Summary
Geleneksel fototrombotik inme (PTS) modelleri esas olarak doku plazminojen aktivatörü (tPA) litik tedavisine karşı yüksek dirençli yoğun trombosit agregatlarını indükler. Burada, fotoaktivasyon için trombin ve ışığa duyarlı boyanın birlikte enjekte edilmesiyle modifiye edilmiş bir murin PTS modeli tanıtıldı. Trombin ile zenginleştirilmiş PTS modeli, karışık trombosit:fibrin pıhtıları üretir ve tPA-trombolizine karşı oldukça hassastır.
Abstract
İdeal bir tromboembolik inme modeli, düşük mortaliteye sahip nispeten basit cerrahi prosedürler, tutarlı bir enfarktüs boyutu ve yeri, trombositin çökelmesi: hastalardakine benzer fibrin karışımlı kan pıhtıları ve fibrinolitik tedaviye yeterli duyarlılık gibi belirli özellikler gerektirir. Gül bengal (RB) boya bazlı fototrombotik inme modeli ilk iki gereksinimi karşılar, ancak muhtemelen trombosit açısından zengin, ancak fibrin açısından fakir pıhtı bileşimi nedeniyle tPA aracılı litik tedaviye oldukça dirençlidir. Orta serebral arterin (MCA) proksimal dalına yönelik fotoaktivasyon için RB boyası (50 mg/kg) ve subtrombotik trombin dozu (80 U/kg) kombinasyonunun fibrin ile zenginleştirilmiş ve tPA'ya duyarlı pıhtılar üretebileceğini düşünüyoruz. Gerçekten de, trombin ve RB (T + RB) kombine fototromboz modeli, immün boyama ve immünoblotlarla gösterildiği gibi karışık trombosit: fibrin kan pıhtılarını tetikledi ve tutarlı enfarktüs boyutları ve konumları ile düşük mortaliteyi korudu. Ayrıca, fotoaktivasyondan sonraki 2 saat içinde intravenöz tPA (Alteplaz, 10 mg/kg) enjeksiyonu, T+RB fototrombozunda enfarktüs boyutunu önemli ölçüde azalttı. Bu nedenle, trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, yeni trombolitik tedavileri test etmek için yararlı bir deneysel model olabilir.
Introduction
Endovasküler trombektomi ve tPA aracılı tromboliz, Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda ~ 700.000 hastayı etkileyen akut iskemik inmenin ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) onaylı iki tedavisidir1. Trombektomi uygulaması büyük damar tıkanıklığı (LVO) ile sınırlı olduğundan, tPA-tromboliz küçük damar tıkanıklıklarını hafifletebildiğinden, her ikisi de akut iskemik inme için değerli tedavilerdir2. Ayrıca, her iki tedavinin kombinasyonu (ör., inme başlangıcından sonraki 4.5 saat içinde tPA-trombolizin başlatılması, ardından trombektomi) reperfüzyonu ve fonksiyonel sonuçları iyileştirir3. Bu nedenle, trombolizi optimize etmek, trombektomi çağında bile inme araştırmaları için önemli bir hedef olmaya devam etmektedir.
Tromboembolik modeller, trombolitik tedavileri iyileştirmeyi amaçlayan klinik öncesi inme araştırmaları için önemli bir araçtır. Bunun nedeni, mekanik vasküler oklüzyon modellerinin (örneğin, intraluminal sütür MCA oklüzyonu) kan pıhtıları üretmemesi ve mekanik oklüzyonun çıkarılmasından sonra serebral kan akışının hızlı bir şekilde geri kazanılmasının aşırı derecede idealize edilmesidir 4,5. Bugüne kadar, başlıca tromboembolik modeller arasında fototromboz 6,7,8, topikal ferrik klorür (FeCl3) uygulaması9, MCA dalına trombin mikroenjeksiyonu10,11, MCA veya ortak karotis artere (CCA) ex vivo (mikro) emboli enjeksiyonu12,13,14 ve geçici hipoksi-iskemi (tHI)15,16, 17,18. Bu inme modelleri, takip eden pıhtıların histolojik bileşimi ve tPA aracılı litik tedavilere duyarlılık açısından farklılık gösterir (Tablo 1). Ayrıca kraniotominin cerrahi gereksinimi (in situ trombin enjeksiyonu ve FeCl3'ün topikal uygulaması için gereklidir), enfarktüs boyutunun ve yerinin tutarlılığı (ör., mikroembolinin CCA infüzyonu çok değişken sonuçlar verir) ve kardiyovasküler sistem üzerindeki küresel etkiler (örneğin, tHI, hipoksi kaynaklı periferik vazodilatasyonu telafi etmek için kalp atış hızını ve kalp debisini arttırır).
RB boya bazlı fototrombotik inme (PTS) modeli, basit kraniyotomi içermeyen cerrahi prosedürler, düşük mortalite (tipik olarak %5'<) ve öngörülebilir bir enfarktüs boyutu ve yeri (MCA sağlayan bölgede) dahil olmak üzere birçok çekici özelliğe sahiptir, ancak iki ana sınırlaması vardır. 8 İlk uyarı, aynı zamanda FeCl3 modeli 7,19,20'nin bir dezavantajı olan tPA aracılı trombolitik tedaviye zayıftan sıfıra yanıttır. PTS ve FeCl3 inme modellerinin ikinci uyarısı, takip eden trombüslerin az miktarda fibrin içeren yoğun paketlenmiş trombosit agregatlarından oluşmasıdır, bu sadece tPA-litik tedaviye karşı direncine yol açmakla kalmaz, aynı zamanda akut iskemik inme hastalarında karıştırılmış trombosit:fibrin trombüs modelinden de sapar21,22. Buna karşılık, in situ trombin-mikroenjeksiyon modeli esas olarak polimerize fibrin ve belirsiz bir trombosit içeriğiiçerir 10.
Yukarıdaki mantık göz önüne alındığında, inceltilmiş kafatası yoluyla MCA hedefli fotoaktivasyon için RB ve sub-trombotik trombin dozunun karışımının, ortaya çıkan trombüsteki fibrin bileşenini artırabileceğini ve tPA aracılı litik tedaviye duyarlılığı artırabileceğini varsaydık. Bu hipotezi doğruladık,23 ve burada modifiye (T+RB) fototrombotik inme modelinin ayrıntılı prosedürlerini açıklıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol, Virginia Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip eder. Şekil 1A , bu protokolün cerrahi prosedürlerinin sırasını özetlemektedir.
1. Ameliyat kurulumu
- Ameliyattan en az 15 dakika önce küçük hayvan adaptörünün üzerine 37 °C sıcaklık ayarlı bir ısıtma pedi yerleştirin. Hayvan kafasının dönmesine izin veren adaptör için bir burun klipsi rulosu hazırlayın. Anestezikleri hazırlayın Ketamin (60 mg / kg) / Ksilazin (10 mg / kg).
- Makas, forseps, mikro iğne tutucular, kanama durdurucular, pamuklu çubuklar ve sütürler dahil olmak üzere cerrahi aletleri otoklavla sterilize edin (60 dakika boyunca 15 psi'de 121 °C). Doku tutkalı ve göz merhemi hazırlayın. Cerrahlar için 532 nm lazer koruma gözlüğünü hazırlayın.
NOT: Bu protokol büyük bir sağkalım cerrahisi prosedürünü açıklar ve aseptik teknikler kullanılarak yapılmalıdır. - Aydınlatma sistemini 532 nm lazer kaynağıyla kurun. Bir diş matkabı hazırlayın.
- Gül Bengal çözeltisini salin (10 mg / mL) içinde hazırlayın. Buz kovasına bir alikot sığır trombini (0.1 U / μL) yerleştirin.
- Ketoprofen'i (4.0 mg / kg) ameliyattan 30 dakika önce analjezi olarak fareye deri altına enjekte edin veya yerel kurumsal kılavuzlar tarafından önerilen analjezik rejimi kullanın.
2. İpsilateral ortak karotis arterin bağlanması
- 22 ila 30 g ağırlığındaki 10-14 haftalık erkek C57BL / 6NCrl farelerini kas içi Ketamin (60 mg / kg) ve Xylazine (10 mg / kg) enjeksiyonu ile uyuşturun.
NOT: Serebral kan akışının izlenmesi yoluyla ipsilateral ortak karotis arterin bağlanmasını kapsayan tüm cerrahi prosedürün ~ 120 dakika sürmesi beklenmektedir. Anestezi rejimi tipik olarak tüm bu süre boyunca etkili olacaktır, ancak anestezik derinlik en az 15 dakikada bir yeniden değerlendirilmelidir. Bu prosedürleri öğrenirken anestezinin yeniden dozlanması gerekebilir. - Hayvanın tamamen uyuşturulduğundan emin olmak için ayak parmağınızı sıkıştırın. CCA ligasyonu için sol boyundaki kılları ve kafatası inceltme için baştaki tüyleri tüy dökücü kremle alın.
- Fareyi sırtüstü pozisyonda küçük hayvan adaptörünün üzerine yerleştirin. Cildi üç alternatif povidon-iyot ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.
- Fare kafasını kulak çubuklarını kullanarak sabitleyin. Diseksiyon mikroskobu altında, orta hattın yaklaşık 0,2 cm lateralinde bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak 0,5 cm'lik sol servikal insizyon yapın.
- Sol ortak karotis arteri (LCCA) ortaya çıkarmak için yumuşak dokuyu ve fasyayı ayırmak için bir çift ince tırtıklı forseps kullanın. Bir çift ince düz forseps kullanarak sol CCA'yı vagal sinirden dikkatlice ayırın.
- 20 mm'lik segmentler halinde kesilmiş 5-0 ipek sütür kullanarak LCCA'nın etrafına kalıcı bir çift düğümlü sütür yerleştirin ve ardından steril yara klipsleri kullanarak yarayı kapatın.
3. MCA dalının üzerinde kafatası incelmesi ve fotoaktivasyon
- Fareyi küçük hayvan adaptörüne yüzüstü pozisyona çevirin. Burun klipsi rulosunu 15° döndürün. Cildi üç alternatif betadin ve% 70 etanol ile silerek cerrahi alanı sterilize edin.
- Göz ile kulak arasında yer alan temporalis kasını ortaya çıkarmak için sol göz ve kulak boyunca bir çift mikro makas ve düz forseps kullanarak saçlı deride 0,8 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1B).
- Diseksiyon mikroskobu altında, bir çift ince tırtıklı forseps ile sol parietal kemikte temporalis kasının kenarı boyunca 0.5 cm'lik bir kesi yapın. Mikro makasla temporalis kası üzerinde 0,3 cm'lik ikinci bir dikey kesi yapın. Parietal kemiğin ve skuamöz kemiğin kenarını ortaya çıkarmak için temporal kası geri çekin. Frontal ve parietal kemikler arasındaki koronal sütürün dönüm noktasını görselleştirdiğinizden emin olun (Şekil 1B,C).
- Sol MCA'yı ortaya çıkarmak için steril salin uygulayarak kafatasını nemlendirin. Skuamöz kemikteki proksimal MCA dalını bir işaretleyici kalemle işaretleyin. Pnömatik diş matkabı ile işaretli alanı çevreleyen yaklaşık 1 mm çapında bir daire çizin (hız kontrol cihazının %50'sinde çapak hızı ayarı) ve ardından alt duraya dokunmadan kafatasını yaklaşık 0.2 mm derinliğinde inceltin. Çok ince bir kemik tabakası kalana kadar delmeyi durdurun.
- Trombin (T, 0.1 U / μL, 80 U / kg) ve Gül bengal (RB, 10 mg / mL, 50 mg / kg) çözeltisini farenin vücut ağırlığına göre karıştırın. Örneğin, 25 g vücut ağırlığına sahip bir fare için 20 μL trombin (0.1 U / μL) ve 125 μL RB (10 mg / mL) karıştırın.
- T + RB çözeltisini (25 g vücut ağırlığı başına 145 μL) bir insülin şırıngası (#31G iğnesi) ile retro-orbital sinüse yavaşça enjekte edin.
NOT: Pilot deneylerde, standart RB boya dozu (50 mg / kg) ile karıştırılmış artan trombin dozlarının mortalite oranı fotoaktivasyon açısından incelenmiştir. Mortalite 80 U/kg trombin için %0 (n=13), 120 U/kg trombin için %43 (n=7) ve hem 160 U/kg (n=5) hem de 200 U/kg trombin (n=5) için %100 idi. Bu nedenle bu model için 80 U/kg'lık bir trombin dozu seçildi. Retro-orbital sinüs T+RB enjeksiyonundan sonra orbital boşluğun yakınında yaygın kan pıhtılaşması olasılığını dışlamak için lazer benek kasılma görüntüleme de kullanıldı (Ek Şekil 1) ve ayrıca lazer aydınlatmasına maruz kalmayan kontralateral hemisferde yaygın fibrin birikimi (Ek Şekil 2). - Kuruluğu önlemek için her iki göze de göz merhemi sürün.
- Aydınlatıcıyı 532 nm lazer ışığıyla (0,5 mW enerji ile) delinmiş alana 2 inç mesafeyle 20 dakika boyunca uygulayın. MCA'nın proksimal dalındaki aydınlatmayı bir lazer koruma gözlüğü ile görselleştirin (Şekil 1C,D).
NOT: 532 nm aydınlatmalı MCA, gözlüğün altında kırmızı floresan gösterir. Distal MCA, 10 dakikalık aydınlatmadan sonra kaybolacaktır. 20 dakikalık aydınlatmadan sonra distal MCA akışı hala mevcutsa hayvanı hariç tutun. - 20 dakika sonra lazer aydınlatmasını durdurun. Yarayı steril yara klipsleriyle kapatın.
4. İntravital görüntüleme (isteğe bağlı)
NOT: Trombüs oluşumunu in vivo olarak karakterize etmek için, fotoaktivasyon sistemi23 ile bir spin-disk konfokal ile intraviral görüntüleme kullanın.
- Kafatasının parietal kemiği üzerinde ~ 3 mm çapında bir kraniyal pencere yapın.
- Kraniyal pencereye bir kapak camı yerleştirin ve distal MCA'yı (~ 50 μm çapında) 20x suya daldırma hedefinin altına yerleştirin.
- Görüntülemeden 5 dakika önce DyLight488-konjuge anti-GPIbβ antikorunun (0.1 mg / kg) kuyruk damarı enjeksiyonu ile dolaşımdaki trombositi etiketleyin.
- Trombin (80 U / kg) ve Rose bengal (50 mg / kg) karışım solüsyonunu görüntülemeden 5 dakika önce retro-orbital ile enjekte edin.
- 10 μm çapında lazer ışını ile 561 nm lazer sistemi kullanarak MCA'yı fotoaktif hale getirin ve görüntüyü trombüs oluşana kadar kaydedin.
5. tPA yönetimi
- Anestezi uygulanmış hayvanı 37 °C'lik ılık bir ped üzerine yerleştirin. Seçilen fotoaktivasyon sonrası zaman noktasında, bir gazlı bezi ~45 °C ılık suyla ıslatın ve 1 dakika boyunca kuyruğa sarın.
- Rekombinant insan tPA'sını (10 mg / kg) infüzyon pompası ile 30 dakika boyunca% 50 bolus ve% 50 ile kuyruk damarından enjekte edin.
NOT: Akut iskemik inme tedavisi için rekombinant insan tPA'sının klinik dozu 0.9 mg / kg olmasına rağmen, kemirgenlerde azalmış türler arası tPA reaktivitesini telafi etmek için daha yüksek bir doz (10 mg / kg) yaygın olarak kullanılır. Ayrıca, klinik öncesi inme modellerinde %50'sini bolus olarak ve %50'sini 30 dakika boyunca kuyruk damarından infüze ederek standart tPA uygulama protokolünü izledik.24
6. Serebral kan akışının izlenmesi (CBF)
NOT: tPA tedavisinden sonra CBF iyileşmesini doğrulamak için, iki boyutlu bir lazer benek kontrast görüntüleme sistemi15 kullanın ve fototrombozdan hemen sonra (adım 3.9) veya tPA tedavisinden 24 saat sonra kaydedin.
- Anestezi uygulanmış hayvanı yüzüstü pozisyona getirin ve kafatası açıkta kalacak şekilde kafa derisinde orta hat kesisi yapın.
- Kafatasını steril salinle nemlendirin ve ultrason jelini kafatasına nazikçe uygulayın. Jölede CBF sinyalini engelleyecek herhangi bir saç ve kabarcıktan kaçının.
- CBF'yi her iki serebral hemisferde lazer benekli kontrast görüntüleyici altında 10 dakika boyunca izleyin.
- CBF görüntüsünü kaydettikten sonra, kafa derisini doku yapıştırıcısı ile kapatın ve hayvanı kafese geri koyun.
- Seçilen bölgelerde CBF'yi analiz edin ve kontralateral bölgeye kıyasla CBF iyileşme yüzdesini hesaplayın.
- Ardından, hayvanı iyileşmesi için sıcak bir kafese geri koyun. Fareleri anesteziden kurtulana kadar 5-10 dakika izleyin. Islanan yiyecekleri kafese koyun ve hayvan bakım tesisine geri koyun.
NOT: Yerel kurumsal kılavuzların önerdiği şekilde ameliyat sonrası analjezi sağlayın.
7. Trifenil tetrazolyum klorür (TTC) boyama ile enfarktüs hacmi ölçümü
- Fototrombozdan yirmi dört saat sonra, hayatta kalmama cerrahisi için yerel kurumsal yönergelere göre hayvanı derinlemesine uyuşturun.
NOT: Tribromoetanol (avertin) 250 mg/kg'ı intraperitoneal (IP) enjeksiyon yoluyla uyguluyoruz. - PBS ile transkardiyal perfüzyon gerçekleştirin, taze beyin toplayın ve% 3 agar jeli içine gömün.
- Beyin dilimini 1 mm kalınlığında vibratom ile bölümlere ayırın ve% 2 TTC çözeltisinde 10 dakika inkübe edin.
- ImageJ yazılımı ile 6 beyin diliminden toplam enfarktüs hacmini mutlak hacim olarak ölçün.
NOT: Beyin ödemi iki nedenden dolayı sonuç ölçümü olarak kullanılmamıştır. İlk olarak, TTC boyası, ödemden daha ciddi bir sonuç olan doku canlılığını (mitokondriyal redüksiyon aktivitesi yoluyla) ölçer. İkincisi, enfarktüs ilerledikçe hem vazojenik hem de sitotoksik ödem oluşur ve standart beyin ödemi ölçüm yöntemleriyle kolayca ayırt edilemez. Bununla birlikte, kan-beyin bariyerinin (BBB) bütünlüğünü değerlendirmek için anti-immünoglobin (IgG) etiketlemesi kullandık ve hem RB hem de T + RB inme modellerinde fotoaktivasyondan 6 saat sonra karşılaştırılabilir IgG ekstravazasyonu bulduk (Ek Şekil 3).
8. Trombüs oluşumu ölçümü
NOT: Trombüs oluşumunu ölçmek için, immünokimya (IHC) ile MCA'da trombüs ölçümü için fototrombozdan 1 saat ve 2 saat sonra beyni toplayın ve immünoblot ile beyin hemisferinde fibrin ölçümü için sırasıyla.
- Pıhtı kompozisyonunun karakterizasyonu için IHC'yi gerçekleştirin. Beyni gece boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin ve ardından OCT yerleştirme için beyni% 30 sükroz ile kurutun.
- Beyni 20 μm kalınlığında sagital yönelimle bölümlere ayırın ve fibrinojen, trombosit (glikoprotein IIb), kırmızı kan hücresi (TER119) ve kan damarına (izolektin GS-IB4) karşı spesifik antikorlarla IHC'yi gerçekleştirin.
- Fibrinojene karşı bir antikor ile immünoblot ile beyin yarımküresinde fibrin ölçümü yapın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İlk olarak, RB ile T + RB fototrombozunun neden olduğu kan pıhtılarındaki fibrin içeriğini karşılaştırdık. Fareler, fotoaktivasyondan 2 saat sonra fiksatiflerin transkardiyal perfüzyonu ile sakrifiye edildi ve uzunlamasına ve enine düzlemlerde MCA dalının immünofloresan boyanması için beyinler çıkarıldı. RB fototrombozunda, MCA dalı yoğun olarak CD41+ trombositler ve az miktarda fibrin ile doluydu (Şekil 2A,C). Buna karşılık, T+RB fototrombozunda MCA dalı rastgele karışık trombosit:fibrin pıhtıları ile tıkanmıştı (her biri için Şekil 2B,D, n>3). Ayrıca, fotoaktivasyondan 2 saat sonra salin ile transkardiyal perfüzyondan sonra iki model arasındaki serebral korteksteki fibrin (ojen) seviyesini karşılaştırmak için immünoblotlar kullandık. Bu analiz, T+RB'de ipsilateral hemisferde fibrin birikiminde RB fototrombozuna göre iki kat artış > gösterdi (Şekil 2E, eşleşmemiş t-testi ile p=0.027; her grup için n=3). Orijinal raporumuzda, FITC konjuge anti-GP1bβ etiketli trombositlerin davranışlarını karşılaştırmak için konfokal mikroskop tabanlı tek damar fotoaktivasyonu ve intravital görüntüleme kullandık. 23 Bu deneyler, intravenöz 80 U/kg trombin enjeksiyonunun lazer aydınlatması altında bile trombosit agregatlarını indükleyemediğini (Şekil 3A) ve trombositlerin RB fototromboz modelinde homojen pıhtılar oluşturduğunu (Şekil 3B), ancak T+RB fototrombozunda birden fazla soluk bölgeye sahip düzensiz agregalar oluşturduğunu göstermiştir (Şekil 3C). Bu sonuçlar, T+RB fototrombozunun takip eden trombüsteki fibrin içeriğini arttırdığını göstermektedir.
Daha sonra, akut intravenöz tPA tedavisinin (10 mg / kg Alteplaz, fotoaktivasyondan 30 dakika sonra) iki model arasında serebral kan akımı (CBF) iyileşmesi üzerindeki etkilerini karşılaştırdık. Aynı farenin tPA'ya karşı araç tedavisinden önceki ve 24 saat sonraki CBF'si lazer benek kontrast görüntüleme ile ölçüldü ve kontralateral hemisfere normalize edildi (Şekil 4A, B). RB fototrombozunda, tPA tedavisi, araçla tedavi edilen farelerle karşılaştırıldığında, özellikle iskemik sınır bölgesinde CBF iyileşme eğilimine yol açmıştır (Şekil 4C, araç %51 ± %9'a karşı tPA 65 ± %7, eşleşmemiş t-testi ile p = 0.3, her biri için n = 4). T + RB fototrombozunda, tPA ile tedavi edilen farelerde CBF'nin iyileşmesi daha belirgindi ve proksimal MCA dalları genellikle 24 saatte görünür hale geldi (Şekil 4D, araç %55 ± %3'e karşı tPA 81 ± %7, eşleşmemiş t-testi ile p = 0.02, her grup için n = 6). Bu sonuçlar, T + RB ile tPA-litik tedaviye RB fototrombozundan daha fazla duyarlılık olduğunu göstermektedir.
Son olarak, RB ve T+RB fototrombotik inme modellerinde tPA tedavisinin enfarktüs boyutu üzerindeki etkilerini ölçmek için TTC boyası kullandık. RB fototrombozunda, araçla tedavi edilen (18 ± 2.80 mm3, n=6) ve tPA ile tedavi edilen farelerde (18 ± 1.95mm3, n=10; fotoaktivasyondan 30 dakika sonra 10 mg/kg tPA enjekte edildi) benzer bir enfarktüs boyutu tespit edildi (Şekil 5A). Buna karşılık, tPA 0.5 saat (7 ± 2.1 mm 3, n = 9), 1 saat (4.6 ± 1 mm 3, n = 10) veya 2 saat (6.4 ± 1.5 mm 3, n = 8) enjekte edildiğinde tPA-litik tedavi enfarktüsü önemli ölçüde azalttı, ancak fotoaktivasyondan 6 saat sonra (15.2 ± 3.1 mm 3, n = 7), araçla tedavi edilen farelere (14.8 ± 2 mm 3) kıyasla, n=19) (Şekil 5B, eşleştirilmemiş t-testi ile belirlenen p değeri). Bu sonuçlar, T+RB fototrombotik inme modelinin tPA-litik tedaviye duyarlılığı olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Prosedürlerin ana hatları. (A) T+RB fototrombotik inme modelinde ana cerrahi prosedürlerin akış şeması. İpsilateral ortak karotis arterin (CCA) ligasyonu isteğe bağlıdır, ancak muhtemelen kollateral dolaşımın azalması nedeniyle enfarktüs boyutunu daha tutarlı hale getirdiğini bulduk. (B) Fare beyninin kafatasına göre üstten ve yandan görünümü. Ayrıca gözler, kulak, temporalis kası, orta serebral arter (MCA) ve dalları, koronal sütür ve lazer aydınlatma bölgesi de endikedir. (C) İnceltilmiş kafatasının altında (C1) ve lazer aydınlatması (C2) sırasında hedeflenen MCA dalının görselleştirilmesi ve fotoaktivasyondan sonra kan akışının kesilmesi (C3). MCA dalının koronal sütür ile ilişkisine dikkat edin. (D) Sol MCA dalında lazer aydınlatması sırasında bir farenin kurulumu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kan pıhtılarındaki farklı fibrin içerikleri. (A-D) Anti-fibrin (yeşil), anti-CD41/trombosit (kırmızı) ve izolektin B4/endotel hücre (mavi) belirteçleri kullanılarak uzunlamasına (A, B) veya enine düzlemde (C, D) distal MCA dalında RB ve T+RB fototrombozunun neden olduğu trombüslerin immünofloresan işaretlemesi. T + RB fototrombozunun neden olduğu kan pıhtılarında anti-fibrin immünosinyallerinin belirgin artışına dikkat edin (her grup için B, D, n = 3). (E) İmmünoblotlama, fotoaktivasyondan 2 saat sonra (her biri için n = 3) T + RB'de ipsilateral serebral kortekste RB fototrombozundan daha fazla fibrin birikimi gösterdi. BM: yaralanmamış fareler; Devam: kontralateral korteks; İpsi: ipsilateral korteks. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakam [23]'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Trombosit yanıtlarının intravital görüntülemesi. Tek damar lazer aydınlatması altında (beyaz oklarla gösterilen bölgede) FITC konjuge anti-GP1bβ etiketli trombositlerin konfokal mikroskop tabanlı intravital görüntülemesi. Deney grupları şunlardır: (A) tek başına trombin, (B) tek başına Rose Bengal ve (C) trombin artı Rose Bengal. Lazer aydınlatmadan sonraki süreler etiketlenir. Bu el yazması için JoVE web sitesindeki videoya bakın. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakam [23]'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: TPA tedavisinin CBF iyileşmesi üzerindeki etkileri. Rekombinant insan tPA'sı (Alteplaz, 10 mg/kg) veya araç, lazer aydınlatmasından 30 dakika sonra RB ve T+RB fototromboz sorunu yaşayan fareye kuyruk veni yoluyla uygulandı ve aynı farede tedavi öncesi ve 24 saat sonra serebral kan akışı (CBF) lazer benek kontrast görüntüleme ile karşılaştırıldı. Her iki hemisferde 3 x 4.8 mm'lik bir alanda CBF ölçüldü. Deney grupları: (A, C) RB fototrombozu; (B, D) T + RB fototrombozu. T + RB fototromboz grubunda tPA tedavisi ile CBF'nin anlamlı iyileşmesine dikkat edin (eşleşmemiş t-testi ile p = 0.02, araç için n = 4 ve tPA tedavisi için n = 6) ve proksimal MCA dalının sık görüntülenmesi. RB fototrombozunda, tPA tedavisi, ağırlıklı olarak periferik iskemik alanda daha iyi bir CBF eğilimine yol açmıştır (eşleşmemiş t-testi ile p = 0.3, araç için n = 4 ve tPA tedavisi için n = 5). Beyaz oklar, MCA-fotoaktivasyon bölgesini gösterir. Bu rakam [23]'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: tPA tedavisinin enfarktüs boyutu üzerindeki etkileri. (A) RB fototrombozundan 30 dakika sonra intravenöz tPA tedavisi (Alteplaz, 10 mg / kg) enfarktüs boyutunu azaltamadı (araçla tedavi edilen farelerde n = 6 ve tPA ile tedavi edilen farelerde n = 10). (B) Buna karşılık, T + RB fototrombozunda, fotoaktivasyondan 0.5, 1 veya 2 saat sonra, ancak 6 saat sonra değil, intravenöz 10 mg / kg Alteplase tedavisi, enfarktüs boyutunda önemli bir azalmaya yol açtı. P değeri tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile belirlendi. Bu rakam [23]'ün izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Model | Cerrahi Prosedür | Kan pıhtıları | Trombosit | Fibrin | tPA reaktivitesi | Ana özellikler/yardımcı program | Önemli referanslar |
| İntraluminal sütür MCAO | Endovasküler MCA oklüzyonu | Hayır | YOK | YOK | Hayır | Hızlı reperfüzyon; Nöropreksiyon çalışması; tPA'nın neden olduğu BBB yaralanması | Longa ve ark. 1989 (Kaynak #5) |
| Fototromboz | Kafatası inceltme ve fotoaktivasyon | Evet | Zayıf | Yüksek tekrarlanabilirlik; düşük mortalite | Watson ve ark. 1985 (Referans #6) | ||
| Trombin-Fototromboz | UCCAO, Kafatası inceltme ve fotoaktivasyon | Evet | Evet | Yüksek tekrarlanabilirlik; düşük mortalite | Sun ve ark. 2020 (Ref #23) | ||
| FeCl3 (MCA'da) | Kafatası inceltme ve kimyasal aktivasyon | Evet | Hayır | Yüksek tekrarlanabilirlik; düşük mortalite | Karataş ve ark. 2011 (Ref #69) | ||
| Yerinde trombin enjeksiyonu | Kraniyotomi ve MCA mikroenjeksiyonu | Evet | Evet | Yüksek tekrarlanabilirlik; düşük ölüm oranı; tPA-litik tedavi | Orset ve ark. 2007 (Kaynak #10) | ||
| Emboli-MCAO | Endovasküler MCA oklüzyonu | Evet | Evet | tPA-litik tedavi; Değişken pıhtı sertliği | Busch ve ark. 1997 (Ref #13) | ||
| Geçici Hipoksi-İskemi (tHI) | UCCAO artı hipoksi | Evet | Evet | MCA alanı > enfarktüs; Sistemik CV etkileri | Sun ve ark. 2014 (Ref #15) |
Tablo 1: Seçilmiş preklinik inme modellerinin karşılaştırılması. Dolu kutular pozitifliği (kan pıhtıları, trombositler ve fibrin varlığı) veya önemli tPA reaktivitesini gösterir.
Ek Şekil 1: Trombinin retro-orbital enjeksiyonundan sonra CBF monitörü. (A) Lazer benek kontrast görüntüleme (alt panel) ile retro-orbital sinüs (üst panel) ve kan akışının temsili fotoğrafları. Üç vasküler bölge (etiketlendiği gibi 1 ~ 3) retro-orbital sinüse trombin enjeksiyonundan (80 U / kg) sonra izlendi. (B) Trombin enjeksiyonundan sonra 15 dakika boyunca kan akışının temsili izleme grafiği (ok). (C) Lazer benek bazlı kantifikasyon, trombin enjeksiyonundan sonraki 15 dakika içinde retro-orbital sinüs yakınında kan akışında azalma göstermedi (n = 4, eşleşmemiş t-testi ile belirlenen p değeri). Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 2: Fotoaktivasyondan 6 saat sonra kontralateral hemisferde fibrin birikimi eksikliği. Anti-fibrinojenin (yeşil) immün boyanması, RB ve T + RB fototrombozundan 6 saat sonra ipsilateral kortekste fibrin birikimi gösterdi. Buna karşılık, trombin ile güçlendirilmiş fototrombozu takiben kontralateral kortekste belirgin bir fibrin birikimi yoktu. Her grup için N=4. Ölçek çubuğu: 50 μm. DAPI-çekirdek boyaması olarak mavi floresan. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Şekil 3: Fototromboz sonrası immünoglobulin (IgG) ekstravazasyon eksikliği. Tek taraflı MCA hedefli fotoaktivasyondan 6 saat sonra, immün boyama, ipsilateral hemisferde IgG'nin ekstravazasyonunu gösterdi, ancak kontralateral hemisferde göstermedi, bu da trombin ile güçlendirilmiş fototrombozdan sonra sınırlı BBB hasarını düşündürdü. Her biri için N=4. Ölçek çubuğu: 50 μm. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
1985 yılında tanıtılan geleneksel RB fototrombotik inme, basit cerrahi prosedürler, düşük mortalite ve beyin enfarktüsünün yüksek tekrarlanabilirliği için çekici bir fokal serebral iskemi modelidir. 5 Bu modelde, fotodinamik boya RB, ışık uyarımı üzerine trombositleri hızla aktive eder ve kan damarını tıkayan yoğun agregalara yol açar 5,8,23. Bununla birlikte, RB ile indüklenen kan pıhtılarındaki az miktarda fibrin (Şekil 2) baskın trombositten sapmaktadır: iskemik inme hastalarında akut olarak alınan trombüsün fibrin ile karıştırılmış paterni21,22. RB ile indüklenen trombüslerdeki düşük fibrin içeriği de muhtemelen tPA-litik tedaviyekarşı direncine katkıda bulunur 7,8,19. Ultraviyole lazer ışınlaması RB fototrombozunda vasküler rekanalizasyonu indüklese de, bu deneysel tedavinin klinik olarak kullanılması olası değildir7. Bu nedenle, geleneksel RB fototrombotik inme esas olarak tromboliz ve nöroproteksiyon araştırmaları için daha az uygun olan kalıcı bir oklüzyon modeli olarak kullanılmıştır (ikincisi genellikle mekanik oklüzyonun çıkarılması üzerine hızlı vasküler reperfüzyon özelliğine sahip intraluminal sütür MCAO modelini kullanır).
Fotoaktivasyon için RB ve sub-trombotik trombin dozu karışımının kullanılmasının, sonraki trombüslerde fibrin içeriğini artırabileceğini ve gerçek dünya inme tedavisi olan tPA trombolizine verilen yanıtları artırabileceğini varsaydık. Bu hipotez, burada ve orijinal raporumuzda sunulan sonuçlarla desteklenmektedir. 23 Trombin ile geliştirilmiş fototrombotik inme modeli, geleneksel RB fototromboz modelinde olduğu gibi düşük mortalite, basit cerrahi prosedürler ve enfarktüs boyutu ve yerinde yüksek tutarlılık avantajlarını da korur. Bu nedenle, trombin ile zenginleştirilmiş fototrombozun tromboembolik inme modellerinin repertuarına değerli bir katkı olduğuna inanıyoruz (Tablo 1). Trombin ile zenginleştirilmiş fototromboz modelinin iki prosedürel detayı tartışmayı garanti eder. İlk olarak, aşırı dozda intravenöz trombin akut pulmoner tromboembolizme ve hayvan ölümlerine neden olabilir25. RB fototrombozu ile kombinasyon için bir dizi trombin dozunu inceledik ve seçilen 80 U / kg dozu, şimdiye kadar >100 denenmiş yetişkin erkek C57Bl / 6 faresinde mortaliteye neden olmadı. Hiperkoagülasyon durumları26 olan fareler için trombin dozunun ayarlanması gerekebilir. İkinci olarak, prosedürlerimizde MCA hedefli fototrombozun yanı sıra ipsilateral CCA'yı da rutin olarak bağladık. İpsilateral CCA'nın ligasyonunun, MCA ile anterior artı posterior serebral arterler arasındaki kollateral dolaşımın azalmasına bağlı olabilecek enfarktüs boyutundaki tutarlılığı daha da arttırdığını bulduk.
Eşsiz özellikleri ile trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, en az üç araştırma konusu için özellikle yararlı olabilir. İlk olarak, bu yeni model, tPA ve Tenecteplase (TNKase)27 gibi diğer fibrinolitik ajanların kafa kafaya karşılaştırılması için idealdir. TNKase, ex vivo deneylerde artmış fibrin özgüllüğü ve iyatrojenik kanama riski daha düşük olan tasarlanmış bir tPA-mutant varyantıdır. Yine de, tPA'ya üstünlüğü sadece bir mikro-embolik inme modelinde ve ikili bir nörolojik sonuç analizi kullanılarak test edilmiştir14. Yüksek tekrarlanabilirliği ve kantitatif enfarktüs boyutu analizi göz önüne alındığında, trombin ile geliştirilmiş fototrombotik inme modeli, tPA-versus-TNKaz'ın yararlarını ve yan etkilerini birçok yönden karşılaştırmak için kullanılabilir (ör., doz yanıtları, terapötik pencere, komorbidite etkileri ve gecikmiş tedavide potansiyel yan etkiler). İkinci olarak, trombin ile zenginleştirilmiş fototromboz modeli, akut iskemik inmede kombine tPA ve anti-trombosit tedavisinin etkilerini araştırmak için yararlı olabilir28. İskemik inmede endovasküler prosedürlerdeki son gelişmeler, araştırmacıların akut trombüslerin histolojik bileşimini analiz etmelerini ve baskın, karışmış bir trombosit: fibrin paterni21,22 tanımlamalarını sağlamıştır. Buna göre, bir fibrinolitik ajan (tPA) ve anti-trombosit ajanların kombinasyonu, trombolizin genel etkinliğini artırabilir, ancak trombüsün klinik trombosit:fibrin bileşimini simüle eden bir inme modeli bu tür araştırmalar için çok önemlidir. tHI ve emboli-MCAO modelleri ile birlikte, trombin-fototromboz bu gereksinimi karşılar ve düşük mortalitesi, basit cerrahi prosedürleri ve sistemik kardiyovasküler etkilerinin olmaması ile öne çıkar (Tablo 1).
Son olarak, trombin ile güçlendirilmiş fototromboz, MCA sağlayan bölgedeki öngörülebilir peri-enfarktüs konumu göz önüne alındığında, inme kaynaklı kollateral dolaşımı araştırmak için özellikle yararlı olabilir. Enfarktüs büyümesini dengelemek için penumbrayı sürdürerek, kollateral dolaşım giderek artan bir şekilde iskemik inme sonuçlarının önemli bir belirleyicisi olarak kabul edilmektedir, çünkü akut vasküler tıkanıklık, kollateral ağ boyunca kan akışını teşvik eder, ardından neo-kollateral damarlar oluşturmak için yeniden şekillenme ve anjiyogenezgelir 29,30. Sonuçlar, tPA'nın sadece proksimal MCA'nın rekanalizasyonunu desteklemekle kalmayıp, aynı zamanda MCA tedarik alanının periferiğinde kollateral dolaşımı da arttırdığını göstermektedir (Şekil 4). Kollateral dolaşımın plastisitesini düzenleyen mekanizmaların daha iyi anlaşılması yeni tedaviler önerebilir. Trombin ile zenginleştirilmiş fototrombotik inme modeli, öngörülebilir peri-enfarktüs bölgesi ve litik tedaviye duyarlılık avantajı sunduğundan, inme sonrası kollateral dolaşımın araştırılmasına yardımcı olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibeleri (NS108763, NS100419, NS095064 ve HD080429'den C.Y.K.'ye; NS106592 Y.Y.S.'ye) desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma | T8877 | infarct |
| 4-0 Nylon monofilament suture | LOOK | 766B | surgical supplies |
| 5-0 silk suture | Harvard Apparatus | 624143 | surgical supplies |
| 543nm laser beam | Melles Griot | 25-LGP-193-249 | photothrombosis |
| adult male mice | Charles River | C57BL/6 | 10~14 weeks old (22~30 g) |
| Anesthesia bar for mouse adaptor | machine shop, UVA | surgical setup | |
| Avertin (2, 2, 2-Tribromoethanol) | Sigma | T48402 | euthanasia |
| Dental drill | Dentamerica | Rotex 782 | surgical setup |
| Digital microscope | Dino-Lite | AM2111 | brain imaging |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ40 | surgical setup |
| Fine curved forceps (serrated) | FST | 11370-31 | surgical instrument |
| Fine curved forceps (smooth) | FST | 11373-12 | surgical instrument |
| goat anti-rabbit Alexa Fluro 488 | Invitrogen | A11008 | Immunohistochemistry |
| Halsted-Mosquito hemostats | FST | 13008-12 | surgical instrument |
| Heat pump with warming pad | Gaymar | TP700 | surgical setup |
| infusion pump | KD Scientific | 200 | thrombolytic treatment |
| Insulin syringe with 31G needle | BD | 328291 | photothrombosis |
| Ketamine | CCM, UVA | anesthesia | |
| Laser protective google 532nm | Thorlabs | LG3 | photothrombosis |
| Ketoprofen | CCM, UVA | NSAID analgesia | |
| micro needle holders | FST | 12060-01 | surgical instrument |
| micro scissors | FST | 15000-03 | surgical instrument |
| MoorFLPI-2 blood flow imager | Moor | 780-nm laser source | Laser Speckle Contrast Imaging |
| Mouse adaptor | RWD | 68014 | surgical setup |
| Puralube Vet ointment | Fisher | NC0138063 | eye dryness prevention |
| Retractor tips | Kent Scientific | Surgi-5014-2 | surgical setup |
| Rose Bengal | Sigma | 198250 | photothrombosis |
| Thrombin | Sigma | T7513 | photothrombosis |
| Tissue glue | Abbott Laboratories | NC9855218 | surgical supplies |
| tPA | Genetech | Cathflo activase 2mg | thrombolytic treatment |
| Vibratome | Stoelting | 51425 | TTC infacrt |
| Xylazine | CCM, UVA | anesthesia |
References
- Lyden, P. D. Thrombolytic Therapy for Acute Stroke. 3/e. , Springer. (2015).
- Linfante, I., Cipolla, M. J. Improving reperfusion therapies in the era of mechanical thrombectomy. Translational Stroke Research. 7 (4), 294-302 (2016).
- Campbell, B. C., et al. Endovascular Therapy for Ischemic stroke with perfusion-imaging selection. The New England Journal of Medicine. 372 (11), 1009-1018 (2015).
- Hossmann, K. A. The two pathophysiologies of focal brain ischemia: implications for translational stroke research. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (7), 1310-1316 (2012).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Annals of Neurology. 17 (5), 497-504 (1985).
- Watson, B. D., Prado, R., Veloso, A., Brunschwig, J. P., Dietrich, W. D. Cerebral blood flow restoration and reperfusion injury after ultraviolet laser-facilitated middle cerebral artery recanalization in rat thrombotic stroke. Stroke. 33 (2), 428-434 (2002).
- Uzdensky, A. B. Photothrombotic stroke as a model of ischemic stroke. Translational Stroke Research. 9 (5), 437-451 (2018).
- Karatas, H., et al. Thrombotic distal middle cerebral artery occlusion produced by topical FeCl(3) application: a novel model suitable for intravital microscopy and thrombolysis studies. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31 (3), 1452-1460 (2011).
- Orset, C., et al. Mouse model of in situ thromboembolic stroke and reperfusion. Stroke. 38 (10), 2771-2778 (2007).
- Orset, C., et al. Efficacy of Alteplase in a mouse model of acute ischemic stroke: A retrospective pooled analysis. Stroke. 47 (5), 1312-1318 (2016).
- Kudo, M., Aoyama, A., Ichimori, S., Fukunaga, N. An animal model of cerebral infarction. Homologous blood clot emboli in rats. Stroke. 13 (4), 505-508 (1982).
- Busch, E., Kruger, K., Hossmann, K. A. Improved model of thromboembolic stroke and rt-PA induced reperfusion in the rat. Brain Research. 778 (1), 16-24 (1997).
- Lapchak, P. A., Araujo, D. M., Zivin, J. A. Comparison of Tenecteplase with Alteplase on clinical rating scores following small clot embolic strokes in rabbits. Experimental Neurology. 185 (1), 154-159 (2004).
- Sun, Y. Y., et al. Synergy of combined tPA-Edaravone therapy in experimental thrombotic stroke. PLoS One. 9 (6), 98807 (2014).
- Sun, Y. Y., et al. Prophylactic Edaravone prevents transient hypoxic-ischemic brain injury: Implications for perioperative neuroprotection. Stroke. 46 (7), 1947-1955 (2015).
- Sun, Y. Y., et al. Sickle mice are sensitive to hypoxia/ischemia-induced stroke but respond to tissue-type plasminogen activator treatment. Stroke. 48 (12), 3347-3355 (2017).
- Sun, Y. Y., Kuan, C. Y. A thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxia-ischemia. Journal of Visualized Experiments. (102), e52978 (2015).
- Pena-Martinez, C., et al. Pharmacological modulation of neutrophil extracellular traps reverses thrombotic stroke tPA (tissue-type plasminogen activator) resistance. Stroke. 50 (11), 3228-3237 (2019).
- Denorme, F., et al. ADAMTS13-mediated thrombolysis of t-PA-resistant occlusions in ischemic stroke in mice. Blood. 127 (19), 2337-2345 (2016).
- Marder, V. J., et al. Analysis of thrombi retrieved from cerebral arteries of patients with acute ischemic stroke. Stroke. 37 (8), 2086-2093 (2006).
- Bacigaluppi, M., Semerano, A., Gullotta, G. S., Strambo, D. Insights from thrombi retrieved in stroke due to large vessel occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 39 (8), 1433-1451 (2019).
- Sun, Y. Y., et al. A murine photothrombotic stroke model with an increased fibrin content and improved responses to tPA-lytic treatment. Blood Advances. 4 (7), 1222-1231 (2020).
- Su, E. J., et al. Activation of PDGF-CC by tissue plasminogen activator impairs blood-brain barrier integrity during ischemic stroke. Nature Medicine. 14 (7), 731-737 (2008).
- Gupta, A. K., et al. Protective effects of gelsolin in acute pulmonary thromboembolism and thrombosis in the carotid artery of mice. PLoS One. 14 (4), 0215717 (2019).
- Carroll, B. J., Piazza, G. Hypercoagulable states in arterial and venous thrombosis: When, how, and who to test. Vascular Medicine. 23 (4), 388-399 (2018).
- Coutts, S. B., Berge, E., Campbell, B. C., Muir, K. W., Parsons, M. W. Tenecteplase for the treatment of acute ischemic stroke: A review of completed and ongoing randomized controlled trials. International Journal of Stroke. 13 (9), 885-892 (2018).
- McFadyen, J. D., Schaff, M., Peter, K. Current and future antiplatelet therapies: emphasis on preserving haemostasis. Nature Reviews Cardiology. 15 (3), 181-191 (2018).
- Bang, O. Y., Goyal, M., Liebeskind, D. S. Collateral crculation in ischemic stroke: Assessment tools and therapeutic strategies. Stroke. 46 (11), 3302-3309 (2015).
- Faber, J. E., Chilian, W. M., Deindl, E., van Royen, N., Simons, M. A brief etymology of the collateral circulation. Arteriosclerosis, Thrombsis, Vascular Biology. 34 (9), 1854-1859 (2014).
