Summary
Uma plataforma alta pode corrigir ratos sem restrições e expor completamente os pontos de acupoint na parte de trás durante a manipulação da acupuntura. Este artigo descreve métodos para a fabricação da alta plataforma, estabelece um modelo de asma de ratos e mede mudanças na função respiratória usando um sistema de plethysmografia não invasiva e em tempo real do corpo inteiro (WBP).
Abstract
Uma plataforma alta pode corrigir ratos sem restrições e expor completamente os pontos de acupoint na parte de trás durante a manipulação da acupuntura. Este artigo descreve métodos para a fabricação da alta plataforma, estabelece um modelo de asma de ratos e mede mudanças na função respiratória usando um sistema de plethysmografia não invasiva e em tempo real do corpo inteiro (WBP).
Introduction
A asma é uma doença crônica caracterizada pela broncoconstrição e hiper-responsividade das vias aéreas1. Aproximadamente 339,4 milhões de pessoas em todo o mundo são diagnosticadas com asma2. A prevalência de asma está aumentando globalmente, com 100 milhões de novos casos esperados para a próxima década3. Corticosteroides inalados e β2-agonistas de longa duração não controlam efetivamente os sintomas de todos os pacientes4. Portanto, o uso de terapias alternativas como a acupuntura para tratar a asma vem recebendo maior atenção5. Um método eficaz para o tratamento da asma é agulha GV14 (Dazhui), BL12 bilateral (Fengmen) e bilateral BL13 (Feishu)6. A acupuntura reduz significativamente os níveis de imunoglobulina secreta A (SIgA) na saliva e secreções nasais de pacientes com asma alérgica e reduz a contagem de eosinófilos sanguíneos periféricos com uma taxa efetiva total de 85%6. A acupuntura em BL13 e ST36 (Zusanli) em camundongos com asma crônica diminui o nível de IL-17 em 40% e diminui a espessura muscular lisa em 33% em comparação com a do grupo ovalbumina (OVA) e, assim, alivia os sintomas de inflamação7,8. No entanto, o mecanismo do tratamento da acupuntura para asma não é completamente claro.
Os modelos animais são uma importante ferramenta para a pesquisa da asma9 porque o modelo animal pode ser utilizado para a medição contínua da função respiratória para avaliar a eficácia do tratamento da asma10. Enquanto isso, estudos da fisiopatologia da asma requerem amostras de teste, incluindo amostras da traqueia, pulmão e lavagem broncoalveolar para verificar alterações nos níveis dos fatores-chave11. Modelos de asma de ratos são comumente usados para avaliar a fisiopatologia da asma porque produzem respostas de longo prazo das vias aéreas e mostram respostas imediatas e tardias das vias aéreas12. No entanto, devido à estimulação experimental repetida, os ratos muitas vezes se tornam irritáveis. Portanto, é necessário um método adequado para fixar ratos. Os métodos comumente utilizados para fixação de ratos incluem anestesia e vinculação13. Embora o método de anestesia proporcione melhor exposição dos acupoints, pode afetar a condução nervosa e, em última instância, afetar os resultados experimentais14. O método de ligação não induz os mesmos efeitos fisiológicos que a anestesia, mas ratos contidos experimentarão tensão muscular esquelética. Além disso, a agulha não pode alcançar facilmente a posição designada15. Aqui, introduzimos uma plataforma alta que pode ser usada para corrigir ratos sem restringi-los e expor totalmente os acupoints na parte de trás. Os ratos podem ser colocados na plataforma alta durante a administração da acupuntura. A plataforma alta é capaz de acomodar o rato apenas enquanto ele está de pé, e como ele é colocado a uma certa distância do chão, os ratos não se moverão por causa do medo das alturas16.
Este artigo descreve detalhadamente a fabricação da alta plataforma, o estabelecimento de um modelo de rato de asma, o funcionamento da necessidade de um rato na plataforma alta e a medição da função respiratória utilizando um sistema de plethysmografia do corpo inteiro (WBP).
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Protocol
Todos os experimentos em animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Medicina Tradicional Chinesa de Xangai (Número de liberação ética PZSHUTCM190308020).
1. Fabricação da alta plataforma
- Defina o comprimento e a largura do dispositivo de suporte para 86 cm x 17 cm(Figura 1).
- Corrija o dispositivo de conexão verticalmente ao dispositivo de suporte. O dispositivo de conexão deve ter aproximadamente 30 cm de comprimento para evitar que o rato escorra até a superfície superior da plataforma alta e tenha uma largura de 14 cm.
- Fixar o pedal horizontal (5 cm x 5 cm) no dispositivo de conexão. A altura suspensa na parte inferior do pedal horizontal deve ser maior ou igual a 50 cm.
NOTA: Dependendo do número de ratos experimentais, podem ser usados vários pedais horizontais, com um rato colocado em cada pedal.
2. Estabelecimento de um modelo de rato de asma
- Sensibilizando os ratos com OVA
- Prepare a solução de sensibilização no dia 0. Prepare cada 1 mL da solução de sensibilização com 1 mg de OVA e 10 mg de hidróxido de alumínio, com soro fisiológico normal como solvente.
- Injete intraperitoneally cada rato com 1 mL da solução de sensibilização no dia 0. Desenhe a solução sensibilizadora com uma seringa adequada para uso posterior.
- Pegue a cauda e levante o rato, coloque-o em uma superfície áspera, e puxe suavemente a cauda para trás. Segure a pele das orelhas e pescoço com o polegar esquerdo e o dedo indicador, mantendo firmemente a pele traseira com os três dedos e palmas restantes (tenha cuidado para evitar aplicar força excessiva que sufocará o rato).
- Com a mão direita, realize uma injeção intraperitoneal no rato com a seringa preparada com 1 mL da solução de sensibilização.
- Ratos desafiadores com OVA
- Selecione uma caixa com uma tampa (o comprimento, largura e altura são 39 cm x 28 cm x 23 cm) e faça um pequeno orifício na lateral. Conecte a caixa selada, o copo de nebulização e o nebulizador de compressão com um tubo de borracha(Figura Suplementar 1).
NOTA: O tamanho da partícula nebulizada do nebulizador comprimido é de 1 a 5 μm, a taxa de nebulização é superior a 0,2 mL/min, e a pressão final é de 205 kPa. - No 14º dia após a sensibilização, abra a tampa da caixa lacrada caseira e coloque o rato na caixa (a caixa pode acomodar 5 ratos), e depois coloque a caixa selada em um armário de biossegurança.
- Prepare a solução do desafio. Misture completamente 300 mg de OVA com 30 mL de soro fisiológico normal.
- Ligue o nebulizador ultrassônico e adicione 30 mL da solução de desafio na xícara de nebulização. Ajuste a dosagem da solução de desafio e o número de ratos de acordo com o volume da caixa lacrada caseira.
- Repita a nebulização várias vezes (uma vez por dia) ou ajuste o procedimento de acordo com a gravidade dos sintomas da asma.
- Selecione uma caixa com uma tampa (o comprimento, largura e altura são 39 cm x 28 cm x 23 cm) e faça um pequeno orifício na lateral. Conecte a caixa selada, o copo de nebulização e o nebulizador de compressão com um tubo de borracha(Figura Suplementar 1).
3. Tratamento de acupuntura
- Selecione pontos de acupoint, incluindo GV14, bilateral BL12 e bilateral BL13, de acordo com a teoria da medicina tradicional chinesa para o tratamento da asma (Figura Suplementar 2). Administre acupuntura manual no dia 2 e realize uma vez a cada dois dias para um total de 7 sessões (Figura 2).
- Acupuntura o GV14 localizado entre a sétima vértebra cervical e a primeira vértebra torácica (a oca da escápula), na linha média da parte de trás(Figura 3).
- Acupuntura o BL13 localizado abaixo da terceira vértebra torácica, em ambos os lados dos espaços intercostais (borda inferior da escápula).
- Acupuntura do BL12 localizado abaixo da segunda vértebra torácica, em ambos os lados dos espaços intercostais (abaixo da escápula, posição identificada segundo BL13).
- Segure os ratos e coloque-os na plataforma alta.
- Segure a agulha de aço inoxidável descartável (0,3 mm x 13,0 mm, Figura Suplementar 3) com o polegar e o dedo indicador da mão direita, e pressione a parte de trás do rato com a palma da mão direita.
NOTA: As agulhas descartáveis devem ser de uso único. Porque o uso repetido vai diminuir a agulha, o que leva ao aumento da dor em ratos. - Toque a depressão no meio da borda superior (GV14) ou na borda inferior da escápula (BL12 e BL13), e depois pique suavemente a pele do rato com a ponta da agulha para localizar os acupoints.
- Insira rapidamente a agulha depois de determinar a localização específica do acupoint e remova rapidamente a mão direita.
- Torcido uniformemente as agulhas aproximadamente 360° a uma taxa de 60 vezes/min para 10 - 20 s, manipulá-las a cada 5 minutos, e depois retirá-las após 20 - 30 min (Figura Suplementar 4).
4. A medição de Penh
- Prepare a methacholina: Coloque 100 mg de metanfetamina em um tubo de centrífuga de 5 mL e adicione PBS a um volume de 2 mL (50 mg/mL de metanfetamina). Em seguida, diluir a solução de methacholina de 50 mg/mL para 25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 6,25 mg/mL e 3.125 mg/mL.
- Inspeção de instrumentos
- Ligue o amplificador de sinal (o sistema de distribuição de aerossol e o sistema de alimentação de fluxo de viés de roedores estão todos desligados, e o conector de nebulização está fechado).
- Verifique os canais: Clique em Calibrar,devolva a linha de base de ajuste grosseiro para 0 e mude para a posição de corrente direta (DC). Ajuste a linha de base para 0 e injete 5 mL de gás com uma seringa. Em seguida, mude para a posição de corrente alternada (AC).
- Após a verificação dos canais, certifique-se de que o valor do erro seja inferior a 0,5%.
- Definindo parâmetros
- Ligue o sistema de distribuição de aerossol e o sistema de alimentação de fluxo de viés de roedores. Ajuste a vazão para 4,5 mL de acordo com o nível líquido na bola de mercúrio.
- Clique em Criar opções de estudo e selecione Estudo de Resposta a Doses,selecione Rato de espécies e clique em Next.
- Selecione Lista de Doses Simples,defina o número de doses para 6 e clique em Next.
- Selecione os parâmetros penh e área: Definir o tempo de adaptação animal para 5 min, o tempo de nebulização para 2 min, o tempo de resposta para 3 min, e o tempo de recuperação para 2 min.
- Adicione sequencialmente as seguintes soluções ao nebulizador (200 μL por rato): metanfetamina (0 mg/mL, 3.125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL). Podem ser observadas alterações em tempo real em Penh(Figura 4).
- Depois de todas as 6 soluções com diferentes concentrações terem sido reagidas, clique em Arquivo e Sessão Final para concluir o experimento.
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Representative Results
Com acupuntura no GV14, bl12 bilateral e pontos bl13 bilaterais, o rato mantém uma posição propensa. O rato pode torcer a cabeça apenas para o lado de fora e não para dentro porque uma direção está bloqueada com uma tábua de madeira(Figura 5).
À medida que a concentração de metanfetamina aumenta, Penh mostra uma tendência crescente e a taxa de crescimento aumenta gradualmente. Nas concentrações de 3.125 mg/mL, 6,25 mg/mL, 12,5 mg/mL, 25 mg/mL e 50 mg/mL, Penh aumentou 18,40% ± 10,70%, 27,55% ± 26,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% e 882,27% ± 121,97%, respectivamente, mostrando um efeito que aumenta com o aumento da dose(Figura 6).
Figura 1. Fabricação da alta plataforma. A plataforma alta consiste em um dispositivo de suporte, três dispositivos de conexão e três pedais. O comprimento e largura do dispositivo de suporte são de 86 cm x 17 cm, o comprimento e largura do dispositivo de conexão são de 30 cm x 14 cm, o comprimento e largura do pedal são de 5 cm x 5 cm. Cada dispositivo de conexão é separado por 20 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Protocolo para estabelecer um modelo de asma. A sensibilização é realizada no dia 0, e a acupuntura é realizada a cada dois dias na plataforma alta dos dias 2 ao 14. Após desafio, a mudança em Penh é medida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Posições anatômicas de GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen)e BL13 (Feishu) nos ratos. (A) Dissecção anatômica da parte de trás de um rato mostrando a escápula, primeira costela, segunda costela, terceira costela e segunda vértebra torácica (T2). (B) O plano sagital das costelas e vértebra torácica. (C) A seção transversal da escápula. (D) GV14: Localizado na oca da escápula, linha média da parte de trás; BL13: Localizado na borda inferior da escápula; BL12: Localizado abaixo da escápula, posicionado de acordo com BL13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Mudanças em tempo real na função respiratória. A curva azul mostra mudanças em tempo real em Penh. A curva verde mostra a variação total do volume de marés (TVb) durante um determinado período. A curva roxa mostra a mudança total em Penh durante um certo período. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Acupuntura de GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen), e BL13 (Feishu) em ratos na plataforma alta. (A) Visão superior das posições de GV14, BL12 e BL13 em ratos. (B) Vista lateral de um rato acupunturado em uma plataforma alta. O rato é colocado na plataforma e mantido na posição propensa durante a acupuntura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Medição de Penh. WBP é usado para medir o Penh do rato normal. À medida que a concentração de metanfetamina aumenta, o Penh também aumenta gradualmente. Os dados são apresentados como a média ± SEM (n = 3). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1. As especificações do nebulizador. O tamanho da partícula nebulizada do nebulizador é de 1 a 5 μm, a taxa de nebulização é superior a 0,2 mL/min, e a pressão final é de 205 kPa. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 2. As posições esquemáticas de GV14 (Dazhui),BL12 (Fengmen), e BL13 (Feishu) em rato. Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 3. Especificações da agulha. O comprimento da agulha é de 13 mm e o diâmetro é de 0,3 mm. Por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar 4. O esquema da manipulação da acupuntura. Depois de inserir a agulha, torcido uniformemente as agulhas aproximadamente 360° em direções diferentes. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Os acupontos GV14, bilateral BL12 e bilateral BL13 utilizados neste estudo estão localizados na parte de trás, e, portanto, a plataforma alta é adequada para fixação de ratos. Em outros estudos, deve ser selecionado um método de fixação adequado de acordo com a posição dos acupoints15. Para acupoints no abdômen, o rato pode ser colocado para baixo em um cone preto (semelhante a um saco de massa usado pelos padeiros)17. Uma corrente é presa ao cone de contenção para fixação, e a perna traseira do rato também é fixada. Dessa forma, a frente do corpo do animal está firmemente fixada no cone, enquanto o abdômen e as costas estão expostos. Para acupoints na perna, o rato pode ser colocado verticalmente em um balde transparente especial, deixando a cauda e as pernas traseiras naturalmente fora do balde18. O barril transparente cobre o corpo do rato, mas é conveniente para acupuntura na perna.
Várias etapas críticas devem ser consideradas ao realizar esses métodos. Antes do tratamento de acupuntura, os ratos devem ser colocados na plataforma alta para treinamento com alguns dias de antecedência até que os ratos fiquem quietos e respirem suavemente na plataforma alta. Para manipulação da acupuntura, quanto mais a palma da mão direita pressiona o rato para trás, mais fácil é inserir a agulha. Para a medição da função respiratória, o sistema WBP mede alterações no Penh que refletem alterações na resistência pulmonar de ratos de forma não invasiva e minimiza os efeitos do estresse psicológico19,20. O efeito do ambiente externo sobre os ratos deve ser minimizado. O rato deve ser colocado na sala de testes e, em seguida, coberto a sala de testes com um saco plástico (com orifício de 1cm x 1cm no lado dorsal para ventilação) para reduzir a irritação causada pelo ambiente externo.
A limitação deste experimento é que a agulha pode cair se o rato balançar durante a acupuntura. Portanto, o necessitamento deve ser manipulado a cada 5 minutos para ajustar a profundidade. Além disso, a plataforma alta é adequada para ratos, mas não para animais menores, como ratos.
Em resumo, fornecemos uma descrição detalhada do método para a fabricação de uma plataforma alta para fixação de ratos sem restrição durante a acupuntura. A plataforma alta pode expor completamente os acupoints na parte de trás do rato. O uso de medidas de alta plataforma e função respiratória não invasiva pode facilitar a análise da acupuntura como tratamento para asma. Estudar o mecanismo terapêutico da acupuntura nas costas pode trazer novos tratamentos para doenças respiratórias, como asma e doença pulmonar obstrutiva crônica.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela National Natural Science Foundation of China (nº 81922076, 81973951, 81873373), projeto de construção de inovação colaborativa de Xangai (Nº. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
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