Summary
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उद्देश्य नैनोकण ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) के माध्यम से जलीय मीडिया में गोलाकार नैनोकणों, अधिक विशेष रूप से सोने के नैनोकणों के हाइड्रोडायनामिक व्यास को मापना है । बाद में ब्राउनियन गति के कारण कणों के आंदोलन पर नज़र रखने और हाइड्रोडायनामिक व्यास प्राप्त करने के लिए स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण को लागू करने शामिल है ।
Abstract
नैनो टेक्नोलॉजी के क्षेत्र में, विश्लेषणात्मक लक्षण वर्णन नैनोमैटेरियल्स (एनएम) के व्यवहार और विषाक्तता को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। लक्षण वर्णन के लिए पूरी तरह से होना चाहिए और चुना तकनीक संपत्ति के लिए अच्छी तरह से अनुकूल होना चाहिए निर्धारित किया जाना चाहिए, सामग्री का विश्लेषण किया जा रहा है और जिस माध्यम में यह मौजूद है । इसके अलावा, उपकरण संचालन और पद्धति को डेटा संग्रह त्रुटियों से बचने के लिए उपयोगकर्ता द्वारा अच्छी तरह से विकसित और स्पष्ट रूप से समझने की आवश्यकता है। लागू विधि या प्रक्रिया में किसी भी विसंगतियों से प्राप्त डेटा के अंतर और खराब प्रजनन क्षमता हो सकती है। इस पेपर का उद्देश्य नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस (एनटीए) के माध्यम से सोने के नैनोकणों के हाइड्रोडायनामिक व्यास को मापने की विधि को स्पष्ट करना है। यह अध्ययन मानक परिचालन प्रक्रिया के प्रदर्शन और प्रजनन क्षमता को मान्य करने के लिए सात विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच एक अंतर-प्रयोगशाला तुलना (आईएलसी) के रूप में किया गया था। इस आईएलसी अध्ययन से प्राप्त परिणाम विस्तृत मानक परिचालन प्रक्रियाओं (एसओपी), सर्वोत्तम अभ्यास अपडेट, उपयोगकर्ता ज्ञान और माप स्वचालन के महत्व और लाभों को प्रकट करते हैं।
Introduction
नैनोमैटेरियल्स (एनएम) भौतिक और रासायनिक दोनों विशेषताओं में भिन्न हो सकते हैं जो बदले में उनके व्यवहार, स्थिरता और विषाक्तता को प्रभावित करते हैं1,2,3,4,5। प्रमुख कठिनाइयों में से एक, जब एनएम गुणों, खतरों और व्यवहारों की पूरी तरह से समझ विकसित करना, भौतिक और रासायनिक नैनोमटेरियल विशेषताओं के बारे में प्रजनन योग्य जानकारी प्राप्त करने की क्षमता है। ऐसे भौतिक गुणों के उदाहरणों में कणों का आकार और आकार वितरण6,7,8शामिल हैं . ये महत्वपूर्ण पैरामीटर हैं क्योंकि वे ' नैनो '9शब्द की यूरोपीय आयोग (ईसी) परिभाषा का एक महत्वपूर्ण पहलू हैं ।
एनएम6,10के भाग्य और विषाक्तता प्रभावों को समझने के अलावा कई अलग - अलग औद्योगिक और अनुसंधान अनुप्रयोगों और प्रक्रियाओं के लिए सटीक कण आकार माप प्राप्त करना भी महत्वपूर्ण है । एनएम के आकार को सही, मज़बूती से मापने और पुन: पेश करने में सक्षम अच्छी तरह से स्थापित तरीकों का होना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, रिपोर्ट की गई जानकारी का उपयोग की जाने वाली तकनीक की गहरी समझ प्रदान करनी चाहिए जैसे, आकार पैरामीटर के प्रकार (जैसे, वास्तविक आकार या हाइड्रोडायनामिक आकार) के साथ-साथ नमूना स्थिति जैसे, विशिष्ट माध्यम जिसमें एनएम मौजूद है, और विभिन्न मीडिया में मज़बूती से प्रदर्शन करने की विधि के लिए इंगित करें। आकार को मापने के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम), डायनामिक लाइट स्कैटरिंग (डीएलएस), एकल कण प्रेरक रूप से प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एसपीआईसीपी-एमएस), अंतर अपकेंद्रित्र तलछट (डीसीएस), स्कैनिंग प्रोब माइक्रोस्कोपी (एसपीएम), छोटे कोण एक्स-रे बिखरने (एसएक्सएस) और नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) सहित कई तकनीकों का उपयोग किया जा सकता है।
एनटीए एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है जो हाल के वर्षों में अच्छी तरह से उन्नत रही है और जटिल जलीय मीडिया में गोलाकार एनएम के हाइड्रोडायनामिक व्यास को मज़बूती से मापने के लिए दिखाया गया है जैसे कि पर्यावरणीय प्रासंगिकता वाले, उदाहरण के लिए, मीठे पानी की प्रणालियां। हाइड्रोडायनामिक व्यास 'एक काल्पनिक कठोर क्षेत्र का आकार है जो उसी फैशन में फैलता है जैसा कि कण को मापा जा रहा है'11; व्यावहारिक दृष्टि से और जलीय मीडिया में यह कण की तुलना में बड़े व्यास का वर्णन करता है, जिसमें कमजोर इलेक्ट्रोस्टैटिक बलों द्वारा कण की सतह पर आयोजित अणुओं (ज्यादातर पानी) की एक परत भी शामिल है। एक कण का हाइड्रोडायनामिक व्यास विभिन्न मीडिया में भिन्न होगा, जो मीडिया की आयनिक ताकत के रूप में छोटा हो रहा है जिसमें इसे मापा जाता है।
एनटीए तकनीक की एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि यह विश्लेषक को संख्या-भारित आकार माप प्राप्त करने की अनुमति देता है, जो ईसी नैनोमटेरियल परिभाषा के संदर्भ में आवश्यक हैं। उच्च संकल्प, कण-दर-कण विश्लेषण इस तकनीक को कण थ्रूपुट10, 12की उच्च दर के साथ विषम परीक्षण नमूने में मौजूद होने पर समूह या बड़े कणों के कारण हस्तक्षेप से कम प्रवण बनाता है।
माप प्रक्रिया में नमूने का उपयुक्त निलंबन तैयार करना होता है, जिसके लिए अक्सर नमूना कमजोर पड़ने की आवश्यकता होती है, इसके बाद कणों के ब्राउनियन मोशन व्यवहार और वीडियो विश्लेषण की वीडियो रिकॉर्डिंग होती है। नमूना कक्ष से, एक लेजर बीम पारित किया जाता है, और लेजर बीम स्कैटर लाइट के रास्ते में निलंबन कण एक घुड़सवार कैमरे के साथ ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उनके दृश्य के लिए अग्रणी होते हैं। कैमरा ब्राउनियन मोशन के तहत चलने वाले कणों से बिखरे लेजर लाइट की वीडियो फाइल कैप्चर करता है । कई कणों को व्यक्तिगत रूप से ट्रैक किया जा सकता है उनके प्रसार गुणांक निर्धारित करने के लिए और उनके हाइड्रोडायनामिक व्यास स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग कर गणना की जा सकती है: डी = kT/3πηD जहां डी हाइड्रोडायनामिक व्यास है, कश्मीर Boltzmann स्थिर है, टी तापमान है, η चिपचिपाहट है और डी प्रसार गुणांक10है । एनटीए का उपयोग उन कणों के एकत्रीकरण व्यवहार को ट्रैक करने के लिए भी किया जा सकता है जो आम तौर पर कोलाइडायल अस्थिर होते हैं (कणों को माप समय पैमाने पर कोलॉयडली रूप से स्थिर होना चाहिए)13,14। एनटीए एक निरपेक्ष विधि है और इस कार्य में उपयोग किए जाने वाले साधन पर किसी प्रणाली अंशांकन की आवश्यकता नहीं है। यदि उपयोगकर्ता सिस्टम प्रदर्शन की जांच करना चाहते हैं तो यह आसानी से आकार मानक सामग्री को मापने के रूप में अक्सर चाहता था द्वारा किया जा सकता है ।
एनटीए उपकरण त्वरित विश्लेषण समय (प्रति नमूना 10 मिनट से कम) के साथ काम करना आसान है। अच्छे डेटा रिपीटेबिलिटी और प्रजनन क्षमता के साथ उच्च गुणवत्ता वाले मापों के लिए, नमूना तैयारी के साथ-साथ साधन संचालन दोनों में कई कारकों पर विचार किया जाना चाहिए। यदि ऐसे कारकों पर सावधानीपूर्वक विचार नहीं किया जाता है, तो विभिन्न प्रयोगशालाओं और ऑपरेटरों में एक ही सामग्री पर माप अज्ञात या खराब मात्रात्मक अनिश्चितताओं के अधीन हो सकते हैं। एनपी लक्षण वर्णन के दौरान, घर में सबसे अच्छा अभ्यास विकसित एसओपी का उपयोग करना हमेशा अन्य प्रयोगशालाओं के साथ स्थिरता की गारंटी नहीं देता है, जैसा कि डीएलएस तकनीक15के लिए रोबबेन एट अल द्वारा दिखाया गया है।
वास्तव में, विभिन्न प्रयोगशालाओं, उपयोगकर्ताओं और उपकरणों के बीच एक प्रारंभिक (पहला दौर) एनटीए आईएलसी ने असंगत परिणामों का खुलासा किया। मुख्य मुद्दों में से एक विभिन्न पुराने विरासत उपकरणों के उपयोग के साथ था, जिनके पास नियमित सेवाएं या अंशांकन जांच नहीं थी, साथ ही विधि व्याख्या में अंतर था। होल एट अल द्वारा एक एनटीए आईएलसी अध्ययन में पाया गया कि एक प्रणाली का उपयोग करने और नमूने तैयार करने के बारे में साझा दिशानिर्देशों के अभाव के साथ, प्रयोगशालाओं में परिवर्तनशीलता अपेक्षाकृत मोनोडिस्पेड नमूनों के लिए भी बड़ी हो सकती है16। आईएलसी के पहले दौर के परिणामों के साथ-साथ अच्छे उपकरण रखरखाव के साथ-साथ विधि प्रशिक्षण और अच्छी तरह से विकसित मानक परिचालन प्रक्रियाओं (एसओपी) की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया है। बाद के वर्णन और अच्छे अभ्यास के साथ अनुपालन दस्तावेज़ के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करते हैं । यदि अच्छी तरह से विस्तृत, मानक ऑपरेटिंग प्रक्रियाओं (एसओपी) स्पष्टता, स्पष्टीकरण, समझ, मानकीकरण, और गुणवत्ता आश्वासन प्रदान कर सकते हैं ।
इसलिए आईएलसी अध्ययन को अपनाने की सिफारिश16प्रोटोकॉल विकसित करने और परीक्षण दोनों के लिए आदर्श है । आईएलसी अभ्यास ने इस विशिष्ट एनटीए एसओपी को मान्य करने का काम किया और इसलिए इस विशिष्ट नैनोमटेरियल जोखिम मूल्यांकन विधि में आत्मविश्वास और स्पष्टता की शुरुआत की। इसमें तीन राउंड शामिल हुए। राउंड 1 प्रशिक्षण से पहले प्रत्येक प्रतिभागी के अपने उपकरणों पर 60 एनएम सोने के नैनोकणों का विश्लेषण किया। राउंड 2 में एक साधारण परीक्षण के रूप में आम विन्यास के साथ एक नए उपकरण का उपयोग करके 100 एनएम लेटेक्स का विश्लेषण करना शामिल था ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि उपकरण को सही ढंग से स्थापित किया गया था और उपयोगकर्ताओं को उपकरण का उपयोग करने के तरीके पर एक अच्छा ज्ञान था। राउंड 3 में प्रशिक्षण के बाद, सामान्य विन्यास के साथ नए साधन पर 60 एनएम सोने के नैनोकणों का विश्लेषण शामिल था। आईएलसी में प्रतिभागी सात अलग-अलग प्रयोगशालाओं, क्षितिज 2020 एसीएननो परियोजना17के सभी कंसोर्टियम सदस्यों से आए थे।
इस लेख का उद्देश्य एनटीए प्रौद्योगिकी के लिए बेंचमार्किंग के तीसरे दौर से विधि और परिणामों पर चर्चा करना है जहां विस्तृत प्रशिक्षण और एसओपी विकास के बाद सात भागीदारों द्वारा 60 एनएम गोल्ड एनपीएस का फिर से विश्लेषण किया गया था। आईएलसी के पहले दौर में प्राप्त परिणामों की तुलना और संदर्भ भी किया जाएगा । आईएलसी के दौर 3 से सभी विश्लेषण एक 405 एनएम लेजर और एक उच्च संवेदनशीलता sCMOS कैमरे के साथ आपूर्ति समान विन्यास के एक ही उपकरण (सामग्रीकी मेज देखें) का उपयोग कर किया गया। बेंचमार्किंग नमूनों पर प्रौद्योगिकी के प्रदर्शन का आकलन करता है और इसलिए 'सर्वश्रेष्ठ अभ्यास' प्रोटोकॉल का विकास होता है। इस प्रकार, यह लेख वैज्ञानिक समुदाय के लिए उपलब्ध इस आईएलसी में उपयोग किए जाने वाले साधन के लिए एनटीए विधि को भी साझा करता है और बनाता है क्योंकि इसे अंतर्राष्ट्रीय मानकों के अनुसार आईएलसी के संचालन और मूल्यांकन के माध्यम से सुसंगत किया गया है।
Protocol
यहां वर्णित पद्धति अंतर प्रयोगशाला तुलना के तीसरे दौर के लिए इस्तेमाल किया गया था ।
1. नमूना तैयार करना
- 0.02 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पानी को फ़िल्टर करें। नमूना कमजोर पड़ने के लिए इसका उपयोग करने से पहले किसी भी संदूषण कणों को हटाने के लिए पानी निस्पंदन आवश्यक है।
- एक हौसले से तैयार नमूने का विश्लेषण करने के लिए, फ़िल्टर किए गए अल्ट्रापुरे पानी में 50 के कारक द्वारा 60 एनएम सोने के कोलॉयड फैलाव की मात्रा का नमूना पतला करें। एनटीए विश्लेषण के लिए सुझाए गए एकाग्रता 1 x 107 - 1 x 109 कण प्रति एमएल है।
2. माप प्रदर्शन
- सिस्टम पर स्विच करना
- एनटीए इंस्ट्रूमेंट, सिरिंज पंप और कंप्यूटर को कनेक्ट करें। हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर पर स्विच करें। संबद्ध सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) यह सुनिश्चित करता है कि सभी हार्डवेयर संचार चल रहे हैं और एक लाइव तापमान रीडआउट प्रदर्शित किया जाता है।
- एनटीए से लेजर मॉड्यूल निकालें और एक ऊतक और संकुचित हवा का उपयोग करके पूरी तरह से कांच की सतहों और कम मात्रा प्रवाह सेल (एलवीएफसी) आंतरिक चैनलों, ट्यूबिंग और तरल बंदरगाहों को सूखा।
- टयूबिंग भड़काना
- किसी भी कण को हटाने और माप के साथ हस्तक्षेप करने वाले हवा के बुलबुले की संभावना को कम करने के लिए अल्ट्रापुरे पानी के साथ इनलेट फ्लूइड ट्यूबिंग कुल्ला। कुल्ला के लिए, उपकरण आवरण के अंदर इनलेट ट्यूबिंग का अंत एक अपशिष्ट कंटेनर में रखा गया है।
- लूर बंदरगाह में फ़िल्टर किए गए पानी की 1 एमएल सिरिंज (सुई के बिना) डालें और वापस दबाव की अनुमति के रूप में तेजी से इनलेट ट्यूबिंग के माध्यम से ~ 900 माइक्रोन तरल पुश करें। किसी भी सिफोनिंग को रोकने के लिए संलग्न शेष तरल युक्त सिरिंज छोड़ दें।
- सिरिंज पंप ट्यूबिंग कनेक्शन
- एलवीएफसी को लेजर मॉड्यूल पर इकट्ठा कर नमूना कक्ष बनाने के लिए जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। एलवीएफसी के दाहिने हाथ की ओर बंदरगाह के लिए आउटलेट टयूबिंग संलग्न करें ।
नोट: इनलेट और आउटलेट ट्यूबिंग व्यास में अलग हैं, इनलेट आउटलेट की तुलना में व्यास में छोटे होने के साथ । इनलेट आउटलेट ट्यूबिंग कनेक्शन गमागमन प्रवाह सेल दबाव और लीक पर कारण हो सकता है । - इनलेट ट्यूबिंग से सिरिंज को डिस्कनेक्ट करें और 1 मिली हुई एक नई सिरिंज के लिए विनिमय करें जिसमें 1 एमएल फ़िल्टर किए गए पानी शामिल हैं, जिससे तरल-से-तरल संपर्क सुनिश्चित होता है। एलवीएफसी के बाएं बंदरगाह से इनलेट ट्यूबिंग को कनेक्ट करें। धीरे-धीरे नमूना कक्ष में ~ 500 μL तरल पदार्थ का परिचय दें। लोडिंग के दौरान कोई हवा बुलबुले पेश किए जाने को सुनिश्चित करने के लिए ध्यान रखें। अंतिम ट्यूबिंग विन्यास चित्रा 2में दिखाया गया है ।
- एलवीएफसी को लेजर मॉड्यूल पर इकट्ठा कर नमूना कक्ष बनाने के लिए जैसा कि चित्र 1 में देखा गया है। एलवीएफसी के दाहिने हाथ की ओर बंदरगाह के लिए आउटलेट टयूबिंग संलग्न करें ।
चित्रा 1: कम मात्रा प्रवाह सेल विधानसभा लेजर मॉड्यूल पर घुड़सवार।
चित्रा 2: कम वॉल्यूम फ्लो सेल ट्यूबिंग कॉन्फ़िगरेशन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
- लेजर मॉड्यूल लोडिंग और सिस्टम की जांच
- उपकरण में पानी से भरे एलवीएफसी के साथ लेजर मॉड्यूल डालें और जगह में ताला।
- सिरिंज पंप पालने में सिरिंज रखें और सुरक्षित रखें। सॉफ्टवेयर इंटरफेस में स्टार्ट कैमरा पर क्लिक करके कैमरे को शुरू करें। इंटरफ़ेस के हार्डवेयर टैब में, संदर्भ स्थिति को स्थानांतरित करने के लिए स्कैटर पर क्लिक करें।
- कैमरा स्तर को 16 तक सेट करें और किसी भी कणों के लिए मंद की जांच करने के लिए मैन्युअल रूप से फोकस को समायोजित करें। मुख्य देखने की खिड़की पर क्लिक छोड़ दिया और माउस का उपयोग करने के लिए ऊपर और नीचे खींचें किसी भी कणों के लिए जांच करने के लिए देखने की स्थिति के क्षेत्र को समायोजित करें । यदि देखने के क्षेत्र में तीन से अधिक कण हैं, तो इसका तात्पर्य पानी की शुद्धता या सफाई प्रक्रिया के साथ एक समस्या है और इसलिए, सफाई प्रक्रिया को दोहराया जाना चाहिए या पानी को प्रतिस्थापित या फ़िल्टर करने की आवश्यकता है।
- उपकरण से लेजर मॉड्यूल निकालें।
- इनलेट ट्यूबिंग से सिरिंज डिस्कनेक्ट करें और इसे केवल हवा से भरी सिरिंज से बदलें। धीरे-धीरे हवा को अंदर तरल को हटाने के लिए नमूना कक्ष में पेश करें। लेजर मॉड्यूल से एलवीएफसी निकालें और ट्यूबिंग डिस्कनेक्ट करें। एलवीएफसी के कांच की सतहों और लेजर मॉड्यूल के ऑप्टिकल ग्लास को पानी के साथ साफ करें और एक ऊतक और संकुचित हवा के साथ सूखा। संकुचित हवा के साथ टयूबिंग सूखी। एलवीएफसी को लेजर मॉड्यूल पर फिर से इकट्ठा करें और नमूना लोडिंग के लिए तैयार ट्यूबिंग को कनेक्ट करें।
नोट: इस कदम की हमेशा आवश्यकता नहीं होती है, हालांकि, इस मामले में इसे किसी भी संभावित भिन्नता को कम करने के लिए अतिरिक्त सावधानी के रूप में जोड़ा गया था।
- लोडिंग नमूना
- दोहराएं चरण 2.2.2। एक सिरिंज से कनेक्ट करें जिसमें 60 एनएम सोने के नैनोकणों के 1 एमएल फैलाव को लूयर पोर्ट से स्टेप 1.1 में बनाया गया है। धीरे-धीरे उपकरण के बाहर देखे गए लेजर मॉड्यूल के साथ इनलेट ट्यूबिंग के माध्यम से एलवीएफसी में नमूने के 750 μL इंजेक्ट करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोई बुलबुले पेश नहीं किए गए हैं।
- लेजर मॉड्यूल को एनटीए इंस्ट्रूमेंट पर वापस लोड करें और सॉफ्टवेयर इंटरफेस में स्टार्ट कैमरा पर क्लिक करके कैमरे को शुरू करें। इंटरफ़ेस के हार्डवेयर टैब में, संदर्भ फोकस स्थिति में जाने के लिए स्कैटर पर क्लिक करें, जांच करें कि यह कणों की एक स्पष्ट छवि देने के लिए सही ढंग से सेट किया गया है।
- जांच करें कि लेजर बीम स्थिति के संबंध में देखने का क्षेत्र केंद्रीय रूप से सेट किया गया है। सॉफ्टवेयर और माउस ऊपर और नीचे खींचने में मुख्य देखने खिड़की पर बाएं क्लिक करके तदनुसार समायोजित करें ।
- फोकस और कैमरा स्तर को स्वचालित रूप से अनुकूलित करने के लिए ऑटोसेटअप फ़ंक्शन चलाएं ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि इष्टतम छवि गुणवत्ता हासिल की जाए।
नोट: स्वचालित कैमरा और फोकस पैरामीटर विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच अधिक स्थिरता की अनुमति देते हैं क्योंकि यह उपयोगकर्ता स्वतंत्र है।
- नमूना विश्लेषण
- धीमी गति से 60 एस के 5 दोहराने वाले वीडियो प्राप्त करने के लिए मानक माप, एसओपी टैब में एक माप स्क्रिप्ट बनाएं (कणों को स्क्रीन के एक तरफ से लगभग 10 एस में दूसरे में गुजरना चाहिए) और निरंतर प्रवाह(पूरक फ़ाइल 1)।
नोट: प्रवाह समग्र नमूने का एक बेहतर प्रतिनिधित्व सुनिश्चित करने के लिए की सिफारिश की है माप के लिए प्रस्तुत किया है । जब नमूने पर धीमी गति से प्रवाह दिया जाता है तो एकाग्रता माप की सटीकता और दोहराव में काफी सुधार होता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि माप क्षेत्र के माध्यम से अधिक संख्या में नए कण प्रवाहित होते हैं और एक प्रयोग के दौरान उनका विश्लेषण किया जाता है। वीडियो की लंबाई प्रोफ़ाइल वितरण पर निर्भर करती है और विश्लेषण के समय में यह कितना परिवर्तनशील है। 60 एस के 5 वीडियो को एक विशिष्ट माप अवधि माना जाता है। - डेटा के लिए प्रयोग फ़ाइल का नाम और स्थान सेट करें और रन शुरू करें। उल्लिखित प्रक्रिया के बाद विश्लेषण क्षितिज 2020 एसीएननो परियोजना17की सात प्रयोगशालाओं द्वारा किया गया था।
- धीमी गति से 60 एस के 5 दोहराने वाले वीडियो प्राप्त करने के लिए मानक माप, एसओपी टैब में एक माप स्क्रिप्ट बनाएं (कणों को स्क्रीन के एक तरफ से लगभग 10 एस में दूसरे में गुजरना चाहिए) और निरंतर प्रवाह(पूरक फ़ाइल 1)।
3. डेटा विश्लेषण
नोट: सभी डेटा विश्लेषण वी 3.4 सॉफ़्टवेयर (सामग्री की तालिकादेखें) के भीतर किया गया था, कोई अतिरिक्त मैन्युअल रूपांतरण या गणना का उपयोग नहीं किया जाता है। कण आकार देने के डेटा को हिस्टोग्राम वितरण के रूप में कच्चे रूप में प्रस्तुत किया जाता है और स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण का उपयोग करके कण की स्थिति में मापा परिवर्तन से गणना की जाती है। सॉफ्टवेयर एक्स और वाई विमानों में प्रत्येक कण द्वारा स्थानांतरित औसत दूरी निर्धारित करता है। यह मूल्य कण प्रसार गुणांक (डी) को निर्धारित करने की अनुमति देता है, जिसमें से, यदि नमूना तापमान टी और विलायक चिपचिपाहट η जाना जाता है, तो कणों के बराबर गोलाकार हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, आरएचकी गणना की जा सकती है। नमूने का तापमान एनटीए द्वारा अपने आप दर्ज किया जाता है। सॉफ्टवेयर द्वारा उपयोग किया जाने वाला डिफ़ॉल्ट नमूना चिपचिपाहट पानी के लिए है और ऊपर दिखाए गए माप स्क्रिप्ट में शामिल है, हालांकि माप लेने से पहले या बाद में विभिन्न नमूना मंदकों का उपयोग किए जाने पर उपयोगकर्ता द्वारा चिपचिपाहट को संशोधित किया जा सकता है।
- स्लाइडर बार खींचकर या डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड के तहत सॉफ्टवेयर में + और बटन पर क्लिक करके डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड(डीटी) सेट करें, जो 2 से 20 के बीच कल्पना कणों की इष्टतम ट्रैकिंग के लिए विश्लेषण पैरामीटर है। सुनिश्चित करें कि डीटी मूल्य चुना पहचान और संभव के रूप में कई दृश्य कणों को ट्रैक (सॉफ्टवेयर छवि स्क्रीन पर लाल पार के रूप में स्वचालित रूप से चिह्नित) ।
- पता लगाने की सीमा निर्धारित करने के लिए मार्गदर्शन के रूप में, एक छवि में पहचाने गए कणों की संख्या लगभग 30-80 की सीमा में होनी चाहिए जहां पर्यवेक्षक द्वारा कणों को नहीं माना जाने वाला साइटों के अनुरूप 10 से अधिक रेड क्रॉस नहीं होना चाहिए। 5 से अधिक नीले क्रॉस (शोर का संकेत) नहीं होना चाहिए।
चित्र 3: सीमा सेटिंग अवलोकन। एक बुरा (बाएं) और अच्छा (दाएं) का पता लगाने की सीमा अवलोकन की स्थापना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
- सॉफ्टवेयर में प्रोसेस बटन दबाकर पार्टिकल ट्रैकिंग एनालिसिस वीडियो को स्वचालित रूप से प्रोसेस करें। सभी प्रसंस्करण मापदंडों को स्वचालित करने के लिए सेट करें और डेटा को एक .csv प्रारूप परिणाम के रूप में निर्यात करें पूर्ण कण आकार वितरण और माप सेटअप का वर्णन करने वाले अतिरिक्त मेटाडेटा के साथ फाइल करें। माप की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए, सॉफ्टवेयर में विश्लेषण टैब देखें या किसी भी चेतावनी संदेश या अलर्ट के लिए .csv आउटपुट फ़ाइल की जांच करें। पीडीएफ परिणाम रिपोर्ट का एक उदाहरण अनुपूरक फाइल 2 में दिखाया गया है।
- पीडीएफ रिपोर्ट से मोड आकार परिणाम और संबंधित मानक विचलन पढ़ें।
नोट: मोड आकार के परिणामों का उपयोग सात प्रयोगशालाओं के बीच प्राप्त आकारों की तुलना करने के लिए किया गया था और धारा 5 में दिखाया और चर्चा की जाती है।
4. सफाई और सुखाने
- उपयोग के बाद, ट्यूबिंग और ऑप्टिकल सतहों से नमूने के सभी निशान को हटाने के लिए सिस्टम को साफ पानी के साथ अच्छी तरह से फ्लश करें। देखने के क्षेत्र में कणों की मात्रा के अवलोकन से सफाई प्रभावशीलता की निगरानी की जा सकती है।
- एनटीए उपकरण से लेजर मॉड्यूल निकालें।
- ट्यूबिंग और एलवीएफसी को खाली करने के लिए सिस्टम के माध्यम से हवा की एक सिरिंज लोड करें।
Representative Results
विभिन्न एनटीए इंस्ट्रूमेंट कॉन्फिगरेशन का उपयोग करके राउंड 1 आईएलसी परिणाम चित्र 4में दिखाए गए हैं । लैब 6 के अपवाद के साथ, 5 कैप्चर रिपीट्स के बीच पुनरावृत्ति अच्छी थी लेकिन कई प्रयोगशालाओं ने उम्मीद से अधिक मोड आकार दर्ज किया। लैब 6 परिणाम खराब पुनरावृत्ति और एक बहुत अधिक मोड आकार मापा दिखाया । जांच के बाद, यह पाया गया कि सबसे बड़े आकार विविधताओं की रिपोर्ट करने वाले सिस्टम को या तो अनुशंसित के रूप में नहीं रखा गया था या विश्लेषण नमूना तैयारी में विसंगति से प्रभावित था जिससे कमजोर पड़ने वाला कदम विभिन्न पाइपिंग उपकरण, उपयोगकर्ता संचालन और तकनीक के कारण भिन्नता पैदा कर सकता है, और/या प्रवाह कोशिका को साफ नहीं होने सहित स्थापित किया जा सकता है, गलत कैमरा स्तर का उपयोग किया जा रहा है, छवि को ठीक से केंद्रित नहीं किया जा रहा है, और विश्लेषण सीमा को गलत तरीके से स्थापित करना ।
चित्रा 4: आईएलसी राउंड 1 मोड आकार परिणाम। विभिन्न एनटीए उपकरणों (एक्स एक्सिस में संक्षिप्त रूप में) पर किए गए राउंड 1 60 एनएम सोने के नैनोपार्टिकल फैलाव के लिए सभी एनटीए बेंचमार्किंग भागीदारों से मोड आकार परिणाम।
राउंड 3 से एनटीए परिणाम सटीकता को एक ही एसओपी और इंस्ट्रूमेंट सेटिंग्स को लागू करने वाली सभी प्रयोगशालाओं द्वारा सुधारा गया था। इस आईएलसी राउंड 3 के लिए प्राप्त मोड आकार के परिणामों को चित्र 5में देखा जा सकता है । सभी प्रयोगशालाओं में औसत मोड 62.02 ± 1.97 एनएम था। राउंड 3 से सभी मापे गए परिणाम पहले चरण के परिणामों की तुलना में अधिक सुसंगत थे, जो निर्माता द्वारा बताए गए बैच के लिए 60.5 एनएम मतलब आकार के 10% के भीतर अच्छी तरह से गिरते हैं। निर्माता द्वारा बताए गए सोने के नमूनों के लिए भिन्नता का गुणांक ≤8% था।
चित्रा 5: आईएलसी राउंड 3 मोड आकार परिणाम। 60 एनएम गोल्ड आईएलसी राउंड 3 के लिए सभी एनटीए बेंचमार्किंग भागीदारों से मोड आकार परिणाम एक ही एनटीए उपकरण पर विश्लेषण किया गया। सभी प्रयोगशालाओं में औसत मोड 62.02 ± 1.97 एनएम था।
निर्माता द्वारा प्रदान किए गए कणों के आकार को सत्यापित करने के लिए, ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (TEM) द्वारा कणों की एक छोटी संख्या (एन = 82) का विश्लेषण किया गया था। लगभग 10 μl undiluted फैलाव एक कार्बन लेपित Cu TEM ग्रिड पर डाली और २०० केवी में एक विश्लेषणात्मक TEM में इमेजिंग से पहले हवा में सूख गया था । अनुपूरक चित्रा 1 जैसी छवियां न्यूनतम कण ओवरलैप वाले क्षेत्रों से ली गई थीं और अर्ध-स्वचालित छवि विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। अलग कणों पर एक स्वचालित वाटरशेड विधि लागू की गई और इस प्रक्रिया की कलाकृतियों को बाहर रखा गया और साथ ही किनारे के कणों परभी 18। मतलब व्यास की गणना या तो प्रमुख और मामूली धुरी (61 ± 7 एनएम) से औसत के रूप में या गोलाकार कणों को संभालने वाले मापा क्षेत्र (62 ± 6 एनएम) से रूपांतरण के रूप में की गई थी। कण ज्यादातर 1.1 के औसत आस्पेक्ट रेशियो के साथ गोलाकार दिखाई देते हैं। TEM परिणाम निर्माता मूल्य (60.5 एनएम) की तुलना में थोड़ा अधिक व्यास दिखाते हैं लेकिन सहिष्णुता के स्तर के भीतर हैं। इसके अतिरिक्त, हाइड्रोडायनामिक व्यास के एनटीए व्युत्पन्न मूल्य के साथ एक बहुत अच्छा समझौता है।
अनुपूरक चित्रा 1: 60 एनएम गोल्ड नैनोकणों की TEM छवि। इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।
अनुपूरक फाइल 1: माप स्क्रिप्ट। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाइल 2: पीडीएफ परिणाम रिपोर्ट का उदाहरण। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
राउंड 1 आईएलसी से प्राप्त असंगत परिणामों में पुरानी प्रणालियों के लिए साधन स्वास्थ्य जांच के साथ-साथ अधिक विस्तृत एसओपी के विकास, हाथों से प्रशिक्षण की आवश्यकता और माप और विश्लेषण सेटिंग्स की बेहतर समझ पर प्रकाश डाला गया ताकि विभिन्न प्रयोगशालाओं में अधिक सुसंगत परिणाम सुनिश्चित किए जा सकें । वास्तव में, होल एट अल ने पाया कि एनटीए प्रणाली का उपयोग करने और नमूने तैयार करने के बारे में साझा दिशानिर्देशों के अभाव में अपेक्षाकृत मोनोडिस्प्स्ड नमूनों के लिए भी प्रयोगशालाओं में परिवर्तनशीलता हुई16। इसलिए, सभी आईएलसी प्रतिभागियों ने सिस्टम ऑपरेशन और माप शर्तों के लिए सर्वोत्तम प्रथाओं के साथ-साथ विशिष्ट एनटीए उपकरण के लिए सफाई और रखरखाव मार्गदर्शन को कवर करते हुए एक प्रशिक्षण कार्यशाला में भाग लिया। सभी प्रतिभागियों को भी बाद में आईएलसी दौर के लिए अपनी प्रयोगशालाओं में एक ही उपकरण पर माप प्रदर्शन किया । प्रक्रिया में पहले एक दौर शामिल था जिसने लेटेक्स मानक नमूनों (आईएलसी राउंड 2) पर आईएलसी चलाकर प्रत्येक प्रयोगशाला में स्थानीय स्तर पर प्रणाली का परीक्षण किया, इससे पहले कि भागीदारों द्वारा सोने के माप (आईएलसी राउंड 3) को दोहराने के लिए उपयोग किया जा रहा है। एनटीए के माध्यम से इन सोने के नमूनों को मापने का उद्देश्य नैनोमटेरियल जोखिम मूल्यांकन विधियों और नैनोसेफ्टी मार्गदर्शन प्रोटोकॉल को प्रभावित करने के लिए आवश्यक प्रथाओं में आत्मविश्वास और स्पष्टता लागू करना था ।
एनटीए एक तकनीक है जो कणों के हाइड्रोडायनामिक गोलाकार समकक्ष व्यास को माप सकती है और कण द्वारा कण के लिए उपयोग किया जा सकता है, 10 एनएम - 50 एनएम से लेकर पॉलीडिस्पर सिस्टम का वास्तविक समय दृश्य विश्लेषण, आकार में लगभग 1000 एनएम तक (गुणों के नमूने और उपकरण विन्यास के आधार पर)। न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता है। न्यूनतम नमूना तैयारी के बावजूद, यह कदम प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण है और नमूना को कमजोर करते समय और पतला चुनते समय बहुत सावधानी बरती जानी चाहिए। आकार एनटीए के संबंध में एक सीमित कारक हो सकता है क्योंकि गोलाकार समकक्ष आकार माप प्राप्त किए जाते हैं और गैर-गोलाकार कणों में कम सटीक आकार मूल्य होगा।
एनटीए प्रौद्योगिकी के लिए, कुछ परिणाम भिन्नता हमेशा उम्मीद की जाती है क्योंकि पूरे नमूने से केवल एक प्रतिनिधि नमूना देखा जाता है। बावजूद, सभी परिणाम कण आकार घटाने के लिए आईएसओ 19430 मानक को पूरा करते हैं। प्रदान करने के लिए इष्टतम एकाग्रता आम तौर पर एक30-60 दूसरे विश्लेषण समय के भीतर १० ८ कणों/मिलीलीटर के आसपास है । निचले कण सांद्रता वाले नमूनों के लिए, प्रजनन योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए लंबे विश्लेषण समय की आवश्यकता होगी। १०९ कणों/एमएल से अधिक कणों की एकाग्रता वाले नमूनों के लिए, समस्याओं पर नज़र रखने की अधिक संभावना है और नमूनों को एनटीए माप के लिए एक उपयुक्त रेंज के लिए नीचे पतला करने की आवश्यकता होगी ।
कुल मिलाकर3 दौर आईएलसी से परिणाम वृद्धि की सटीकता और पुनरावृत्ति के साथ एनटीए के साथ सोने नैनोपार्टिकल माप की अच्छी प्रजनन क्षमता दिखाते हैं । सभी एनटीए माप स्वचालित कैमरा स्तर और फोकस सेटिंग्स का उपयोग करके किया गया था छवि को समायोजित करने के लिए, के रूप में सॉफ्टवेयर में ऑटो सेटअप सुविधा द्वारा चयनित । सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित कैमरा स्तर बहुत सुसंगत था, 10 या 11 के कैमरे के स्तर के साथ सभी मामलों में सेट किया जा रहा है कि जैसा कि अपेक्षित था, अधिक स्वचालन एक प्रक्रिया में अधिक स्थिरता हासिल की जाती है। आकार घटाने के परिणाम TEM के माध्यम से निर्माता द्वारा प्राप्त उन लोगों के बराबर थे जो यह दर्शाते हैं कि परिणाम प्रजनन योग्य थे, हालांकि विभिन्न तकनीकों से न्यूनतम अंतर की उम्मीद की जानी चाहिए क्योंकि TEM हाइड्रोडायनामिकल व्यास निर्धारित नहीं करता है। परिणामों की निरंतरता में महत्वपूर्ण सुधार एनटीए के लिए उपकरण रखरखाव, विस्तृत एसओपी, सर्वोत्तम अभ्यास अपडेट, उपयोगकर्ता ज्ञान और अनुप्रयुक्त माप स्वचालन के महत्व और लाभों को दर्शाता है। अंत में आईएलसी ने इस विशिष्ट एनटीए एसओपी को मान्य किया और इसलिए इस विशिष्ट नैनोमटेरियल जोखिम मूल्यांकन विधि में आत्मविश्वास और स्पष्टता की शुरुआत की।
Disclosures
लेखक जो सुलिवान, एग्निस्का सिउपा, पॉलीन कार्नेल-मॉरिस और मिशेल कार्बोनी माल्वेर्न पैनालिटिकल लिमिटेड में कर्मचारी हैं जो इस लेख में इस्तेमाल किए जाने वाले उपकरणों का निर्माण करते हैं।
Acknowledgments
लेखक H2020 वित्त पोषित परियोजना से वित्तीय सहायता स्वीकार करते हैं: ACEnano (अनुदान समझौते नहीं 720952) । इस काम को आंशिक रूप से अंतर्राष्ट्रीय सहकारी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था जो व्यापार, उद्योग और कोरिया की ऊर्जा मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित था (अनुदान संख्या N0531000009, "क्षितिज 2020 कोर-ईयू सहयोगी आर एंड बीडी एटेनो टूलबॉक्स पर") जिसने क्षितिज 2020 एसीएननो प्रोजेक्ट के कंसोर्टियम में कोरियाई भागीदारों की भागीदारी सक्षम की।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 nm gold colloid dispersion | BBI Solutions OEM Ltd. | Product EM. GC60, Batch number 024650 | |
| 0.02 µm syringe filter - Whatman Anotop 25 Sterile Syringe Filters | Sigma Aldrich | WHA68092102 | |
| NanoSight | Malvern Panalytical Ltd. | NS300 | |
| NanoSight NTA Software v3.4 | Malvern Panalytical Ltd. | v3.4 | |
| Syringe PP/PE without needle luer slip tip, centered, capacity 1 mL, graduated, 0.01 mL, sterile | Sigma Aldrich | Z230723 |
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