Summary
Высокая платформа может исправить крыс без ограничений и полностью подвергать acupoints на спине во время манипуляции иглоукалыванием. В этой статье описаны методы изготовления высокой платформы, устанавливается крысиная модель астмы и измеряется изменение дыхательной функции с помощью неинвазивной и в режиме реального времени системы плетисмографии всего тела (WBP).
Abstract
Высокая платформа может исправить крыс без ограничений и полностью подвергать acupoints на спине во время манипуляции иглоукалыванием. В этой статье описаны методы изготовления высокой платформы, устанавливается крысиная модель астмы и измеряется изменение дыхательной функции с помощью неинвазивной и в режиме реального времени системы плетисмографии всего тела (WBP).
Introduction
Астма является хроническим заболеванием, характеризующимся бронхоконструкцией и гипер-реакцией дыхательных путей1. Приблизительно 339,4 миллиона человек во всем мире с диагнозом астма2. Распространенность астмы растет во всем мире, с 100 миллионов новых случаев ожидается в следующемдесятилетии 3. Вдыхание кортикостероидов и длительного действия β2-агонистыне эффективно контролировать симптомы всех пациентов4. Таким образом, использование альтернативных методов лечения, таких как иглоукалывание для лечения астмы получает повышенное внимание5. Эффективным методом лечения астмы является игла GV14 (Дашуй), двусторонний BL12 (фэнмен) и двусторонний BL13 (Фейшу)6. Иглоукалывание значительно снижает уровень секреторного иммуноглобулина А (SIgA) в слюне и носовых выделениях пациентов с аллергической астмой и уменьшает количество эозинофилов периферической крови с общей эффективной скоростью 85%6. Иглоукалывание в BL13 и ST36 (Зусанли) у мышей с хронической астмой снижает уровень IL-17 на 40% и уменьшает гладкую толщину мышц на 33% по сравнению с группой овалбумина (OVA), и, таким образом, снятиясимптомов воспаления 7,8. Однако механизм лечения астмы иглоукалыванием не совсем ясен.
Модели животных являются важным инструментом для исследованияастмы 9, потому что модель животного может быть использована для непрерывного измерения дыхательной функции для оценки эффективностилечения астмы 10. Между тем, исследования патофизиологии астмы требуют тестовых образцов, в том числе образцов из трахеи, легких и бронхоалвеолярной лаваж для проверки изменений в уровнях ключевыхфакторов 11. Крысы модели астмы обычно используются для оценки астмы патофизиологии, потому что они производят долгосрочные реакции дыхательных путей и показать немедленной и поздней фазы дыхательныхпутей ответы 12. Однако, из-за повторной экспериментальной стимуляции, крысы часто становятся раздражительными. Поэтому необходим подходящий метод фиксации крыс. Обычно используемые методы фиксации крыс включают анестезию и связывание13. Хотя метод анестезии обеспечивает лучшее воздействие акупойнтов, он может повлиять на проведение нерва и в конечном итоге повлиять на экспериментальныерезультаты 14. Обязательный метод не вызывает те же физиологические эффекты, как анестезия, но сдержанные крысы будут испытывать напряжение скелетных мышц. Кроме того, игла не может легко достичь назначенногоположения 15. Здесь мы вводим высокую платформу, которая может быть использована для фиксации крыс, не ограничивая их и полностью подвергать acupoints на спине. Крысы могут быть размещены на высокой платформе во время введения иглоукалывания. Высокая платформа способна вместить крысу только в то время как она стоит, и, как она находится на определенном расстоянии от земли, крысы не будут двигаться из-за страхавысоты 16.
В этой статье подробно описывается изготовление высокой платформы, создание крысиной модели астмы, работа иголки крысы на высокой платформе и измерение дыхательной функции с помощью системы плетисмографии всего тела (WBP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Шанхайского университета традиционной китайской медицины (этический номер разрешения P'SHUTCM190308020).
1. Изготовление высокой платформы
- Установите длину и ширину вспомогательного устройства до 86 см x 17 см(рисунок 1).
- Зафиксите соединивающее устройство вертикально к поддерживающее устройство. Соединительной устройства должно быть около 30 см в длину, чтобы предотвратить крысы от запуска на верхнюю поверхность высокой платформы и имеют ширину 14 см.
- Зафиксите горизонтальную педаль (5 см х 5 см) к соединительной устройству. Подвесная высота в нижней части горизонтальной педали должна быть больше или равна 50 см.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от количества экспериментальных крыс, несколько горизонтальных педалей могут быть использованы, с одной крысы размещены на каждой педали.
2. Создание крысиной модели астмы
- Сенсибилизация крыс с OVA
- Подготовь решение для сенсибилизации на 0-й день. Приготовьте каждый 1 мл раствора сенсибилизации с 1 мг OVA и 10 мг гидроксида алюминия, с нормальным солевым растворителем.
- Intraperitoneally вводить каждую крысу с 1 мл раствора сенсибилизации на день 0. Нарисуйте сенсибилизирующий раствор подходящим шприцем для более длительного использования.
- Возьмите хвост и поднимите крысу, поместите ее на шероховатую поверхность и аккуратно потяните хвост назад. Возьмите кожу обоих ушей и шеи с большим пальцем левой руки и указательным пальцем, плотно удерживая заднюю кожу с оставшимися тремя пальцами и ладонями (будьте осторожны, чтобы воздержаться от применения избыточной силы, которая задушит крысу).
- Правой рукой выполнить внутриперитонеавную инъекцию крысы с помощью подготовленного шприца с 1 мл раствора сенсибилизации.
- Сложные крысы с OVA
- Выберите коробку с крышкой (длина, ширина и высота 39 см х 28 см х 23 см), и просверлите небольшое отверстие в стороне. Соедините запечатанную коробку, небуляривную чашку и компрессионную небулайзер с резиновойтрубкой (дополнительная цифра 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Размер небулированных частиц сжатого небулайзера составляет 1 - 5 мкм, скорость небулизации превышает 0,2 мл/мин, а конечное давление составляет 205 кПа. - На 14-й день после сенсибилизации откройте крышку самодельного запечатанного ящика и поместите крысу в коробку (коробка может вместить 5 крыс), а затем положите запечатанную коробку в шкаф для биобезопасности.
- Подготовь решение проблемы. Тщательно смешайте 300 мг OVA с 30 мл нормального солевого раствора.
- Включите ультразвуковой небулайзер и добавьте 30 мл раствора вызова в небулирующую чашку. Отрегулируйте дозировку раствора вызова и количество крыс в зависимости от объема самодельной герметичной коробки.
- Повторите небулизацию несколько раз (один раз в день) или отрегулируйте процедуру в зависимости от тяжести симптомов астмы.
- Выберите коробку с крышкой (длина, ширина и высота 39 см х 28 см х 23 см), и просверлите небольшое отверстие в стороне. Соедините запечатанную коробку, небуляривную чашку и компрессионную небулайзер с резиновойтрубкой (дополнительная цифра 1).
3. Лечение иглоукалыванием
- Выберите acupoints, в том числе GV14, двусторонний BL12 и двусторонний BL13, в соответствии с теорией традиционной китайской медицины для лечения астмы(Дополнительный рисунок 2). Администрирование ручной иглоукалывание на второй день и выполнять один раз в день в общей сложности 7 сессий (Рисунок 2).
- Иглоукалывание GV14 расположен между седьмым шейным позвонком и первым грудным позвонком (полость лопатки), на средней линииспины (рисунок 3).
- Иглоукалывание BL13 расположен ниже третьего грудного позвонка, по обе стороны межреберных пространств (нижний край лопатки).
- Иглоукалывание BL12 расположен ниже второго грудного позвонка, по обе стороны межреберных пространств (ниже лопатки, положение, идентифицировано в соответствии с BL13).
- Возьмитесь за крыс и поместите их на высокую платформу.
- Держите одноразовую иглу из нержавеющей стали (0,3 мм х 13,0 мм, дополнительный рисунок 3) ручку большим и указательным пальцем правой руки, и нажмите на заднюю часть крысы ладонью правой руки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Одноразовые иглы должны быть только одноразового использования. Потому что повторное использование будет притупить иглу, что приводит к увеличению боли у крыс. - Коснитесь депрессии в середине верхнего края (GV14) или нижнего края лопатки (BL12 и BL13), а затем осторожно колоть кожу крысы кончиком иглы, чтобы найти acupoints.
- Быстро вставьте иглу после определения конкретного местоположения акупойнт и быстро удалите правую руку.
- Равномерно скрученные иглы примерно 360 "со скоростью 60 раз/мин в течение 10 - 20 с, манипулировать ими каждые 5 минут, а затем снять их после 20 - 30 мин (Дополнительный рисунок 4).
4. Измерение Пена
- Подготовка метахолина: Поместите 100 мг метахолина в 5 мл центрифуги трубки и добавить PBS к объему 2 мл (50 мг/мл метахолина). Затем разбавьте раствор метахолина 50 мг/мл до 25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 6,25 мг/мл и 3,125 мг/мл.
- Инспекция приборов
- Включите усилитель сигнала (система распределения аэрозолей и система подачи потока грызунов отключены, а разъем небулизации закрыт).
- Проверьте каналы: Нажмите Калибруйте,верните базовую линию грубой регулировки до 0 и переключитесь на положение прямого тока (DC). Отладить базовый уровень до 0 и впрыснуть 5 мл газа шприцем. Затем переключитесь на положение переменного тока (AC).
- После проверки каналов убедитесь, что значение ошибки составляет менее 0,5%.
- Установка параметров
- Включите систему распределения аэрозолей и систему подачи потока грызунов. Отрегулируйте скорость потока до 4,5 мл в зависимости от уровня жидкости на ртутном шаре.
- Нажмите Создать Варианты исследования и выберите Доза Ответ Исследование, выберите Крыса видов и нажмите Далее.
- Выберите простой списокдоз, установите количество доз до 6 и нажмите Далее.
- Выберите параметры Penh и Area: Установите время адаптации животных до 5 минут, время небулизации до 2 минут, время отклика до 3 минут, и время восстановления до 2 минут.
- Последовательно добавляйте в небулайзер следующие растворы (200 л на крысу): метахолин (0 мг/мл, 3,125 мг/мл, 6,25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 25 мг/мл и 50 мг/мл). Изменения в режиме реального времени в Пен можно наблюдать(рисунок 4).
- После того, как все 6 решений с различными концентрациями были прореагированы, нажмите Файл и Конец сессии для завершения эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С иглоукалыванием на GV14, двусторонних BL12 и двусторонних bl13 точек, крыса сохраняет склонную позицию. Крыса может крутить головой только снаружи, а не изнутри, потому что одно направление блокируется деревянной доской(рисунок 5).
По мере увеличения концентрации метахолина Пен показывает растущую тенденцию, и темпы роста постепенно увеличиваются. При концентрациях 3,125 мг/мл, 6,25 мг/мл, 12,5 мг/мл, 25 мг/мл и 50 мг/мл, пен увеличилась на 18,40% ± 10,70%, 27,55% ± 2 6,30%, 88,10% ± 45,63%, 427,60% ± 172,92% и 882,27% ± 121,97%, соответственно, показывая эффект, который увеличивается с увеличениемдозы (рисунок 6).
Рисунок 1. Изготовление высокой платформы. Высокая платформа состоит из вспомогательного устройства, трех соединительных устройств и трех педалей. Длина и ширина вспомогательного устройства 86 см х 17 см, длина и ширина соединительной устройства 30 см х 14 см, длина и ширина педали 5 см х 5 см. Каждое соединиющее устройство разделено на 20 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Протокол для создания крысиной модели астмы. Сенсибилизация проводится на 0-й день, а иглоукалывание проводится через день на высокой платформе с 2 по 14 дней. После вызова, изменения в Penh измеряется. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3. Анатомические позиции GV14 (Dazhui), BL12 (Фэнмен) , и BL13 (Фейшу) на крысах. (A) Анатомическое вскрытие задней части крысы с указанием лопатки, первое ребро, второе ребро, третье ребро, и второй грудной позвонок (T2). (B)Сагиттаальная плоскость ребер и грудного позвонка. (C)Поперечное сечение лопатки. (D) GV14: Расположен в дупле лопатки, средней линии спины; BL13: Расположен на нижнем краю лопатки; BL12: Расположен ниже лопатки, расположенной в соответствии с BL13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4. Изменения в дыхательной функции в режиме реального времени. Синяя кривая показывает изменения в режиме реального времени в Пене. Зеленая кривая показывает общее изменение приливного объема (TVb) за определенный период. Фиолетовая кривая показывает общее изменение в Penh за определенный период. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5. Иглоукалывание GV14 (Dazhui), BL12 (Fengmen) , иBL13 (Feishu) у крыс на высокой платформе. ( ) Верхний вид позиций GV14, BL12 и BL13 у крыс. (B) Боковой вид иглоукалывание крысы на высокой платформе. Крыса помещается на платформу и поддерживается в положении склонны во время иглоукалывания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6. Измерение Пена. WBP используется для измерения Пена нормальной крысы. По мере увеличения концентрации метахолина, Пен также постепенно увеличивается. Данные представлены в качестве среднего ± (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная цифра 1. Спецификации небулайзера. Размер небулированных частиц сжатого небулайзера составляет 1 - 5 мкм, скорость небулизации превышает 0,2 мл/мин, а конечное давление составляет 205 кПа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная цифра 2. Схематические позиции GV14 (Dazhui), BL12 (Фэнмен), и BL13 (Feishu) в крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительные спецификации рисунка 3. Иглы. Длина иглы составляет 13 мм, а диаметр 0,3 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительная цифра 4. Схема манипуляции иглоукалыванием. После вставки иглы, равномерно скрученные иглы примерно на 360 "в разных направлениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GV14, двусторонний BL12 и двусторонние acu3 Acupoints BL13, используемые в этом исследовании, расположены на задней стороне, и, таким образом, высокая платформа подходит для фиксации крыс. В других исследованиях, адекватный метод фиксации должны быть выбраны в зависимости от положения acupoints15. Для acupoints на животе, крыса может быть помещен вниз в черный конус (по аналогии с кондитерской мешок используется пекарей)17. Цепь крепится к удерживаемому конусу для фиксации, а задняя нога крысы также фиксируется. Таким образом, передняя часть тела животного прочно закреплена в конусе, в то время как живот и спина подвергаются воздействию. Для acupoints на ноге, крыса может быть помещена вертикально в специальном прозрачном ведре, оставляя хвост и задние ноги естественно вне ведра18. Прозрачная бочка покрывает тело крысы, но удобна для иглоукалывания на ноге.
При выполнении этих методов следует учитывать несколько важных шагов. Перед процедурой иглоукалывания, крысы должны быть размещены на высокой платформе для обучения в течение нескольких дней вперед, пока крысы молчать и дышать плавно на высокой платформе. Для манипуляции с иглоукалыванием, чем сильнее ладонь правой руки отжимает крысу назад, тем легче вставить иглу. Для измерения функции дыхания, система WBP измеряет изменения в Penh, которые отражают изменения в легочной устойчивости крыс в неинвазивным образом и сводит к минимуму последствия психологического стресса19,20. Влияние внешней среды на крыс должно быть сведено к минимуму. Крыса должна быть помещена в испытательный зал, а затем покрыты испытательный зал с полиэтиленовым пакетом (с 1 см х 1 см отверстие на спинной стороне для вентиляции), чтобы уменьшить раздражение, вызванное внешней среды.
Ограничение этого эксперимента заключается в том, что игла может упасть, если крыса качается во время иглоукалывания. Поэтому, needling необходимо манипулировать каждые 5 минут для того чтобы отрегулировать глубину. Кроме того, высокая платформа подходит для крыс, но не для мелких животных, таких как мыши.
Подводя итог, мы предоставляем подробное описание метода изготовления высокой платформы для фиксации крыс без ограничений во время иглоукалывания. Высокая платформа может полностью разоблачить acupoints на задней части крысы. Использование высокой платформы и неинвазивных измерений дыхательной функции может облегчить анализ иглоукалывания в качестве лечения астмы. Изучение терапевтического механизма иглоукалывания на спине может принести новые методы лечения респираторных заболеваний, таких как астма и хроническая обструктивная болезнь легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (No 81922076, 81973951, 81873373), Строительный проект совместных инноваций Шанхая (No. ZYJKFW201811010, ZYJKFW201701005).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.3 mm x 13.0 mm acupuncture needle | China Suzhou Medical Device Factory | ||
| Al(OH)3 | American Thermo | 77161 | |
| Compression nebulizer | Jiangsu Lude Medical Electronics Co., Ltd. | NB-212C | |
| Fine Pointe V2.0 | American Buxco | ||
| Laboratory gas drying unit | American Drierite | 26800 | |
| Methacholine | American Sigma | MKCF6054 | |
| Ovalbumin | American Sigma | A5503-25G | |
| Phosphate Buffer solution (1x) | Gelifesciences | SH30256.01 | |
| Seal box | IRIS Corporation of Japan | ||
| Whole-body plethysmography respiratory function measurement system | American Buxco |
References
- Papi, A., Brightling, C., Pedersen, S. E., Reddel, H. K.
- Global Initiative for Asthma, 2019. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2019).
- Enilari, O., Sinha, S. The Global Impact of Asthma in Adult Populations. Annals of Global Health. 85 (1), (2019).
- Global Initiative for Asthma, 2020. Global strategy for asthma management and prevention. , Available from: https://ginasthma.org/gina-reports/ (2020).
- Zhuang, Y., Xing, J. J., Li, J., Zeng, B. Y., Liang, F. R.
- Yang, Y. Q., et al. Considerations for use of acupuncture as supplemental therapy for patients with allergic asthma. Clinical Reviews in Allergy & Immunology. 44 (3), 254-261 (2013).
- Nurwati, I., et al. Reduction of interleukin-17 level by acupuncture at Feishu (BL13) is strengthened by acupuncture at Zusanli (ST36) in a mouse model of chronic asthma: An experimental study. Medical Acupuncture. 27 (4), 278-282 (2015).
- Nurwati, I., et al. Improvement in inflammation and airway remodelling after acupuncture at BL13 and ST36 in a mouse model of chronic asthma. Acupuncture in Medicine. 37 (4), 228-236 (2019).
- Reddy, A. T., Lakshmi, S. P., Reddy, R. C. Murine model of allergen induced asthma. Journal of Visualized Experiments. (63), e3771 (2012).
- Zhou, D. D., et al. Metallothionein-2 is associated with the amelioration of asthmatic pulmonary function by acupuncture through protein phosphorylation. Biomedicine & Pharmacotherapy. 123, 109785 (2020).
- Yin, L. M., et al. Transgelin-2 as a therapeutic target for asthmatic pulmonary resistance. Science Translational Medicine. 10 (427), (2018).
- Shin, Y. S., Takeda, K., Gelfand, E. W. Understanding asthma using animal models. Allergy Asthma & Immunology Research. 1 (1), 10-18 (2009).
- Cui, K. M., et al. Electro-acupuncture relieves chronic visceral hyperalgesia in rats. Neuroscience Letters. 376 (1), 20-23 (2005).
- Tobin, J. R., Martin, L. D., Breslow, M. J., Traystman, R. J. Selective anesthetic inhibition of brain nitric oxide synthase. Anesthesiology. 81 (5), 1264-1269 (1994).
- Dimitrov, N., Sivrev, D., Atanasova, D. Method of rat immobilization during experimental acupuncture. Scripta Scientifica Medica. 45, 105-108 (2013).
- Aguilar, R., et al. emotional reactivity and fear of heights: a factor analytic map from a large F(2) intercross of Roman rat strains. Brain Research Bulletin. 57 (2), 17-26 (2002).
- Lai, X., et al. Proteomic response to acupuncture treatment in spontaneously hypertensive rats. PloS One. 7 (9), 44216 (2012).
- Niu, C., et al. A novel uni-acupoint electroacupuncture stimulation method for pain relief. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2011, 209879 (2011).
- McFadden, E. R., Luparello, T., Lyons, H. A., Bleecker, E. The mechanism of action of suggestion in the induction of acute asthma attacks. Psychosomatic Medicine. 31 (2), 134-143 (1969).
- Savov, J. D., et al. Ozone-induced acute pulmonary injury in inbred mouse strains. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 31 (1), 69-77 (2004).
