Summary
En høj platform kan rette rotter uden begrænsning og helt udsætte akupunkterne på bagsiden under akupunkturmanipulation. Denne artikel beskriver metoder til fremstilling af den høje platform, etablerer en rottemodel af astma og måler ændringer i åndedrætsfunktionen ved hjælp af et ikke-invasivt og realtids fuldkrops plethysmografi (WBP) system.
Abstract
En høj platform kan rette rotter uden begrænsning og helt udsætte akupunkterne på bagsiden under akupunkturmanipulation. Denne artikel beskriver metoder til fremstilling af den høje platform, etablerer en rottemodel af astma og måler ændringer i åndedrætsfunktionen ved hjælp af et ikke-invasivt og realtids fuldkrops plethysmografi (WBP) system.
Introduction
Astma er en kronisk sygdom karakteriseret ved bronchoconstriction og luftveje hyper-lydhørhed1. Ca. 339.400 tusind mennesker verden over er diagnosticeret med astma2. Forekomsten af astma er stigende globalt, med 100 millioner nye tilfælde forventes i det næste årti3. Inhalerede kortikosteroider og langtidsvirkende β2-agonisterkontrollerer ikke effektivt symptomerne på alle patienter4. Derfor har brugen af alternative behandlingsformer såsom akupunktur til behandling af astma fået øget opmærksomhed5. En effektiv metode til behandling af astma er at nål GV14 (Dazhui), bilateral BL12 (Fengmen) og bilateral BL13 (Feishu)6. Akupunktur reducerer niveauet af sekretorisk immunoglobulin A (SIgA) i spyt- og næsesekretioner hos patienter med allergisk astma og reducerer perifere blodeosinofiler med en samlet effektiv sats på 85%6. Akupunktur ved BL13 og ST36 (Zusanli) hos mus med kronisk astma reducerer niveauet af IL-17 med 40% og reducerer den glatte muskeltykkelse med 33% sammenlignet med ovalbumingruppen (OVA) og lindrer dermed inflammationssymptomer7,8. Men mekanismen for akupunktur behandling for astma er ikke helt klart.
Dyremodeller er et vigtigt redskab til astmaforskning9, fordi dyremodellen kan bruges til kontinuerlig måling af åndedrætsfunktion til at vurdere effektiviteten af astmabehandlingen10. I mellemtiden kræver undersøgelser af astmas patofysiologi testprøver, herunder prøver fra luftrøret, lungerne og bronchoalveolar-toilettet for at verificere ændringer i niveauerne af nøglefaktorer11. Rottemodeller af astma er almindeligt anvendt til at vurdere astma patofysiologi, fordi de producerer langvarige luftvejsresponser og viser øjeblikkelige og sene luftvejsresponser12. Men på grund af gentagen eksperimentel stimulation bliver rotterne ofte irritabel. Derfor er der brug for en passende metode til at fikse rotter. Almindeligt anvendte metoder til rottefiksering omfatter anæstesi og binding13. Selvom anæstesimetoden giver bedre eksponering af akupunkterne, kan det påvirke nerveledningen og i sidste ende påvirke de eksperimentelle resultater14. Bindingsmetoden fremkalder ikke de samme fysiologiske virkninger som anæstesi, men tilbageholdte rotter vil opleve skeletmuskelspændinger. Nålen kan heller ikke nemt nå den angivne position15. Her introducerer vi en høj platform, der kan bruges til at fikse rotter uden at begrænse dem og fuldt ud udsætte akupunkterne på bagsiden. Rotterne kan placeres på den høje platform under administration af akupunktur. Den høje platform er kun i stand til at rumme rotten, mens den står, og da den er placeret en vis afstand fra jorden, vil rotterne ikke bevæge sig på grund af frygt for højder16.
Denne artikel beskriver i detaljer fremstillingen af den høje platform, etableringen af en rottemodel af astma, driften af at have brug for en rotte på den høje platform og måling af åndedrætsfunktion ved hjælp af et helkrops plethysmografisystem (WBP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af Komitéen for Etik af Dyreforsøg på Shanghai University of Traditional Chinese Medicine (Etisk clearance nummer PZSHUTCM190308020).
1. Fremstilling af den høje platform
- Anstil længden og bredden af støtteanordningen til 86 cm x 17 cm (Figur 1).
- Fastgør tilslutningsenheden lodret til støtteenheden. Tilslutningsenheden skal være ca. 30 cm lang for at forhindre rotten i at løbe til den øverste overflade af den høje platform og have en bredde på 14 cm.
- Fastgør den vandrette pedal (5 cm x 5 cm) til tilslutningsenheden. Den ophængte højde i bunden af den vandrette pedal skal være større end eller lig med 50 cm.
BEMÆRK: Afhængigt af antallet af forsøgsrotter kan der anvendes flere vandrette pedaler med en rotte placeret på hver pedal.
2. Etablering af en rottemodel af astma
- Sensibilisere rotterne med OVA
- Forbered sensibiliseringsopløsningen på dag 0. Forbered hver 1 ml af sensibiliseringsopløsningen med 1 mg æg og 10 mg aluminiumhydroxid, med normal saltvand som opløsningsmiddel.
- Intraperitoneally injicere hver rotte med 1 ml af sensibiliseringsopløsningen på dag 0. Tegn den sensibiliserende opløsning med en passende sprøjte til senere brug.
- Grib halen og løft rotten op, læg den på en ru overflade, og træk forsigtigt halen tilbage. Tag fat i huden på både ører og hals med venstre tommelfinger og pegefinger, mens du holder ryghuden tæt med de resterende tre fingre og håndflader (vær omhyggelig med at afstå fra at anvende overskydende kraft, der vil kvæle rotten).
- Udfør med højre hånd en intraperitoneal injektion i rotten med den forberedte sprøjte med 1 ml sensibiliseringsopløsning.
- Udfordrende rotter med OVA
- Vælg en kasse med låg (længde, bredde og højde er 39 cm x 28 cm x 23 cm), og bor et lille hul i siden. Tilslut den forseglede kasse, forstøvningskoppen og kompressionsforstøveren med et gummirør(supplerende figur 1).
BEMÆRK: Den forstøvede partikelstørrelse på den komprimerede forstøver er 1 - 5 μm, forstøvningshastigheden er større end 0,2 mL/min, og det ultimative tryk er 205 kPa. - På den 14. dag efter sensibilisering skal du åbne låget på den hjemmelavede forseglede kasse og placere rotten i kassen (kassen kan rumme 5 rotter) og derefter sætte den forseglede kasse i et biosikkerhedsskab.
- Forbered udfordringsløsningen. Bland 300 mg æg grundigt med 30 mL normal saltvand.
- Tænd ultralydsforstøveren, og tilsæt 30 ml af udfordringsløsningen i den forstøvende kop. Juster dosering af udfordringsopløsning og antallet af rotter i henhold til mængden af den hjemmelavede forseglede kasse.
- Gentag forstøvning flere gange (en gang om dagen) eller justere proceduren i henhold til sværhedsgraden af astmasymptomer.
- Vælg en kasse med låg (længde, bredde og højde er 39 cm x 28 cm x 23 cm), og bor et lille hul i siden. Tilslut den forseglede kasse, forstøvningskoppen og kompressionsforstøveren med et gummirør(supplerende figur 1).
3. Akupunkturbehandling
- Udvalgte akupunkter, herunder GV14, bilateral BL12 og bilateral BL13, i henhold til teorien om traditionel kinesisk medicin til behandling af astma (supplerende figur 2). Administrere manuel akupunktur på dag 2 og udføre en gang hver anden dag i alt 7 session (Figur 2).
- Akupunktur GV14 placeret mellem den syvende halshvirvel og den første brysthvirvel (den hule af skulderbladet), på midterlinjen af ryggen (Figur 3).
- Akupunktur BL13 placeret under den tredje brysthvirvel, på begge sider af intercostal rum (nederste kant af skulderbladet).
- Akupunktur BL12 placeret under den anden brysthvirvel, på begge sider af intercostal rum (under scapula, position identificeret i henhold til BL13).
- Tag fat i rotterne og læg dem på den høje platform.
- Hold det engangs kanyle i rustfrit stål (0,3 mm x 13,0 mm, supplerende figur 3)med højre hånds tommelfinger og pegefinger, og tryk på bagsiden af rotten med højre håndflade.
BEMÆRK: Engangsnåle må kun være engangsbrug. Fordi gentagen brug vil sløve nålen, hvilket fører til øget smerte hos rotter. - Rør ved fordybning i midten af den øverste kant (GV14) eller den nederste kant af skulderbladet (BL12 og BL13), og drikke derefter forsigtigt rottens hud med nålespidsen for at finde akupunkterne.
- Sæt hurtigt kanylen ind, når du har bestemt akupunktets specifikke placering, og fjern hurtigt højre hånd.
- De snoede nålene jævnt ca. 360° med en hastighed på 60 gange/min. i 10 - 20 s, manipulerede dem hvert 5. minut og trak dem derefter tilbage efter 20 - 30 min (Supplerende figur 4).
4. Penh-målingen
- Forbered methacholin: Placer 100 mg methacholin i et 5 mL centrifugerør, og tilsættes PBS til et volumen på 2 mL (50 mg/mL methacholin). Derefter fortyndes methacholinopløsningen på 50 mg/mL til 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL og 3,125 mg/mL.
- Inspektion af instrumenter
- Tænd for signalforstærkeren (aerosolfordelingssystemet og gnaver-bias flowforsyningssystemet er alle slukket, og forstøvningsstikket er lukket).
- Kontroller kanalerne: Klik på Kalibrer, vend den grove justeringslinje tilbage til 0, og skift til jævnstrømspositionen ( DC). Finjuster basislinjen til 0, og indsprøjt 5 mL gas med en sprøjte. Skift derefter til vekselstrømspositionen (AC).
- Når du har kontrolleret kanalerne, skal du sikre dig, at fejlværdien er mindre end 0,5 %.
- Angive parametre
- Tænd for aerosolfordelingssystemet og gnaver bias flowforsyningssystemet. Juster strømningshastigheden til 4,5 mL i henhold til væskeniveauet på kviksølvkuglen.
- Klik på Opret undersøgelsesindstillinger , vælg Dosisresponsundersøgelse, vælg Arternes Rotte , og klik på Næste.
- Vælg Simpel dosisliste, angiv antallet af doser til 6 , og klik på Næste.
- Vælg Penh- og Area-parametrene: Indstil dyrenes tilpasningstid til 5 min., forstøvningstiden til 2 min., responstiden til 3 min. og restitutionstiden til 2 min.
- Fortløbende tilsættes følgende opløsninger til forstøveren (200 μL pr. rotte): methacholin (0 mg/mL, 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL og 50 mg/mL). Ændringer i realtid i Penh kan observeres (Figur 4).
- Når alle 6 løsninger med forskellige koncentrationer er blevet reageret, skal du klikke på Filer og Afslut session for at fuldføre eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med akupunktur på GV14, bilaterale BL12 og bilaterale BL13-punkter opretholder rotten en udsat position. Rotten kan kun vride hovedet til ydersiden og ikke indersiden, fordi en retning er blokeret med et træbræt(Figur 5).
Efterhånden som methacholinkoncentrationen steg, viser Penh en stigende tendens, og vækstraten stiger gradvist. Ved koncentrationer på 3,125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL og 50 mg/mL steg Penh med 18,40% ± 10,70%, 27,55% ± 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% og 882,27% ± henholdsvis 121,97%, hvilket viser en effekt, der stiger med stigende dosis (figur 6).
Figur 1. Fremstilling af den høje platform. Den høje platform består af en støtteenhed, tre forbindelsesenheder og tre pedaler. Længden og bredden af støtteenheden er 86 cm x 17 cm, længden og bredden af forbindelsesenheden er 30 cm x 14 cm, pedalens længde og bredde er 5 cm x 5 cm. Hver forbindelsesenhed er adskilt af 20 cm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Protokol for etablering af en rottemodel af astma. Sensibilisering udføres på dag 0, og akupunktur udføres hver anden dag på den høje platform fra dag 2 til 14. Efter udfordringen måles ændringen i Penh. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Anatomiske positioner af GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen)og BL13 (Feishu) på rotterne. (A) Anatomisk dissektion af bagsiden af en rotte, der viser skulderbladet, første ribben, andet ribben, tredje ribben og anden brysthvirvel (T2). (B) Ribbenenes og brysthvirvlernes sagittale plan. (C)Tværsnit af skulderbladet. D) GV14: Beliggende i den hule scapula, midterlinjen af ryggen; BL13: Placeret på den nederste kant af skulderbladet; BL12: Placeret under skulderbladet, placeret i henhold til BL13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Ændringer i realtid i åndedrætsfunktionen. Den blå kurve viser ændringer i realtid i Penh. Den grønne kurve viser den samlede ændring i tidevandsvolumen (TVb) over en bestemt periode. Den lilla kurve viser den samlede ændring i Penh over en bestemt periode. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Akupunktur af GV14 (Dazhui) ,BL12 (Fengmen)og BL13 (Feishu) hos rotter på den høje platform. (B) Lateral visning af en akupunktør rotte på en høj platform. Rotten placeres på platformen og opretholdes i udsat position under akupunktur. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6. Måling af Penh. WBP bruges til at måle Penh af den normale rotte. Efterhånden som koncentrationen af methacholin øges, øges Penh også gradvist. Dataene præsenteres som middelværdien ± SEM (n = 3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1. Forstøver specifikationerne. Den forstøvede partikelstørrelse af den komprimerede forstøver er 1 - 5 μm, forstøvningshastigheden er større end 0,2 mL/ min, og det ultimative tryk er 205 kPa. Klik her for at hente denne fil.
Supplerende figur 2. De skematiske positioner GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen), og BL13 (Feishu) i rotte.
Supplerende figur 3. Nålespecifikationer. Nålens længde er 13 mm, og diameteren er 0,3 mm. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur 4. Den skematiske af akupunktur manipulation. Efter indføring af nålen, jævnt snoet nålene ca 360 ° i forskellige retninger. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De GV14-, bilaterale BL12- og bilaterale BL13-akkupunkter, der anvendes i denne undersøgelse, er placeret på bagsiden, og den høje platform er således velegnet til fastgørelse af rotter. I andre undersøgelser bør der vælges en passende fikseringsmetode i overensstemmelse med akupunkternes position15. For akupunkter på maven kan rotten placeres nedad i en sort kegle (svarende til en konditorpose, der bruges af bagere)17. En kæde er fastgjort til fastholdelseskeglerne til fiksering, og rottens bagben er også fastgjort. På denne måde er forsiden af dyrets krop fast fastgjort i keglen, mens underlivet og ryggen udsættes. For akupunkter på benet kan rotten placeres lodret i en speciel gennemsigtig spand, hvilket efterlader halen og bagbenene naturligt uden for spanden18. Den gennemsigtige tønde dækker rottens krop, men det er bekvemt for akupunktur på benet.
Der bør tages hensyn til flere kritiske trin, når disse metoder udføres. Før akupunkturbehandlingen skal rotterne placeres på den høje platform til træning i et par dage i forvejen, indtil rotterne holder stille og trækker vejret glat på den høje platform. For akupunktur manipulation, jo hårdere håndfladen af højre hånd presser rotten tilbage, jo lettere er det at indsætte nålen. Til måling af åndedrætsfunktion måler WBP-systemet ændringer i penh, der afspejler ændringer i rotters lungeresistens på en ikke-invasiv måde og minimerer virkningerne af psykologisk stress19,20. Det ydre miljøs indvirkning på rotter bør minimeres. Rotten skal placeres i testlokalet og derefter dækkes testlokalet med en plastikpose (med 1 cm x 1 cm hul på dorsalsiden til ventilation) for at reducere irritationen forårsaget af det ydre miljø.
Begrænsningen af dette eksperiment er, at nålen kan falde af, hvis rotten svinger rundt under akupunkturen. Derfor skal needling manipuleres hvert 5. minut for at justere dybden. Derudover er den høje platform velegnet til rotter, men ikke til mindre dyr, såsom mus.
Sammenfattende giver vi en detaljeret beskrivelse af metoden til fremstilling af en høj platform til fastgørelse af rotter uden begrænsning under akupunktur. Den høje platform kan helt udsætte akupunkterne på bagsiden af rotten. Brugen af målinger af høj platform og ikke-invasiv åndedrætsfunktion kan lette analysen af akupunktur som en behandling for astma. Undersøgelse af den terapeutiske mekanisme akupunktur på bagsiden kan bringe nye behandlinger til luftvejssygdomme som astma og kronisk obstruktiv lungesygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr. 81922076, 81973951, 81873373), Byggeprojekt for samarbejdsinnovation i Shanghai (nr. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
