Summary
Dit protocol presenteert een nieuw, robuust en reproduceerbaar kweeksysteem om driedimensionale sferoïden uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen te genereren en te laten groeien. De resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze aanpak om kankerstamcelbiologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.
Abstract
Colorectale kankers worden gekenmerkt door heterogeniteit en een hiërarchische organisatie bestaande uit een populatie van kankerstamcellen (CSC's) die verantwoordelijk zijn voor tumorontwikkeling, onderhoud en resistentie tegen geneesmiddelen. Een beter begrip van CSC-eigenschappen voor hun specifieke targeting is daarom een vereiste voor effectieve therapie. Er is echter een tekort aan geschikte preklinische modellen voor diepgaand onderzoek. Hoewel in vitro tweedimensionale (2D) kankercellijnen waardevolle inzichten bieden in tumorbiologie, repliceren ze de fenotypische en genetische tumor heterogeniteit niet. Driedimensionale (3D)-modellen daarentegen pakken bijna-fysiologische kankercomplexiteit en cel heterogeniteit aan en reproduceren deze. Het doel van dit werk was om een robuust en reproduceerbaar 3D-cultuursysteem te ontwerpen om CSC-biologie te bestuderen. De huidige methodologie beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van omstandigheden om 3D-sferoïden, die homogeen van grootte zijn, te genereren uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen, een model dat kan worden gebruikt voor langetermijncultuur. Belangrijk is dat binnen de sferoïden de cellen die waren georganiseerd rond lumenachtige structuren, werden gekenmerkt door differentiële celproliferatiepatronen en door de aanwezigheid van CSC's die een paneel van markers uitdrukken. Deze resultaten vormen de eerste proof-of-concept voor de geschiktheid van deze 3D-benadering om cel heterogeniteit en CSC-biologie te bestuderen, inclusief de respons op chemotherapie.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) blijft de tweede belangrijkste oorzaak van kanker-geassocieerde sterfgevallen in de wereld1. De ontwikkeling van CRC is het resultaat van een progressieve verwerving en accumulatie van genetische mutaties en/of epigenetische veranderingen2,3, met inbegrip van de activering van oncogenen en inactivatie van tumoronderdrukkergenen3,4. Bovendien kunnen niet-genetische factoren (bv. het micromilieu) bijdragen tot en de oncogene transformatie bevorderen en zo deelnemen aan de ontwikkeling van CRC's5. Belangrijk is dat CRC's bestaan uit verschillende celpopulaties, waaronder ongedifferentieerde CSC's en bulktumorcellen die enkele differentiatiekenmerken vertonen, die een hiërarchische structuur vormen die doet denken aan de organisatie van het epitheel in een normale coloncrypte 6,7.
CSC 's worden geacht verantwoordelijk te zijn voor het verschijnen vantumoren 8, het onderhoud en de groei ervan, de gemetastaseerde capaciteit en de resistentie tegen conventionele therapieën6,7. Binnen tumoren vertonen kankercellen, waaronder CSC's, een hoog niveau van heterogeniteit en complexiteit in termen van hun verschillende mutatie- en epigenetische profielen, morfologische en fenotypische verschillen, genexpressie, metabolisme, proliferatiepercentages en gemetastaseerd potentieel9. Daarom, om kankerbiologie, tumorprogressie en het verwerven van resistentie tegen therapie en de vertaling ervan in effectieve behandelingen beter te begrijpen, zijn menselijke preklinische modellen die deze kanker heterogeniteit en hiërarchie vastleggen belangrijk10,11.
In vitro 2D-kankercellijnen worden al lange tijd gebruikt en bieden waardevolle inzichten in tumorontwikkeling en de mechanismen die ten grondslag liggen aan de werkzaamheid van therapeutische moleculen. Hun beperking met betrekking tot het ontbreken van de fenotypische en genetische heterogeniteit gevonden in de oorspronkelijke tumoren wordt nu echter algemeen erkend12. Bovendien worden nutriënten, zuurstof, pH-gradiënten en het micromilieu van de tumor niet gereproduceerd, waarbij het micromilieu vooral belangrijk is voor het behoud van verschillende celtypen, waaronder CSC's11,12. Om deze belangrijkste nadelen te overwinnen, zijn verschillende 3D-modellen ontwikkeld om de complexiteit en heterogeniteit van kankers experimenteel aan te pakken en te reproduceren. In feite vatten deze modellen tumor cellulaire heterogeniteit, cel-cel interacties en ruimtelijke architectuur samen, vergelijkbaar met die waargenomen in vivo12,13,14. Primaire tumororganoïden die zijn vastgesteld op basis van verse tumoren, evenals van cellijn afgeleide sferoïden, worden grotendeels gebruikt15,16.
Sferoïden kunnen op een steigervrije of steigergebaseerde manier worden gekweekt om de cellen te dwingen zich te vormen en te groeien in celaggregaten. Steigervrije methoden zijn gebaseerd op de cultuur van cellen onder niet-aanhangende omstandigheden (bv. de ophangingsmethode of ultralage bevestigingsplaten), terwijl steigermodellen afhankelijk zijn van natuurlijke, synthetische of hybride biomaterialen voor kweekcellen12,13,14. Op steigers gebaseerde sferoïden hebben verschillende nadelen, omdat de uiteindelijke sferoïdevorming afhankelijk is van de aard en samenstelling van het gebruikte (bio)materiaal. Hoewel de tot nu toe beschikbare steigervrije sferoïdemethoden niet afhankelijk zijn van de aard van het substraat, genereren ze sferoïden die variëren in structuur en grootte17,18.
Dit werk was gericht op het ontwerpen van een robuust en reproduceerbaar 3D-kweeksysteem van sferoïden, die homogeen van grootte zijn, samengesteld uit Caco2 colon adenocarcinoomcellen om CSC-biologie te bestuderen. Caco2-cellen zijn van bijzonder belang vanwege hun vermogen om in de loop van de tijd19,20te differentiëren , wat sterk wijst op een stamachtig potentieel. Dienovereenkomstig onthulde de langetermijncultuur van de sferoïden de aanwezigheid van verschillende CSC-populaties met verschillende reacties op chemotherapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: De details van alle reagentia en materialen zijn opgenomen in de tabel met materialen.
1. Sferoïde vorming
- Sferoïde cultuurmedia
- Bereid basaal medium bestaande uit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 4 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide.
- Bereid DMEM compleet medium met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine (Pen/Strep) in basaal medium vanaf stap 1.1.1.
- Bereid DMEM/keldermembraanmatrixmedium voor met 2,5% keldermembraanmatrix, 10% FBS en 1% Pen/Strep in basaal medium vanaf stap 1.1.1.
- Voorbereiding van platen voor sferoïde vorming
- Warm basaal en DMEM/keldermembraanmatrixmedium bij kamertemperatuur (RT) gedurende ongeveer 20 min.
- Voorbehandel de putten van een 24-put plaat gewijd aan sferoïde vorming door 500μL anti-therapie spoeloplossing aan elke put toe te voegen.
OPMERKING: In deze platen bestaat elke put uit 1.200 microwells. - Centrifugeer de plaat op 1.200 × g gedurende 5 minuten in een schommelende emmerrotor met adapters voor platen.
OPMERKING: Als er slechts één plaat wordt gebruikt, bereid dan een extra standaardplaat gevuld met water voor om het gewicht tegen te gaan. - Spoel elke put af met 2 ml warm basaal medium en aspireer het medium uit de putten.
- Let op de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de bellen volledig uit de microwells zijn verwijderd. Als de bellen vastzitten, centrifugeer dan opnieuw op 1.200 × g gedurende 5 minuten om de bellen te verwijderen.
- Herhaal de spoelstappen 1.2.4-1.2.5.
- Voeg 1 ml warme DMEM / keldermembraanmatrix medium toe aan elke put.
- Generatie van sferoïden
- Kweek de Caco2-cellen in een 2D-monolaag in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 (hierna 37 °C/5% CO2genoemd).
OPMERKING: Het maximum aantal te gebruiken celpassages is 80. - Wanneer 80% van de samenvloeiing is bereikt, wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 1x (5 ml voor een schaal van 10 cm), voegt u trypsine-ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (2 ml voor een schaal van 10 cm) toe en incubeert u gedurende 2-5 minuten bij 37 °C/5% CO2.
- Controleer de celloslating onder de microscoop en neutraliseer de trypsine door 4 ml DMEM compleet medium per schaal van 10 cm toe te voegen.
- Tel cellen met behulp van een hemocytometer om het totale aantal cellen te bepalen.
- Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten op 1.200 × g. Gooi het supernatant weg en resuspend de pellet in een geschikt volume DMEM/keldermembraanmatrixmedium.
- Raadpleeg tabel 1 om het aantal cellen te bepalen dat per put nodig is om het gewenste aantal cellen per microwell te bereiken. U kunt ook het aantal cellen berekenen met behulp van de volgende formule voor een plaat met 24 putten, aangezien elke put 1.200 microwells bevat
Vereist aantal cellen per put = Gewenst aantal cellen per microwell × 1.200 - Voeg het vereiste volume van de celsuspensie toe aan elke put om het gewenste celnummer te bereiken in een eindvolume van 1 ml.
- Voeg 1 ml DMEM/keldermembraanmatrixmedium toe aan elke put om het uiteindelijke volume van 2 ml per put te bereiken (zie ook stap 1.2.7).
OPMERKING: Zorg ervoor dat u geen bellen in de microwells brengt. - Centrifugeer de plaat onmiddellijk op 1.200 × g gedurende 5 minuten om de cellen in de microwells op te vangen. Indien nodig, tegenwicht van de centrifuge met een standaardplaat gevuld met water.
- Observeer de plaat onder de microscoop om te controleren of de cellen gelijkmatig over de microwells zijn verdeeld.
- Incubeer de plaat bij 37 °C/5% CO2 gedurende 48 uur zonder de plaat te verstoren.
OPMERKING: Volgens het oorspronkelijke protocol21, hoewel veel cellijnen binnen 24 uur sferoïden kunnen vormen, vereisen sommige een langere incubatietijd. In dit protocol is 48 uur voldoende voor sferoïde vorming.
- Kweek de Caco2-cellen in een 2D-monolaag in DMEM-medium aangevuld met 10% FBS en 1% Pen/Strep bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 (hierna 37 °C/5% CO2genoemd).
- Het oogsten van de sferoïden uit de microwells
- Verwarm het basale en DMEM/keldermembraanmatrixmedium bij RT gedurende ongeveer 20 minuten.
- Verwijder met behulp van een serologische pipet de helft van het kweekmedium (1 ml) uit elke put.
- Voeg het medium terug toe aan het oppervlak van de put om de sferoïden uit de microwells te verdrijven.
OPMERKING: Raak de sferoïden niet aan of tritureer ze niet. - Plaats een omkeerbare zeef van 37 μm (of een standaardzeef van 40 μm) op de bovenkant van een conische buis van 15 ml om de sferoïden te verzamelen.
OPMERKING: Als u een standaardzeef van 40 μm gebruikt, plaatst u deze ondersteboven. - Aspireer voorzichtig de losgeraakte sferoïden (vanaf stap 1.4.3) en passeer de sferoïde suspensie door de zeef.
OPMERKING: De sferoïden blijven op het filter achter; enkele cellen stromen door met het medium. - Doseer met behulp van een serologische pipet 1 ml van het warme basale medium over het hele oppervlak van de put om eventuele resterende sferoïden los te maken en op de zeef te herstellen.
- Herhaal deze wasstap 1.4.6 tweemaal.
- Let op de plaat onder de microscoop om er zeker van te zijn dat alle sferoïden uit de microwells zijn verwijderd. Herhaal de was indien nodig (stappen 1.4.6-1.4.7).
- Keer de zeef om en plaats deze op een nieuwe conische buis van 15 ml. Verzamel de sferoïden door de zeef te wassen met DMEM/keldermembraanmatrixmedium.
OPMERKING: De verzamelde sferoïden zijn klaar voor downstream toepassingen en analyses.
- Langetermijncultuur van sferoïden
- Bereid 1,5% agarose-oplossing in basaal medium en steriliseer deze door autoclaaf (standaardcyclus).
- Terwijl de agarose-oplossing warm en nog vloeibaar is, bedek de putten van standaard kweekplaten of gerechten, zoals beschreven in tabel 2.
OPMERKING: Het opwarmen van de schaal/plaat in de oven vergemakkelijkt de coatingstap. Gecoate borden/borden kunnen maximaal 10 dagen bij RT worden bewaard in een steriele omgeving en beschermd tegen het licht. - Zaai de geoogste sferoïden (vanaf stap 1.4.9) in de met agarose bedekte platen en voeg DMEM/keldermembraanmatrixmedium toe om het uiteindelijke volume te bereiken, afhankelijk van de grootte van de plaat.
OPMERKING: Om sferoïde aggregaten te voorkomen, zaait u ze met de optimale dichtheid van 22 sferoïden/cm2. Merk op dat de coating niet perfect vlak is en naar de rand stijgt, waardoor een lichte concaviteit in het midden van de plaat ontstaat. Als het aantal sferoïden te hoog is, hebben ze meer kans om zich aan elkaar te hechten. - Incubeer de plaat bij 37 °C/5% CO2 tot de sferoïden voor specifieke analyses worden teruggewinningd.
- Behandeling van sferoïden met chemotherapeutische geneesmiddelen
- Plaat sferoïden uit stap 1.5.4, en kweek ze gedurende 2 dagen. Behandel ze vanaf dag 3 (D3) met FOLFIRI (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml) of met FOLFOX (5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatine, 10 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml) chemotherapeutische regimecombinaties die routinematig worden gebruikt voor de behandeling van CRC-patiënten22,23,24,25, of om ze in (controle)niet-behandelde (NT) toestand te houden.
- Verzamel de sferoïden na 3 dagen behandeling met behulp van een pipet met de tip afgesneden (1.000 μL tip), zodat elke aandoening wordt vertegenwoordigd door ten minste drie replica's. Centrifugeer ze op 1000 × g gedurende 3 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
- Bevestig de pellets in 2% paraformaldehyde (PFA) voor histologische analyse (zie rubriek 3), of gebruik de pellets voor RNA-extractie (zie rubriek 4).
- Om celdood te analyseren, incubeer de sferoïden vanaf stap 1.6.1 in zwarte kweekputplaten in DMEM / keldermembraanmatrixmedium gedurende 30 minuten met een nucleïnezuurvlek (1:5000 verdunning) die geen levende cellen doordringt, maar de aangetaste membranen van dode cellen doordringt26. Meet de accumulatie van fluorescentie met een microplaatlezer.
2. Monitoring van sferoïde groei
- Verkrijg met behulp van een omgekeerde microscoop representatieve beelden van sferoïden die gedurende de dagen in cultuur onder verschillende omstandigheden worden bewaard.
- Analyseer de beelden door drie verschillende representatieve diameters van elke sferoïde te meten met behulp van de juiste software.
- Gebruik de volgende formule om het geschatte bolvolume te verkrijgen.
OPMERKING: De termen d1, d2 en d3 zijn de drie diameters van de sferoïde.
3. Immunofluorescentie (IF) en histologische kleuring
- Fixatie en paraffine inbedding
- Verzamel de sferoïden op geselecteerde tijdstippen met behulp van een pipet met de punt afgesneden zoals beschreven in stap 1.6.2, en bevestig ze gedurende 30 minuten bij RT in 2% PFA.
OPMERKING: U kunt de monsters ook bij deze stap bij 4 °C bewaren tot verder gebruik. - Voor paraffine-inbedding, was de sferoïden 3x met PBS 1x en resuspend ze in 70% ethanol. Voer na paraffine-inclusie en -doorsnede hematoxyline & eosine (H&E) kleuring uit voor histologische analyse.
- Verzamel de sferoïden op geselecteerde tijdstippen met behulp van een pipet met de punt afgesneden zoals beschreven in stap 1.6.2, en bevestig ze gedurende 30 minuten bij RT in 2% PFA.
- Immunolabeling van paraffinesecties
OPMERKING: Gebruik 5-μm dikke secties voor indirecte immunostaining.- Incubeer dia's bij 60 °C gedurende 2 uur om de was te smelten en de deparaffinisatie te verbeteren.
- Was de dia's tweemaal gedurende 3 minuten in methylcyclohexaan.
- Was de dia's gedurende 3 minuten in 1:1 methylcyclohexaan:100% ethanol.
- Was de dia's twee keer gedurende 3 minuten in 100% ethanol.
OPMERKING: Voer alle manipulaties uit voor stap 3.2.2 tot stap 3.2.4 in een chemische kap. - Was de dia's 3 min in 90% ethanol.
- Was de dia's 3 min in 75% ethanol.
- Was de dia's 3 min in 50% ethanol.
- Was de glijbanen onder leidingwater.
- Rehydrateer de dia's gedurende 5 minuten in gedestilleerd water.
- Bereid 700 ml citraatbuffer van 0,01 m, pH 6,0, en voeg deze toe aan een geschikte container (breedte: 11,5 cm, lengte: 17 cm, hoogte: 7 cm); dompel de dia's erin. Verwarm de container in de magnetron gedurende 9-10 minuten op 700 W en wanneer het koken begint, vermindert u het vermogen tot 400-450 W. Incubeer nog eens 10 minuten.
- Laat de dia's ongeveer 30-40 minuten afkoelen in de buffer naar RT.
- Was de dia's tweemaal in PBS gedurende 5 minuten.
- Teken een cirkel rond de secties met een markeerstift om een barrière te creëren voor vloeistoffen die op de secties worden aangebracht.
- Incubeer elke sectie met 50 μL blokkerende buffer (10% normaal geitenserum, 1% runderserumalbumine (BSA) en 0,02% Triton X-100 in PBS) gedurende ten minste 30 minuten bij RT.
- Verwijder de blokkerende buffer en voeg 50 μL primaire antilichamen toe die zijn verdund in de incubatiebuffer (1% normaal geitenserum, 0,1% BSA en 0,02% Triton X-100 in PBS). Incubeer gedurende 2 uur bij RT of 's nachts bij 4 °C.
- Verwijder de primaire antilichamen en was de dia's 3x in PBS gedurende 5 minuten.
- Incubeer de dia's met 50 μL fluorescerende secundaire antilichamen verdund in de incubatiebuffer gedurende 1 uur bij RT.
- Verwijder de secundaire antilichamen en was de dia's 3x in PBS gedurende 5 minuten.
- Voeg 50 μL montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindole toe aan elke sectie en plaats een glazen afdeklip over de sectie.
4. RNA-extractie, omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-PCR) en kwantitatieve RT-PCR (qRT-PCR)
- Verzamel sferoïden op verschillende tijdstippen, elk punt vertegenwoordigd door ten minste drie replica's. Centrifugeer ze op 1000 × g gedurende 3 minuten en verwijder vervolgens het supernatant.
OPMERKING: Pellets kunnen direct worden gebruikt voor RNA-extractie of worden opgeslagen bij -20 °C tot verder gebruik. - Isoleer het totale RNA met behulp van een commerciële RNA-isolatiekit, volgens de instructies van de fabrikant.
- Transcriberen 500 ng van elk RNA-monster in complementair DNA (cDNA) met een commerciële kit volgens de instructies van de fabrikant.
- Voer na omgekeerde transcriptie een PCR-analyse uit op 1 μL cDNA om een huishoudelijk gen te versterken met primers in verschillende exons.
OPMERKING: Deze stap maakt het mogelijk om de afwezigheid van genomische DNA-besmetting in de RNA-preparaten te verifiëren. Voor dit protocol werden peptidylprolyl isomerase B(PPIB) primers gebruikt. - Voer qPCR-versterking uit op 4 μL eerder verdund cDNA (1:10 in RNAsevrij dubbel gedestilleerd water) met primers die specifiek zijn voor de genen van belang. Kwantificeer in elk monster specifieke mRNA-expressie met behulp van de ΔΔCt-methode en waarden die zijn genormaliseerd ten opzichte van een huishoudgenniveau.
OPMERKING: Voor dit protocol is β-actin (ACTB) geselecteerd. Primers die in dit protocol worden gebruikt, worden vermeld in tabel 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aangezien het gebrek aan homogeniteit in de grootte van sferoïden een van de belangrijkste nadelen is van de momenteel beschikbare 3D-sferoïdekweeksystemen13, was het doel van dit werk om een betrouwbaar en reproduceerbaar protocol op te zetten om homogene sferoïden te verkrijgen. Ten eerste werden verschillende aantallen Caco2-cellen getest om ideale werkomstandigheden vast te stellen, variërend van 50 tot 2.000 cellen per microwell/spheroid met behulp van speciale platen (Tabel 1). In feite bevat elke put in deze platen 1.200 microwells, waardoor de vorming van hetzelfde aantal sferoïden per put mogelijk is, en nog belangrijker, de vorming van één sferoïde per microwell21. Na twee dagen kweek groeiden de putten met 2.000 cellen per sferoïde als een monolaag, en 50 cellen per sferoïde gaven aanleiding tot kleine en niet-homogene sferoïden (figuur 1A). Deze twee voorwaarden werden derhalve uitgesloten van verdere analyses. Om langdurige culturen vast te stellen, werden sferoïden uit de microwells geoogst en onder niet-aanhechtende omstandigheden gezaaid in vers bereide met agarose bedekte platen. De sferoïdegroei werd vervolgens gedurende de experimentele tijdsverloop gemonitord door de verandering in volume te meten. Om rekening te houden met de niet-bolvorm werden drie verschillende diameters van elke sferoïde gemeten en werd de volumeformule toegepast27 (figuur 1B). Sferoïden die uit 100 en 200 cellen werden gegenereerd, handhaafden hun oorspronkelijke grootte gedurende de hele loop van het experiment, terwijl die met 1.000 cellen tijdens het oogsten uiteenvielen vanwege hun grote omvang en bijgevolg meer variabiliteit in hun volume vertoonden. Daarom, aangezien sferoïden die uit 500 cellen voortkwamen de meest homogene toename in grootte over de experimentele tijdsloop vertoonden, werd dit aantal cellen gebruikt voor sferoïdevorming.
Ten tweede werden naast 500 cellen per sferoïde ook extra celaantallen van 300 tot 800 cellen bestudeerd. Bovendien, om de niet-aanhanfde omstandigheden te verbeteren, werd het oorspronkelijke protocol gewijzigd door de putten twee keer voor te behandelen in plaats van slechts één wasbeurt aan te brengen. Bij deze veranderingen werd een verbetering van de homogeniteit en verdichting van sferoïden waargenomen (figuur 2A). De grootte van de sferoïden in elke toestand werd gemeten op het moment van de oogst (figuur 2B), en hun groei op lange termijn werd gedurende de dagen in cultuur in met agarose bedekte gerechten gemonitord (figuur 2C). Op basis van de resultaten werden 500 en 600 cellen/sferoïde bevestigd als de optimale omstandigheden die een goede groei en lage variabiliteit opleverden. Vanwege het homogenere groeiprofiel gedurende de experimentele tijdsloop en de gevormde compacte structuren, werden 600 cellen per sferoïde geselecteerd als celnummer voor latere experimenten. Ten slotte, om het protocol verder te verbeteren, werd DMEM complete medium aangevuld met 2,5% keldermembraanmatrix, die extra groeifactoren en een groot paneel extracellulaire matrixeiwittenbevat 28. De multilobulaire vorm van de sferoïden kan inderdaad te wijten zijn aan het gebrek aan signalen van de micro-omgeving die de celpolarisatie kunnen hebben beïnvloed29,30. De toevoeging van keldermembraanmatrix verbeterde de sferoïdegroei en verbeterde hun homogeniteit (Figuur 2D). Een voorbeeld van deze verbetering is te zien voor 500 cellen per sferoïde. Bij afwezigheid van de keldermembraanmatrix(figuur 1B)was de grootte van de sferoïden heterogeener, verdubbelde van D3 naar D7 en bereikte vervolgens een plateau. In aanwezigheid van de keldermembraanmatrix(figuur 2C)was de grootte van de sferoïden op elk tijdspunt echter homogener en steeg deze in de loop van de tijd proportioneel.
Om langetermijnkenmerken van de sferoïden te analyseren, werden ze op verschillende tijdstippen na de kweek teruggevonden in met agarose bedekte gerechten voor gedetailleerde histologische en IF-analyses op paraffinesecties. H&E-kleuring toonde aan dat cellen binnen de sferoïden in de loop van de tijd veranderingen in hun organisatie en vorm ondergingen. Inderdaad, cellen waren dicht gerangschikt in meerlagen bij D3, terwijl afgeplatte cellen gerangschikt in monolagen duidelijk zichtbaar waren bij D10. Interessant is dat, zoals aangegeven door de zwarte stippellijnen in de afbeeldingen, vanaf D5 een lumen in de sferoïden verscheen (figuur 3). Tegelijkertijd werden celproliferatie en apoptose geanalyseerd door IF met behulp van de proliferatiemarker, proliferatie van celkernantigeen (PCNA) en de celdoodmarker, geactiveerde caspase 3. Etikettering voor PCNA onthulde dat proliferatiecellen vaak aanwezig waren aan de buitenkant van de sferoïden, soms in cryptische of knopachtige structuren die doen denken aan organoïde culturen15. Bovendien werd een duidelijke toename van PCNA-positieve cellen bij D5 en D7 waargenomen die met D10 daalde (figuur 4, linkerpanelen). Verrassend genoeg werd geactiveerd caspase 3 waargenomen in zeer weinig cellen in de sferoïden bij zowel D3 als D5(figuur 4, linkerpanelen) en over langere perioden (gegevens niet weergegeven). Het expressiepatroon van β-catenine werd ook geëvalueerd in paraffinesecties. Interessant is dat op elk moment hoge niveaus van β-catenine-expressie werden waargenomen met duidelijke membraangebonden en cytoplasmatische kleuring(figuur 4,rechterpanelen). Het is vermeldensgetrouw dat membraangebonden β-catenine deelneemt aan celceladhesie door binding aan E-cadherine31. Een hoog niveau van ß-catenine labeling werd waargenomen in clusters van cellen op alle tijdstippen. In sommige gevallen vertoonden cellen ook duidelijke nucleaire ß-catenine lokalisatie(figuur 4,rechterpanelen). Van caco2-cellen is bekend dat ze in vitro in 2D voornamelijk differentiëren in enterocyten19,32. De expressie van differentiatiemarkers, zoals chromogranine A (enteroendocrinecellen), lysozym (Paneth-cellen) of mucine 2 (MUC 2, bokaalcellen), was echter niet detecteerbaar in deze sferoïden door IF (gegevens niet weergegeven). Het potentieel om te differentiëren in enterocyten werd echter bevestigd, aangezien de sferoïden ALPI (alkalische fosfatase) en opgeloste dragerfamilie 2, transcriptievariant 2 (SLC2A5)/glucosetransporter 5 (GLUT5) mRNAs (Figuur 5) uitdrukten. Deze mRNA-niveaus stegen bij D5 en D7, maar het verschil was ofwel niet significant (ALPI) of slechts marginaal significant (SLC2A5) in vergelijking met de niveaus op D3.
Met als uiteindelijke doel te bepalen of de sferoïden die op basis van deze nieuwe methode worden gegenereerd en gekweekt een betrouwbaar hulpmiddel zijn om CSC's te bestuderen, werd de expressie van CSC-markers geanalyseerd door IF en qRT-PCR. CD133 en CD44 kenmerken kankercelpopulaties, waaronder CSC 's7,33,34 en worden ook uitgedrukt door SCs in de normale darm en dikke darm33,34,35. Clusters van CD133-positieve cellen werden voornamelijk gelokaliseerd op het externe oppervlak van de sferoïden op elk tijdspunt(figuur 6A, linkerpanelen). CD44-positieve cellen kwamen minder vaak voor, maar werden altijd geassocieerd met CD133-positieve cellen(figuur 6A, rechterpanelen), wat wijst op het bestaan van een populatie cd133/cd44 dubbelpositieve CSC-achtige cellen en een populatie die alleen CD133 uitdrukt. Olfactomedin 4 (OLFM4) en Musashi 1 (MSI1) werden onderzocht als SC/CSC-markers; deze markers worden op zeer beperkte wijze uitgedrukt in colon crypten36,37 en ook in afzonderlijke celpopulaties35,38. Slechts enkele MSI1-positieve cellen werden op elk tijdstip waargenomen (figuur 7), terwijl OLFM4 niet detecteerbaar bleef (gegevens niet weergegeven). Niettemin, zoals waargenomen voor CD44 en CD133, bevonden MSI1-gelabelde cellen zich op het externe oppervlak van de sferoïden in cryptische of knopachtige structuren. Dezelfde markers werden ook geanalyseerd op mRNA-niveau op dezelfde tijdspunten na cultuur in met agarose bedekte gerechten. Aldehydedehydrogenase 1 (ALDH1a1), een goed gekarakteriseerde marker van CSC's39,40, werd ook in de studie opgenomen (figuur 8). De analyse van prominine-1(PROM1-codering voor CD133) en CD44 mRNAs bevestigde de expressie van beide markers in sferoïden op alle geanalyseerde tijdstippen. Hoewel de PROM1 mRNA-niveaus in de loop van de tijd in cultuur vrij vergelijkbaar waren, daalden de CD44-niveaus vanaf D3. Het verschil was echter slechts marginaal significant bij het vergelijken van de mRNA-niveaus van D10 en D3.
De analyse van MSI1 mRNA bevestigde de expressie ervan in sferoïden op elk tijdstip, met significant hogere niveaus bij D3 en D5 in vergelijking met die bij D7 of D10 (figuur 8), terwijl OLFM4 mRNA niet detecteerbaar was (niet weergegeven). Ten slotte werd ALDH1a1 mRNA op elk tijdstip uitgedrukt in sferoïden en vertoonde het een expressieprofiel dat bij D10 daalde, waarbij de niveaus slechts marginaal significant waren in vergelijking met die bij D3 (figuur 8). Om de geschiktheid van het nieuwe model voor de studie van kankercelbiologie te valideren, werd de respons op chemotherapie geanalyseerd in sferoïden die werden behandeld met FOLFOX of FOLFIRI, combinatietherapieën die routinematig werden toegediend aan CRC-patiënten22,23,24,25. Ten eerste werd de werkzaamheid van de behandelingen bij het induceren van celdood onderzocht door de sferoïden te incuberen met een fluorescerende nucleïnezuurvlek die specifiek in dode cellen terechtkomt26. In vergelijking met de controle-NT-toestand veroorzaakte de behandeling met elk van de geneesmiddelen significante celdood, gemeten aan de hand van de accumulatie van fluorescentie (figuur 9A). Deze observatie werd ook bevestigd op morfologisch niveau met behulp van levende microscopie, waaruit bleek dat de behandelingen de grootte en het uiterlijk van de sferoïden sterk beïnvloedden (figuur 9B). Ten slotte werd de expressie van SC/CSC-markers geanalyseerd door qRT-PCR in sferoïden onder dezelfde omstandigheden (Figuur 9C). Intrigerend genoeg werd een significante daling van prom1 mRNA-niveaus onder zowel FOLFOX- als FOLFIRI-omstandigheden waargenomen in vergelijking met de niveaus voor de controle, terwijl MSI1-niveaus niet werden beïnvloed door de behandelingen. Bovendien, terwijl FOLFOX geen effect had op de ALDH1a1 mRNA-expressie in vergelijking met de controle, verhoogde de behandeling met FOLFIRI de niveaus aanzienlijk. OLFM4 mRNA werd niet gedetecteerd en cd44 mRNA-niveaus waren extreem laag (gegevens niet weergegeven).
Figuur 1: Opstelling van sferoïde culturen. (A) Sferoïde vorming geïnitieerd uit de aangegeven concentraties caco2 cellen per spheroid/microwell. Het bovenste paneel toont een representatief beeld van een hele cultuurplaat na twee dagen cultuur. Het onderste paneel toont afbeeldingen van geselecteerde microwells per voorwaarde. De beelden werden genomen bij 4x vergroting (microwellgrootte: 400 μm). Schaalbalken: lage vergroting, 100 μm; hoge vergroting, 30 μm. (B) Groeikenmerken van de sferoïden gegenereerd uit verschillende soorten cellen per microwell en geanalyseerd op verschillende tijdstippen. Merk op dat de aangegeven dagen de eerste twee dagen van cultuur in de microwells en de daaropvolgende cultuur van de geoogste sferoïden in met agarose bedekte platen omvatten. Histogrammen tonen gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 4–6. Zwarte cirkels tonen de waarden voor individuele sferoïden. De formule voor het geschatte volume wordt weergegeven in het bovenste deel van het paneel, waar d1, d2 en d3 de drie diameters aangeven die voor elke bolide worden gemeten. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Optimalisatie van de condities voor sferoïde vorming en cultuur. (A) Representatieve beelden van sferoïden bij D7 na hun herstel uit de microwells (2 dagen) en cultuur in met agarose bedekte gerechten (5 dagen), met behulp van nieuwe goed voorbereide en kweekmediumomstandigheden. Schaalbalk: 30 μm. (B) Geschat volume van de vers geoogste sferoïden twee dagen na het begin van de celkweek in de microwells. Histogrammen tonen gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 4–6. Zwarte cirkels geven de grootte van de afzonderlijke sferoïden aan. (C) Geschat volume van de sferoïden in de langetermijncultuur op basis van de nieuw geselecteerde omstandigheden. Grafieken tonen de groeikenmerken van de sferoïden gegenereerd uit verschillende soorten cellen per sferoïde en geanalyseerd op verschillende tijdstippen na hun oogst, zoals aangegeven. Histogrammen tonen gemiddelde ± SD, n = 6–10. Zwarte cirkels geven de grootte van de afzonderlijke sferoïden aan. (D) Representatieve beelden van de gekozen 600 cellen per sferoïde toestand gedurende de experimentele tijdsloop (rechterpanelen) en binnen de microwells (linkerpaneel). De beelden werden genomen bij 4x vergroting. Schaalbalken: lage vergroting, 100 μm; hoge vergroting, 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Histologische karakterisering van de sferoïden. Histologische hematoxyline en eosine (H&E) kleuring van paraffine secties. Representatieve beelden van sferoïden op de aangegeven tijdstippen na de oogst, zoals aangegeven. Zwarte stippellijnen in elke hoge vergrotingsinzet afbakenen het lumen binnen de sferoïden. Schaalbalken: lage vergroting, 30 μm; hoge vergroting, 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Caco2 sferoïde karakterisering door immunolabeling. Immunostaining van sferoïden voor proliferatiemarker, proliferatiecel nucleair antigeen (PCNA, rood) en celdoodmarker, geactiveerde caspase 3 (groen) (linkerpanelen) en voor β-catenine (rood) (rechterpanelen) op de aangegeven tijdstippen. Afbeeldingen tonen samengevoegde labels van PCNA (rood), geactiveerde caspase 3 (groen) en kernen (blauw) of van β-catenine (rood) en kernen (blauw). Witte pijlen wijzen naar cellen of groepen cellen die hoge niveaus van β-catenine uitdrukken. De foto's zijn gemaakt met een 20x objectief. Schaalbalk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Analyse van enterocytdifferentiatiemarkers door qRT-PCR. Analyse van ALPI en SLC2A5 die coderen voor respectievelijk alkalische fosfatase en GLUT5-eiwitten. Histogrammen tonen gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 3, na normalisatie ten opzichte van ACTB. Gegevens worden weergegeven als vouwverandering ten opzichte van normaal darmslijmvlies (rode lijn = 1). NS: niet significant; MS: marginaal significant in vergelijking met D3 door onbetaalde Student's t-test. Afkortingen: qRT-PCR = kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerase kettingreactie; GLUT5 = glucosetransporter 5; SLC2A5 = solute carrier family 2, transcriptie variant 2; ACTB = β-actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Heterogene expressie van stamcelmarkers, CD44 en CD133, in de sferoïden. Immunostaining voor de stamcelmarkers, CD133 en CD44, op de aangegeven tijdstippen. Afbeeldingen in de linkerpanelen tonen samengevoegde labels van CD133 (groen) en kernen (blauw); dezelfde afbeeldingen in de rechterpanelen tonen samengevoegde labels van CD44 (rood) en kernen (blauw). Groene pijlen in de linkerpanelen wijzen naar CD133-uitdrukkende cellen en witte pijlen in beide panelen wijzen naar cellen of groepen cellen die CD44 en CD133 uitdrukken. Beelden werden verworven met een 20x doel. Schaalbalk: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Heterogene expressie van stamcelmarker, MSI1, in de sferoïden. Immunostaining voor de stamcelmarker MSI1 (rood) op de aangegeven tijdstippen. Afbeeldingen tonen samengevoegde labels van MSI1 (rood) en kernen (blauw). Witte stippellijnen onderstrepen enkele cryptische structuren waar cellen positief zijn voor MSI1-immunolabeling. De foto's zijn genomen met een vergroting van 20x. Schaalbalk: 5 μm. Afkorting = MSI1 = Musashi 1. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 8: Analyse van stamcelmarkers door qRT-PCR. Kwantificering van PROM1-, CD44-, MSI1- en ALDH1a1-niveaus werd uitgevoerd op mRNA uit sferoïden op de aangegeven tijdstippen. Histogrammen tonen gemiddelde ± standaarddeviatie, n = 3, na normalisatie ten opzichte van ACTB. Gegevens worden weergegeven als vouwverandering ten opzichte van normaal darmslijmvlies (rode lijn = 1). NS: niet significant; MS: marginaal significant in vergelijking met D3, met behulp van de t-testvan de onbetaalde student. *: P < 0,05 in vergelijking met D3 of D5, met behulp van de t-toetsvan de onbetaalde student. Afkortingen: qRT-PCR = kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerase kettingreactie; PROM1 = prominine-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehydedehydrogenase 1 alfa; ACTB = β-actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 9: Effect van chemotherapie op sferoïden. Na het oogsten uit de microwells werden sferoïden gekweekt in met agarose bedekte platen en gedurende 3 dagen behandeld met FOLFOX of FOLFIRI of werden ze in (controle)niet-behandelde (NT) toestand gehouden. (A) Analyse van fluorescentie als gevolg van etikettering van nucleïnezuur in dode cellen. Histogrammen tonen gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), n = 4. (B) Morfologische kenmerken van de sferoïden die in de verschillende kweekomstandigheden worden gehandhaafd. De foto's zijn gemaakt met een 4x objectief. Schaalbalk: 400 μm. (C) Kwantificering van PROM1, MSI1 en ALDH1a1 mRNAs door qRT-PCR. Histogrammen tonen gemiddelde ± SD, n = 4, na normalisatie tegen ACTB. *: NS: niet significant; P < 0,05; **: P < 0,01; : P < 0,001 in vergelijking met de controlevoorwaarde (NT), met behulp van de niet-gevrije student-t-toets. Afkortingen: FOLFOX = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Oxaliplatine, 10 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml ; FOLFIRI = 5-Fluorouracil, 50 μg/ml; Irinotecan, 100 μg/ml; Leucovorine, 25 μg/ml; qRT-PCR = kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerasekettingreactie; PROM1 = prominine-1; MSI1 = Musashi 1; ALDH1α1 = aldehydedehydrogenase 1 alfa; ACTB = β-actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
| Gewenst aantal cellen per sferoïde | Vereist aantal cellen per put |
| 50 | 6 x 104 |
| 100 | 1,2 x 105 |
| 200 | 2,4 x 105 |
| 300 | 3,6 x 105 |
| 400 | 4,8 x 105 |
| 500 | 6 x 105 |
| 600 | 7,2 x 105 |
| 700 | 8,4 x 105 |
| 800 | 9,6 x 105 |
| 1000 | 1,2 x 106 |
| 2000 | 2,4 x 106 |
Tabel 1: Samenvatting van sferoïde vorming en celzaden.
| 10 mm schotels | 6-put platen | 12-put platen | 24-put platen | 96-put platen | |
| Coatingvolume | 4 ml | 300 μL | 250 μL | 150 μL | 50 μL (omlaag en omhoog) |
Tabel 2: Volumes van agarose oplossing voor het coaten van verschillende borden / gerechten.
| Genen | Inleidingen | volgorde | Productlengte | |
| Differentiatiemarkeringen | ALPI | voorwaarts | CTG GTA CTC AGA TGC TGA CA | 81 |
| omkeren | ATG TTG GAG ATG AGC TGA GT | |||
| SLC2A5 | voorwaarts | TAC CCA TAC TGG AAG GAT GA | 94 | |
| omkeren | AAC AGG ATC AGA GCA TGA AG | |||
| Stamcelmarkers | ALDH1a1 | voorwaarts | GCC TTC ACA GGA TCA ACA SPREEKNEVEL | 147 |
| omkeren | TGC AAA TTC AAC AGC T.A.B. GTC | |||
| MSI1 | voorwaarts | AGT TGG CAG ACT ACG CAG GA | 131 | |
| omkeren | TGG TCC ATG AAA GTG ACG AAG | |||
| PROM1 | voorwaarts | GTA AGA ACC CGG ATC AAA AGG | 131 | |
| omkeren | GCC TTG TCC TTG GTA GTG TTG | |||
| CD44 | voorwaarts | TGC CTT TGA TGG ACC AAT TAC | 160 | |
| omkeren | TGA AGT GCT GCT CCT TTC AKTE | |||
| OLFM4 | voorwaarts | TCT GTG TCC CAG TTG TTT TCC | 118 | |
| omkeren | ATT CCA AGC GTT CCA CTC TGT | |||
| De genen van het huishouden | ACTB | voorwaarts | CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C | 134 |
| omkeren | AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T | |||
| PPIB | voorwaarts | ATG ATC CAG GGC GGA GAC TT | 100 | |
| omkeren | GCC CGT AGT GCT TCA GTT TG |
Tabel 3: Primers gebruikt voor kwantitatieve omgekeerde transcriptie-polymerase kettingreactie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro 3D-modellen overwinnen de belangrijkste experimentele nadelen van 2D-kankercelculturen, omdat ze betrouwbaarder lijken te zijn bij het samenvatten van typische tumorkenmerken, waaronder micromilieu en cel heterogeniteit. Veelgebruikte 3D-modellen van sferoïden zijn steigervrij (gekweekt in omstandigheden met weinig bevestiging) of steigergebaseerd (met behulp van biomaterialen om cellen te gekweekt). Deze methoden vertonen verschillende nadelen omdat ze afhankelijk zijn van de aard van de gebruikte steiger of aanleiding geven tot sferoïden die variabel zijn in structuur en grootte.
Het huidige protocol rapporteert geoptimaliseerde omstandigheden voor het produceren van homogene sferoïden uit de colon adenocarcinoom cellijn, Caco2, met behulp van een steigervrije methode. De sferoïden zijn gemakkelijk te oogsten en in tegenstelling tot een eerder gerapporteerde studie41, groeien ze met succes en hun groeikenmerken gedurende de tijd in cultuur kunnen ook worden geanalyseerd. Bovendien verspreiden de sferoïden (a) zich met deze nieuwe methode actief, b) vertonen ze een zeer laag percentage celdood, (c) organiseren ze zich om een lumen in de bollen te vormen en (d) vertonen ze differentiatiecapaciteit van de componentcellen. Aangezien het uiteindelijke doel van de nieuwe aanpak het gebruik ervan was voor studies over CSC-biologie, werd de expressie van verschillende markers van CSC's geanalyseerd. Interessant is dat de markeringen een dynamisch expressiepatroon presenteerden, afhankelijk van het tijdspunt en gedefinieerde verschillende CSC-populaties.
Van het grootste belang kunnen de sferoïden die via dit protocol worden gegenereerd, worden gebruikt voor het analyseren van geneesmiddelen die relevant zijn voor klinische toepassingen zoals de chemotherapeutische regimes, FOLFOX en FOLFIRI. De resultaten onderstrepen ook een heterogene reactie van cellen op de geneesmiddelen, afhankelijk van de geanalyseerde CSC-marker. Deze observatie is consistent met de huidige opvatting dat heterogene en meervoudige CSC-achtige celpopulaties binnen tumoren diverse chemosensitiviteit/chemoresistentie-eigenschappen vertonen42,43. Deze bevinding versterkt sterk de toepasbaarheid van deze nieuwe methode voor grootschalige screening. Naast de toepassingen die in deze studie worden gerapporteerd, kan het nieuwe protocol ook worden gebruikt voor een breder scala aan analyses (bijv. RNA- en/of DNA-extractie en grootschalige analyses, western blotting en immunofluorescentie). Het volume van sferoïden en groeikenmerken kan inderdaad gemakkelijk worden bepaald door de bolvolumeformule toe te passen die, indien nodig, ook rekening houdt met verschillende diameters om afwijkingen van een perfect bolvorm tegen te gaan. Specifieke parameters moeten echter worden geoptimaliseerd, afhankelijk van het celtype (cellijn of nieuwe primaire culturen) en de groeicapaciteit zoals de replicatietijd. Toch geeft het protocol kritische stappen aan die eenvoudig kunnen worden aangepast.
Sommige punten van zorg moeten worden overwogen bij het uitvoeren van sferoïde generatie beschreven in dit artikel. Eerst moeten verschillende wasstappen worden uitgevoerd met de anti-hechtingsspoelingsoplossing om de homogeniteit en verdichting van de bollen te bevorderen. In dit geval waren twee wasbeurten nodig. Ten tweede moeten bellen uit de microwells worden verwijderd, omdat dit de juiste vorming van de sferoïden kan verstoren. Ten derde, zodra de cellen na de centrifugeerstap in elke microwell zijn gezaaid, moet de plaat twee dagen ongestoord blijven. Aanvullende overwegingen en wijzigingen in het protocol zijn nodig bij het bestuderen van de vroege stappen van sferoïde vorming, mogelijk inclusief een geautomatiseerd visualisatie- en beeldvormingssysteem. Ten vierde kan het veranderen van het medium zonder de sferoïden te verstoren, gezien het feit dat ze in suspensie zijn, een uitdaging zijn. Daarom wordt aanbevolen om elke keer slechts de helft van het volume te wijzigen. Ten vijfde is het bij het oogsten van de sferoïden belangrijk om hun structuur te behouden. Daarom wordt het gebruik van serologische pipetten of micropipetten met de afgesneden uiteinden aanbevolen voor alle doseerstappen na het spoelen in een serumbevattend medium of PBS om te voorkomen dat de sferoïden zich aan de uiteinden vastkuren.
Er kunnen ook enkele beperkingen worden ondervonden bij het gebruik van dit protocol. Ten eerste hebben niet alle cellijnen of celtypen dezelfde kweekparameters; in sommige gevallen kunnen cel heterogeniteit en het aantal passages/veroudering van cellen ook van invloed zijn op het vermogen om sferoïden te vormen. Ten tweede, in tegenstelling tot organoïden, kan het moeilijk zijn om sferoïden heel lang in cultuur te houden. Bovendien kunnen ze niet worden gerepliceerd door eenvoudige fragmentatie door een micropipettip15. Ten derde kan dit protocol niet worden aangepast voor analyse met één sferoïde, omdat het handmatig één voor één herstellen van sferoïden lastig kan zijn. Deze techniek is meer geschikt voor het verkrijgen van grote hoeveelheden homogene sferoïden tegelijkertijd. Ten slotte zou het voor studies die de effecten van groeifactoren van andere celtypen onderzoeken of het belang van het micromilieu analyseren, belangrijk zijn om het model te verrijken en co-cultuurexperimenten uit te voeren.
Concluderend beschrijft de huidige methodologie een nieuw protocol om sferoïden efficiënt te genereren en te culten uit Caco2-cellen. De resultaten tonen aan dat deze methode kan worden toegepast op de studie van tumor heterogeniteit en voor de analyse van CSC's. Deze methode kan ook worden gebruikt voor high-throughput drug screening en de studie van stamcelbiologie bij kanker en niet-kankercellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen
Acknowledgments
We erkennen de platforms voor beeldvorming en Anipath recherche histologie (CRCL, CLB). We zijn de apotheek van het Centre Léon Bérard (CLB) Hospital schatplichtig voor het soort geschenk van FOLFOX en FOLFIRI. We danken brigittemanship ook voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk werd ondersteund door de FRM (Equipes FRM 2018, DEQ20181039598) en door de Inca (PLBIO19-289). MVG en LC kregen steun van de FRM en CF kreeg steun van arc foundation en het Centre Léon Bérard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37 µm Reversible Strainer, Large | STEMCELL Technologies | 27250 | To be used with 50 mL conical tubes |
| 5-Fluorouracil | Gift from Pharmacy of the Centre Leon Berard (CLB) | - | stock solution, 5 mg/100 mL; final concentration, 50 µg/mL |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| Aggrewell 400 24-well plates | STEMCELL Technologies | 34411 | 1,200 microwells per well for spheroid formation and growth |
| Anti Caspase3 - Rabbit | Cell Signaling | 9661 | dilution 1:200 |
| Anti Musashi-1 (14H1) - Rat | eBioscience/Thermo Fisher | 14-9896-82 | dilution 1:500 |
| Anti-Adherence Rinsing Solution x 100 mL | STEMCELL Technologies | 07010 | |
| Anti-CD133 (13A4) - Rat | Invitrogen | 14-133-82 | dilution 1:100 |
| Anti-CD44 -Rabbit | Abcam | ab157107 | dilution 1:2000 |
| Anti-PCNA - Mouse | Dako | M0879 | dilution 1:1000 |
| Anti-β-catenin - Mouse | Santa Cruz Biotechnology | sc-7963 | dilution 1:50 |
| Black multiwell plates | Thermo Fisher Scientific | 237108 | |
| Citric Acid Monohydrate | Sigma | C1909 | |
| CLARIOstar apparatus | BMG Labtech | microplate reader | |
| Dako pen | marker pen to mark circles on slides for creating barriers for liquids | ||
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21202 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10037 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | dilution 1:1000 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A10042 | dilution 1:1000 |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Glutamax (L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 10569010 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Fluorogel mounting medium with DAPI | Interchim | FP-DT094B | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A11077 | dilution 1:1000 |
| ImageJ software | Spheroid image analysis | ||
| Irinotecan | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 20 mg/mL; final concentration, 100 µg/mL |
| iScript reverse transcriptase | Bio-Rad | 1708891 | |
| Leucovorin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 50 mg/mL; final concentration, 25 µg/mL |
| Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | Basement membrane matrix |
| Nucleospin RNA XS Kit | Macherey-Nagel | 740902 .250 | |
| Oxaliplatin | Gift from Pharmacy CLB | - | stock solution, 100 mg/20 mL;final concentration, 10 µg/mL |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140130 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco | 14190250 | |
| SYBR qPCR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | Takara | RR420B | |
| SYTOX- Green | Thermo Fisher Scientific | S7020 | nucleic acid stain; dilution 1:5000 |
| Trypsin-EDTA (0.05 %) | Gibco | 25300062 | |
| Zeiss-Axiovert microscope | inverted microscope for acquiring images of spheroids |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Fearon, E. R., Vogelstein, B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61 (5), 759-767 (1990).
- Rao, C. V., Yamada, H. Y. Genomic instability and colon carcinogenesis: from the perspective of genes. Frontiers in Oncology. 3, 130 (2013).
- Fearon, E. R.
- Tran, T. Q., et al. α-Ketoglutarate attenuates Wnt signaling and drives differentiation in colorectal cancer. Nature Cancer. 1 (3), 345-358 (2020).
- Batlle, E., Clevers, H.
- Clevers, H. The cancer stem cell: premises, promises and challenges. Nature Medicine. 17 (3), 313-319 (2011).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Bleijs, M., van de Wetering, M., Clevers, H., Drost, J. Xenograft and organoid model systems in cancer research. The EMBO Journal. 38 (15), 101654 (2019).
- Kawai, S., et al. Three-dimensional culture models mimic colon cancer heterogeneity induced by different microenvironments. Scientific Reports. 10 (1), 3156 (2020).
- Ferreira, L. P., Gaspar, V. M., Mano, J. F. Design of spherically structured 3D in vitro tumor models -Advances and prospects. Acta Biomaterialia. 75, 11-34 (2018).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nature Protocols. 4 (3), 309-324 (2009).
- Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling. World Journal of Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Weiswald, L. -B., Bellet, D., Dangles-Marie, V. Spherical cancer models in tumor biology. Neoplasia. 17 (1), 1-15 (2015).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Silva-Almeida, C., Ewart, M. -A., Wilde, C. 3D gastrointestinal models and organoids to study metabolism in human colon cancer. Seminars in Cell & Developmental Biology. 98, 98-104 (2020).
- Chantret, I., Barbat, A., Dussaulx, E., Brattain, M. G., Zweibaum, A. Epithelial polarity, villin expression, and enterocytic differentiation of cultured human colon carcinoma cells: A survey of twenty cell lines. Cancer Research. 48 (7), 1936-1942 (1988).
- Caro, I., et al. Characterisation of a newly isolated Caco-2 clone (TC-7), as a model of transport processes and biotransformation of drugs. International Journal of Pharmaceutics. 116 (2), 147-158 (1995).
- Antonchuk, J. Formation of embryoid bodies from human pluripotent stem cells using AggreWellTM plates. Methods in Molecular Biology. 946, 523-533 (2013).
- Wolpin, B. M., Mayer, R. J.
- Yaffee, P., Osipov, A., Tan, C., Tuli, R., Hendifar, A. Review of systemic therapies for locally advanced and metastatic rectal cancer. Journal of Gastrointestinal Oncology. 6 (2), 185-200 (2015).
- Fujita, K., Kubota, Y., Ishida, H., Sasaki, Y. Irinotecan, a key chemotherapeutic drug for metastatic colorectal cancer. World Journal of Gastroenterology. 21 (43), 12234-12248 (2015).
- Mohelnikova-Duchonova, B., Melichar, B., Soucek, P. FOLFOX/FOLFIRI pharmacogenetics: the call for a personalized approach in colorectal cancer therapy. World Journal of Gastroenterology. 20 (30), 10316-10330 (2014).
- Jordan, N. J., et al. Impact of dual mTORC1/2 mTOR kinase inhibitor AZD8055 on acquired endocrine resistance in breast cancer in vitro. Breast Cancer Research. 16 (1), 12 (2014).
- Mohr, J. C., et al. The microwell control of embryoid body size in order to regulate cardiac differentiation of human embryonic stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1885-1893 (2010).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), 59689 (2013).
- Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Nusse, R., Clevers, H. Wnt/β-catenin signaling, disease, and emerging therapeutic modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biology and Toxicology. 21 (1), 1-26 (2005).
- Vermeulen, L., Snippert, H. J. Stem cell dynamics in homeostasis and cancer of the intestine. Nature Reviews Cancer. 14 (7), 468-480 (2014).
- van der Heijden, M., Vermeulen, L. Stem cells in homeostasis and cancer of the gut. Molecular Cancer. 18 (1), 66 (2019).
- Barker, N., Bartfeld, S., Clevers, H. Tissue-resident adult stem cell populations of rapidly self-renewing organs. Cell Stem Cell. 7 (6), 656-670 (2010).
- van der Flier, L. G., Haegebarth, A., Stange, D. E., van de Wetering, M., Clevers, H. OLFM4 is a robust marker for stem cells in human intestine and marks a subset of colorectal cancer cells. Gastroenterology. 137 (1), 15-17 (2009).
- Potten, C. S., et al. Identification of a putative intestinal stem cell and early lineage marker; musashi-1. Differentiation. 71 (1), 28-41 (2003).
- Clevers, H. The intestinal crypt, a prototype stem cell compartment. Cell. 154 (2), 274-284 (2013).
- Clark, D. W., Palle, K. Aldehyde dehydrogenases in cancer stem cells: potential as therapeutic targets. Annals of Translational Medicine. 4 (24), 518 (2016).
- Tomita, H., Tanaka, K., Tanaka, T., Hara, A. Aldehyde dehydrogenase 1A1 in stem cells and cancer. Oncotarget. 7 (10), 11018-11032 (2016).
- Zoetemelk, M., Rausch, M., Colin, D. J., Dormond, O., Nowak-Sliwinska, P. Short-term 3D culture systems of various complexity for treatment optimization of colorectal carcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 7103 (2019).
- Garcia-Mayea, Y., Mir, C., Masson, F., Paciucci, R., Leonart, M. E. Insights into new mechanisms and models of cancer stem cell multidrug resistance. Seminars in Cancer Biology. 60, 166-180 (2020).
- Marusyk, A., Janiszewska, M., Polyak, K. Intratumor heterogeneity: The Rosetta Stone of therapy resistance. Cancer Cell. 37 (4), 471-484 (2020).
