Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام إليجانات Caenorhabditis

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

يمكن استخدام النيماتودا Caenorhabditis elegans القابلة للسحب وراثيا كنموذج بسيط وغير مكلف لاكتشاف الأدوية. وصف هنا هو بروتوكول لتحديد العلاجات المضادة للانسان التي تمنع الإشارات المصب من RAS وEGFR البروتينات.

Abstract

وقد تورطت التغيرات في توطين غشاء البلازما لمستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) وتأثيرها المصب RAS في العديد من الأمراض بما في ذلك السرطان. النيماتودا C. elegans العيش الحر تمتلك التطورية والمحافظ عليها وظيفيا EGFR-RAS-ERK MAP سلسلة إشارة التي هي مركزية لتطوير الفرج. كسب الطفرات وظيفة في RAS homolog LET-60 وEGFR homolog LET-23 حث توليد pseudovulva خارج الرحم مرئية على طول جدار الجسم البطني من هذه الديدان. في السابق ، كان النمط الظاهري متعدد الصمامات (Muv) في هذه الديدان مثبطا بجزيئات كيميائية صغيرة. هنا نصف بروتوكول لاستخدام الدودة في المقايسة القائمة على السائل لتحديد مثبطات إلغاء أنشطة EGFR و RAS البروتينات. باستخدام هذا المقايسة، نعرض R-fendiline، مثبط غير مباشر من K-RAS، يقمع النمط الظاهري Muv المعبر عنه في let-60 (n1046) والسماح-23(sa62) الديدان المتحولة. المقايسة بسيطة وغير مكلفة ، ليست مضيعة للوقت لإعداد ، ويمكن استخدامها كمنصة أولية لاكتشاف العلاجات المضادة للانسان.

Introduction

يتم الحفاظ على المسارات الخلوية التي تنظم الأحداث التنموية داخل الكائنات الحية بشكل كبير بين جميع الميتازوان. أحد هذه المسارات هو EGFR-RAS-ERK mitogen تنشيط البروتين كيناز (MAPK) سلسلة الإشارات التي هي مسار حاسم الذي يحكم انتشار الخلايا, التمايز, الهجرة والبقاء على قيد الحياة1,2. يمكن أن تؤدي العيوب في مسار الإشارات هذا إلى حالات مرضية أو مرضية مثل السرطان. وقد أظهرت مستقبلات عامل نمو البشرة (EGFR) أن أعرب عنها بشكل كبير في الأورام البشرية، بما في ذلك 50٪ من سرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم، ويساهم في تطوير الأورام الخبيثة3،4،5. في حين أن الطفرات في ثلاثة RAS isoforms H-, K- و N-RAS هي المحركات الرئيسية للتحول الخبيث في سرطانات بشرية متعددة. من بين هذه ISOFORMs RAS الثلاثة، الطفرات أونكوجينيك في K-RAS هي الأكثر انتشارا6،7،8. لكي تعمل EGFR وRAS ، يجب أن يتم توطينها في غشاء البلازما (PM). منع توطين هذه الجزيئات إلى رئيس الوزراء يمكن أن يلغي تماما النشاط البيولوجي لهذا المسارإشارة 9،10. ومن هنا فإن تثبيط توطين هذه البروتينات لرئيس الوزراء هو استراتيجية علاجية لمنع الإشارات المصب والنتائج السلبية الناتجة. باستخدام فحص عالي المحتوى ، تم تحديد fendiline ، وهو مانع قناة الكالسيوم من نوع L ، كمثبط لنشاط K-RAS11. يتم تقليل Nanoclustering من K - RAS إلى المنشور الداخلي لرئيس الوزراء بشكل كبير في وجود fendiline. وعلاوة على ذلك، يتم إعادة توزيع K-RAS من غشاء البلازما إلى الشبكية الانتوبلازمية (ER)، جهاز غولجي، الاندوسومات، والسيتوسول. الأهم من ذلك، يتم حظر انتشار البنكرياس والقولون والرئة، وخطوط الخلايا السرطانية بطانة الرحم التعبير عن متحولة oncogenic K-RAS عن طريق تثبيط الإشارات المصب من قبل fendiline11. تشير هذه البيانات وظائف fendiline كعلاج محدد K-RAS المضادة للانسان الذي يسبب سوء توطين بروتين RAS إلى رئيس الوزراء.

وقد درست على نطاق واسع في nematode Caenorhabditis elegans في سياق التنمية. العديد من مسارات الإشارات التي تحكم التنمية في الدودة هي التطورية والحفاظ عليها وظيفيا. على سبيل المثال، تم التوسط في EGFR تنشيط RAS والتنشيط اللاحق لسلسلة إشارة ERK MAPK يتم حفظها في الفيروس المتنقل12. يتم تمثيل السلسلة البروتينات التالية: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 هو متجانسة لRAS، في حين LET-23 هو متجانسة لEGFR. في الدودة ، ينظم هذا المسار تطور الفرج13. الفرج هو فتحة الظهارية على جدار الجسم البطني من الدودة التي تسمح للبويضات المخصبة لوضعها. يعتمد تكوين الفرج في الدودة على تعرض خلايا السلائف الفرجية (VPC) لتدرج تنشيط سلسلة إشارة EGFR-RAS-MAPK. خلال التطور الطبيعي ، تتلقى VPCs القريبة إشارات قوية من خلايا ارتساء الغدد التناسلية للتمييز إلى مصائر خلايا 1° و 2 ° التي تؤدي إلى فرج وظيفي12. في حين أن VPCs البعيدة تفرق إلى مصائر الخلايا 3 ° التي تنصهر إلى التزامن hypodermal ولا تشكل الفرج بسبب الإشارات المستنفدة. في حالة عدم وجود إشارات ، تفرق جميع VPCs إلى مصائر خلايا 3 ° مما يؤدي إلى تكوين أي فرج. ومع ذلك ، تؤدي الإشارات التأسيسية إلى تشكيل فرج واحد أو أكثر غير وظيفي بسبب تحريض جميع VPCs على افتراض مصائر الخلية 1° و 2° .

تم تحديد الطفرات التي تسبب الحث الفرجي المعيب أو المفرط للعديد من الجينات التي ترمز إلى البروتينات التي تمثل هذا المسار. يؤدي التعريفي الفرجي المعيب إلى النمط الظاهري الفرجي (Vul) ، في حين يؤدي التعريفي الفرجي المفرط إلى النمط الظاهري متعدد الأصوات (Muv) الذي يمثله تطور العديد من السودوفولفا المنتبذة غير الوظيفة في جميع أنحاء جدار الجسم البطني. النمط الظاهري Muv التي أعرب عنها let-60(n1046) سلالة يرجع إلى زيادة طفرة وظيفة في RAS, بينما في سلالة السماح-23 (sa62) ومن المقرر طفرة تنشيط في EGFR14,15. وقد ثبت أن النمط الظاهري Muv قوية في هذه السلالات متحولة أن تكون مضطربة من التدخلات الدوائية كما يتضح من خلال علاج الديدان السماح-60 (n1046) مع مثبط MEK-1 U012616,17. ومن المثير للاهتمام, لقد أظهرنا أن R-fendiline ومثبطات التي تؤثر على التمثيل الغذائي sphingomyelin قمع النمط الظاهري موف في دودة18. لإثبات هذه المثبطات كتلة السماح-60 الإشارات على مستوى RAS، وقد استخدمت سلالة خالية لين-1 17. Lin-1 هو عامل نسخ مثبط يشبه Ets يعمل كمقمع في تطور الفرج19. إعادة قوية من النمط الظاهري Muv في السماح-60 (n1046) الديدان وليس لها تأثير على لين-1 الديدان الخالية تشير إلى أن هذه الموانع تحدث على مستوى RAS.

في هذا البروتوكول، ونحن نظهر استخدام C. elegans كنموذج لتحديد مثبطات RAS وEGFR البروتينات. باستخدام المقايسة القائمة على السائل، ونحن نظهر الآثار المثبطة للR-fendiline عن طريق قمع الأنماط الظاهرية Muv في let-60 (n1046) واسمحوا-23(sa62) سلالات متحولة من C. elegans. هذا المقايسة يؤكد استخدام C. elegans كأداة في المرحلة الأولى من اكتشاف المخدرات لعلاجات مضادة للانسان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. نيماتود متوسط النمو (NGM) إعداد لوحة

  1. إضافة 2.5 غرام من بيبتون و 3 غرام من NaCl إلى 970 مل من المياه deionized الواردة في قارورة 2 L Erlenmeyer. تحريك المحتويات باستخدام شريط تحريك مغناطيسي. بعد ذلك، إضافة 20 غرام من أجار إلى القارورة. أوتوكلاف محتويات القارورة في 121 درجة مئوية وضغط 15 رطل / في2 لمدة 30 دقيقة. بعد التعقيم، ضع القارورة على لوحة تحريك واترك الوسط يبرد حتى تصل درجة الحرارة إلى 50 درجة مئوية.
  2. لإعداد لوحات NGM إضافة الكواشف التالية إلى المتوسط المبرد: 25 مل من 1 M البوتاسيوم الفوسفات العازلة (درجة الحموضة = 6.0)، 1 مل من 1 M MgSO4،1 مل من 1 M CaCl2،1 مل من (5 ملغم / مل في الإيثانول 95٪) الكوليسترول، 1 مل من (10٪ v/w في الإيثانول) النيستاتين، و 1 مل من 25 ملغم/ مل ستربتومايسين.
  3. تحت تدفق صفح، صب المتوسط المبردة في 60 مم × 15 مم أطباق بيتري معقمة. دع اللوحات تتوطد لمدة 2 ساعة. يمكن الاحتفاظ بهذه اللوحات لمدة شهر واحد عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

2. انتشار اليجانات C.

  1. بقعة 100 ميكرولتر من بين عشية وضحاها نمت E. القولونية OP50 على وسط كل لوحة NGM والسماح لوحات لتجف لمدة 24 ساعة في غطاء محرك السيارة صفح. في وقت لاحق، يمكن تخزين لوحات في حاوية البوليسترين.
    ملاحظة: تزرع ثقافة E. coli OP50 في وسائط لوريا -بيرتاني (LB) عند 37 درجة مئوية قبل بذر اللوحات. يمكن تخزين الثقافة عند 4 درجات مئوية لمدة 1-2 أشهر واستخدامها للبذر الدوري للوحات.
  2. باستخدام معول دودة معقمة، وجمع 10-12 الديدان البالغة gravid من لوحة نمت سابقا تحت المجهر تشريح. نقل هذه الديدان إلى لوحة NGM الطازجة المصنفة مع E. coli OP50 واحتضان لوحة لمدة 24 ساعة في 20 درجة مئوية.
  3. بعد 24 ساعة، وذلك باستخدام معقم دودة اختيار إزالة الديدان الكبار من لوحات. احتضان لوحات في 20 درجة مئوية لمدة 3 أيام تقريبا. الأجنة سوف تتطور إلى ديدان بالغة مرق.

3. إعداد ثقافة C. elegans متزامن

  1. جمع الديدان البالغة gravid في أنبوب مخروطي 15 مل عن طريق غسل 2-4 لوحات مع M9W.
    1. إعداد M9W: حل 5 غرام من NaCl، 6 غرام من Na2HPO4،و 3 غرام من KH2PO4 في الماء deionized إلى حجم نهائي من 1 L. Autoclave الحل في 121 درجة مئوية على ضغط 15 رطل / في2 لمدة 30 دقيقة. أضف 1 مل من 1 M MgSO4 إلى الحل المبرد.
  2. بيليه الديدان عن طريق الطرد المركزي في أنبوب 450 × ز لمدة 1 دقيقة. decant العملاقة دون إزعاج بيليه دودة.
  3. إعداد محلول تحلل الدودة عن طريق الجمع بين 400 ميكرولتر من 8.25٪ هيبوكلوريت الصوديوم (التبييض المنزلي) و 100 ميكرولتر من 5 N NaOH. إضافة هذا الحل إلى بيليه دودة ونفض الغبار أنبوب لخلط محتويات الأنبوب. منع الإفراط في bleaching الأجنة في الأنبوب عن طريق مراقبة تحلل الديدان تحت المجهر تشريح.
  4. إضافة 10 مل من M9W إلى أنبوب مخروطي لتخفيف مزيج تحلل عندما 70٪ من الديدان الكبار قد lysed.
  5. الطرد المركزي الأنبوب في 450 × ز لمدة 1 دقيقة. استبدال supernatant مع 10 مل من M9W.
  6. كرر الخطوة 3.5 مرتين.
  7. بعد الانتهاء من خطوات الغسيل، أضف 3-5 مل من M9W لإعادة إنفاق بيليه البيض. تدوير الأنبوب بين عشية وضحاها بسرعة 18 دورة في الدقيقة على أنبوب الدوار في درجة حرارة الغرفة (RT).
  8. بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، قم بإزالة الأنبوب من الدوار ، بيليه يرقات L1 عن طريق الطرد المركزي للأنبوب عند 450 × ز لمدة دقيقة واحدة. يستنشق M9W حتى يتم ترك 250 ميكرولتر في الأنبوب.
  9. هز الأنبوب لإعادة إنفاق اليرقات. أضف ثلاث قطرات 5 ميكرولتر تحتوي على اليرقات على غطاء طبق بيتري. باستخدام المجهر تشريح عد عدد الديدان في كل قطرة وتحديد عدد الديدان في 1 ميكرولتر.

4. إعداد المقايسات المخدرات

ملاحظة: يتم عرض الخطوات في هذا المقايسة في الشكل 1.

  1. تنمو 30 مل من E. coli OP50 في أنبوب مخروطي 50 مل في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في شاكر المدارية في 150 دورة في الدقيقة.
  2. تدور بين عشية وضحاها نمت E. القولونية OP50 الثقافة في 4000 × ز لمدة 10 دقيقة بيليه الخلايا. إزالة supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 3 مل من M9W لتركيز الثقافة.
  3. قبل إعداد حلول العمل لارساء المخدرات، إضافة 0.1 مل من (5 ملغم / مل في 95٪ الإيثانول) الكوليسترول في 100 مل من M9W.
  4. إعداد حلول العمل لكل دواء تجريبي عن طريق تمييع كل دواء بالإضافة إلى مركبة (ثنائي ميثيل سلفوإكسيد؛ DMSO) في 4.8 مل M9W تكملها مع الكوليسترول للحصول على تركيزات المناسبة. حل DMSO في 4.8 مل من M9W تكملها الكوليسترول لإعداد التحكم في السيارة.
  5. أضف 200 ميكرولتر من ثقافة E. coli OP50 المركزة إلى كل أنبوب يحتوي على التحكم في السيارة أو الأدوية وأنابيب الدوامة لضمان خلطها.
  6. لإجراء التجربة، أضف 2 مل من كل محلول دواء عامل أو التحكم في السيارة إلى كل بئر في لوحة زراعة أنسجة من 12 بئرا. اختبار كل تركيز المخدرات والسيطرة على السيارة في مكررة.
  7. أضف ~ 100 يرقة L1 لكل بئر (انظر خطوات ثقافة C. elegans المتزامنة) باستخدام ميكروبايت معقم. الحد من حجم الديدان إلى 10 ميكرولتر.
  8. احتضان لوحات في 20 درجة مئوية.
  9. آبار الملحق مع 50 ميكرولتر من 10x مركزة E. القولونية OP50 في اليوم 3 من المقايسة إذا لزم الأمر.

5. Agarose إعداد لوحة للفحص المجهري

  1. إعداد محلول 2٪ ث / الخامس من الآغاروز عن طريق حل 0.1 غرام من الآغاروز في 5 مل من الماء deionized. سخني المحتويات في ميكروويف لإذابة الآغاروز. 20 الشرائح يمكن إعدادها من 5 مل من الحل agarose.
  2. وضع شرائط من شريط المختبر على طول اثنين من الشرائح الزجاجية. الشريط سيكون بمثابة الفواصل الحد من سمك منصات agarose. بعد ذلك، ضع شريحة زجاجية نظيفة ثالثة بين الشرائح المسجلة.
  3. لجعل لوحة agarose، بقعة 100 ميكرولتر من الآغاروز المنصهر على وسط الشريحة النظيفة. ضع شريحة زجاجية نظيفة أخرى عبر وعلى قمة الآغاروز واضغط برفق إلى أسفل لتشكيل لوحة. قم بإزالة الشريحة العلوية عندما توطدت اللوحة.

6. مراقبة النمط الظاهري Muv في let-60، واسمحوا-23 و lin-1 سلالات

ملاحظة: سيتم فحص الأدوية المرشحة فقط التي تقمع الأنماط الظاهرية Muv في سلالات let-23 و let-60 باستخدام سلالة lin-1 لتحديد ما إذا كان التثبيط يحدث على مستوى RAS أو EGFR.

  1. عندما يتم الوصول إلى المرحلة المناسبة من دورة الحياة (3 أيام للسلالات let-60 و let-23 ، 5 أيام لسلالة lin-1) ، قم بإزالة اللوحات من الحاضنة. وجمع الديدان في أنابيب مخروطية 15 مل باستخدام ماصة.
  2. الطرد المركزي الأنابيب في 450 × ز لمدة 1 دقيقة. إزالة M9W دون إزعاج بيليه دودة وإضافة 5 مل من M9W الطازجة.
  3. كرر الخطوة 6.2 مرتين.
  4. دون إزعاج بيليه دودة، وإزالة جميع M9W المتبقية عن طريق الطموح. بعد ذلك، أضف 500 ميكرولتر من 2 مليون ثانية من أزيد الصوديوم أو 2 مليون م رباعي ميثيل هيدروكلوريد. السماح للأنابيب لاحتضان في RT لمدة 15 دقيقة. 2 مليون صوديوم أزيد أو 2 مليون متر رباعي مي هيدروكلوريد سوف تخدير الديدان للتصوير.
    تنبيه: تأكد من ارتداء معدات الحماية الشخصية (PPE) عند التعامل مع أزيد الصوديوم. يجب إعداد الحل تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي.
  5. أضف 10 ميكرولتر من تعليق الدودة المخدرة إلى مركز لوحة الآغاروز. ضع غطاء #1.5 برفق فوق تعليق الدودة. إذا لزم الأمر، إصلاح غطاء مع بعض طلاء الأظافر لمنع الجفاف.
  6. استخدام المجهر DIC لمراقبة السماح-60(n1046), السماح-23(sa62) ولين-1 (sy254) سلالات. صورة الديدان في التكبير 10x و 20x.
  7. للسماح-60 (n1046) واسمحوا-23(sa62)، يسجل الديدان الكبار على أساس وجود أو غياب النمط الظاهري موف. بينما لسلالة لين-1، عد عدد VPCs التي اعتمدت مصائر الخلية 1° أو 2° على الجانب البطني من يرقات L4 باستخدام مجهر DIC عالي الدقة.
  8. بعد تسجيل الميكروستوغرافيات لكل سلالة وعلاج المخدرات، قم بإجراء اختبار الطالب لتحديدالاختلافات الإحصائية بين العلاجات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نحن أول من يثبت أن R-fendiline قادرة على قمع النمط الظاهري Muv في سلالة متحولة السماح-60 (n1046) مقارنة مع الديدان المعالجة DMSO. تظهر بياناتنا أن R-fendiline قادر على منع النمط الظاهري Muv في let-60 (n1046) بطريقة تعتمد على الجرعة(الشكل 2A, B). ومع ذلك، لوحظ عدم عكس النمط الظاهري Muv في سلالة متحولة فارغة لين-1 ردا على تركيزات متزايدة من R-fendiline(الشكل 2B). وتشير البيانات إلى أن كتل R-fendiline تنشيط السماح-60 الإشارات على مستوى RAS في C. elegans. وبالمثل، لاحظنا أن النمط الظاهري Muv قد انخفض بشكل كبير في سلالة let-23 (sa62) استجابة لعلاج 3 و 10 و 30 ميكرومتر R-fendiline بالنسبة للديدان المعالجة DMSO(الشكل 2C، D). في جميع التجارب، تم استخدام اختبار الطلاب tلتحديد الأهمية الإحصائية.

Figure 1
الشكل 1: مخطط انسيابي يمثل الخطوات التي ينطوي عليها إعداد المقايسات المخدرات باستخدام let-60 (n1046), let-23(sa62) و lin-1 (sy254) سلالات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: R-fendiline يغير السماح-60 والسماح-23 وظيفة في C. elegans بطريقة تعتمد على الجرعة. (أ) صور تمثيلية للديدان let-60 (n1046) في وجود مركبة (DMSO) أو 30 ميكرومتر R-fendiline. (ب)تحديد كمي للنمط الظاهري Muv في السماح-60 (n1046) الديدان تعامل في وجود DMSO, 3, 10 و 30 ميكرومتر R-fendiline, أو 30 ميكرومتر U0126. (ج) صور تمثيلية للديدان let-23(sa62) في وجود مركبة (DMSO) أو 30 ميكرومتر R-fendiline. (د)تحديد كمي للنمط الظاهري Muv في السماح-23(sa62) الديدان المعالجة في وجود DMSO, 3, 10 و 30 ميكرومتر R- fendiline, أو 30 ميكرومتر U0126. في جميع الصور يشار إلى pseudovulva بواسطة السهام البيضاء والفرج العادي بواسطة النجمة البيضاء. وتم تصوير ما مجموعه 60 دودة لكل علاج. تكررت التجربة 3 مرات. (*** P<0.001 و ** P<0.01 اعتبرت كبيرة) يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن المقايسات التي نصفها باستخدام الدودة بسيطة وغير مكلفة لتحديد مثبطات وظيفة EGFR و RAS. C. elegans هو نموذج جذاب لاكتشاف المخدرات لأنه من السهل أن تنمو في المختبر بسبب دورة الحياة القصيرة (3 أيام عند 20 درجة مئوية) والقدرة على توليد أعداد كبيرة من اليرقات. والأهم من ذلك، يتم الحفاظ على مسار EGFR-RAS-ERK MAPK تطوريا ووظيفيا مع الثدييات التي توفر نظاما قابلا للسحب وراثيا لتحليل آثار مثبطات EGFR وRAS. علاوة على ذلك ، فإن الطبيعة الشفافة للديدان تمكن المحقق من تصور الهياكل المتميزة وتوطين البروتين الفلوري الأخضر (GFP) أو الفلوروفور الآخر المنصهر إلى البروتينات ذات الأهمية من قبل DIC والمجهر الفلوري.

البروتوكولات التي استخدمناها لنشر والحفاظ على مختلف elegans C. المستخدمة في هذه الدراسة أنشئت سابقا20،21. ومع ذلك ، في إعداد لوحات NG أدرجنا الستربتومايسين والنيستاتين لمنع التلوث البكتيري والفطري. إضافة هذه العوامل المضادة للميكروبات لم تعوق تطور الديدان وتحريض النمط الظاهري Muv.

هناك العديد من المزايا للحصول على يرقات L1 بواسطة بروتوكول مزامنة الدودة. يمكن الحصول على العديد من اليرقات من لوحتين أو أكثر تحتوي على بالغين مرقد ويتم مزامنة جميع اليرقات التي تم جمعها. وهذا يضمن تطوير الديدان متسقة بين السكان. بعض السلالات المتحولة التي تعرض النمط الظاهري Muv هي طبقات بيض فقيرة مما يؤدي إلى انخفاض غلة اليرقات كما رأينا في الطفرة الفارغة التي تأوي في عامل النسخ العائلي Ets lin-119. سيؤدي علاج التبييض للبالغين الجاذبية lin-1 إلى زيادة كبيرة في عدد اليرقات المطلوبة للمقايسة.

من الضروري مراقبة تحلل الديدان أثناء إعداد ثقافة C. elegans المتزامنة. يحمي قشر البيض السميك الأجنة جزئيا من عمل مزيج هيدروكسيد التبييض والصوديوم حتى مع ذوبان كتل اليرقات والبالغين. ومع ذلك ، فإن التعرض لفترات طويلة لمحلول التحلل يخترق هذا الغلاف الواقي مما يؤدي إلى وفاة الأجنة. ومن ثم من المهم وقف عمل مزيج هيدروكسيد التبييض والصوديوم عندما يكون 70٪ من الديدان البالغة قد تحلل. ويتحقق ذلك عن طريق تخفيف حل التحلل مع M9W. إن الحفاظ على يرقات L1 الموقوفة هو خطوة أخرى يجب أخذها في الاعتبار في بروتوكول زراعة C. elegans المتزامن. يمكن أن يؤدي الحضانة المطولة لليرقات L1 الموقوفة في M9W إلى تحويلها إلى مرحلة dauer بسبب تراكم الفيرومون dauer. لتجنب تكوين مرحلة dauer ، يقترح استخدام اليرقات L1 الموقوفة في غضون 1-2 يوم من جمع الأجنة.

النمط الظاهري Muv القاعدي هو 60٪-90٪ و 90٪ للديدان let-60 (n1046) و let-23 (sa62) على التوالي. وهذا يشير إلى أن الديدان let-60 (n1046) تخضع للانجراف الظاهري ، وبالتالي ، من المهم الإبلاغ عن المستويات القاعدية للتعبير عن النمط الظاهري Muv. علاج السماح-60 (n1046) واسمحوا-23(sa62) الديدان مع R-fendiline وغيرها من مثبطات K-RAS تقليل النسبة المئوية للديدان التعبير عن النمط الظاهري موف. ومع ذلك، أفيد أيضا أن بعض مثبطات مسار EGFR-RAS-ERK MAPK قد يقلل من عدد pseudovulvae لكل دودة وحدها أو قد تؤثر على كل من التعبير وعدد pseudovulvae17. ومن ثم من المهم أن تحسب عدد pseudovulvae في الديدان موف في كل من المخدرات والديدان المعالجة DMSO. النمط الظاهري Muv أعرب في السماح-60 (n1046) واسمحوا-23(sa62) الديدان الكبار واضحة للعيان تحت المجهر تشريح. ومع ذلك ، فإن سلالة لين-1 (فارغة) غير صحية نسبيا ، وضعيفة النمو ، وتتميز نتوءات الفرج بشكل سيئ في الديدان البالغة. لذلك ، بدلا من نتوءات الفرج خارج الرحم ، في الديدان اللينة 1 (الخالية) ، يمكن حساب VPCs التي تعتمد مصائر خلايا معتمدة 1 أو 2 درجة على الجانب البطني في مرحلة L4 ، باستخدام مجهر DIC عالي الدقة.

المقايسة غير مكلفة وسهلة ، وليس مضيعة للوقت لإعداد. ولتحسين وقت المعالجة، يمكن تخدير الديدان إلى تركيز نهائي قدره 2 مليون متر من أزيد الصوديوم داخل آبار لوحة زراعة الأنسجة وصورت باستخدام مجهر تشريح مجهز بكاميرا. تعديل آخر للمقاهة سيكون لاستخدام الحرارة قتل E. coli OP50 بدلا من البكتيريا الحية23. وقد ثبت أن البكتيريا يمكن استقلاب جزيئات صغيرة معينة مما يؤدي إلى انخفاض النشاطات الحيوية24.

وقد أظهرت الدراسات السابقة أن تحريض الفرج في الدودة يعتمد على إشارات بيئية معينة. وقد أظهرت الأنماط الظاهرية الفرجية من لين-3 (n378) واسمحوا-23 (n1045) أن قمعها جزئيا من قبل المجاعة والخروج من المرحلة dauer14. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسة أجراها مغول وآخرون، أن المسوخ اللين-3 (n378) واسمحوا-23 (sy1) واسمحوا-60 (sy95dn) نمت في المخزن المؤقت M9 كان عدد أكبر من VPCs افتراض مصائر الخلية الفرجية مقارنة مع الحيوانات التي تزرع على لوحات NG القياسية24. تشير البيانات إلى أن الديدان التي تزرع في بيئة سائلة تؤثر على الحث الفرجي. ومع ذلك ، في دراساتنا لم نلاحظ قمع النمط الظاهري Muv في بيئة سائلة.

في هذا البروتوكول نحن نظهر استخدام C. elegans لتقييم خصائص مكافحة RAS من fendiline. في دراسة سابقة, وقد أظهرنا أن مثبطات حمض متعددة sphingomyelinase, بما في ذلك مضادات الاكتئاب ثلاثية الحلقات مثل ديسيبرامين, إيميبرامين, والأميتريبتيلين تمنع النمط الظاهري موف18. وعلاوة على ذلك، مثبطات مسارات التركيب الحيوي sphingomyelin وceramide قمع النمط الظاهري Muv أعرب في الديدان السماح-60 (n1046). تم التحقق من صحة هذه النتائج باستخدام الدودة في خطوط خلايا الثدييات.

في الختام، نحن نظهر استخدام C. elegans لتحديد مثبطات نشاط EGFR و RAS في الفحص القائم على السائل. وعلاوة على ذلك، توفر الدودة نظاما آخر لتحديد وتوصيف آليات عمل العلاجات المضادة ل RAS وEGFR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgments

نشكر الدكتور Swathi أرور (MD أندرسون مركز السرطان) لتوفير السماح-60 (n1046). كما نشكر الدكتور ديفيد راينر (معهد مركز تكساس للعلوم الصحية للعلوم الحيوية والتكنولوجيا في هيوستن) على سلالة لين-1. وأخيرا، نشكر الدكتورة دانييل غارسين ومختبرها (جامعة تكساس، كلية ماكغفرن الطبية) على توفير بعض الكواشف. تم توفير بعض سلالات الديدان من قبل CGC ، التي يمولها مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440). تم دعم هذا البحث من قبل معهد الوقاية من السرطان والبحوث في تكساس (CPRIT) منحة RP200047 إلى JF هانكوك.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 164، كاينورهابديتس إيليغانس، LET-60، LET-23، K-RAS، EGFR، GFP
تحديد مثبطات EGFR و RAS باستخدام <em>إليجانات Caenorhabditis</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter