Summary
高平台可以不受限制地修复大鼠，并在针灸操作期间完全暴露背部的穴位。本文描述了制造高平台的方法，建立了哮喘的老鼠模型，并使用非侵入性和实时全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能的变化。
Abstract
高平台可以不受限制地修复大鼠，并在针灸操作期间完全暴露背部的穴位。本文描述了制造高平台的方法，建立了哮喘的老鼠模型，并使用非侵入性和实时全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能的变化。
Introduction
哮喘是一种慢性疾病，其特征是支气管收缩和气道反应过度。全世界约有3.394亿人被诊断患有哮喘2。全球哮喘患病率正在上升，预计未来十年将新增1亿例。吸入皮质类固醇和长效β 2-agonists不能有效地控制所有患者的症状4。因此，使用针灸等替代疗法治疗哮喘已受到越来越多的关注。治疗哮喘的有效方法是针GV14（大泽），双边BL12（丰门）和双边BL13（飞舒）6。针灸显著降低过敏性哮喘患者唾液和鼻分泌物中分泌免疫球蛋白A（SIgA）的水平，减少周围血液中嗜血球菌的计数，总有效率为85%6。慢性哮喘小鼠的BL13和ST36（Zusanli）针灸可降低IL-17水平40%，与椭圆形布明（OVA）组相比，平滑肌肉厚度降低33%，从而缓解炎症症状7、8。然而，哮喘针灸治疗的机制并不完全清楚。
动物模型是哮喘研究的重要工具9，因为动物模型可用于持续测量呼吸功能，以评估哮喘治疗10的有效性。同时，哮喘病理生理学的研究需要测试样本，包括气管、肺和支气管厕所的样本，以验证关键因素11水平的变化。哮喘的老鼠模型通常用于评估哮喘病理生理学，因为它们产生持久的气道反应，并显示即时和后期气道反应12。然而，由于反复的实验刺激，大鼠往往变得易怒。因此，需要一种合适的方法来修复老鼠。常用的老鼠固定方法包括麻醉和结合13。虽然麻醉方法提供了更好的暴露穴位，它可能会影响神经传导，并最终影响实验结果14。结合方法不会诱导与麻醉相同的生理效果，但受约束的老鼠会经历骨骼肌肉紧张。此外，针头不能轻易到达指定位置15。在这里，我们引入了一个高平台，可用于修复大鼠，而无需限制它们，并充分暴露背面的穴位。在针灸管理期间，大鼠可以放在高平台上。高平台只能容纳老鼠，因为它被放置在离地面一定距离的地方，老鼠不会移动，因为害怕高度16。
本文详细描述了高平台的制造、哮喘鼠模型的建立、高平台上需要大鼠的操作以及使用全身全息摄影（WBP）系统测量呼吸功能。
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Protocol
所有动物实验均经上海中医药大学动物实验伦理委员会审核通过（伦理许可号PZSHUTCM190308020）。
1. 高平台的制造
- 将支撑装置的长度和宽度设置为 86 厘米 x 17 厘米（图 1）。
- 垂直修复连接设备以连接到支持设备。连接装置应长约30厘米，以防止大鼠跑到高平台的顶部表面，宽度为14厘米。
- 将水平踏板（5 厘米 x 5 厘米）固定到连接设备上。水平踏板底部的悬浮高度应大于或等于 50 厘米。
注：根据实验鼠的数量，可以使用多个水平踏板，每个踏板上放置一只大鼠。
2. 建立哮喘的老鼠模型
- 用 OVA 使大鼠敏感
- 在第 0 天准备感化解决方案。用1毫克OVA和10毫克氢氧化铝准备每1毫升的感化溶液，以普通盐水作为溶剂。
- 在第0天给每只大鼠注射1mL的敏感溶液。使用合适的注射器绘制感性解决方案，供以后使用。
- 抓住尾巴，抬起老鼠，放在粗糙的表面上，轻轻地把尾巴拉回来。用左拇指和食指抓住耳朵和脖子的皮肤，同时用剩下的三根手指和手掌紧紧握住背部皮肤（小心不要施加会窒息老鼠的过度力）。
- 用右手，用1mL的感官溶液准备注射器，在大鼠中进行腹膜内注射。
- 挑战大鼠与OVA
- 选择带盖子的盒子（长度、宽度和高度为 39 厘米 x 28 厘米 x 23 厘米），并在侧面钻一个小孔。用橡胶管连接密封的盒子、雾化杯和压缩雾化器（补充图1）。
注：压缩雾化器的星云粒子大小为1-5微米，雾化率大于0.2 mL/min，最终压力为205 kPa。 - 在敏感后的第14天，打开自制密封盒的盖子，将老鼠放在盒子里（盒子可以容纳5只老鼠），然后把密封的盒子放在一个生物安全柜里。
- 准备挑战解决方案。将300毫克OVA与30毫升普通盐水彻底混合。
- 打开超声波雾化器，将 30 mL 的挑战解决方案添加到雾化杯中。根据自制密封盒的体积调整挑战溶液的剂量和大鼠数量。
- 重复数次（每天一次）或根据哮喘症状的严重程度调整程序。
- 选择带盖子的盒子（长度、宽度和高度为 39 厘米 x 28 厘米 x 23 厘米），并在侧面钻一个小孔。用橡胶管连接密封的盒子、雾化杯和压缩雾化器（补充图1）。
3. 针灸治疗
- 根据治疗哮喘的中医理论，选择包括GV14、双边BL12和双边BL13在内的穴位（补充图2）。在第2天进行手动针灸，每隔一天进行一次，共7次（图2）。
- 针灸GV14位于第七颈椎和第一胸椎（肩骨的空心）之间，在背部中线（图3）。
- 针灸 BL13 位于第三个胸椎以下，位于腹腔间空间的两侧（肩骨的下边缘）。
- 针灸 BL12 位于第二个胸椎以下，位于间歇空间的两侧（在肩骨下方，根据 BL13 确定的位置）。
- 抓住老鼠，把它们放在高高的平台上。
- 用右手拇指和食指握住一次性不锈钢针（0.3毫米 x 13.0 毫米， 辅助图 3）手柄，用右手手掌按鼠背。
注：一次性针头必须仅一次性使用。因为反复使用会使针头钝化，从而增加大鼠的疼痛。 - 触摸上边缘 （GV14） 或肩骨下边缘 （BL12 和 BL13） 中间的凹陷，然后用针尖轻轻刺破大鼠的皮肤以定位穴位。
- 确定穴位的具体位置后，快速插入针头，并迅速移除右手。
- 均匀地扭动针头约360°，速度为60次/分钟，10-20秒，每5分钟操纵一次，然后在20-30分钟后取出（补充图4）。
4. 笔测量
- 准备甲基苯甲基苯甲酰：将100毫克甲基胆碱放入5mL离心管中，并将PBS添加到2mL（50毫克/mL甲基苯甲酰胆碱）的体积中。然后，将 50 毫克/mL 甲基胆碱溶液稀释到 25 毫克/mL、12.5 毫克/mL、6.25 毫克/mL 和 3.125 毫克/mL。
- 仪器检查
- 打开信号放大器（气溶胶分布系统和啮齿动物偏置流供应系统全部关闭，星云连接器关闭）。
- 检查通道：单击 校准，将粗调整基线返回到 0，然后切换到直流 （DC） 位置。将基线微调到 0，用注射器注入 5 mL 气体。然后，切换到交替电流 （AC） 位置。
- 检查通道后，确保误差值小于 0.5%。
- 设置参数
- 打开气溶胶分布系统和啮齿动物偏置流供应系统。根据汞球上的液体水平将流速调整到 4.5 mL。
- 点击 创建研究选项 ，并选择 剂量响应研究，选择 老鼠 的物种，并点击 下一步。
- 选择 简单的剂量列表，将 剂量数 设置为 6， 然后单击 下一个。
- 选择 Penh 和 区域 参数：将动物适应时间设置为 5 分钟，雾化时间设置为 2 分钟，响应时间设置为 3 分钟，恢复时间设置为 2 分钟。
- 依次向雾化器添加以下解决方案（每只大鼠 200 μL）：甲基胆碱（0 毫克/mL、3.125 毫克/mL、6.25 毫克/mL、12.5 毫克/mL、25 毫克/mL 和 50 毫克/mL）。可以观察到 Penh 的实时变化 （图 4）。
- 在响应所有 6 种不同浓度的解决方案后，单击 "文件 "和 "结束会话 "以完成实验。
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Representative Results
在GV14、双边BL12和双边BL13点进行针灸时，大鼠保持一个容易的位置。老鼠只能把头扭到外面，不能扭到里面，因为一个方向被木板挡住了（图5）。
随着甲基苯甲酰浓度的增加，Penh 呈现出上升趋势，增长率逐渐增加。浓度为3.125毫克/千升、6.25毫克/千升、12.5毫克/mL、25毫克/mL和50毫克/千升， Penh 增长 18.40% ± 10.70%， 27.55% ± 26.30%， 88.10% ± 45.63 %，427.60%±172.92%和882.27%，±121.97%，显示出增加剂量的效果（图6）。
图1。高平台的制造。 高平台由支撑设备、三个连接设备和三个踏板组成。支撑装置的长度和宽度为86厘米×17厘米，连接装置的长度和宽度为30厘米×14厘米，踏板的长度和宽度为5厘米×5厘米。每个连接设备相隔 20 厘米， 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。建立哮喘大鼠模型的议定书。 敏感在第 0 天进行，针灸每隔一天在高平台上进行一次，从第 2 天到第 14 天。挑战之后，将测量 Penh 的变化。 请单击此处查看此图的更大版本。
图3. GV14（大泽）、BL12（丰门）和BL13（飞舒）对大鼠的解剖位置。（A） 对显示肩骨、第一肋骨、第二肋骨、第三根肋骨和第二胸椎 （T2） 的老鼠背部进行解剖解剖。（B） 肋骨和胸椎的下垂平面。（C） 肩骨的横截面。（D） GV14：位于肩骨的空心处，后部中线：BL13：位于肩骨的下边缘;BL12：位于肩骨下方，根据BL13定位。请单击此处查看此图的更大版本。
图4。呼吸功能的实时变化。 蓝色曲线显示 Penh 的实时变化。绿色曲线显示一定时期内潮汐体积 （TVb） 的总变化。紫色曲线显示 Penh 在一定时期内的总体变化。 请单击此处查看此图的更大版本。
图5。 GV14（大泽）、BL12（丰门）和BL13（飞树）在大鼠的高平台上针灸。（B） 在高平台上对针灸大鼠的横向视图。大鼠被放置在平台上，并在针灸期间保持在易发生位置。请单击此处查看此图的更大版本。
图6。彭的测量。 WBP 用于测量正常大鼠的 Penh。随着甲基苯甲酰的浓度增加，边也逐渐增加。数据以平均± SEM（n = 3）的形式呈现。 请单击此处查看此图的更大版本。
补充图1。雾化器规格。压缩雾化器的星云颗粒大小为1 -5微米，雾化率大于0.2mL/min，最终压力为205 kPa。请单击此处下载此文件。
补充图2。GV14（大泽）、BL12（丰门）和BL13（飞舒）在大鼠中的示意图位置，请点击这里下载此文件。
补充 图3. 针头规格。 针的长度是 13 毫米， 直径是 0.3 毫米。 请点击这里下载这个文件。
补充图4.针灸操作的示意图。插入针头后，均匀地扭曲针头约360°在不同的方向。请单击此处下载此文件。
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Discussion
本研究中使用的GV14、双边BL12和双边BL13穴位位于背面，因此高平台适合固定大鼠。在其他研究中，应根据穴位15的位置选择适当的固定方法。对于腹部的穴位，大鼠可以向下放置在一个黑色的圆锥体（类似于面包师使用的糕点袋）17。链条连接到约束锥固定，大鼠的后腿也固定。这样，动物身体的前部被牢牢地固定在圆锥体中，而腹部和背部则暴露在外。对于腿部的穴位，大鼠可以垂直放置在一个特殊的透明桶中，将尾巴和后腿自然地放在水桶18之外。透明的桶盖住老鼠的身体，但方便在腿上进行针灸。
执行这些方法时应考虑几个关键步骤。在针灸治疗之前，大鼠应提前几天被放置在高平台上进行训练，直到大鼠在高平台上保持安静和平稳呼吸。对于针灸操作，右手的手掌越难按回大鼠，插入针头就越容易。在呼吸功能测量方面， WBP 系统测量了的变化，这些变化以非侵入性的方式反映大鼠的肺抵抗力变化，并最大限度地减少心理压力的影响。应尽量减少外部环境对大鼠的影响。大鼠应放在测试室，然后用塑料袋盖住测试室（在后部侧有1厘米×1厘米的孔进行通风），以减少外部环境造成的刺激。
这个实验的局限性是，如果大鼠在针灸过程中摆动，针头可能会脱落。因此，必须每 5 分钟操纵一次需要调整深度。此外，高平台适合大鼠，但不适合小动物，如老鼠。
综上所述，我们详细描述了在针灸过程中无限制地制造一个固定大鼠的高平台的方法。高平台可以完全暴露老鼠背部的穴位。使用高平台和非侵入性呼吸功能测量可促进针灸作为哮喘治疗的分析。研究针灸的治疗机制，可以为哮喘、慢性阻塞性肺病等呼吸道疾病带来新的治疗方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了中国国家自然科学基金委员会（第81922076号、81973951号、81873373号）、上海市合作创新建设项目（第81922076号）的支持。ZYJKFW201811010，ZYJKFW201701005）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
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