Summary
高いプラットホームは制限なしでラットを固定し、鍼治療の操作の間に背の指を完全に露出させることができる。この記事では、高いプラットフォームの製造方法について説明し、喘息のラットモデルを確立し、非侵襲的かつリアルタイム全身プレチスモグラフィー(WBP)システムを使用して呼吸機能の変化を測定する。
Abstract
高いプラットホームは制限なしでラットを固定し、鍼治療の操作の間に背の指を完全に露出させることができる。この記事では、高いプラットフォームの製造方法について説明し、喘息のラットモデルを確立し、非侵襲的かつリアルタイム全身プレチスモグラフィー(WBP)システムを使用して呼吸機能の変化を測定する。
Introduction
喘息は気管支収縮および気道過敏性1を特徴とする慢性疾患である。世界中で約3億3,940万人が喘息2と診断されている。喘息の罹患率は世界的に増加しており、今後10年間で1億人の新しい症例が予想される3 .吸入コルチコステロイドおよび長時間作用型β 2-アゴニストは、全患者の症状を効果的に制御しない4.したがって、喘息を治療するための鍼治療などの代替療法の使用は、注目度が高まっている5。喘息を治療するための有効な方法は、針GV14(ダズイ)、両側BL12(風門)および両側BL13(フェイシュ)6.鍼治療は、アレルギー性喘息患者の唾液および鼻分泌物中の分泌免疫グロブリンA(SIgA)のレベルを有意に低下させ、総有効率85%6で末梢血好酸球数を減少させる。慢性喘息を有するマウスにおけるBL13およびST36(Zusanli)における鍼治療は、IL-17のレベルを40%減少させ、オボアルブミン(OVA)群のそれと比較して平滑筋厚を33%減少させ、したがって症状7,8を緩和する。しかし、喘息に対する鍼治療のメカニズムは完全には明らかではない。
動物モデルは喘息治療10の有効性を評価する呼吸機能の連続測定に使用することができるので、9の喘息研究のための重要なツールである。一方、喘息の病態生理学の研究は、主要因子11のレベルの変化を検証するために気管、肺および気管支肺胞洗浄からのサンプルを含む試験サンプルを必要とする。喘息のラットモデルは、長期にわたる気道応答を産生し、即時および後期気道応答12を示すため、喘息病態生理を評価するために一般的に使用される。しかし、繰り返される実験的刺激のために、ラットはしばしば過敏になる。そのため、ラットを固定するための適切な方法が必要である。ラット固定のために一般的に使用される方法には、麻酔および結合13が含まれる。麻酔法は、視力の露出を改善するが、神経伝導に影響を与え、最終的には実験結果14に影響を与える可能性がある。この結合方法は麻酔と同じ生理学的効果を誘発しないが、抑制されたラットは骨格筋の緊張を経験する。また、針は指定位置15に容易に達することができない。ここでは、ラットを制限せずに固定し、背中の指を完全に露出させるために使用できる高いプラットフォームを紹介します。ラットは、鍼治療の投与中に高いプラットフォーム上に配置することができます。高いプラットホームはラットが立っている間だけ収容することができ、そして地面から一定の距離に置かれるので、ラットは高所16の恐怖のために動かないだろう。
この記事では、高いプラットフォームの製造、喘息のラットモデルの確立、高いプラットフォーム上でのラットの必要性の操作、全身プレチスモグラフィー(WBP)システムを用いた呼吸機能の測定について詳細に説明する。
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Protocol
すべての動物実験は、上海伝統中国医学大学動物実験倫理委員会(倫理クリアランス番号PZSHUTCM190308020)によって審査され、承認されました。
1. ハイプラットフォームの製作
- サポートデバイスの長さと幅を86 cm x 17 cmに設定します(図1)。
- 接続デバイスをサポートデバイスに垂直に固定します。接続デバイスは、ラットが高いプラットフォームの上面に走るのを防ぐために約30cmの長さであり、幅は14cmである必要があります。
- 接続デバイスに水平ペダル(5cm x 5 cm)を固定します。水平ペダルの底部の吊り下げ高さは50cm以上でなければなりません。
注:実験ラットの数に応じて、複数の水平ペダルを使用することができ、各ペダルに1匹のラットを配置します。
2. 喘息のラットモデルの確立
- OVAでラットを感作する
- 0日目に感作液を準備します。1 mgのOVAと10mgの水酸化アルミニウムを溶媒として、それぞれ1mLの感作液を調製する。
- 腹腔内に、0日目に1mLの感作液を各ラットに注入する。後で使用するために適当な注射器で感作液を描きます。
- 尾をつかんでラットを持ち上げ、粗い表面に置き、尾をそっと引き戻します。左手親指と人差し指で両耳と首の皮膚をつかみ、残りの3本の指と手のひらで背中の皮膚をしっかりと握りしめる(ネズミを窒息させる余分な力を加えないように注意してください)。
- 右手で、1mLの感作液で調製した注射器を用いてラットに腹腔内注射を行う。
- OVAを使用して挑戦ラット
- ふた付きの箱(長さ、幅、高さは39cm x 28cm x 23cm)を選択し、側面に小さな穴を開けます。密閉ボックス、ネビュライズカップ、圧縮ネブライザーをゴムチューブで接続します(補助図1)。
注:圧縮ネブライザーのネビュライズされた粒子サイズは1〜5μm、ネビュレーション速度は0.2 mL/minより大きく、最終的な圧力は205 kPaです。 - 感作後14日目、自家製密封箱の蓋を開け、箱にネズミを入れ(箱は5匹のラットを収容できる)、密封箱をバイオセーフティキャビネットに入れます。
- チャレンジ ソリューションを準備します。完全に正常な生理液の30 mLとOVAの300mgを混合します。
- 超音波ネブライザーをオンにし、ネビュライズカップに挑戦溶液の30 mLを追加します。自家製の密封箱の体積に応じて、チャレンジ溶液の投与量とラット数を調整します。
- ネビュライズを数回(1日1回)繰り返すか、喘息症状の重症度に応じて手順を調整します。
- ふた付きの箱(長さ、幅、高さは39cm x 28cm x 23cm)を選択し、側面に小さな穴を開けます。密閉ボックス、ネビュライズカップ、圧縮ネブライザーをゴムチューブで接続します(補助図1)。
3. 鍼治療
- 喘息を治療するための伝統的な中国医学の理論に従って、GV14、両側BL12および両側BL13を含むアクポイントを選択する(補足図2)。2日目に手動鍼治療を行い、1日おきに1日に1回、合計7セッションずつ実行します(図2)。
- 第7頸椎と第1胸椎(肩甲骨の中空)の間に位置するGV14を後ろの正中線に鍼治療する(図3)。
- 肋間空間(肩甲骨の下端)の両側にある第3胸椎の下に位置するBL13を鍼治療する。
- 第2胸椎下、肋間空間の両側(肩甲骨の下、BL13に従って特定された位置)の下に位置するBL12を鍼治療する。
- ラットをつかみ、高いプラットホームに置きます。
- 使い捨てのステンレス製の針 (0.3mm x 13.0 mm)を右手の親指と人差し指でハンドルに持ち、右手の手のひらでラットの後ろを押します。
注: 使い捨て針は、1 回のみ使用してください。繰り返し使用すると針が鈍くなり、ラットの痛みが増加するからです。 - 上端の中央(GV14)または肩甲骨の下端(BL12とBL13)のくぼみに触れ、ラットの皮膚を針先でそっと刺して、指差しを見つけます。
- 指差しの特定の位置を決定した後、針を素早く挿入し、すぐに右手を取り外します。
- 10~20秒間60回/分の割合で針を約360°均等にねじり、5分ごとに操作し、20~30分後に引き出した(補足図4)。
4. ペンの測定
- メタコリンを準備する: 5 mL 遠心分離チューブにメタコリンの 100 mg を配置し、2 mL (50 mg/mL メタコリン) のボリュームに PBS を追加します。その後、50 mg/mL メタコリン溶液を25 mg/mL、12.5 mg/mL、6.25 mg/mL、3.125 mg/mL に希釈します。
- 機器検査
- 信号増幅器をオンにします(エアロゾル分布システムとげっ歯類バイアスフロー供給システムはすべてオフになり、ネビュライズコネクタは閉じています)。
- チャンネルを確認する :[キャリブレーション]をクリックし、粗い調整ベースラインを0に戻し、直流(DC)位置に切り替えます。ベースラインを0に微調整し、5 mLのガスをシリンジで注入します。次に、交流(AC)位置に切り替えます。
- チャネルを確認した後、エラー値が 0.5% 未満であることを確認します。
- パラメータの設定
- エアロゾル分布システムとげっ歯類バイアスフロー供給システムをオンにします。水銀球の液面に応じて流量を4.5mLに調整します。
- [ スタディ オプションの作成 ] をクリックし、[ 線量応答スタディ] を選択し、[ 種のラット ] を選択して 、[ 次へ] をクリックします。
- [ 単純な線量リスト] を選択し、[ 線量の数 ] を 6 に設定して、[ 次へ] をクリックします。
- PenhとAreaパラメータを選択します: 動物の適応時間を 5 分、ネビュライズ時間を 2 分、応答時間を 3 分、回復時間を 2 分に設定します。
- ネブライザーに次の溶液を順次添加します(ラット当たり200 μL):メタコリン(0 mg/mL、3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mLおよび50 mg/mL)。Penhのリアルタイム変化を観察することができます(図4)。
- 濃度の異なる 6 つのソリューションがすべて反応した後、[ ファイル と セッションの終了 ] をクリックして実験を完了します。
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Representative Results
GV14、両側BL12および両側BL13ポイントで鍼治療を行い、ラットは起こりやすい位置を維持する。一方向が木製の板で塞がれているため、ラットは頭を外側にだけねじることができ、内側にはねじれない(図5)。
メタコリン濃度が増加するにつれて, ペンは増加傾向を示し、成長速度は徐々に増加します..3.125 mg/mL、6.25 mg/mL、12.5 mg/mL、25 mg/mL、50 mg/mLの濃度で、 Penhは10.70%±18.40%増加し、27.55%±26.30%、88.10%±、45.63%、427.60%±172.92%、882.27%±121.97%増加する効果を示しました(図6)。
図 1.ハイプラットフォームの製作。 高いプラットフォームは、サポートデバイス、3つの接続デバイスと3つのペダルで構成されています。支持デバイスの長さと幅は86 cm x 17 cm、接続デバイスの長さと幅は30 cm x 14 cm、ペダルの長さと幅は5cm x 5cmです。各接続デバイスは20cmで区切 られています。
図 2.喘息のラットモデルを確立するためのプロトコル。 感作は0日目に行われ、2日目から14日目までの高いプラットフォームで1日おきに鍼治療が行われる。挑戦の後、Penhの変化を測定する。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3. GV14の解剖学的位置(ダジュイ), BL12 (風門), BL13 (Feishu) ラット上.(A)肩甲骨、第1肋骨、第2肋骨、第3肋骨、第2胸椎(T2)を示すラットの後部の解剖学的解剖。(B) 肋骨と胸椎の矢状平面。(C) 肩甲骨の断面。(D) GV14: 肩甲骨の中空に位置します, 背部の正中線;BL13: 肩甲骨の下端に位置します。BL12:BL13に従って位置付け、肩甲骨の下に位置しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4.呼吸機能のリアルタイム変化。 青い曲線は、Penh のリアルタイムの変化を示しています。緑色の曲線は、一定期間における潮汐量(TVb)の総変化を示しています。紫色の曲線は、一定期間におけるペンの総変化を示しています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 5. GV14(ダズイ)、BL12(風門)、BL13(フェイシュ)の鍼治療は、高いプラットフォーム上のラットにおけるラットにおける、ラットにおけるGV14、BL12およびBL13の位置のトップビューである。(B) 高いプラットフォーム上の鍼ラットの側面図。ラットはプラットホームに置かれ、鍼治療の間に起こりやすい位置に維持される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 6.ペンの測定。 WBPは、正常ラットのペンを測定するために使用される。メタコリンの濃度が増加するにつれて, ペンも徐々に増加します。.データは SEM ±平均値として表示されます (n = 3)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
補助 図 1. ネ ブライザー仕様。 圧縮ネブライザーのネビュライズされた粒子サイズは1〜5μm、ネビュレーション速度は0.2 mL/minより大きく、最終的な圧力は205kPaです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補助図 2.GV14(大朱井)、BL12(風門)、BL13(フェイシュ)の模式的な位置をラットに表示します。
補助 図3. 針の仕様 針の長さは13mmで、直径は0.3mmです 。
補足図 4.鍼治療操作の概略図。針を挿入した後、針を約360°の方向に均等にねじった。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
この研究で使用されるGV14、両側BL12および両側BL13のacupointsは背に位置し、したがって、高いプラットホームはラットを固定するのに適している。他の研究では、適切な固定法は、指数15の位置に応じて選択する必要があります。腹部の指差しの場合、ラットは黒いコーン(パン屋が使用するペストリーバッグに似ています)17に下方に置くことができます。固定のために拘束コーンに鎖が付着し、ラットの後ろ足も固定される。このようにして、動物の体の前部はコーンにしっかりと固定され、腹部と背部は露出する。脚の指差しのために、ラットは、ピロ18の外に自然に尾と後ろ足を残して、特別な透明なバケツに垂直に配置することができます。透明なバレルはラットの体を覆うが、それは足の鍼治療のために便利である。
これらの方法を実行する場合は、いくつかの重要な手順を考慮する必要があります。鍼治療の前に、ラットはラットが静かに保ち、高いプラットフォーム上でスムーズに呼吸するまで、数日間前に訓練のために高いプラットフォームに置かれるべきです。鍼治療の操作のために、右手の手のひらがラットを押し戻すほど、針を挿入するのが容易になります。呼吸機能測定のために、WBPシステムは、非侵襲的な方法でラットの肺抵抗の変化を反映し、心理的ストレス19、20の影響を最小限に抑えるPenhの変化を測定する。ラットに対する外部環境の影響は最小限に抑える必要があります。ラットは試験室に置かれ、外部環境によって引き起こされる刺激を減らすために、ビニール袋(換気のための裏側に1cm x 1cmの穴を持つ)で試験室を覆う必要があります。
この実験の限界は、ラットが鍼治療中に振り回した場合に針が落ちる可能性があることです。したがって、深さを調整するために5分ごとに操作する必要があります。さらに、高いプラットフォームはラットには適しているが、マウスのような小さな動物には適していない。
要約すると、鍼治療中に制限なくラットを固定するための高いプラットフォームの製造方法の詳細な説明を提供する。高いプラットホームは完全にラットの背部の洞察力を露出させることができる。高いプラットフォームおよび非侵襲的な呼吸機能測定の使用は、喘息の治療として鍼の分析を容易にし得る。背中の鍼治療のメカニズムを研究することは、喘息や慢性閉塞性肺疾患などの呼吸器疾患に新しい治療法をもたらす可能性があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、中国国立自然科学財団(No. 81922076, 81973951, 81873373), 上海の共同イノベーションの建設プロジェクトによって支援されました (No.ZYJKFW201811010、ザイクFW201701005)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
