Summary
Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.
Abstract
Darmkrebs ist durch Heterogenität und eine hierarchische Organisation gekennzeichnet, die eine Population von Krebsstammzellen (CSCs) umfasst, die für die Tumorentwicklung, -erhaltung und -resistenz gegen Medikamente verantwortlich sind. Ein besseres Verständnis der CSC-Eigenschaften für ihre spezifische Ausrichtung ist daher eine Voraussetzung für eine effektive Therapie. Es gibt jedoch einen Mangel an geeigneten präklinischen Modellen für eingehende Untersuchungen. Obwohl in vitro zweidimensionale (2D) Krebszelllinien wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie liefern, replizieren sie die phänotypische und genetische Tumorheterogenität nicht. Im Gegensatz dazu adressieren und reproduzieren dreidimensionale (3D) Modelle die nahe physiologische Krebskomplexität und Zellheterogenität. Ziel dieser Arbeit war es, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem zu entwerfen, um CSC-Biologie zu studieren. Die vorliegende Methodik beschreibt die Entwicklung und Optimierung von Bedingungen zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden, die homogen in der Größe sind, aus Caco2-Kolon-Adenokarzinomzellen, einem Modell, das für die langfristige Kultur verwendet werden kann. Wichtig ist, dass innerhalb der Sphäroide die Zellen, die um lumenartige Strukturen organisiert waren, durch differentiale Zellproliferationsmuster und durch das Vorhandensein von CSCs gekennzeichnet waren, die ein Panel von Markern ausdrückten. Diese Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses 3D-Ansatzes zur Untersuchung der Zellheterogenität und CSC-Biologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.
Introduction
Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor die zweithäufigste Ursache für krebsassoziierte Todesfälle weltweit1. Die Entwicklung von SCRC ist das Ergebnis einer fortschreitenden Erfassung und Akkumulation genetischer Mutationen und/oder epigenetischer Veränderungen2,3, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen3,4. Darüber hinaus können nichtgenetische Faktoren (z. B. die Mikroumgebung) zur onkogenen Transformation beitragen und diese fördern und somit an der Entwicklung der SFB5teilnehmen. Wichtig ist, dass CRCs aus verschiedenen Zellpopulationen bestehen, einschließlich undifferenzierter CSCs und Massentumorzellen, die einige Differenzierungsmerkmale aufweisen, die eine hierarchische Struktur darstellen, die an die Organisation des Epithels in einer normalen Doppelpunktkryptaerinnert 6,7.
CSCs gelten als verantwortlich für Tumor aussehen8, seine Wartung und Wachstum, metastasierende Kapazität, und Resistenz gegen konventionelle Therapien6,7. Innerhalb von Tumoren weisen Krebszellen, einschließlich CSCs, ein hohes Maß an Heterogenität und Komplexität in Bezug auf ihre ausgeprägten Mutations- und Epigenetischen Profile, morphologische und phäkotypische Unterschiede, Genexpression, Stoffwechsel, Proliferationsraten und metastasisches Potenzialauf 9. Daher, um Krebsbiologie besser zu verstehen, Tumorprogression, und Erwerb der Resistenz gegen Therapie und ihre Umsetzung in wirksame Behandlungen, menschliche präklinische Modelle erfassung diese Krebsheterogenität und Hierarchie sind wichtig10,11.
In-vitro-2D-Krebszelllinien werden seit langem verwendet und liefern wertvolle Einblicke in die Tumorentwicklung und die Mechanismen, die der Wirksamkeit therapeutischer Moleküle zugrunde liegen. Jedoch, ihre Beschränkung in Bezug auf das Fehlen der phänotypischen und genetischen Heterogenität in den ursprünglichen Tumoren gefunden ist jetzt weithin anerkannt12. Darüber hinaus werden Nährstoffe, Sauerstoff, pH-Gradienten und die Tumormikroumgebung nicht reproduziert, wobei die Mikroumgebung für die Aufrechterhaltung verschiedener Zelltypen, einschließlich CSCs11,12,besonders wichtig ist. Um diese Hauptnachteile zu überwinden, wurden mehrere 3D-Modelle entwickelt, um die Komplexität und Heterogenität von Krebsen experimentell anzugehen und zu reproduzieren. In der Tat rekapitulieren diese Modelle tumorzelluläre Heterogenität, Zell-Zell-Interaktionen und räumliche Architektur, ähnlich denen, die in vivo12,13,14beobachtet wurden. Primäre Tumororganoide, die aus frischen Tumoren sowie zelllinienabgeleiteten Sphäroiden hergestellt werden, werden größtenteils15,16eingesetzt.
Sphäroide können auf Gerüst-freie oder Gerüstbasis kultiviert werden, um die Zellen zu zwingen, sich in Zellaggregaten zu bilden und zu wachsen. Gerüstfreie Methoden basieren auf der Kultur von Zellen unter nicht haftenden Bedingungen (z.B. die Hängetropfenmethode oder ultraniedrige Aufsatzplatten), während Gerüstmodelle auf natürlichen, synthetischen oder hybriden Biomaterialien zu Kulturzellen12,13,14basieren. Gerüst-basierte Sphäroide stellen unterschiedliche Nachteile dar, da die endgültige Sphäroidbildung von der Art und Zusammensetzung des verwendeten (Bio-)Materials abhängt. Obwohl die gerüstfreien Sphäroid-Methoden, die bisher zur Verfügung stehen, nicht auf die Art des Substrats angewiesen sind, erzeugen sie Sphäroide, die in Struktur und Größe17,18variieren.
Diese Arbeit zielte darauf ab, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem von Sphäroiden zu entwerfen, die homogen in der Größe sind und aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen bestehen, um die CSC-Biologie zu studieren. Caco2-Zellen sind von besonderem Interesse aufgrund ihrer Fähigkeit, im Laufe der Zeit zu differenzieren19,20, stark auf ein Stammpotenzial hindeutend. Dementsprechend zeigte die Langzeitkultur der Sphäroide das Vorhandensein verschiedener CSC-Populationen mit unterschiedlichen Reaktionen auf die Chemotherapie.
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Protocol
HINWEIS: Die Einzelheiten aller Reagenzien und Materialien sind in der Materialtabelleaufgeführt.
1. Sphäroidbildung
- Sphäroide Kulturmedien
- Bereiten Sie Basalmedium bestehend aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid.
- Bereiten Sie DMEM komplettes Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
- Bereiten Sie DMEM/Basement Membranmatrixmedium mit 2,5% Kellermembranmatrix, 10% FBS und 1% Pen/Strep im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
- Vorbereitung von Platten zur Sphäroidbildung
- Warmes Basal- und DMEM/Kellermembranmatrixmedium bei Raumtemperatur (RT) ca. 20 min.
- Ziehen Sie die Brunnen einer 24-Well-Platte, die der Sphäroidbildung gewidmet ist, ab, indem Sie jedem Brunnen 500 l Anti-Haft-Spüllösung hinzufügen.
HINWEIS: In diesen Platten besteht jeder Brunnen aus 1.200 Mikrobrunnen. - Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.200 × g für 5 min in einem schwingenden Schaufelrotor mit Adaptern für Platten.
HINWEIS: Wenn nur eine Platte verwendet wird, bereiten Sie eine zusätzliche Standardplatte mit Wasser gefüllt, um das Gewicht auszugleichen. - Spülen Sie jeden Brunnen mit 2 ml warmem Basalmedium, und aspirieren Sie das Medium aus den Brunnen.
- Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass Blasen vollständig aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wenn Blasen gefangen bleiben, Zentrifuge wieder bei 1.200 × g für 5 min, um die Blasen zu beseitigen.
- Wiederholen Sie die Spülschritte 1.2.4-1.2.5.
- Fügen Sie 1 ml warmes DMEM/Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen hinzu.
- Erzeugung von Sphäroiden
- Wachsen Sie die Caco2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1% Pen/Strep bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%CO2 (im Folgenden 37 °C/5% CO2).
HINWEIS: Die maximale Anzahl der zu verwendenden Zellpassagen beträgt 80. - Wenn 80% der Konfluenz erreicht ist, waschen Sie die Zellen mit phosphatgepufferter Saline (PBS) 1x (5 ml für eine 10 cm Schale), trypsin-ethylenediamine tetraessig acid (EDTA) (2 ml für eine 10 cm Schale) hinzufügen und für 2-5 min bei 37 °C/5% CO2brüten.
- Überprüfen Sie die Zellablösung unter dem Mikroskop und neutralisieren Sie das Trypsin, indem Sie 4 ml DMEM-Gesamtmedium pro 10 cm Schale hinzufügen.
- Zählen Sie Zellen mit einem Hämozytometer, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 1.200 × g für 5 min. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von DMEM/Kellermembranmatrixmedium wieder auf.
- Siehe Tabelle 1, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die pro Bohrkörper erforderlich sind, um die gewünschte Anzahl von Zellen pro Mikrowell zu erreichen. Alternativ können Sie die Anzahl der Zellen mit der folgenden Formel für eine 24-Well-Platte berechnen, wobei jeder Brunnen 1.200 Mikrobrunnen enthält.
Erforderliche Anzahl von Zellen pro Bohrkörper = Gewünschte Anzahl von Zellen pro Mikrowell × 1.200 - Fügen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension zu jedem Brunnen hinzu, um die gewünschte Zellzahl in einem Endvolumen von 1 ml zu erreichen.
- Fügen Sie 1 ml DMEM/Kellermembranmatrixmedium zu jedem Brunnen hinzu, um das Endvolumen von 2 ml pro Bohrung zu erreichen (siehe auch Schritt 1.2.7).
HINWEIS: Achten Sie darauf, keine Blasen in die Mikrobrunnen einzuführen. - Zentrifugieren Sie die Platte sofort bei 1.200 × g für 5 min, um die Zellen in den Mikrobrunnen zu erfassen. Bei Bedarf die Zentrifuge mit einer mit Wasser gefüllten Standardplatte ausgleichen.
- Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um zu überprüfen, ob die Zellen gleichmäßig auf die Mikrobrunnen verteilt sind.
- Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C/5%CO2 für 48 h, ohne die Platte zu stören.
HINWEIS: Laut dem ursprünglichen Protokoll21können viele Zelllinien sphäroide innerhalb von 24 h bilden, einige benötigen jedoch eine längere Inkubationszeit. In diesem Protokoll sind 48 h ausreichend für die Sphäroidbildung.
- Wachsen Sie die Caco2-Zellen in einer 2D-Monoschicht in DMEM-Medium, ergänzt mit 10% FBS und 1% Pen/Strep bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5%CO2 (im Folgenden 37 °C/5% CO2).
- Ernte der Sphäroide aus den Mikrobrunnen
- Das Basal- und DMEM/Kellermembranmatrixmedium bei RT ca. 20 min erwärmen.
- Mit einer serologischen Pipette die Hälfte des Kulturmediums (1 ml) aus jedem Brunnen entfernen.
- Fügen Sie das Medium wieder auf die Oberfläche des Brunnens, um die Sphäroide aus den Mikrobrunnen zu lösen.
HINWEIS: Berühren oder trituieren Sie die Sphäroide nicht. - Legen Sie ein umkehrbares Sieb (oder ein Standardsieb von 40 m) auf ein 15 ml konisches Rohr, um die Sphäroide zu sammeln.
HINWEIS: Wenn Sie ein Standardsieb mit 40 m verwenden, stellen Sie es auf den Kopf. - Die ausgleiteten Sphäroide (ab Schritt 1.4.3) vorsichtig ansaugen und die Sphäroidaufhängung durch das Sieb passieren.
HINWEIS: Die Sphäroide bleiben auf dem Filter; einzelne Zellen fließen mit dem Medium durch. - Mit einer serologischen Pipette 1 ml des warmen Basalmediums über die gesamte Oberfläche des Brunnens verteilen, um alle verbleibenden Sphäroide zu lösen und auf dem Sieb zurückzugewinnen.
- Wiederholen Sie diesen Waschschritt 1.4.6 zweimal.
- Beobachten Sie die Platte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass alle Sphäroide aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Wiederholen Sie die Wäsche bei Bedarf (Schritte 1.4.6-1.4.7).
- Invertieren Sie das Sieb, und legen Sie es auf einem neuen 15 ml konischen Rohr. Sammeln Sie die Sphäroide, indem Sie das Sieb mit DMEM/Basement Membran Matrix Medium waschen.
HINWEIS: Die gesammelten Sphäroide sind bereit für nachgelagerte Anwendungen und Analysen.
- Langfristige Kultur der Sphäroide
- 1,5% Agarose-Lösung im Basalmedium vorbereiten und durch Autoklavieren sterilisieren (Standardzyklus).
- Während die Agarose-Lösung warm und noch flüssig ist, beschichten Sie die Brunnen von Standard-Kulturtellern oder Gerichten, wie in Tabelle 2beschrieben.
HINWEIS: Das Erwärmen der Schale/Platte im Ofen erleichtert den Beschichtungsschritt. Beschichtete Teller können bis zu 10 Tage in einer sterilen Umgebung bei RT zurückgelassen und vor dem Licht geschützt werden. - Säen Sie die geernteten Sphäroide (ab Schritt 1.4.9) in den Agarose-beschichteten Platten, und fügen Sie DMEM/Kellermembranmatrixmedium hinzu, um das endgültige Volumen je nach Größe der Platte zu erreichen.
ANMERKUNG: Um Sphäroidaggregate zu vermeiden, säen Sie sie bei der optimalen Dichte von 22 Sphäroiden/cm2. Beachten Sie, dass die Beschichtung nicht perfekt flach ist, und es steigt in Richtung der Kante, wodurch eine leichte Konkavität in der Mitte der Platte. Wenn die Anzahl der Sphäroide zu hoch ist, sind sie eher aneinander kleben. - Inkubieren Sie die Platte bei 37 °C/5%CO2 bis zur Rückgewinnung der Sphäroide für spezifische Analysen.
- Behandlung von Sphäroiden mit Chemotherapeutika
- Plattensphäride ab Schritt 1.5.4, und wachsen sie für 2 Tage. Ab Tag 3 (D3) mit FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 g/ml; Irinotecan, 100 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml) oder mit FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 g/ml; Oxaliplatin, 10 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml) Chemotherapie-Kombinationen routinemäßig verwendet, um CRC-Patienten zu behandeln22,23,24,25, oder halten sie in (Kontrolle) nicht behandelt (NT) Zustand.
- Sammeln Sie die Sphäroide nach 3 Tagen der Behandlung mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze (1.000 L-Spitze), um sicherzustellen, dass jede Bedingung durch mindestens drei Wiederholungen dargestellt wird. Zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 3 min, und entfernen Sie dann den Überstand.
- Fixieren Sie die Pellets in 2% Paraformaldehyd (PFA) für die histologische Analyse (siehe Abschnitt 3), oder verwenden Sie die Pellets für die RNA-Extraktion (siehe Abschnitt 4).
- Um den Zelltod zu analysieren, inkubieren Sie die Sphäroide aus Schritt 1.6.1 in schwarzen Kulturbrunnenplatten in DMEM/Kellermembranmatrixmedium für 30 min mit einem Nukleinsäurefleck (1:5000 Verdünnung), der keine lebenden Zellen durchdringt, sondern die kompromittierten Membranen abgestorbener Zellen durchdringt26. Messen Sie die Fluoreszenzakkumulation mit einem Mikroplattenleser.
2. Überwachung des Sphäroidwachstums
- Erfassen Sie mit Hilfe eines invertierten Mikroskops repräsentative Bilder von Sphäroiden, die während der Tage in der Kultur unter verschiedenen Bedingungen gehalten werden.
- Analysieren Sie die Bilder, indem Sie mit entsprechender Software drei verschiedene repräsentative Durchmesser jedes Sphäroids messen.
- Verwenden Sie die folgende Formel, um das geschätzte Kugelvolumen zu erhalten.
HINWEIS: Die Begriffe d1, d2 und d3 sind die drei Durchmesser des Sphäroids.
3. Immunfluoreszenz (IF) und histologische Färbung
- Fixierung und Paraffineinbettung
- Sammeln Sie die Sphäroide an ausgewählten Zeitpunkten mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze wie in Schritt 1.6.2 beschrieben, und fixieren Sie sie für 30 min bei RT in 2% PFA.
HINWEIS: Alternativ können Sie die Proben in diesem Schritt bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung aufbewahren. - Zum Paraffineinbetten die Sphäroide 3x mit PBS 1x waschen und in 70% Ethanol wieder aufsetzen. Nach Paraffin-Einschluss und Schnitt durchführen Sie Hämatoxylin & Eosin (H&E) Färbung für die histologische Analyse.
- Sammeln Sie die Sphäroide an ausgewählten Zeitpunkten mit einer Pipette mit abgeschnittener Spitze wie in Schritt 1.6.2 beschrieben, und fixieren Sie sie für 30 min bei RT in 2% PFA.
- Immunolabeling von Paraffinabschnitten
HINWEIS: Verwenden Sie 5-m-dicke Abschnitte für die indirekte Immunfärbung.- Inkubieren Sie Diaglüg bei 60 °C für 2 h, um das Wachs zu schmelzen und die Deparaffinierung zu verbessern.
- Waschen Sie die Dias zweimal für 3 min in Methylcyclohexan.
- Waschen Sie die Dias für 3 min in 1:1 Methylcyclohexan: 100% Ethanol.
- Waschen Sie die Dias zweimal für 3 min in 100% Ethanol.
HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen für Schritt 3.2.2 bis Schritt 3.2.4 in einer chemischen Haube durch. - Waschen Sie die Dias für 3 min in 90% Ethanol.
- Waschen Sie die Dias für 3 min in 75% Ethanol.
- Waschen Sie die Dias für 3 min in 50% Ethanol.
- Waschen Sie die Rutschen unter Leitungswasser.
- Rehydrieren Sie die Dias in destilliertem Wasser für 5 min.
- 700 ml 0,01 M Citratpuffer, pH 6,0 vorbereiten und in einen geeigneten Behälter geben (Breite: 11,5 cm, Länge: 17 cm, Höhe: 7 cm); die Dias darin untertauchen. Erhitzen Sie den Behälter in der Mikrowelle für 9-10 min bei 700 W, und wenn das Kochen beginnt, verringern Sie die Leistung auf 400-450 W. Inkubieren für weitere 10 min.
- Lassen Sie die Dias im Puffer ca. 30-40 min auf RT abkühlen.
- Waschen Sie die Dias zweimal in PBS für 5 min.
- Zeichnen Sie einen Kreis um die Abschnitte mit einem Markerstift, um eine Barriere für Flüssigkeiten zu schaffen, die auf die Abschnitte angewendet werden.
- Inkubieren Sie jeden Abschnitt mit 50 l Blockierpuffer (10% normales Ziegenserum, 1% Rinderserumalbumin (BSA) und 0,02% Triton X-100 in PBS) für mindestens 30 min bei RT.
- Entfernen Sie den Blockierpuffer, und fügen Sie 50 L primärer Antikörper hinzu, die im Inkubationspuffer verdünnt wurden (1% normales Ziegenserum, 0,1% BSA und 0,02 % Triton X-100 in PBS). 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Entfernen Sie die primären Antikörper, und waschen Sie die Dias 3x in PBS für 5 min.
- Inkubieren Sie die Dias mit 50 l fluoreszierenden Sekundärantikörpern, die im Inkubationspuffer für 1 h bei RT verdünnt werden.
- Entfernen Sie die sekundären Antikörper, und waschen Sie die Dias 3x in PBS für 5 min.
- Fügen Sie jedem Abschnitt 50 l Montagemedium mit 4,6-Diamidino-2-Phenylindole hinzu und legen Sie einen Glasdeckel über den Abschnitt.
4. RNA-Extraktion, Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) und quantitative RT-PCR (qRT-PCR)
- Sammeln Sie Sphäroide zu verschiedenen Zeitpunkten, wobei jeder Punkt durch mindestens drei Replikationen dargestellt wird. Zentrifugieren Sie sie bei 1.000 × g für 3 min, und entfernen Sie dann den Überstand.
HINWEIS: Pellets können bis zur weiteren Verwendung direkt zur RNA-Extraktion verwendet oder bei -20 °C gelagert werden. - Isolieren Sie die gesamte RNA mit einem kommerziellen RNA-Isolationskit, gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Reverse-Transcribe 500 ng jeder RNA-Probe in komplementäre DNA (cDNA) mit einem kommerziellen Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
- Führen Sie nach der umgekehrten Transkription eine PCR-Analyse an 1 L cDNA durch, um ein Housekeeping-Gen mit Primern in verschiedenen Exons zu verstärken.
HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Überprüfung des Fehlens einer genomischen DNA-Kontamination in den RNA-Präparaten. Für dieses Protokoll wurden Peptidylprolyl-Isomerase-B-Grundierungen(PPIB) verwendet. - Führen Sie die qPCR-Amplifikation auf 4 l zuvor verdünnter cDNA (1:10 in RNAse-freiem doppeldestilliertem Wasser) durch, indem Sie Primer verwenden, die speziell für die Gene von Interesse sind. In jeder Probe wird die spezifische mRNA-Expression mit der Methode "Ct" und den werten, die gegen ein Housekeeping-Genniveau normalisiert wurden, quantifiziert.
HINWEIS: Für dieses Protokoll wurde β-Actin (ACTB) ausgewählt. Die in diesem Protokoll verwendeten Primer sind in Tabelle 3aufgeführt.
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Representative Results
Da der Mangel an Homogenität in der Größe der Sphäroide einer der Hauptnachteile der derzeit verfügbaren 3D-Sphäroid-Kultursysteme13ist, bestand das Ziel dieser Arbeit darin, ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll zur Erzielung homogener Sphäroide zu erstellen. Um ideale Arbeitsbedingungen zu schaffen, wurden verschiedene Anzahl von Caco2-Zellen getestet, die von 50 bis 2.000 Zellen pro Mikrowell/Spheroid mit speziellen Platten reichten (Tabelle 1). In der Tat enthält jeder Brunnen in diesen Platten 1.200 Mikrowells, was die Bildung der gleichen Anzahl von Sphäroiden pro Brunnen und, was noch wichtiger ist, die Bildung eines Sphäroids pro Mikrowell21ermöglicht. Nach zwei Tagen Kultur wuchsen die Brunnen mit 2.000 Zellen pro Sphäroid als Monolayer, und 50 Zellen pro Sphäroid führten zu kleinen und nicht homogenen Sphäroiden (Abbildung 1A). Diese beiden Bedingungen wurden daher von weiteren Analysen ausgeschlossen. Um Langzeitkulturen zu etablieren, wurden Sphäroide aus den Mikrobrunnen geerntet und unter nicht haftenden Bedingungen in frisch zubereiteten Agarose-beschichteten Platten gesät. Das Sphäroidwachstum wurde dann während des gesamten experimentellen Zeitverlaufs überwacht, indem die Volumenänderung gemessen wurde. Um der nicht-sphärischen Form Rechnung zu tragen, wurden drei verschiedene Durchmesser jedes Sphäroids gemessen, und die Volumenformel wurde27 (Abbildung 1B) angewendet. Sphäroide, die aus 100 und 200 Zellen erzeugt wurden, hielten ihre ursprüngliche Größe über den gesamten Verlauf des Experiments bei, während diejenigen, die 1.000 Zellen enthielten, während der Ernte aufgrund ihrer großen Größe zerfielen und folglich eine größere Variabilität ihres Volumens aufwiesen. Da sphäroide, die aus 500 Zellen hervortraten, den homogensten Größenzuwachs über den experimentellen Zeitverlauf zeigten, wurde diese Anzahl von Zellen für die Sphäroidbildung verwendet.
Zweitens wurden neben 500 Zellen pro Sphäroid weitere Zellzahlen von 300 bis 800 Zellen untersucht. Darüber hinaus wurde das ursprüngliche Protokoll zur Verbesserung der nicht anhaftenden Bedingungen geändert, indem die Brunnen zweimal vorbehandelt wurden, anstatt nur eine Wäsche aufzutragen. Mit diesen Veränderungen wurde eine Verbesserung der Sphäroidhomogenität und Verdichtung beobachtet (Abbildung 2A). Die Größe der Sphäroide in jedem Zustand wurde zum Zeitpunkt der Ernte gemessen (Abbildung 2B), und ihr langfristiges Wachstum wurde während der Tage in kultur in Agarose-beschichteten Gerichten überwacht (Abbildung 2C). Basierend auf den Ergebnissen wurden 500 und 600 Zellen/Sphäroid als optimale Bedingungen bestätigt, die ein gutes Wachstum und eine geringe Variabilität lieferten. Aufgrund des homogeneren Wachstumsprofils während des gesamten Versuchsverlaufs und der sich bildenden kompakten Strukturen wurden 600 Zellen pro Sphäroid als Zellzahl für nachfolgende Experimente ausgewählt. Schließlich, um das Protokoll weiter zu verbessern, DMEM komplettes Medium wurde mit 2,5% der Kellermembranmatrix ergänzt, die zusätzliche Wachstumsfaktoren und eine große Platte von extrazellulären Matrixproteinenenthält 28. Tatsächlich könnte die multilobuläre Form der Sphäroide auf das Fehlen von Signalen aus der Mikroumgebung zurückzuführen sein, die die Zellpolarisation29,30beeinflusst haben könnten. Die Zugabe von Kellermembranmatrix verbesserte das Sphäroidwachstum und verbesserte deren Homogenität (Abbildung 2D). Ein Beispiel für diese Verbesserung kann für 500 Zellen pro Sphäroid gesehen werden. In Ermangelung der Kellermembranmatrix (Abbildung 1B) war die Größe der Sphäroide heterogener, verdoppelte sich von D3 auf D7 und erreichte dann ein Plateau. In Gegenwart der Kellermembranmatrix (Abbildung 2C) war die Größe der Sphäroide zu jedem Zeitpunkt jedoch homogener und nahm im Laufe der Zeit proportional zu.
Um die Langzeitmerkmale der Sphäroide zu analysieren, wurden sie zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Kultur in agarosebeschichteten Gerichten für detaillierte histologische und IF-Analysen an Paraffinabschnitten wiederhergestellt. Die H&E-Färbung zeigte, dass sich die Zellen innerhalb der Sphäroide im Laufe der Zeit veränderten. Tatsächlich waren die Zellen bei D3 dicht in Mehrschichten angeordnet, während abgeflachte Zellen, die in Monolayern angeordnet waren, bei D10 deutlich sichtbar waren. Interessanterweise, wie durch die schwarzen gepunkteten Linien in den Bildern angegeben, erschien ein Lumen innerhalb der Sphäroide ab D5 (Abbildung 3). Parallel dazu wurden Zellproliferation und Apoptose mit DEM Proliferationsmarker, dem proliferierenden Zellkernantigen (PCNA) und dem Zelltodmarker, aktivierter Caspase 3, von IF analysiert. Die Kennzeichnung für PCNA ergab, dass sich ausbreitende Zellen oft an der außenigen Oberfläche der Sphäroide vorhanden waren, manchmal in kryptischen oder knospenartigen Strukturen, die an Organoidkulturen erinnern15. Darüber hinaus wurde ein deutlicher Anstieg der PCNA-positiven Zellen bei D5 und D7 beobachtet, der um D10 zurückging (Abbildung 4, linke Felder). Überraschenderweise wurde aktivierte Kaspase 3 in sehr wenigen Zellen in den Sphäroiden sowohl bei D3 als auch bei D5(Abbildung 4, linke Felder) und über längere Zeiträume (Daten nicht dargestellt) beobachtet. Das Ausdrucksmuster von β-Catenin wurde auch in Paraffinabschnitten ausgewertet. Interessanterweise wurden zu jedem Zeitpunkt hohe Konzentrationen von β-Catenin-Expression mit klarer membrangebundener und zytoplasmatischer Färbung beobachtet(Abbildung 4, rechte Paneele). Es ist erwähnenswert, dass membrangebundenes β-Catenin an der Zell-Zell-Adhäsion durch Bindung an E-Cadherin31beteiligt ist. Ein hohes Maß an ß-Catenin-Etikettierung wurde in Zellgruppen zu allen Zeitpunkten festgestellt. In einigen Fällen zeigten zellen auch eine klare kernnukleare ß-Catenin-Lokalisierung(Abbildung 4, rechte Paneele). Caco2-Zellen sind dafür bekannt, in vitro in 2D hauptsächlich in Enterozyten zu differenzieren19,32. Die Expression von Differenzierungsmarkern wie Chromogranin A (enteroendokrine Zellen), Lysozym (Paneth-Zellen) oder Mucin 2 (MUC 2, Kelchenzellen) war in diesen Sphäroiden jedoch durch IF (daten nicht dargestellt) nicht nachweisbar. Das Potenzial, sich in Enterozyten zu differenzieren, wurde jedoch bestätigt, da die Sphäroide ALPI (alkalische Phosphatase) und solute Trägerfamilie 2, Transkriptvariante 2 (SLC2A5)/Glukosetransporter 5 (GLUT5) mRNAs (Abbildung 5) exprimierten. Diese mRNA-Spiegel stiegen bei D5 und D7, aber der Unterschied war entweder nicht signifikant (ALPI) oder nur geringfügig signifikant (SLC2A5) im Vergleich zu den Niveaus bei D3.
Mit dem Endziel zu definieren, ob die auf dieser neuen Methode erzeugten und kultivierten Sphäroide ein zuverlässiges Werkzeug zur Untersuchung von CSCs sind, wurde die Expression von CSC-Markern von IF und qRT-PCR analysiert. CD133 und CD44 charakterisieren Krebszellpopulationen einschließlich CSCs7,33,34 und werden auch durch SCs im normalen Darm und Dickdarm33,34,35ausgedrückt. Cluster von CD133-positiven Zellen wurden hauptsächlich auf der außenoberfläche der Sphäroide zu jedem Zeitpunkt lokalisiert(Abbildung 6A, linke Felder). CD44-positive Zellen waren seltener, wurden aber immer mit CD133-positiven Zellen assoziiert (Abbildung 6A, rechte Felder), was auf die Existenz einer Population von CD133/CD44 doppelpositiven CSC-ähnlichen Zellen und einer Population, die nur CD133 ausdrückt, hindeutet. Olfactomedin 4 (OLFM4) und Musashi 1 (MSI1) wurden als SC/CSC-Marker untersucht; Diese Marker werden in sehr begrenzter Weise in Doppelpunkt-Krypten36,37 und auch in unterschiedlichen Zellpopulationen35,38ausgedrückt. Nur wenige MSI1-positive Zellen wurden zu jedem Zeitpunkt beobachtet (Abbildung 7), während OLFM4 nicht nachweisbar blieb (Daten nicht dargestellt). Dennoch befanden sich, wie bei CD44 und CD133 beobachtet, MSI1-markierte Zellen auf der Außenfläche der Sphäroide in krypto- oder knospenähnlichen Strukturen. Dieselben Marker wurden auch auf mRNA-Ebene zu den gleichen Zeitpunkten nach der Kultur in agarosebeschichteten Gerichten analysiert. Aldehyddehydrogenase 1 (ALDH1a1), ein gut charakterisierter Marker von CSCs39,40, wurde ebenfalls in die Studie einbezogen (Abbildung 8). Die Analyse von Prominin-1 (PROM1-Codierung für CD133) und CD44 mRNAs bestätigte die Expression beider Marker in Spheroiden zu allen analysierten Zeitpunkten. Bemerkenswert ist jedoch, dass die PROM1-mRNA-Werte im Laufe der Zeit in der Kultur recht ähnlich waren, während die CD44-Spiegel ab D3 zurückgingen. Der Unterschied war jedoch nur marginal signifikant, wenn man die mRNA-Spiegel von D10 und D3 vergleicht.
Die Analyse von MSI1 mRNA bestätigte seine Expression in Sphäroiden zu jedem Zeitpunkt, mit signifikant höheren Konzentrationen bei D3 und D5 im Vergleich zu denen bei D7 oder D10 (Abbildung 8), während OLFM4 mRNA nicht nachweisbar war (nicht gezeigt). Schließlich wurde ALDH1a1 mRNA zu jedem Zeitpunkt in Sphäroiden exprimiert und zeigte ein Expressionsprofil, das bei D10 abnahm, wobei die Werte im Vergleich zu D3 nur marginal signifikant waren (Abbildung 8). Um die Angemessenheit des neuen Modells zur Untersuchung der Krebszellbiologie zu validieren, wurde die Reaktion auf die Chemotherapie in Sphäroiden analysiert, die mit FOLFOX oder FOLFIRI behandelt wurden, Kombinationstherapien, die crC-Patienten routinemäßig verabreicht werden22,23,24,25. Zunächst wurde die Wirksamkeit der Behandlungen bei der Induktion des Zelltodes untersucht, indem die Sphäroide mit einem fluoreszierenden Nukleinsäurefleck inkubiert wurden, der speziell in abgestorbene Zellen eindringt26. Verglichen mit der Kontrolle NT Zustand, die Behandlung mit jedem der Medikamente induziert signifikanten Zelltod gemessen durch die Akkumulation der Fluoreszenz (Abbildung 9A). Diese Beobachtung wurde auch auf morphologischer Ebene mit Hilfe der Live-Mikroskopie bestätigt, die zeigte, dass die Behandlungen stark die Größe und das Aussehen der Sphäroide beeinflussten (Abbildung 9B). Schließlich wurde die Expression von SC/CSC-Markern mit qRT-PCR in Spheroiden unter den gleichen Bedingungen analysiert (Abbildung 9C). Faszinierenderweise wurde ein signifikanter Rückgang der PROM1 mRNA-Spiegel unter FOLFOX- und FOLFIRI-Bedingungen im Vergleich zu den Kontrollniveaus beobachtet, während die MSI1-Spiegel von den Behandlungen nicht betroffen waren. Während FOLFOX im Vergleich zur Kontrolle keinen Einfluss auf die ALDH1a1-mRNA-Expression hatte, erhöhte die Behandlung mit FOLFIRI seinen Gehalt signifikant. OLFM4 mRNA wurde nicht erkannt, und die CD44 mRNA-Werte waren extrem niedrig (Daten wurden nicht angezeigt).
Abbildung 1:Einrichtung von Sphäroidkulturen. (A) Sphäroidbildung, die aus den angegebenen Konzentrationen von Caco2-Zellen per spheroid/microwell ausgelöst wird. Das obere Panel zeigt ein repräsentatives Bild einer ganzen Kulturplatte nach zwei Tagen Kultur. Im unteren Bereich werden Bilder ausgewählter Mikrobrunnen pro Zustand angezeigt. Die Bilder wurden bei 4-facher Vergrößerung aufgenommen (Mikrowellgröße: 400 m). Skalenstäbe: geringe Vergrößerung, 100 m; hohe Vergrößerung, 30 m. (B) Wachstumsmerkmale der Sphäroide, die aus unterschiedlicher Anzahl von Zellen pro Mikrowell erzeugt und zu verschiedenen Zeitpunkten analysiert werden. Beachten Sie, dass die angegebenen Tage die ersten beiden Tage der Kultur in den Mikrobrunnen und die nachfolgende Kultur der geernteten Sphäroide in Agarose-beschichteten Platten umfassen. Histogramme zeigen mittelmäßig ± Standardabweichung n = 4–6. Schwarze Kreise zeigen die Werte für einzelne Sphäroide an. Die Formel für das geschätzte Volumen wird im oberen Teil des Panels angezeigt, wobei d1, d2 und d3 die drei für jedes Sphäroid gemessenen Durchmesser angeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Optimierung der Bedingungen für Sphäroidbildung und -kultur. (A) Repräsentative Bilder von Sphäroiden bei D7 nach ihrer Erholung von den Mikrobrunnen (2 Tage) und Kultur in Agarose-beschichteten Gerichten (5 Tage), unter Verwendung neuer Brunnenvorbereitung und Kultur medium Bedingungen. Maßstabsleiste: 30 m. (B) Geschätztes Volumen der frisch geernteten Sphäroide zwei Tage nach Beginn der Zellkultur in den Mikrobrunnen. Histogramme zeigen mittelmäßig ± Standardabweichung (SD), n = 4–6. Schwarze Kreise geben die Größe der einzelnen Sphäroide an. (C) Geschätztes Volumen der Sphäroide in der Langzeitkultur auf der Grundlage der neu ausgewählten Bedingungen. Graphen zeigen die Wachstumsmerkmale der Sphäroide, die aus einer unterschiedlichen Anzahl von Zellen pro Sphäroid erzeugt und zu verschiedenen Zeitpunkten nach ihrer Ernte analysiert werden, wie angegeben. Histogramme zeigen ± SD, n = 6–10. Schwarze Kreise geben die Größe der einzelnen Sphäroide an. (D) Repräsentative Bilder der gewählten 600 Zellen pro Sphäroidzustand über den experimentellen Zeitverlauf (rechte Felder) und innerhalb der Mikrobrunnen (linkes Panel). Die Bilder wurden mit der 4-fachen Vergrößerung aufgenommen. Skalenstäbe: geringe Vergrößerung, 100 m; hohe Vergrößerung, 30 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Histologische Charakterisierung der Sphäroide. Histologische Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E) von Paraffinabschnitten. Repräsentative Bilder von Sphäroiden zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Ernte, wie angegeben. Schwarze gepunktete Linien in jedem hohen Vergrößerungseinleger begrenzen das Lumen innerhalb der Sphäroide. Skalenstäbe: geringe Vergrößerung, 30 m; hohe Vergrößerung, 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:Caco2-Sphäroidcharakterisierung durch Immunlabeling. Immunostainierung von Sphäroiden für Proliferationsmarker, proliferierendes Zellkernantigen (PCNA, rot) und Zelltodesmarker, aktivierte Caspase 3 (grün) (linke Paneele) und für β-Catenin (rot) (rechte). Bilder zeigen die zusammengeführte Beschriftung von PCNA (rot), aktivierter Kaspase 3 (grün) und Kernen (blau) oder von β-Catenin (rot) und Kernen (blau). Weiße Pfeile zeigen auf Zellen oder Gruppen von Zellen, die einen hohen Β-Catenin exdrücken. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Skalenbalken: 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Analyse der Enterozytendifferenzierungsmarker durch qRT-PCR. Analyse von ALPI- und SLC2A5-Kodierung alkalischer Phosphatase bzw. GLUT5-Proteine. Histogramme zeigen mittelmäßig ± Standardabweichung, n = 3, nach Normalisierung gegen ACTB. Daten werden als Faltenänderung relativ zur normalen Doppeldarmschleimhaut dargestellt (rote Linie = 1). NS: nicht signifikant; MS: im Vergleich zu D3 durch ungepaarten Schüler-t-Testgeringfügig signifikant. Abkürzungen: qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; GLUT5 = Glukosetransporter 5; SLC2A5 = Solute Trägerfamilie 2, Transkriptvariante 2; ACTB = β-Actin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Heterogene Expression von Stammzellmarkern,CD44 und CD133, in den Sphäroiden. Immunostainierung für die Stammzellmarker CD133 und CD44 zu den angegebenen Zeiten. Bilder in den linken Panels zeigen die zusammengeführte Beschriftung von CD133 (grün) und Kernen (blau); Die gleichen Bilder in den rechten Panels zeigen die zusammengeführte Beschriftung von CD44 (rot) und Kernen (blau). Grüne Pfeile in den linken Feldern zeigen auf CD133-exättige Zellen, und weiße Pfeile in beiden Feldern verweisen auf Zellen oder Gruppen von Zellen, die CD44 und CD133 exprossieren. Die Bilder wurden mit einem 20-fachen Objektiv aufgenommen. Skalenbalken: 5 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Heterogene Expression des Stammzellmarkers MSI1 in den Sphäroiden. Immunostainierung für den Stammzellmarker MSI1 (rot) zu den angegebenen Zeiten. Bilder zeigen die zusammengeführte Beschriftung von MSI1 (rot) und Kernen (blau). Weiße gepunktete Linien unterstreichen einige kryptoartige Strukturen, bei denen Zellen positiv für die MSI1-Immunkennzeichnung sind. Die Bilder wurden mit der 20-fachen Vergrößerung aufgenommen. Skalenbalken: 5 m. Abkürzung = MSI1 = Musashi 1. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 8: Analyse von Stammzellmarkern durch qRT-PCR. Die Quantifizierung der PROM1-, CD44-, MSI1- und ALDH1a1-Spiegel wurde zu den angegebenen Zeiten auf mRNA von Sphäroiden durchgeführt. Histogramme zeigen mittelmäßig ± Standardabweichung, n = 3, nach Normalisierung gegen ACTB. Daten werden als Faltenänderung relativ zur normalen Doppeldarmschleimhaut dargestellt (rote Linie = 1). NS: nicht signifikant; MS: im Vergleich zu D3 geringfügig signifikant, wobei der t-Testdes ungepaarten Schülers verwendet wird. *: P < 0,05 im Vergleich zu D3 oder D5, wobei der t-Testdes nicht gepaarten Schülers verwendet wird. Abkürzungen: qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; PROM1 = Prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1-1 = Aldehyddehydrogenase 1 alpha; ACTB = β-Actin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 9: Wirkung der Chemotherapie auf Sphäroide. Nach der Ernte aus den Mikrobrunnen wurden Sphäroide in Agarose-beschichteten Platten kultiviert und 3 Tage lang mit FOLFOX oder FOLFIRI behandelt oder in (Kontroll-)unbehandeltem Zustand (NT) gehalten. (A) Analyse der Fluoreszenz durch Kennzeichnung von Nukleinsäure in abgestorbenen Zellen. Histogramme zeigen mittelmäßig ± Standardabweichung (SD), n = 4. (B) Morphologische Merkmale der Sphäroide, die in den verschiedenen Kulturbedingungen beibehalten werden. Die Bilder wurden mit einem 4x Objektiv aufgenommen. Maßstabsleiste: 400 m. (C) Quantifizierung von PROM1, MSI1 und ALDH1a1 mRNAs durch qRT-PCR. Histogramme zeigen mittelwert ± SD, n = 4, nach normalisieren d. Chr. gegen ACTB. *: NS: nicht signifikant; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 im Vergleich zur Zustand der Steuerung (NT) unter Verwendung des t-Testsdes nicht gepaarten Schülers. Abkürzungen: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 g/ml; Oxaliplatin, 10 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml ; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 g/ml; Irinotecan, 100 g/ml; Leucovorin, 25 g/ml; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion; PROM1 = Prominin-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1-1 = Aldehyddehydrogenase 1 alpha; ACTB = β-Actin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gewünschte Anzahl von Zellen pro Sphäroid | Erforderliche Anzahl von Zellen pro Bohrkörper |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Tabelle 1: Zusammenfassung der Sphäroidbildung und Zellaussaat.
| 10 mm Geschirr | 6-Well-Platten | 12-Well-Platten | 24-Well-Platten | 96-Well-Platten | |
| Beschichtungsvolumen | 4 ml | 300 l | 250 l | 150 l | 50 l (Nach unten & nach oben) |
Tabelle 2: Volumen von Agarose-Lösung für die Beschichtung von verschiedenen Platten / Geschirr.
| Gene | Zündkapseln | Sequenz | Produktlänge | |
| Differenzierungsmarker | Alpi | vorwärts | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| Rückwärts | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | vorwärts | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| Rückwärts | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Stammzellmarker | ALDH1a1 | vorwärts | GCC TTC ACA GGA TCA ACA GAG | 147 |
| Rückwärts | TGC AAA TTC AAC AGC ATT AGB | |||
| MSI1 | vorwärts | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| Rückwärts | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | vorwärts | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| Rückwärts | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | vorwärts | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| Rückwärts | TGA AGT GCT GCT CCT TTC ACT | |||
| OLFM4 | vorwärts | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| Rückwärts | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| Housekeeping-Gene | Actb | vorwärts | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| Rückwärts | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | vorwärts | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| Rückwärts | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tabelle 3: Primer, die für die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion verwendet werden.
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Discussion
In-vitro-3D-Modelle überwinden die wichtigsten experimentellen Nachteile von 2D-Krebszellkulturen, da sie bei der Rekapitulation typischer Tumormerkmale wie Mikroumgebung und Zellheterogenität zuverlässiger zu sein scheinen. Häufig verwendete 3D-Modelle von Sphäroiden sind gerüstfrei (kultiviert unter niedriganbaulichen Bedingungen) oder Gerüstbasis (mit Biomaterialien zur Kulturvon Zellen). Diese Methoden weisen unterschiedliche Nachteile auf, da sie von der Art des verwendeten Gerüsts abhängen oder sphäroide sphärische Sphäroide hervorrufen, die in Struktur und Größe variabel sind.
Das vorliegende Protokoll berichtet über optimierte Bedingungen für die Herstellung homogener Sphäroide aus der Doppeldarm-Adenokarzinom-Zelllinie Caco2 mit einer gerüstfreien Methode. Die Sphäroide sind leicht zu ernten und im Gegensatz zu einer zuvor berichteten Studie41wachsen sie erfolgreich und ihre Wachstumsmerkmale während der Zeit in der Kultur können auch analysiert werden. Darüber hinaus vermehren sich die Sphäroide (a) aktiv, (b) mit dieser neuen Methode eine sehr niedrige Rate des Zelltodes, (c) organisieren sich zu einem Lumen innerhalb der Sphären und (d) zeigen Differenzierungsfähigkeit der Komponentenzellen. Da das Endziel des neuen Ansatzes seine Verwendung für Studien zur CSC-Biologie war, wurde die Expression verschiedener Marker von CSCs analysiert. Interessanterweise präsentierten die Marker ein dynamisches Ausdrucksmuster in Abhängigkeit vom Zeitpunkt und definierten verschiedene CSC-Populationen.
Von größter Bedeutung, die Sphäroide durch dieses Protokoll erzeugt werden könnte für die Analyse von Medikamenten relevant für klinische Anwendungen wie die Chemotherapeutika, FOLFOX und FOLFIRI verwendet werden. Die Ergebnisse unterstreichen auch eine heterogene Reaktion der Zellen auf die Medikamente in Abhängigkeit vom analysierten CSC-Marker. Diese Beobachtung stimmt mit der aktuellen Ansicht überein, dass heterogene und mehrfache CSC-ähnliche Zellpopulationen innerhalb von Tumoren verschiedene Chemosensitivitäts-/Chemoresistenzeigenschaften aufweisen42,43. Dieser Befund potenziert die Anwendbarkeit dieser neuen Methode für großflächiges Screening stark. Zusätzlich zu den in dieser Studie berichteten Anwendungen kann das neue Protokoll auch für ein breiteres Spektrum von Analysen (z. B. RNA- und/oder DNA-Extraktion und groß angelegte Analysen, Western Blotting und Immunfluoreszenz) verwendet werden. Tatsächlich kann das Volumen der Sphäroide und Wachstumsmerkmale leicht durch Anwendung der Kugelvolumenformel bestimmt werden, die bei Bedarf auch unterschiedliche Durchmesser berücksichtigt, um Abweichungen von einer perfekt kugelförmigen Form auszugleichen. Bestimmte Parameter sollten jedoch je nach Zelltyp (Zelllinie oder frische Primärkulturen) und Wachstumskapazität optimiert werden, z. B. Replikationszeit. Dennoch zeigt das Protokoll kritische Schritte an, die leicht angepasst werden können.
Einige Punkte, die Anlass zur Sorge geben, müssen bei der Durchführung der sphäroiden Erzeugung berücksichtigt werden, die in diesem Artikel beschrieben wird. Zunächst sollten mehrere Waschschritte mit der Anti-Haft-Spüllösung durchgeführt werden, um die Homogenität und Verdichtung der Kugeln zu fördern. In diesem Fall waren zwei Wähmaßnahmen notwendig. Zweitens müssen Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt werden, da dies die korrekte Bildung der Sphäroide stören kann. Drittens muss die Platte, sobald die Zellen nach dem Zentrifugationsschritt in jedem Mikrobrunnen ausgesät sind, zwei Tage lang ungestört bleiben. Zusätzliche Überlegungen und Änderungen im Protokoll sind erforderlich, wenn die frühen Schritte der Sphäroidbildung untersucht werden, möglicherweise einschließlich eines automatisierten Visualisierungs- und Bildgebungssystems. Viertens kann es schwierig sein, das Medium zu wechseln, ohne die Sphäroide zu stören, da sie sich in der Suspension befinden. Daher wird empfohlen, jedes Mal nur die Hälfte des Volumens zu ändern. Fünftens, bei der Ernte der Sphäroide, ist es wichtig, ihre Struktur zu erhalten. Daher wird die Verwendung von serologischen Pipetten oder Mikropipetten mit abgeschnittenen Spitzen für alle Dosierschritte nach dem Spülen in einem serumhaltigen Medium oder PBS empfohlen, um zu verhindern, dass die Sphäroide an den Spitzen haften.
Bei der Verwendung dieses Protokolls können auch einige Einschränkungen auftreten. Erstens weisen nicht alle Zelllinien oder Zelltypen dieselben Kulturparameter auf. in einigen Fällen können die Zellheterogenität und die Anzahl der Passagen/Alterung von Zellen auch die Fähigkeit beeinflussen, Sphäroide zu bilden. Zweitens, im Gegensatz zu Organoiden, kann es schwierig sein, Sphäroide für eine sehr lange Zeit in der Kultur zu erhalten. Darüber hinaus können sie nicht durch einfache Fragmentierung durch eine MikropipetteSpitze15repliziert werden. Drittens kann dieses Protokoll nicht für die Analyse von Einsphäroiden angepasst werden, da die manuelle Wiederherstellung von Sphäroiden nacheinander schwierig sein kann. Diese Technik eignet sich besser, um gleichzeitig hohe Mengen homogener Sphäroide zu erhalten. Schließlich wäre es für Studien, die die Auswirkungen von Wachstumsfaktoren aus anderen Zelltypen untersuchen oder die Bedeutung der Mikroumgebung analysieren, wichtig, das Modell zu bereichern und Co-Kultur-Experimente durchzuführen.
Zusammenfassend beschreibt die vorliegende Methodik ein neues Protokoll zur effizienten Erzeugung und Kultur von Sphäroiden aus Caco2-Zellen. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Methode auf die Untersuchung der Tumorheterogenität und für die Analyse von CSCs angewendet werden kann. Diese Methode kann auch für das Hochdurchsatz-Arzneimittelscreening und die Erforschung der Stammzellbiologie bei Krebs und nicht-kanzerösen Zellen verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten
Acknowledgments
Wir erkennen die Imaging- und Anipath-Recherche-Histologie-Plattformen (CRCL, CLB) an. Wir sind der Apotheke des Centre Léon Bérard (CLB) Krankenhauses für das freundliche Geschenk von FOLFOX und FOLFIRI zu verdanken. Wir danken auch Brigitte Manship für die kritische Lektüre des Manuskripts. Die Arbeiten wurden vom FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) und der Inca (PLBIO19-289) unterstützt. MVG und LC erhielten Unterstützung von der FRM und CF erhielt Unterstützung von der ARC-Stiftung und dem Centre Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
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