Summary
פרוטוקול זה מציג מערכת תרבות חדשנית, חזקה וניתן לשחזור כדי ליצור ולגדל ספרואידים תלת מימדיים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2. התוצאות מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה זו לחקר ביולוגיה של תאי גזע סרטן, כולל התגובה לכימותרפיה.
Abstract
סרטן המעי הגס מאופיין בהטרוגניות ובארגון היררכי הכולל אוכלוסייה של תאי גזע סרטניים (CSCs) האחראים על התפתחות הגידול, תחזוקתו והעמידות לתרופות. הבנה טובה יותר של מאפייני CSC עבור המיקוד הספציפי שלהם היא, אם כן, דרישה מוקדמת לטיפול יעיל. עם זאת, יש מחסור במודלים פרה-קוליניים מתאימים לחקירות מעמיקות. למרות הפריה דו מימדית (2D) קווי תאים סרטניים לספק תובנות חשובות לתוך הביולוגיה הגידול, הם לא לשכפל את ההטרוגניות גידול פנוטיפי וגנטי. לעומת זאת, מודלים תלת מימדיים (תלת מימדיים) מטפלים ומשכפלים מורכבות סרטן כמעט פיזיולוגית והטרוגניות של תאים. מטרת עבודה זו הייתה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה הניתנת לשחזור לחקר הביולוגיה של CSC. המתודולוגיה הנוכחית מתארת את הפיתוח והאופטימיזציה של תנאים ליצירת ספרואידים תלת-ממדיים, שהם הומוגניים בגודלם, מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2, מודל שניתן להשתמש בו לתרבות ארוכת טווח. חשוב לציין, בתוך הכדורואידים, התאים שאורגנו סביב מבנים דמויי לומן, התאפיינו בדפוסי התפשטות תאים דיפרנציאליים ובנוכחות CSCs המבטאים פאנל של סמנים. תוצאות אלו מספקות את הוכחת הרעיון הראשונה לצורך ההתאמה של גישה תלת-ממדית זו לחקר הטרוגניות התא וביולוגיה של CSC, כולל התגובה לכימותרפיה.
Introduction
סרטן המעי הגס (CRC) נשאר הגורם המוביל השני של מקרי מוות הקשורים לסרטן בעולם1. הפיתוח של CRC הואתוצאהשל רכישה מתקדמת והצטברות של מוטציות גנטיות ו / או שינויים אפיגנטיים 2,3, כולל הפעלה של אונקוגנים והפעלה של גנים מדכאי גידול3,4. יתר על כן, גורמים לא גנטיים (למשל, microenvironment) יכול לתרום ולקדם טרנספורמציה oncogenic ובכך להשתתף באבולוציה של CRCs5. חשוב לציין, CRCs מורכבים מאוכלוסיות תאים שונות, כולל CSCs מובחנים ותאי גידול בתפזורת המציגים כמה תכונות בידול, המהוות מבנה היררכי המזכיר את ארגון האפיתל בקריפטה המעי הגס נורמלי6,7.
CSCs נחשבים אחראים על מראה הגידול8, תחזוקה וצמיחה שלה, קיבולת גרורתית, והתנגדות לטיפולים קונבנציונליים6,7. בתוך גידולים, תאים סרטניים, כולל CSCs, להציג רמה גבוהה של הטרוגניות ומורכבות במונחים של פרופילים מוטציה ואפיגנטית מובהק שלהם, הבדלים מורפולוגיים פנוטיפיים, ביטוי גנים, חילוף החומרים, שיעורי התפשטות, פוטנציאל גרורתי9. לכן, כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של הסרטן, התקדמות הגידול, ורכישת עמידות לטיפול ותרגומו לטיפולים יעילים, מודלים פרה-קוליניים אנושיים הלוכדים את ההטרוגניות וההיררכיה של סרטן זה חשובים10,11.
In vitro 2D קווי תאים סרטניים שימשו במשך זמן רב ולספק תובנות חשובות על התפתחות הגידול ואת המנגנונים שבבסיס היעילות של מולקולות טיפוליות. עם זאת, המגבלה שלהם ביחס לחוסר ההטרוגניות הפנוטיפית והגנטית שנמצאה בגידולים המקוריים מוכרת כיום באופן נרחב12. יתר על כן, חומרים מזינים, חמצן, שיפוע pH, ואת microenvironment הגידול אינם משוחזרים, microenvironment להיות חשוב במיוחד לשמירה על סוגי תאים שונים כולל CSCs11,12. כדי להתגבר על חסרונות עיקריים אלה, מספר מודלים 3D פותחו כדי לטפל באופן ניסיוני ולשכפל את המורכבות וההטרוגניות של סרטן. למעשה, מודלים אלה מסכמים מחדש את ההטרוגניות התאית הגידולית, אינטראקציות תאים וארכיטקטורה מרחבית, בדומה לאלה שנצפו ב vivo12,13,14. אורגנואידים גידול ראשוני הוקמה גידולים טריים, כמו גם ספירואידים קו התא נגזר, מועסקים בעיקר15,16.
ניתן לתרבת ספרואידים באופן נטול פיגומים או פיגומים כדי לאלץ את התאים להיווצר ולצמוח באגרגטים של תאים. שיטות ללא פיגומים מבוססות על תרבות התאים בתנאים שאינם עמידים (למשל, שיטת תלייה-טיפה או לוחות התקשרות נמוכים במיוחד), ואילו מודלים מבוססי פיגומים מסתמכים על ביו-חומרים טבעיים, סינתטיים או היברידיים לתאי תרבות12,13,14. ספירואידים מבוססי פיגומים מציגים חסרונות שונים שכן היווצרות הכדורואיד הסופי תהיה תלויה באופיו ובהרכבו של החומר (הביולוגי) בו נעשה שימוש. למרות ששיטות הכדורידים נטולות הפיגומים הזמינות עד כה אינן מסתמכות על אופי המצע, הן יוצרות ספרואידים המשתנים במבנה ובגודל17,18.
עבודה זו נועדה לעצב מערכת תרבות תלת-ממדית חזקה וניתנת לשחזור של ספרואידים, שהם הומוגניים בגודלם, המורכבים מתאי אדנוקרצינומה של המעי הגס Caco2 לחקר הביולוגיה של CSC. תאי Caco2 מעניינים במיוחד בשל יכולתם להבדיל לאורך זמן19,20, מאוד מציע פוטנציאל דמוי גזע. בהתאם לכך, תרבות ארוכת טווח של הכדורואידים חשפה את נוכחותן של אוכלוסיות CSC שונות עם תגובות שונות לכימותרפיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: הפרטים של כל ריאגנטים וחומרים מפורטים בטבלת החומרים.
1. היווצרות ספרואידית
- מדיית תרבות ספרואידית
- הכינו מדיום בזלי המורכב מ-DMEM בינוני הנשר שעבר שינוי של Dulbecco בתוספת 4 מ"מ L-אלניל-ל-גלוטמין דיפטיד.
- הכינו מדיום מלא של DMEM המכיל 10% סרום שור עוברי (FBS) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (עט/סטרפטומיצין) במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
- הכן מדיום מטריצת קרום DMEM/מרתף המכיל מטריצת קרום מרתף של 2.5%, FBS 10% ו- 1% עט/סטרפטוקוקוס במדיום בסיסי משלב 1.1.1.
- הכנת צלחות להיווצרות ספרואידית
- מטריצה חמה של בזל ו- DMEM / ממברנה במרתף בינונית בטמפרטורת החדר (RT) במשך כ -20 דקות.
- Pretreat בארות של צלחת 24-באר המוקדש היווצרות ספרואידים על ידי הוספת 500μL של פתרון נגד דבקות שטיפה לכל באר.
הערה: בצלחות אלה, כל באר מורכבת 1,200 microwells. - צנטריפוגה הצלחת ב 1,200 × גרם במשך 5 דקות רוטור דלי מתנדנד עם מתאמים עבור צלחות.
הערה: אם נעשה שימוש בצלחת אחת בלבד, הכינו צלחת סטנדרטית נוספת מלאה במים כדי לאזן את המשקל. - שוטפים כל באר עם 2 מ"ל של מדיום בזל חם, ושופטים את המדיום מהבארות.
- שים לב לצלחת מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי בועות הוסרו לחלוטין מן microwells. אם בועות להישאר לכודים, צנטריפוגה שוב ב 1,200 × g במשך 5 דקות כדי לחסל את הבועות.
- חזור על שלבי השטיפה 1.2.4-1.2.5.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף חם לכל באר.
- דור של ספרואידים
- לגדל את תאי Caco2 ב monolayer 2D במדיום DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% עט / סטרפטוקוקוס ב 37 °C (77 °F) באווירה לחה המכילה 5% CO2 (להלן נקרא 37 °C /5% CO2).
הערה: המספר המרבי של מעברי תאים לשימוש הוא 80. - כאשר מגיעים ל-80% מההתקהלות, שוטפים את התאים עם מלוחים עם אגירת פוספט (PBS) 1x (5 מ"ל לצלחת של 10 ס"מ), מוסיפים חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין (EDTA) (2 מ"ל למנה של 10 ס"מ), ומדגירה למשך 2-5 דקות ב-37°C/5%CO2.
- בדוק ניתוק תאים מתחת למיקרוסקופ, ולנטרל את טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של DMEM מדיום מלא לכל צלחת 10 ס"מ.
- ספירת תאים באמצעות המוציטרומטר כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים.
- צנטריפוגה השעיית התא ב 1,200 × g במשך 5 דקות. השלך את supernatant, ו resuspend גלולה בנפח המתאים של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף בינוני.
- עיין בטבלה 1 כדי לקבוע את מספר התאים הדרושים לבאר כדי להשיג את מספר התאים הרצוי לכל מיקרווול. לחלופין, חשב את מספר התאים באמצעות הנוסחה הבאה עבור צלחת של 24 בארות, בהתחשב בכך שכל באר מכילה 1,200 מיקרו-בתים
מספר תאים נדרש לבאר = מספר התאים הרצוי למיקרווול × 1,200 - הוסף את הנפח הנדרש של השעיית התא לכל באר כדי להשיג את מספר התא הרצוי בכרך סופי של 1 מ"ל.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף לכל באר כדי להגיע לנפח הסופי של 2 מ"ל לבאר (ראה גם שלב 1.2.7).
הערה: היזהר לא להכניס בועות לתוך microwells. - צנטריפוגה הצלחת מיד ב 1,200 × g במשך 5 דקות כדי ללכוד את התאים microwells. במידת הצורך, לאזן את הצנטריפוגה עם צלחת סטנדרטית מלאה במים.
- שים לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים מפוזרים באופן שווה בין המיקרווולים.
- דגירה את הצלחת ב 37 °C/5% CO2 עבור 48 שעות מבלי להפריע את הצלחת.
הערה: על פי הפרוטוקול המקורי21, למרות קווי תאים רבים יכולים ליצור ספרואידים בתוך 24 שעות, חלקם דורשים זמן דגירה ארוך יותר. בפרוטוקול זה, 48 שעות מספיקות להיווצרות ספרואידית.
- לגדל את תאי Caco2 ב monolayer 2D במדיום DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% עט / סטרפטוקוקוס ב 37 °C (77 °F) באווירה לחה המכילה 5% CO2 (להלן נקרא 37 °C /5% CO2).
- קצירת הכדורואידים מהמיקרווולים
- מחממים את מדיום מטריצת הבזל וה- DMEM / מרתף ב- RT למשך כ -20 דקות.
- באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר מחצית מדיום התרבות (1 מ"ל) מכל באר.
- מוסיפים את המדיום בחזרה אל פני השטח של הבאר כדי לעקור את הכדורואידים מהמיקרו-גלים.
הערה: אין לגעת או לתעתע את הכדורואידים. - מניחים מסננת הפיכה 37 מיקרומטר (או מסננת סטנדרטית 40 מיקרומטר) על גבי צינור חרוט 15 מ"ל כדי לאסוף את spheroids.
הערה: אם אתם משתמשים במסננת סטנדרטית של 40 מיקרומטר, הניחו אותה במהופך. - בעדינות לשאוף את spheroids נעקר (משלב 1.4.3), ולהעביר את ההשעיה ספרואידית דרך מסננת.
הערה: הכדורואידים יישארו על המסנן; תאים בודדים יזרמו דרך עם המדיום. - באמצעות פיפטה סרולוגית, לוותר 1 מ"ל של מדיום הבסיס חם על פני כל פני השטח של הבאר כדי לעקור את כל spheroids הנותרים לשחזר אותם על מסננת.
- חזור על שלב כביסה זה 1.4.6 פעמיים.
- שימו לב ללוח שמתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שכל הכדורואידים הוסרו מהמיקרווולים. חזור על הכביסה במידת הצורך (צעדים 1.4.6-1.4.7).
- להפוך את מסננת, ומניחים אותו על צינור חרוט חדש 15 מ"ל. לאסוף את spheroids על ידי שטיפת מסננת עם מדיום מטריצת קרום DMEM / מרתף.
הערה: הכדורואידים שנאספו מוכנים ליישומים וניתוחים במורד הזרם.
- תרבות ארוכת טווח של ספרואידים
- הכן 1.5% פתרון agarose במדיום בסיסי, לעקר אותו על ידי autoclaving (מחזור סטנדרטי).
- בעוד הפתרון agarose הוא חם ועדיין נוזלי, לציפוי בארות של צלחות תרבות סטנדרטיות או מנות, כמתואר בטבלה 2.
הערה: חימום המנה/צלחת בתנור יקל על שלב הציפוי. ניתן להשאיר כלים/ צלחות מצופים ב- RT עד 10 ימים בסביבה סטרילית ומוגנים מפני האור. - זרעו את הכדורואידים שנקטפו (משלב 1.4.9) בלוחות מצופים הארגרוז, והוסיפו מדיום מטריצת קרום DMEM/מרתף כדי להשיג את הנפח הסופי בהתאם לגודל הצלחת.
הערה: כדי למנוע אגרגטים ספרואידיים, זרע אותם בצפיפות אופטימלית של 22 ספרואידים / ס"מ2. שימו לב שהציפה אינה שטוחה לחלוטין, והיא עולה לכיוון הקצה, ויוצרת קהירות קלה במרכז הצלחת. אם מספר הכדורים גבוה מדי, סביר יותר שהם ידבקו זה בזה. - דגירה את הצלחת ב 37 °C/5% CO2 עד התאוששות של spheroids לניתוחים ספציפיים.
- טיפול בספרואידים עם תרופות כימותרפיות
- spheroids צלחת משלב 1.5.4, ולגדל אותם במשך 2 ימים. החל מהיום השלישי (D3), טפל בהם עם FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אירינוטקן, 100 מיקרוגרם/ מ"ל; Leucovorin, 25 מיקרוגרם / מ"ל) או עם FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אוקסליפלטין, 10 מיקרוגרם/ מ"ל; Leucovorin, 25 מיקרוגרם / מ"ל) שילובים משטר כימותרפי המשמשים באופן שגרתי לטיפול בחולי CRC22,23,24,25, או לשמור אותם במצב (שליטה) לא מטופל (NT).
- לאסוף את spheroids לאחר 3 ימים של טיפול באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך (1,000 קצה μL), להבטיח כי כל מצב מיוצג על ידי לפחות שלושה שכפולים. צנטריפוגה אותם ב 1,000 × g במשך 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
- לתקן את כדורי 2% paraformaldehyde (PFA) לניתוח היסטולוגי (ראה סעיף 3), או להשתמש כדורי עבור מיצוי RNA (ראה סעיף 4).
- כדי לנתח מוות של תאים, דגירה spheroids משלב 1.6.1 בתרבות השחורה גם צלחות DMEM / מרתף מטריצת מדיום במשך 30 דקות עם כתם חומצת גרעין (1:5000 דילול) שאינו מחלחל תאים חיים, אבל חודר את הקרומים בסכנה של תאים מתים26. למדוד את הצטברות של פלואורסצנטיות עם קורא microplate.
2. ניטור צמיחת ספרואידים
- באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לרכוש תמונות מייצגות של ספרואידים מתוחזקים בתנאים שונים לאורך כל הימים בתרבות.
- לנתח את התמונות על ידי מדידת שלושה קטרים נציג שונים של כל ספרואיד באמצעות תוכנה מתאימה.
- השתמש בנוסחה הבאה כדי להשיג את אמצעי האחסון המשוער.
הערה: המונחים d1, d2 ו- d3 הם שלושת הקוטרים של הכדורואיד.
3. שפעת אימונופלואורסצנטית (IF) וכתמים היסטולוגיים
- קיבוע והטבעת פרפין
- לאסוף את spheroids בנקודות זמן נבחרות באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך כמתואר בשלב 1.6.2, ולתקן אותם במשך 30 דקות ב RT ב 2% PFA.
הערה: לחלופין, לאחסן את הדגימות בשלב זה ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. - להטמעת פרפין, לשטוף את spheroids 3x עם PBS 1x, ו resuspend אותם 70% אתנול. לאחר הכללה וניתוח של פרפין, בצע כתמי המטוקסילין (H&E) לניתוח היסטולוגי.
- לאסוף את spheroids בנקודות זמן נבחרות באמצעות פיפטה עם קצה לחתוך כמתואר בשלב 1.6.2, ולתקן אותם במשך 30 דקות ב RT ב 2% PFA.
- אימונולה של סעיפי פרפין
הערה: השתמש בקטעים בעובי 5 מיקרומטר לחיסון עקיף.- דגירה שקופיות ב 60 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות כדי להמיס את השעווה ולשפר deparaffinization.
- לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 3 דקות במתילציקלוהקסאן.
- לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 1:1 מתילציקלוהקסאן:100% אתנול.
- לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 3 דקות ב 100% אתנול.
הערה: בצע את כל המניפולציות עבור שלב 3.2.2 לשלב 3.2.4 במכסה המנוע הכימי. - לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 90% אתנול.
- לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 75% אתנול.
- לשטוף את השקופיות במשך 3 דקות ב 50% אתנול.
- לשטוף את המגלשות תחת מי ברז.
- מחזרים את המגלשות במים מזוקקים במשך 5 דקות.
- הכן 700 מ"ל של 0.01 M מאגר ציטראט, pH 6.0, ולהוסיף אותו מיכל מתאים (רוחב: 11.5 ס"מ, אורך: 17 ס"מ, גובה: 7 ס"מ); שקוע את השקופיות בתוכו. מחממים את המיכל במיקרוגל במשך 9-10 דקות ב 700 W, וכאשר הרתיחה מתחילה, להקטין את הכוח ל 400-450 W. דגירה במשך 10 דקות נוספות.
- תן לשקופיות להתקרר במאגר ל- RT למשך כ- 30-40 דקות.
- לשטוף את השקופיות פעמיים PBS במשך 5 דקות.
- צייר עיגול סביב המקטעים באמצעות עט סימון כדי ליצור מחסום לנוזלים המוחלים על המקטעים.
- דגירה כל קטע עם 50 μL של חיץ חסימה (10% סרום עזים רגיל, 1% אלבומין סרום שור (BSA), ו 0.02% טריטון X-100 ב PBS) לפחות 30 דקות ב RT.
- הסר את מאגר החסימה, והוסף 50 μL של נוגדנים ראשוניים מדוללים במאגר הדגירה (1% סרום עזים רגיל, 0.1% BSA ו- 0.02% טריטון X-100 ב- PBS). דגירה במשך 2 שעות ב RT או לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את הנוגדנים העיקריים, ולשטוף את השקופיות 3x ב PBS במשך 5 דקות.
- דגירה שקופיות עם 50 μL של נוגדנים משניים פלואורסצנטי מדולל במאגר הדגירה במשך 1 שעות ב RT.
- הסר את הנוגדנים המשניים, ולשטוף את השקופיות 3x ב PBS במשך 5 דקות.
- הוסף 50 μL של מדיום הרכבה עם 4′,6-diamidino-2-פנילינדול לכל קטע, ומניחים כיסוי זכוכית על החלק.
4. מיצוי RNA, תגובת שרשרת שעתוק פולימראז הפוכה (RT-PCR), ו RT-PCR כמותי (qRT-PCR)
- לאסוף ספרואידים בנקודות זמן שונות, כל נקודה המיוצגת על ידי לפחות שלושה שכפולים. צנטריפוגה אותם ב 1,000 × g במשך 3 דקות, ולאחר מכן להסיר את supernatant.
הערה: כדורי יכול לשמש ישירות עבור מיצוי RNA או מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. - לבודד את ה-RNA הכולל באמצעות ערכת בידוד RNA מסחרית, על פי הוראות היצרן.
- תעתיק לאחור 500 ng של כל דגימת RNA לתוך DNA משלים (cDNA) עם ערכה מסחרית על פי הוראות היצרן.
- לאחר שעתוק הפוך, לבצע ניתוח PCR על 1 μL של cDNA כדי להגביר את גן משק הבית עם פריימרים הממוקמים exons שונים.
הערה: שלב זה מאפשר אימות של היעדר כל זיהום DNA גנומי בהכנות RNA. עבור פרוטוקול זה, פפטידיל רוליל isomerase B(PPIB) פריימרים שימשו. - בצע הגברה qPCR על 4 μL של cDNA מדולל בעבר (1:10 במים מזוקקים כפולים ללא RNAse) באמצעות פריימרים ספציפיים עבור הגנים של עניין. בכל מדגם, לכמת ביטוי mRNA ספציפי באמצעות שיטת ΔΔCt וערכים מנורמלים נגד רמות גנים משק בית.
הערה: עבור פרוטוקול זה, נבחר β-actin (ACTB). פריימנים המשמשים בפרוטוקול זה מפורטים בטבלה 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כמו חוסר הומוגניות בגודל של ספרואידים הוא אחד החסרונות העיקריים של מערכות תרבות 3D ספירואיד זמין כיום13, המטרה של עבודה זו הייתה להקים פרוטוקול אמין לשחזור כדי להשיג כדוריות הומוגניות. ראשית, כדי לקבוע תנאי עבודה אידיאליים, נבדקו מספר שונה של תאי Caco2, הנעים בין 50 ל-2,000 תאים למיקרווול/ספרואיד באמצעות לוחות ייעודיים(טבלה 1). למעשה, כל באר בלוחות אלה מכילה 1,200 מיקרו-בתים, מה שמאפשר היווצרות של אותו מספר של ספרואידים לבאר, וחשוב מכך, היווצרות של ספרואיד אחד לכל מיקרווול21. לאחר יומיים של תרבות, הבארות המכילות 2,000 תאים לספרואיד גדלו כמונולאייר, ו-50 תאים לספרואיד הולידו ספרואידים קטנים ולא הומוגניים(איור 1A). שני תנאים אלה לא נכללו אפוא בניתוחים נוספים. כדי ליצור תרבויות ארוכות טווח, ספרואידים נקצרו מן המיקרווולים וזרעו בתנאים שאינם עמידים בלוחות מצופים agarose שהוכנו טרי. צמיחה ספרואידית היה אז במעקב לאורך כל זמן הניסיון כמובן על ידי מדידת השינוי בנפח. אם ניקח בחשבון את הצורה הלא כדורית, נמדדו שלושה קטרים שונים של כל ספרואיד, ונוסחת עוצמת הקול הוחלה27 (איור 1B). ספירואידים שנוצרו מ-100 ו-200 תאים שמרו על גודלם הראשוני לאורך כל הניסוי, ואילו אלה המכילים 1,000 תאים התפוררו במהלך הקציר בשל גודלם הגדול, וכתוצאה מכך הציגו שונות רבה יותר בנפחם. לכן, כמו spheroids הנובעים 500 תאים הראו את הגידול ההומוגני ביותר בגודל על פני זמן הניסיון כמובן, מספר זה של תאים שימש להיווצרות ספרואיד.
שנית, מלבד 500 תאים לכל ספרואיד, נחקרו מספרי תאים נוספים הנעים בין 300 ל-800 תאים. יתר על כן, כדי לשפר את התנאים שאינם עמידים, הפרוטוקול המקורי שונה על ידי טיפול מראש בארות פעמיים במקום להחיל רק לשטוף אחד. שיפור בהומוגניות הספרואידית ובדחיסה נצפה בשינויים אלה (איור 2A). גודל הספרואידים בכל תנאי נמדד בזמן הקציר (איור 2B), וצמיחתם ארוכת הטווח נוטרה לאורך כל הימים בתרבות במנות מצופות אגרוז (איור 2C). בהתבסס על התוצאות, 500 ו 600 תאים / ספרואיד אושרו כתנאים אופטימליים המניבים צמיחה טובה ושונות נמוכה. בשל פרופיל הצמיחה ההומוגני יותר לאורך כל מסלול הזמן הניסיוני והמבנים הקומפקטיים שנוצרו, 600 תאים לספרואיד נבחרו כמספר התא לניסויים הבאים. לבסוף, כדי לשפר עוד יותר את הפרוטוקול, מדיום שלם DMEM היה בתוספת 2.5% של מטריצת קרום המרתף, אשר מכיל גורמי גדילה נוספים פאנל גדול של חלבוני מטריצה חוץ תאיים28. אכן, הצורה הרב-לשונית של הכדורידים יכולה להיות בגלל היעדר אותות מהמיקרו-וירוס שאולי השפיעו על קיטוב התאים29,30. התוספת של מטריצת קרום מרתף שיפרה את צמיחת הספרואיד ושיפרה את ההומוגניות שלהם (איור 2D). דוגמה לשיפור זה ניתן לראות עבור 500 תאים לכל ספרואיד. בהיעדר מטריצת קרום המרתף(איור 1B),גודל הספרואידים היה הטרוגני יותר, הכפיל את עצמו מ-D3 ל-D7 ואז הגיע לרמה. עם זאת, בנוכחות מטריצת קרום המרתף (איור 2C), גודל הספרואידים בכל נקודת זמן היה הומוגני יותר, וגדל באופן פרופורציונלי עם הזמן.
כדי לנתח תכונות ארוכות טווח של הכדורואידים, הם נמצאו בנקודות זמן שונות לאחר התרבות במנות מצופות אגרוז לניתוחים היסטולוגיים מפורטים ו- IF על קטעי פרפין. כתמי H&E הראו כי תאים בתוך הכדורידים עברו שינויים בארגון ובצורה שלהם לאורך זמן. ואכן, התאים היו מסודרים בצפיפות רב שכבתית ב D3, בעוד תאים שטוחים מסודרים monolayers היו גלויים בבירור ב D10. מעניין, כפי שעולה מהקווים המנוקדים השחורים בתמונות, לומן הופיע בתוך הספרואידים מ-D5 ואילך(איור 3). במקביל, התפשטות תאים ואפופטוזיס נותחו על ידי IF באמצעות סמן התפשטות, אנטיגן גרעיני של תאים מתרבים (PCNA), ואת סמן המוות של התא, מופעל caspase 3. תיוג עבור PCNA גילה כי תאים מתרבים היו נוכחים לעתים קרובות על פני השטח החיצוניים של spheroids, לפעמים במבנים דמויי קריפטה או ניצן מזכיר תרבויות אורגנואידים15. בנוסף, נצפתה עלייה ברורה בתאים חיוביים ל-PCNA ב-D5 וב-D7 שירדו ב-D10(איור 4,לוחות שמאליים). באופן מפתיע, Caspase מופעל 3 נצפתה בתאים מעטים מאוד בספרואידים הן ב- D3 והן ב- D5(איור 4,לוחות שמאליים) ועל פני פרקי זמן ארוכים יותר (נתונים שאינם מוצגים). תבנית הביטוי של β-קטנין הוערכה גם במקטעי פרפין. באופן מעניין, בכל נקודת זמן נצפו רמות גבוהות של ביטוי β-קטנין עם כתמים ברורים הקשורים לקרום וציטופלסמי(איור 4,לוחות ימניים). ראוי לציין כי קרום מאוגד β-קטנין משתתף הידבקות תאים על ידי קשירה E-cadherin31. רמה גבוהה של תיוג ß-קטנין נרשמה באשכולות של תאים בכל נקודות הזמן. במקרים מסוימים, התאים הציגו גם לוקליזציה גרעינית ברורה של ß-catenin (איור 4, לוחות ימניים). תאי Caco2 ידועים להבדיל במבחנה ב 2D בעיקר לתוך enterocytes19,32. עם זאת, הביטוי של סמני בידול, כגון כרומוגרנין A (תאים enteroendocrine), lysozyme (תאים Paneth) או mucin 2 (MUC 2, תאי גביע), היה בלתי ניתן לגילוי בספרואידים אלה על ידי IF (נתונים לא מוצגים). עם זאת, הפוטנציאל להבדיל לאנטרוציטים אושר, בהתחשב בכך שהספרואידים הביעו ALPI (פוספטאז אלקליין) ומשפחת נשאים מסיסים 2, גרסת תעתיק 2 (SLC2A5)/טרנספורטר גלוקוז 5 (GLUT5) mRNAs (איור 5). רמות mRNA אלה עלו ב D5 ו- D7, אבל ההבדל לא היה משמעותי (ALPI) או רק משמעותי שולית (SLC2A5) בהשוואה לרמות ב D3.
במטרה הסופית של הגדרת אם spheroids שנוצר ותרבית מבוסס על שיטה חדשה זו הם כלי אמין ללמוד CSCs, הביטוי של סמני CSC נותח על ידי IF ו qRT-PCR. CD133 ו CD44 מאפיינים אוכלוסיות תאים סרטניים כולל CSCs7,33,34 והם באים לידי ביטוי גם על ידי SCs במעי הרגיל המעי הגס33,34,35. אשכולות של תאים CD133 חיוביים היו מקומיים בעיקר על פני השטח החיצוניים של הספרואידים בכל נקודת זמן(איור 6A, לוחות שמאליים). תאים CD44 חיוביים היו פחות תכופים, אך תמיד היו קשורים לתאים CD133 חיוביים(איור 6A, לוחות ימניים), המציין את קיומה של אוכלוסייה של תאים דמויי CSC CD133/CD44 חיוביים כפולים ואוכלוסייה המבטאת רק CD133. אולפופומדין 4 (OLFM4) ומוסאשי 1 (MSI1) נבדקו כסמני SC/CSC; סמנים אלה באים לידי ביטוי באופן מוגבל מאוד בקריפטות המעי הגס36,37 וגם באוכלוסיות תאים שונות35,38. רק תאים חיוביים מעטים של MSI1 נצפו בכל נקודת זמן (איור 7), בעוד ש- OLFM4 נותר בלתי ניתן לגילוי (נתונים לא מוצגים). עם זאת, כפי שנצפה עבור CD44 ו- CD133, תאים עם תווית MSI1 היו ממוקמים על פני השטח החיצוניים של הכדורידים במבנים דמויי קריפטה או ניצן. אותם סמנים נותחו גם ברמת ה-mRNA באותן נקודות זמן לאחר התרבות במנות מצופות אגרוז. אלדהיד דהידרוגנאז 1 (ALDH1a1), סמן מאופיין היטב של CSCs39,40, נכלל גם הוא במחקר (איור 8). הניתוח של prominin-1 (קידוד PROM1 עבור CD133) ו CD44 mRNAs אישר את הביטוי של שני סמנים בספרואידים בכל נקודות הזמן מנותח. ראוי לציין, עם זאת, בעוד PROM1 mRNA רמות היו די דומות לאורך זמן בתרבות, רמות CD44 ירד מ D3 ואילך. ההבדל, לעומת זאת, היה משמעותי רק באופן שולי כאשר משווים את רמות mRNA של D10 ו- D3.
הניתוח של MSI1 mRNA אישר את ביטויו בספרואידים בכל נקודת זמן, עם רמות גבוהות משמעותית ב- D3 ו- D5 בהשוואה לאלה ב- D7 או D10 (איור 8), ואילו OLFM4 mRNA לא היה ניתן לגילוי (לא מוצג). לבסוף, ALDH1a1 mRNA בא לידי ביטוי בספרואידים בכל נקודת זמן והראה פרופיל ביטוי שירד ב- D10, הרמות היו משמעותיות רק באופן שולי בהשוואה לאלה ב- D3 (איור 8). כדי לאמת את ההתאמה של המודל החדש לחקר ביולוגיה של תאים סרטניים, התגובה לכימותרפיה נותחה בספרואידים שטופלו ב- FOLFOX או FOLFIRI, טיפולים משולבים הניתנים באופן שגרתי לחולי CRC22,23,24,25. ראשית, היעילות של הטיפולים בגרימת מוות של תאים נבדקה על ידי דגירה של הספרואידים עם כתם חומצת גרעין פלואורסצנטי שנכנס במיוחד לתאים מתים26. בהשוואה למצב הבקרה של NT, הטיפול בכל אחת מהתרופות גרם למוות תאי משמעותי הנמדד על ידי הצטברות הפלואורסצנטיות (איור 9A). תצפית זו אושרה גם ברמה המורפולוגית באמצעות מיקרוסקופיה חיה, שהראתה כי הטיפולים השפיעו מאוד על גודלם ועל המראה של הספרואידים(איור 9B). לבסוף, הביטוי של סמני SC/CSC נותח על ידי qRT-PCR בספרואידים באותם תנאים (איור 9C). באופן מסקרן, ירידה משמעותית ברמות ה-MRNA של PROM1 הן בתנאי FOLFOX והן בתנאי FOLFIRI נצפתה בהשוואה לרמות הבקרה, בעוד שרמות MSI1 לא הושפעו מהטיפולים. יתר על כן, בעוד FOLFOX לא היתה השפעה על ביטוי ALDH1a1 mRNA בהשוואה לבקרה, הטיפול עם FOLFIRI הגדיל באופן משמעותי את רמותיו. OLFM4 mRNA לא זוהה, ורמות ה- MRNA של CD44 היו נמוכות ביותר (הנתונים לא הוצגו).
איור 1: הגדרת תרבויות ספרואידיות. (A)היווצרות ספרואידית יזם מן הריכוזים המצוינים של תאי Caco2 per ספרואיד / microwell. הפאנל העליון מציג תמונה מייצגת של צלחת תרבות שלמה לאחר יומיים של תרבות. החלונית התחתונה מציגה תמונות של מיקרו-בתים שנבחרו לכל תנאי. תמונות צולמו בהגדלה 4x (גודל מיקרווול: 400 מיקרומטר). סרגלי קנה מידה: הגדלה נמוכה, 100 מיקרומטר; הגדלה גבוהה, 30 מיקרומטר. (B) מאפייני הצמיחה של הכדורואידים שנוצרו ממספר שונה של תאים למיקרווול ונותחו בנקודות זמן שונות. שים לב כי הימים שצוינו כוללים את שני הימים הראשונים של התרבות במיקרווולים ואת התרבות הבאה של הכדורואידים שנקטפו בצלחות מצופות אגרוז. היסטוגרמות מראות ממוצע ± סטיית תקן, n = 4–6. עיגולים שחורים מציגים את הערכים עבור ספירואידים בודדים. הנוסחה עבור הנפח המשוער מוצגת בחלק העליון של הלוח, כאשר d1, d2 ו- d3 מציינים את שלושת הקוטרים הנמדדים עבור כל ספרואיד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: אופטימיזציה של התנאים להיווצרות ותרבות ספרואידית. (A)תמונות מייצגות של ספרואידים ב D7 לאחר החלמתם מן microwells (2 ימים) ותרבות מנות מצופות agarose (5 ימים), באמצעות הכנת היטב חדשה ותרבות תנאים בינוניים. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר. (B)נפח משוער של ספרואידים שנקטפו טרי יומיים לאחר תחילת תרבות התא במיקרווולים. היסטוגרמות מראות ממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 4–6. עיגולים שחורים מציינים את גודל הכדורואידים הבודדים. (ג)נפח משוער של הכדורואידים בתרבות ארוכת הטווח בהתבסס על התנאים החדשים שנבחרו. גרפים מראים את מאפייני הצמיחה של הכדורואידים הנוצרים ממספר שונה של תאים לספרואיד ומנותחים בנקודות זמן שונות לאחר הקציר שלהם, כפי שצוין. היסטוגרמות מראות ממוצע ± SD, n = 6-10. עיגולים שחורים מציינים את גודל הכדורואידים הבודדים. (ד)תמונות מייצגות של 600 התאים שנבחרו לכל מצב ספרואידי לאורך זמן הניסיוני (לוחות ימניים) ובתוך המיקרו-וולים (פאנל שמאלי). תמונות צולמו בהגדלה פי 4. סרגלי קנה מידה: הגדלה נמוכה, 100 מיקרומטר; הגדלה גבוהה, 30 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: אפיון היסטולוגי של הספרואידים. המטוקסילין היסטולוגי ואאוסין (H&E) מכתימים מקטעי פרפין. תמונות מייצגות של ספרואידים בנקודות הזמן שצוינו לאחר הקציר, כפי שצוין. קווים מנוקדים שחורים בכל קבוצה של הגדלה גבוהה מפרידים את הלומן בתוך הכדורואידים. סרגלי קנה מידה: הגדלה נמוכה, 30 מיקרומטר; הגדלה גבוהה, 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפיון ספרואידי של Caco2 על ידי אימונולאבלינג. Immunostaining של spheroids עבור סמן התפשטות, אנטיגן גרעיני תא מתרבה (PCNA, אדום), וסמן מוות של תאים, מופעל caspase 3 (ירוק) (לוחות שמאל) ועל β קטנין (אדום) (לוחות ימניים) בזמנים שצוינו. תמונות מציגות תיוג ממוזג של PCNA (אדום), כספית פעילה 3 (ירוק) וגרעינים (כחולים) או של β-קטנין (אדום) וגרעינים (כחול). חצים לבנים מצביעים על תאים או קבוצות של תאים המבטאים רמות גבוהות של β קטנין. תמונות צולמו עם מטרה 20x. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: ניתוח סמני בידול enterocyte לפי qRT-PCR. ניתוח של ALPI ו- SLC2A5 קידוד פוספטאז אלקליין וחלבוני GLUT5, בהתאמה. היסטוגרמות מראות ממוצע ± סטיית תקן, n = 3, לאחר נורמליזציה נגד ACTB. הנתונים מיוצגים כשינוי קיפול ביחס לרירית המעי הגס הרגילה (קו אדום = 1). NS: לא משמעותי; טרשת נפוצה: משמעותית באופן שולי בהשוואה ל-D3 על ידי מבחן t-testשל סטודנט לא מנושל. קיצורים: qRT-PCR = תגובת שרשרת שעתוק הפוך כמותית-פולימראז; GLUT5 = טרנספורטר גלוקוז 5; SLC2A5 = משפחת נשאים מסיסים 2, גרסת תעתיק 2; ACTB = β-אקטין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: ביטוי הטרוגניים של סמני תאי גזע,CD44 ו- CD133, בספרואידים. חיסון עבור סמני תאי הגזע, CD133 ו- CD44, בזמנים שצוינו. תמונות בלוחות השמאליים מציגות תיוג ממוזג של CD133 (ירוק) וגרעינים (כחול); אותן תמונות בלוחות הימניים מציגות תיוג ממוזג של CD44 (אדום) וגרעינים (כחול). חצים ירוקים בלוחות השמאליים מצביעים על תאים המבטאים CD133, וחצים לבנים בשני הלוחות מצביעים על תאים או קבוצות תאים המבטאים CD44 ו- CD133. תמונות נרכשו עם מטרה 20x. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ביטוי הטרוגניים של סמן תאי גזע, MSI1, בספרואידים. חיסון עבור סמן תא הגזע MSI1 (אדום) בזמנים שצוינו. תמונות מציגות תיוג ממוזג של MSI1 (אדום) וגרעינים (כחול). קווים מנוקדים לבנים מדגישים כמה מבנים דמויי קריפטה שבהם התאים חיוביים עבור immunolabeling MSI1. תמונות צולמו בהגדלה של פי 20. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. קיצור = MSI1 = מוסאשי 1. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: ניתוח סמני תאי גזע לפי qRT-PCR. כימות של PROM1, CD44, MSI1, ו ALDH1a1 רמות בוצע על mRNA מן ספרואידים בזמנים שצוינו. היסטוגרמות מראות ממוצע ± סטיית תקן, n = 3, לאחר נורמליזציה נגד ACTB. הנתונים מיוצגים כשינוי קיפול ביחס לרירית המעי הגס הרגילה (קו אדום = 1). NS: לא משמעותי; טרשת נפוצה: משמעותית באופן שולי בהשוואה ל- D3, באמצעות מבחן tשל סטודנט לא משויווה. *: P < 0.05 בהשוואה ל-D3 או D5, באמצעות מבחן tשל סטודנט שלא נצפה. קיצורים: qRT-PCR = תגובת שרשרת שעתוק הפוך כמותית-פולימראז; PROM1 = בולטן-1; MSI1 = מוסאשי 1; ALDH1α1 = אלדהיד דהידרוגנאז 1 אלפא; ACTB = β-אקטין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 9: השפעת כימותרפיה על ספרואידים. לאחר הקציר מן microwells, spheroids היו מתורבתים בצלחות מצופות agarose וטופלו במשך 3 ימים עם FOLFOX או FOLFIRI או נשמרו במצב (שליטה) לא מטופל (NT). (A) ניתוח של פלואורסצנטיות עקב תיוג של חומצת גרעין בתאים מתים. היסטוגרמות מראות ממוצע ± סטיית תקן (SD), n = 4. (B)מאפיינים מורפולוגיים של הכדורואידים המתוחזקים בתנאי התרבות השונים. תמונות צולמו עם מטרה 4x. סרגל קנה מידה: 400 מיקרומטר. (C)כימות של PROM1, MSI1, ו ALDH1a1 mRNAs על ידי qRT-PCR. היסטוגרמות להראות ממוצע ± SD, n = 4, לאחר נורמליזציה נגד ACTB. *: NS: לא משמעותי; P < 0.05; **: P < 0.01; P < 0.001 בהשוואה למצב הפקד (NT), באמצעות מבחן tשל סטודנט שאינו משויווה. קיצורים: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אוקסליפלטין, 10 מיקרוגרם/ מ"ל; לאוקובורין, 25 מיקרוגרם / מ"ל ; FOLFIRI = 5-פלואוראציל, 50 מיקרוגרם / מ"ל; אירינוטקן, 100 מיקרוגרם/ מ"ל; לוקובורין, 25 מיקרוגרם/ מ"ל; qRT-PCR = תגובת שרשרת שעתוק הפוכה כמותית-פולימראז; PROM1 = בולטן-1; MSI1 = מוסאשי 1; ALDH1α1 = אלדהיד דהידרוגנאז 1 אלפא; ACTB = β-אקטין. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| מספר התאים הרצוי לכל ספרואיד | מספר תאים נדרש לבאר |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1.2 x 105 |
| 200 | 2.4 x 105 |
| 300 | 3.6 x 105 |
| 400 | 4.8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7.2 x 105 |
| 700 | 8.4 x 105 |
| 800 | 9.6 x 105 |
| 1000 | 1.2 x 106 |
| 2000 | 2.4 x 106 |
טבלה 1: סיכום היווצרות ספרואידים וזריעת תאים.
| מנות 10 מ"מ | צלחות 6 באר | צלחות 12 באר | צלחות 24 באר | צלחות 96 באר | |
| נפח ציפוי | 4 מ"ל | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (למטה &) |
טבלה 2: כמויות של פתרון agarose לציפוי של צלחות / מנות שונות.
| גנים | פריימטרים | רצף | אורך מוצר | |
| סמני בידול | ALPI | קדימה | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| הפוך | ATG TTG איסור פרסום ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | קדימה | TAC CCA טק TGG AAG גת GA | 94 | |
| הפוך | AAC AGG ATC אגה GCA TGA AG | |||
| סמני תאי גזע | ALDH1a1 | קדימה | GCC TTC ACA GGA TCA ACA איסור פרסום | 147 |
| הפוך | TGC AAA TTC AAC AGC ATT GTC | |||
| MSI1 | קדימה | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| הפוך | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | קדימה | GTA אגא ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| הפוך | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | קדימה | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| הפוך | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | קדימה | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| הפוך | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| גנים של משק בית | ACTB | קדימה | CAC חתול TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| הפוך | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB (PPIB) | קדימה | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| הפוך | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
טבלה 3: פריימרים המשמשים לתגובת שרשרת כמותית הפוכה של שעתוק-פולימראז.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אין ויטרו מודלים 3D להתגבר על החסרונות הניסיוניים העיקריים של תרביות תאים סרטניים 2D, כפי שהם נראים אמינים יותר recapitulating תכונות גידול טיפוסי כולל microenvironment והטרוגניות התא. מודלים תלת-ממדיים נפוצים של ספרואידים הם נטולי פיגומים (בתרבית בתנאים של התקשרות נמוכה) או מבוססי פיגומים (שימוש בביו-חומרים לתאי תרבות). שיטות אלה מציגות חסרונות שונים כפי שהם תלויים באופי הפיגום המשמש או להוליד spheroids כי הם משתנים במבנה ובגודל.
הפרוטוקול הנוכחי מדווח על תנאים ממוטבים לייצור ספרואידים הומוגניים מקו התא אדנוקרצינומה המעי הגס, Caco2, באמצעות שיטה ללא פיגומים. spheroids נקצרים בקלות ובניגוד למחקר שדווח בעבר41, הם גדלים בהצלחה ומאפייני הצמיחה שלהם במהלך הזמן בתרבות ניתן גם לנתח. יתר על כן, בשיטה חדשה זו, הספרואידים (א) מתרבים באופן פעיל, (ב) מציגים שיעור נמוך מאוד של מוות תאי, (ג) להתארגן כדי ליצור לומן בתוך הספירות, ו (ד) להפגין יכולת בידול של התאים המרכיבים. בהתחשב בכך שהמטרה הסופית של הגישה החדשה הייתה השימוש שלה במחקרים על ביולוגיה של CSC, הביטוי של סמנים שונים של CSCs נותח. באופן מעניין, הסמנים הציגו תבנית ביטוי דינמית בהתאם לנקודת הזמן והגדירו אוכלוסיות CSC שונות.
בעל חשיבות עליונה, spheroids שנוצר באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח תרופות רלוונטיות עבור יישומים קליניים כגון משטרים כימותרפיים, FOLFOX ו FOLFIRI. התוצאות גם להדגיש תגובה הטרוגנית של תאים לתרופות בהתאם סמן CSC ניתח. תצפית זו עולה בקנה אחד עם ההשקפה הנוכחית כי אוכלוסיות תאים הטרוגניות ומרובות דמויות CSC בתוך גידולים מציגות תכונות כימוזסיביות / chemoresistance מגוונות42,43. ממצא זה מחזק מאוד את הישימות של שיטה חדשה זו לסינון בקנה מידה גדול. בנוסף ליישומים המדווחים במחקר זה, הפרוטוקול החדש יכול לשמש גם למגוון רחב יותר של ניתוחים (למשל, מיצוי RNA ו/או DNA וניתוחים בקנה מידה גדול, כתמים מערביים, ו immunofluorescence). ואכן, נפח הספרואידים ומאפייני הצמיחה ניתן לקבוע בקלות על ידי החלת נוסחת נפח הכדור אשר, במידת הצורך, גם לוקח בחשבון קטרים שונים כדי לאזן סטיות צורה כדורית לחלוטין. עם זאת, יש למטב פרמטרים ספציפיים בהתאם לסוג התא (קו תא או תרבויות ראשיות חדשות) ולקיבולת צמיחה כגון זמן השכפול. עם זאת, הפרוטוקול מציין צעדים קריטיים שניתן להתאים בקלות.
כמה נקודות של דאגה צריך להילקח בחשבון בעת ביצוע דור ספרואיד המתואר במאמר זה. ראשית, יש לבצע מספר שלבי כביסה עם פתרון השטיפה נגד הדבקות כדי לקדם את ההומוגניות והדחיסה של הספירות. במקרה זה, שתי שטיפות היו נחוצות. שנית, בועות יש להסיר מן microwells כמו זה יכול להפריע היווצרות נכונה של spheroids. שלישית, ברגע שהתאים נזרעים בכל מיקרווול לאחר שלב הצנטריפוגה, הצלחת חייבת להישאר ללא הפרעה במשך יומיים. שיקולים נוספים ושינויים בפרוטוקול נדרשים בעת לימוד השלבים המוקדמים של היווצרות ספרואידית, אולי כולל מערכת הדמיה והדמיה אוטומטית. רביעית, שינוי המדיום מבלי להפריע לספירואידים, בהתחשב בכך שהם בהשעיה, יכול להיות מאתגר. לפיכך, מומלץ לשנות רק חצי מנפח בכל פעם. חמישית, בעת קצירת הכדורואידים, חשוב לשמר את המבנה שלהם. לפיכך, השימוש פיפטות סרולוגיות או micropipettes עם טיפים לחתוך מומלץ עבור כל השלבים מחלק לאחר שטיפה בינונית המכילה סרום או PBS כדי למנוע את spheroids לדבוק טיפים.
ייתכן שתיתקל במגבלות מסוימות גם בעת שימוש בפרוטוקול זה. ראשית, לא לכל קווי התאים או סוגי התאים יש אותם פרמטרי תרבות; במקרים מסוימים, הטרוגניות התא ומספר המעברים / הזדקנות של תאים עשויים להשפיע גם על היכולת ליצור ספרואידים. שנית, בניגוד לאורגנואידים, זה עלול להיות קשה לשמור על ספרואידים במשך זמן רב מאוד בתרבות. בנוסף, הם לא יכולים להיות משוכפלים על ידי פיצול פשוט באמצעות טיפ micropipette15. שלישית, פרוטוקול זה לא יכול להיות מותאם לניתוח ספירואיד יחיד כי באופן ידני התאוששות spheroids אחד אחד יכול להיות מסובך. טכניקה זו מתאימה יותר להשגת כמויות גבוהות של ספרואידים הומוגניים בו זמנית. לבסוף, עבור מחקרים החוקרים את ההשפעות של גורמי גדילה שמקורם בסוגי תאים אחרים או מנתחים את החשיבות של microenvironment, חשוב להעשיר את המודל ולבצע ניסויים בתרבות משותפת.
לסיכום, המתודולוגיה הנוכחית מתארת פרוטוקול חדש לייצור יעיל ותרבות spheroids מתאי Caco2. התוצאות מראות כי שיטה זו יכולה להיות מיושמת על המחקר של הטרוגניות הגידול לניתוח של CSCs. שיטה זו יכולה לשמש גם להקרנת תרופות בתפוקה גבוהה ולחקר ביולוגיה של תאי גזע בתאים סרטניים ולא סרטניים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף
Acknowledgments
אנו מכירים בפלטפורמות ההדמיה וההיסטולוגיה של אניפת רצ'ה (CRCL, CLB). אנו חייבים לבית המרקחת של בית החולים סנטר לאון ברארד (CLB) עבור המתנה האדיבה של FOLFOX ו FOLFIRI. אנו מודים גם לבריג'יט מנשיפ על הקריאה הביקורתית של כתב היד. העבודה נתמכה על ידי FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) ועל ידי האינקה (PLBIO19-289). MVG ו- LC קיבלו תמיכה מה- FRM ו- CF שקיבלו תמיכה מקרן ARC ומהמרכז לאון ברארד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
