Ein dreidimensionales Modell von Sphäroiden zur Untersuchung von Darmkrebs-Stammzellen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll stellt ein neuartiges, robustes und reproduzierbares Kultursystem zur Erzeugung und zum Wachstum dreidimensionaler Sphäroide aus Caco2-Kolonadenokarzinomzellen dar. Die Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses Ansatzes zur Untersuchung der Krebsstammzellbiologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Zusammenfassung

Darmkrebs ist durch Heterogenität und eine hierarchische Organisation gekennzeichnet, die eine Population von Krebsstammzellen (CSCs) umfasst, die für die Tumorentwicklung, -erhaltung und -resistenz gegen Medikamente verantwortlich sind. Ein besseres Verständnis der CSC-Eigenschaften für ihre spezifische Ausrichtung ist daher eine Voraussetzung für eine effektive Therapie. Es gibt jedoch einen Mangel an geeigneten präklinischen Modellen für eingehende Untersuchungen. Obwohl in vitro zweidimensionale (2D) Krebszelllinien wertvolle Einblicke in die Tumorbiologie liefern, replizieren sie die phänotypische und genetische Tumorheterogenität nicht. Im Gegensatz dazu adressieren und reproduzieren dreidimensionale (3D) Modelle die nahe physiologische Krebskomplexität und Zellheterogenität. Ziel dieser Arbeit war es, ein robustes und reproduzierbares 3D-Kultursystem zu entwerfen, um CSC-Biologie zu studieren. Die vorliegende Methodik beschreibt die Entwicklung und Optimierung von Bedingungen zur Erzeugung von 3D-Sphäroiden, die homogen in der Größe sind, aus Caco2-Kolon-Adenokarzinomzellen, einem Modell, das für die langfristige Kultur verwendet werden kann. Wichtig ist, dass innerhalb der Sphäroide die Zellen, die um lumenartige Strukturen organisiert waren, durch differentiale Zellproliferationsmuster und durch das Vorhandensein von CSCs gekennzeichnet waren, die ein Panel von Markern ausdrückten. Diese Ergebnisse liefern den ersten Proof-of-Concept für die Angemessenheit dieses 3D-Ansatzes zur Untersuchung der Zellheterogenität und CSC-Biologie, einschließlich der Reaktion auf Chemotherapie.

Einleitung

Darmkrebs (CRC) ist nach wie vor die zweithäufigste Ursache für krebsassoziierte Todesfälle weltweit¹. Die Entwicklung von SCRC ist das Ergebnis einer fortschreitenden Erfassung und Akkumulation genetischer Mutationen und/oder epigenetischer Veränderungen^2,3, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen und der Inaktivierung von Tumorsuppressorgenen^3,4. Darüber hinaus können nichtgenetische Faktoren (z. B. die Mikroumgebung) zur onkogenen Transformation beitragen und diese fördern und somit an der Entwicklung der SFB

Protokoll

HINWEIS: Die Einzelheiten aller Reagenzien und Materialien sind in der Materialtabelleaufgeführt.

1. Sphäroidbildung

1. Sphäroide Kulturmedien
   1. Bereiten Sie Basalmedium bestehend aus Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 4 mM L-Alanyl-L-Glutamin Dipeptid.
   2. Bereiten Sie DMEM komplettes Medium mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
   3. Bereiten Sie DMEM/Basement Membranmatrixmedium mit 2,5% Kellermembranmatrix, 10% FBS und 1% Pen/Strep im Basalmedium ab Schritt 1.1.1 vor.
2. Vorbereitung von....

Ergebnisse

Da der Mangel an Homogenität in der Größe der Sphäroide einer der Hauptnachteile der derzeit verfügbaren 3D-Sphäroid-Kultursysteme¹³ist, bestand das Ziel dieser Arbeit darin, ein zuverlässiges und reproduzierbares Protokoll zur Erzielung homogener Sphäroide zu erstellen. Um ideale Arbeitsbedingungen zu schaffen, wurden verschiedene Anzahl von Caco2-Zellen getestet, die von 50 bis 2.000 Zellen pro Mikrowell/Spheroid mit speziellen Platten reichten (Tabelle 1.......

Diskussion

In-vitro-3D-Modelle überwinden die wichtigsten experimentellen Nachteile von 2D-Krebszellkulturen, da sie bei der Rekapitulation typischer Tumormerkmale wie Mikroumgebung und Zellheterogenität zuverlässiger zu sein scheinen. Häufig verwendete 3D-Modelle von Sphäroiden sind gerüstfrei (kultiviert unter niedriganbaulichen Bedingungen) oder Gerüstbasis (mit Biomaterialien zur Kulturvon Zellen). Diese Methoden weisen unterschiedliche Nachteile auf, da sie von der Art des verwendeten Gerüsts abhängen oder sphäroide sphärische.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
37 & Mikro; m Wendesieb, groß	STEMCELL Technologies	27250	Zur Verwendung mit konischen 50-ml-Röhrchen
5-Fluorouracil	Geschenk aus der Apotheke des Centre Leon Berard (CLB)	-	Stammlösung, 5 mg/100 mL; Endkonzentration, 50 & Mikro; g/mL
Agarose	Sigma	A9539
Aggrewell 400 24-Well-Platten	STEMCELL Technologies	34411	1.200 Mikrowells pro Well für die Bildung und das Wachstum von Sphäroiden
Anti Caspase3 - Rabbit	Cell Signaling	9661	Verdünnung 1:200
Anti Musashi-1 (14H1) - Rat	eBioscience/Thermo Fisher	14-9896-82	Verdünnung 1:500
Anti-Adhärenz-Spüllösung x 100 mL	STEMCELL Technologies	07010
Anti-CD133 (13A4) - Ratte	Invitrogen	14-133-82	Verdünnung 1:100
Anti-CD44 -Kaninchen	Abcam	ab157107	Verdünnung 1:2000
Anti-PCNA - Maus	Dako	M0879	Verdünnung 1:1000
Anti-Β-Catenin - Maus	Santa Cruz Biotechnology	sc-7963	Verdünnung 1:50
Schwarz Multiwell-Platten	Thermo Fisher Scientific	237108
Zitronensäure-Monohydrat	Sigma	C1909
CLARIOstar-Gerät	BMG Labtech		Mikroplatten-Reader
Dako Stift			Marker zum Markieren von Kreisen auf Objektträgern zur Schaffung von Barrieren für Flüssigkeiten
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21202	Verdünnung 1:1000
Esel Anti-Maus IgG (H+L) Sekundärer Antikörper, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10037	Verdünnung 1:1000
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	Verdünnung 1:1000
Esel Anti-Kaninchen IgG (H+L) Hochgradig kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A10042	Verdünnung 1:1000
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-Alanyl-L-Glutamin-Dipeptid)	Gibco	10569010
Fötales Kälberserum (FBS)	Gibco	16000044
Fluorogel Eindeckmedium mit DAPI	Interchim	FP-DT094B
Ziege Anti-Ratte IgG (H+L) Kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 568	Thermo Fisher Scientific	A11077	Verdünnung 1:1000
ImageJ Software			Sphäroid-Bildanalyse
Irinotecan& nbsp;	Geschenk aus der Apotheke	CLB-Stammlösung	, 20 mg/ml; Endkonzentration, 100 & Mikro; g/mL
iScript reverse Transkriptase	Bio-Rad	1708891
Leucovorin	Geschenk aus der Apotheke CLB-Stammlösung		, 50 mg/ml; Endkonzentration, 25 & Mikro; g/mL
Matrigel Basalmembran-Matrix	Corning	354234	Basalmembran-Matrix
Nucleospin RNA XS Kit	Macherey-Nagel	740902 .250
Oxaliplatin	Geschenk aus der Apotheke CLB-Stammlösung		, 100 mg/20 mL; Endkonzentration, 10 & Mikro; g/mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140130
Phosphatpuffer Kochsalzlösung (PBS)	Gibco	14190250
SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)	Takara	RR420B
SYTOX- Green	Thermo Fisher Scientific	S7020	Nukleinsäure-Färbung; Verdünnung 1:5000
Trypsin-EDTA (0,05 %)	Gibco
Zeiss-Axiovert Mikroskop			Inverses Mikroskop zur Aufnahme von Sphäroiden

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