhalter i blodpropparna. (A-D) Immunofluorescensmärkning av RB- och T+RB-fototrombosinducerad trombi i den distala MCA-grenen i ett antingen längsgående (A, B) eller tvärgående plan (C, D) med användning av anti-fibrin (grön), anti-CD41/trombocyt (röd) och isolektin B4/endotelcell (blå) markörer. Notera den markanta ökningen av antifibrinimmunsignaler i T+RB-fototrombosinducerade blodproppar (B, D, n=3 för varje grupp). (E) Immunoblot indikerade större fibrindeponering i ipsilaterala hjärnbarken i T+RB än RB-fototrombos 2 timmar efter fotoaktivering (n=3 för varje). FN: oskadade möss; Forts: kontralaterala cortex; Ipsi: ipsilaterala cortex. Skalstreck: 50 μm. Denna siffra är modifierad med tillstånd från [23]. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Intravital avbildning av trombocytsvaren. Konfokalmikroskopbaserad intravital avbildning av FITC-konjugerade anti-GP1bβ-märkta blodplättar under laserbelysning med ett kärl (på den plats som indikeras med vita pilar). De experimentella grupperna är: (A) enbart trombin, (B) enbart Rose Bengal och (C) trombin plus Rose Bengal. Tiderna efter laserbelysning är märkta. Se videon på JoVE:s webbplats för detta manuskript. Skalstreck: 50 μm. Denna siffra är modifierad med tillstånd från [23]. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Effekter av tPA-behandling på CBF-återhämtning. Rekombinant human tPA (Alteplas, 10 mg/kg) eller vehikel administrerades via svansvenen till RB- och T+RB-fototrombosutmantade möss 30 minuter efter laserbelysning och cerebralt blodflöde (CBF) vid för- och 24 timmar efter behandling i samma mus jämfördes med laserspeckelkontrastavbildning. CBF i ett område på 3 x 4,8 mm på båda halvkloten mättes. De experimentella grupperna är: (A, C) RB fototrombos; (B, D) T+RB fototrombos. Notera den signifikanta återhämtningen av CBF genom tPA-behandling i T+RB-fototrombosgruppen (p=0,02 vid oparat t-test, n= 4 för vehikel och n=6 för tPA-behandling) och frekvent visualisering av den proximala MCA-grenen. Vid RB-fototrombos ledde tPA-behandlingen till en trend av bättre CBF, främst i det perifera ischemiska området (p=0,3 vid oparat t-test, n=4 för vehikel och n=5 för tPA-behandling). Vita pilar indikerar platsen för MCA-fotoaktivering. Denna siffra är modifierad med tillstånd från [23]. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekter av tPA-behandling på infarktstorleken. (A) Intravenös behandling med tPA (Alteplas, 10 mg/kg) 30 minuter efter RB-fototrombos misslyckades med att minska infarktstorleken (n=6 hos vehikelbehandlade och n=10 hos tPA-behandlade möss). (B) Vid T+RB-fototrombos ledde däremot intravenös 10 mg/kg Alteplasbehandling vid antingen 0,5, 1 eller 2 timmar, men inte vid 6 timmar efter fotoaktivering, till signifikant minskning av infarktstorleken. P-värdet bestämdes av envägs ANOVA med Tukeys test för multipla jämförelser. Denna siffra är modifierad med tillstånd från [23]. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Modell | Kirurgiskt ingrepp | Blodproppar | Trombocyter | Fibrin | tPA-reaktivitet | Huvudfunktioner/verktyg | Viktiga referenser |
| Intraluminal sutur MCAO | Endovaskulär MCA-ocklusion | Nej | N/A | N/A | Nej | Snabb reperfusion; Neuroprektionsstudie; tPA-inducerad BBB-skada | Longa et al. 1989 (Ref #5) |
| Fototrombos | Skallförtunning och fotoaktivering | Ja | Svag | Hög reproducerbarhet; Låg dödlighet | Watson et al. 1985 (Ref #6) | ||
| Trombin-fototrombos | UCCAO, Skallförtunning och fotoaktivering | Ja | Ja | Hög reproducerbarhet; Låg dödlighet | Sun et al. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (på MCA) | Skallförtunning och kemisk aktivering | Ja | Nej | Hög reproducerbarhet; Låg dödlighet | Karatas et al. 2011 (Ref #69) | ||
| In situ injektion av trombin | Kraniotomi och mikroinjektion av MCA | Ja | Ja | Hög reproducerbarhet; låg dödlighet; tPA-lytisk behandling | Orset et al. 2007 (Ref #10) | ||
| Emboli-MCAO | Endovaskulär MCA-ocklusion | Ja | Ja | tPA-lytisk behandling; Variabel koagelhårdhet | Busch et al. 1997 (Ref #13) | ||
| Övergående hypoxi-ischemi (tHI) | UCCAO plus hypoxi | Ja | Ja | Infarct > MCA-området; Systemiska kardiovaskulära effekter | Sun et al. 2014 (Ref #15) |
Tabell 1: Jämförelse av utvalda prekliniska strokemodeller. Fyllda rutor indikerar positivitet (förekomst av blodproppar, blodplättar och fibrin) eller signifikant tPA-reaktivitet.
Kompletterande figur 1: CBF-monitor efter retroorbital injektion av trombin. (A) Representativa foton av retroorbital sinus (övre panel) och blodflöde genom laserfläckkontrastavbildning (nedre panelen). De tre kärlställena (1~3 enligt märkningen) övervakades efter trombininjektion (80 E/kg) i den retroorbitala sinusen. (B) Den representativa spårningsgrafen för blodflödet under 15 minuter efter trombininjektion (pil). (C) Den laserspeckelbaserade kvantifieringen visade ingen minskning av blodflödet nära retroorbital sinus inom 15 minuter efter trombininjektion (n=4, p-värde bestämt av oparat t-test). Klicka här för att ladda ner figuren.
Kompletterande figur 2: Brist på fibrinavsättning i kontralaterala hemisfären 6 timmar efter fotoaktivering. Immunfärgning av anti-fibrinogen (grönt) visade fibrindeposition i ipsilaterala cortex 6 timmar efter RB och T+RB fototrombos. Däremot fanns det ingen diskerbar fibrinavsättning i den kontralaterala cortex efter trombinförstärkt fototrombos. N=4 för varje grupp. Skalstreck: 50 μm. Blå fluorescens som DAPI-kärnfärgning. Klicka här för att ladda ner figuren.
Tilläggsfigur 3: Avsaknad av extravasering av immunglobulin (IgG) efter fototrombos. 6 timmar efter unilateral MCA-riktad fotoaktivering visade immunfärgning extravasering av IgG i den ipsilaterala hemisfären, men inte i den kontralaterala hemisfären, vilket tyder på begränsad BBB-skada efter trombinförstärkt fototrombos. N=4 för varje. Skalstreck: 50 μm. Klicka här för att ladda ner figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den traditionella RB-fototrombotiska stroken, som introducerades 1985, är en attraktiv modell för fokal cerebral ischemi för enkla kirurgiska ingrepp, låg dödlighet och hög reproducerbarhet av hjärninfarkt. 5 I denna modell aktiverar det fotodynamiska färgämnet RB snabbt blodplättar vid ljusexcitation, vilket leder till täta aggregat som täpper till blodkärlet 5,8,23. Den lilla mängden fibrin i RB-inducerade blodproppar (Figur 2) avviker dock från det dominerande trombocyt-fibrin-blandade mönstret av tromber som återfanns akut hos patienter med ischemisk stroke21,22. Det låga fibrininnehållet i RB-inducerade tromber bidrar sannolikt också till dess motståndskraft mot tPA-lytisk behandling 7,8,19. Även om ultraviolett laserbestrålning inducerar vaskulär rekanalisering vid RB-fototrombos, är det osannolikt att denna experimentella terapi kommer att användas kliniskt7. Således har den traditionella RB-fototrombotiska stroken huvudsakligen använts som en permanent ocklusionsmodell, mindre lämpad för trombolys och neuroprotektionsforskning (den senare använder ofta intraluminal sutur-MCAO-modell som har snabb vaskulär reperfusion vid avlägsnande av den mekaniska ocklusionen).
Vår hypotes var att användning av en blandning av RB och en subtrombotisk dos av trombin för fotoaktivering kan öka fibrinhalten i efterföljande trombi och förbättra svaret på tPA-trombolys, den verkliga strokebehandlingen. Denna hypotes stöds av de resultat som presenteras här och i vår ursprungliga rapport. 23 Den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen bibehåller också fördelarna med låg dödlighet, enkla kirurgiska ingrepp och hög konsistens i infarktens storlek och läge, som i traditionell RB-fototrombosmodell. Därför tror vi att trombinförstärkt fototrombos är ett värdefullt tillskott till repertoaren av tromboemboliska strokemodeller (Tabell 1). Två procedurdetaljer i den trombinförstärkta fototrombosmodellen förtjänar att diskuteras. För det första kan överdosering av intravenöst trombin framkalla akut lungtromboembolism och djurdödlighet25. Vi undersökte en rad trombindoser för kombination med RB-fototrombos, och den valda dosen på 80 E/kg har hittills inte inducerat mortalitet hos > 100 experimenterade vuxna C57Bl/6-möss av hantyp. Det är troligt att trombindosen behöver justeras för möss med hyperkoagulationstillstånd26. För det andra ligerade vi rutinmässigt den ipsilaterala CCA förutom MCA-riktad fototrombos i våra procedurer. Vi fann att ligering av den ipsilaterala CCA ytterligare ökar konsistensen i infarktstorlek, vilket kan bero på minskad kollateral cirkulation mellan MCA och de främre plus bakre cerebrala artärerna.
Med sina unika egenskaper kan den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen vara särskilt användbar för minst tre forskningsämnen. För det första är denna nya modell idealisk för direkt jämförelse av tPA och andra fibrinolytiska medel som Tenecteplas (TNKase)27. TNKas är en konstruerad tPA-mutant variant med ökad fibrinspecificitet och lägre risk för iatrogen blödning i ex vivo-experiment. Ändå har dess överlägsenhet jämfört med tPA endast testats i en mikroembolisk strokemodell och med hjälp av en binär neurologisk utfallsanalys14. Med tanke på dess höga reproducerbarhet och kvantitativa analys av infarktstorlek kan den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen användas för att jämföra fördelarna och biverkningarna av tPA-kontra-TNKas i flera aspekter (t.ex. dosrespons, terapeutiskt fönster, samsjuklighet och potentiella biverkningar vid fördröjd behandling). För det andra kan den trombinförstärkta fototrombosmodellen vara användbar för att undersöka effekterna av kombinerad tPA- och trombocythämmande behandling vid akut ischemisk stroke28. De senaste framstegen inom endovaskulära procedurer vid ischemisk stroke har gjort det möjligt för forskare att analysera den histologiska sammansättningen av akuta tromber och identifierat ett dominerande, blandat trombocyt-fibrinmönster21,22. Följaktligen kan kombinationen av ett fibrinolytiskt medel (tPA) och trombocythämmande medel öka den totala effekten av trombolys, men en strokemodell som simulerar den kliniska trombocyt-fibrinsammansättningen av trombos är avgörande för sådan forskning. Tillsammans med tHI- och emboli-MCAO-modellerna uppfyller trombinfototrombos detta krav och utmärker sig för sin låga dödlighet, enkla kirurgiska ingrepp och avsaknad av systemiska kardiovaskulära effekter (tabell 1).
Sist men inte minst kan trombinförstärkt fototrombos vara särskilt användbar för att undersöka stroke-inducerad kollateral cirkulation, med tanke på dess förutsägbara peri-infarktläge i MCA-försörjande territorium. Genom att upprätthålla penumbran för att kompensera för infarkttillväxt, erkänns kollateralcirkulation alltmer som en viktig prediktor för ischemisk strokeresultat, eftersom akut vaskulär obstruktion främjar blodflödet över kollateralt nätverk, följt av ombyggnad och angiogenes för att bilda neo-kollaterala kärl29,30. Resultaten tyder på att tPA inte bara främjar rekanalisering av proximala MCA, utan också ökar kollateralcirkulationen i periferin av MCA-försörjningsområdet (Figur 4). En bättre förståelse av de mekanismer som reglerar plasticiteten i kollateral cirkulation kan föreslå nya terapier. Eftersom den trombinförstärkta fototrombotiska strokemodellen erbjuder fördelen av förutsägbar peri-infarktregion och känslighet för lytisk behandling, kommer den att hjälpa forskningen om kollateral cirkulation efter stroke.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH-anslagen (NS108763, NS100419, NS095064 och HD080429 till C.Y.K.; och NS106592 till Y.Y.S.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
