Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels Caenorhabditis elegans

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

Der genetisch traktierbare Fadenwurm Caenorhabditis elegans kann als einfaches und kostengünstiges Modell für die Wirkstoffforschung verwendet werden. Hier wird ein Protokoll zur Identifizierung von Krebsmedikamenten beschrieben, die die nachgeschaltete Signalübertragung von RAS- und EGFR-Proteinen hemmen.

Abstract

Die Veränderungen in der Plasmamembranlokalisierung des epidermalen Wachstumsfaktorrezeptors (EGFR) und seines nachgeschalteten Effektors RAS wurden mit mehreren Krankheiten einschließlich Krebs in Verbindung gebracht. Der freilebende Fadenwurm C. elegans besitzt eine evolutionäre und funktionell konservierte EGFR-RAS-ERK MAP-Signalkaskade, die für die Entwicklung der Vulva zentral ist. Der Gewinn von Funktionsmutationen im RAS-Homolog LET-60 und EGFR-Homolog LET-23 induziert die Erzeugung von sichtbaren nicht-funktionellen ektopischen Pseudovulva entlang der ventralen Körperwand dieser Würmer. Bisher wurde gezeigt, dass der multivulvale (Muv) Phänotyp in diesen Würmern durch kleine chemische Moleküle gehemmt wird. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Wurms in einem flüssigkeitsbasierten Assay, um Inhibitoren zu identifizieren, die die Aktivitäten von EGFR- und RAS-Proteinen aufheben. Mit diesem Assay zeigen wir, dass R-Fendalin, ein indirekter Inhibitor von K-RAS, den Muv-Phänotyp unterdrückt, der in den mutierten Würmern let-60(n1046) und let-23(sa62) exprimiert wird. Der Assay ist einfach, kostengünstig, nicht zeitaufwendig einzurichten und kann als erste Plattform für die Entdeckung von Krebstherapeutika verwendet werden.

Introduction

Die zellulären Wege, die Entwicklungsereignisse innerhalb von Organismen regulieren, sind bei allen Metazoen hoch konserviert. Ein solcher Signalweg ist die EGFR-RAS-ERK-Signalkaskade (MITOGEN Activated Protein Kinase( MAPK), die ein kritischer Signalweg ist, der die Zellproliferation, Differenzierung, Migration und das Überleben steuert1,2. Defekte in diesem Signalweg können zu pathologischen oder Krankheitszuständen wie Krebs führen. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) hat sich in menschlichen Tumoren, einschließlich 50% der oralen Plattenepithelkarzinome, als hoch exprimiert erwiesen und trägt zur Entwicklung bösartiger Tumoren bei3,4,5. Während Mutationen in den drei RAS-Isoformen H-, K- und N-RAS wichtige Treiber für die maligne Transformation bei mehreren menschlichen Krebsarten sind. Unter diesen drei RAS-Isoformen sind onkogene Mutationen in K-RAS am häufigsten6,7,8. Damit EGFR und RAS funktionieren, müssen sie auf der Plasmamembran (PM) lokalisiert werden. Die Verhinderung der Lokalisierung dieser Moleküle zum PM kann die biologische Aktivität dieses Signalwegs vollständig aufheben9,10. Daher ist die Hemmung der Lokalisation dieser Proteine zum PM eine therapeutische Strategie, um die nachgelagerte Signalübertragung und die daraus resultierenden unerwünschten Ergebnisse zu blockieren. Mit einem High-Content-Screening-Assay wurde Fendilin, ein L-Typ-Kalziumkanalblocker, als Inhibitor der K-RAS-Aktivität11identifiziert. Die Nanoclusterung von K-RAS auf das innere Blättchen des PM wird in Gegenwart von Fendilin signifikant reduziert. Darüber hinaus wird K-RAS von der Plasmamembran auf das endoplasmatische Retikulum (ER), den Golgi-Apparat, die Endosomen und das Zytosol umverteilt. Noch wichtiger ist, dass die Proliferation von Bauchspeicheldrüsen-, Dickdarm-, Lungen- und Endometriumkarzinomzelllinien, die onkogene mutierte K-RAS exprimieren, durch die Hemmung der nachgeschalteten Signalübertragung durch Fendilin11blockiert wird. Diese Daten deuten darauf hin, dass Fendilin als spezifisches K-RAS-Antikrebstherapeutikum fungiert, das die Fehllokalisierung des RAS-Proteins auf das PM verursacht.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans wurde im Kontext der Entwicklung umfassend untersucht. Viele der Signalwege, die die Entwicklung im Wurm steuern, sind evolutionär und funktionell konserviert. Beispielsweise bleibt die EGFR-vermittelte Aktivierung von RAS und die anschließende Aktivierung der ERK-MAPK-Signalkaskade im Wurm12erhalten. Die Kaskade wird durch folgende Proteine dargestellt: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 ist homolog zu RAS, während LET-23 homolog zu EGFR ist. Im Wurm reguliert dieser Weg die Entwicklung der Vulva13. Die Vulva ist eine epitheliale Öffnung an der ventralen Körperwand des Wurms, die es ermöglicht, befruchtete Eier zu legen. Die Bildung der Vulva im Wurm ist abhängig von der Exposition der Vulvavorläuferzellen (VPC) gegenüber einem Aktivierungsgradienten der EGFR-RAS-MAPK-Signalkaskade. Während der normalen Entwicklung erhalten die proximalen VPCs starke Signale von den Gonadenankerzellen, um sich in 1° und 2° Zellschicksale zu differenzieren, die zu einer funktionellen Vulvaführen 12. Während sich distale VPCs in 3° Zellschicksale differenzieren, die mit dem hypodermalen Synzytium verschmelzen und aufgrund erschöpfter Signalübertragung keine Vulva bilden. In Ermangelung einer Signalübertragung differenzieren sich alle VPCs in 3° Zellschicksale, was zur Bildung keiner Vulva führt. Die konstitutive Signalgebung führt jedoch zur Bildung einer oder mehrerer nichtfunktionaler Vulva aufgrund der Induktion aller VPCs, 1° und 2° Zellschicksale anzunehmen.

Mutationen, die eine fehlerhafte oder übermäßige Vulvainduktion verursachen, wurden für viele der Gene identifiziert, die für Proteine kodieren, die diesen Weg repräsentieren. Eine defekte Vulvainduktion führt zu einem vulvalosen (Vul) Phänotyp, während eine übermäßige Vulvainduktion zu einem Multivulva (Muv) Phänotyp führt, der durch die Entwicklung zahlreicher nichtfunktioneller ektopischer Pseudovulvae in der gesamten ventralen Körperwand dargestellt wird. Der Muv-Phänotyp, der durch den let-60(n1046)-Stamm exprimiert wird, ist auf einen Gewinn der Funktionsmutation in RAS zurückzuführen, während er im let-23(sa62)-Stamm auf eine aktivierende Mutation in EGFR14,15zurückzuführen ist. Es wurde gezeigt, dass der starke Muv-Phänotyp in diesen mutierten Stämmen durch pharmakologische Eingriffe gestörtwird,wie die Behandlung von let-60(n1046)-Würmern mit dem MEK-1-Inhibitor U012616,17gezeigt hat. Interessanterweise haben wir gezeigt, dass R-Fendilin und Inhibitoren, die den Sphingomyelin-Stoffwechsel beeinflussen, den Muv-Phänotyp im Wurm unterdrücken18. Um zu demonstrieren, dass diese Inhibitoren die Let-60-Signalisierung auf RAS-Ebene blockieren, wurde der Lin-1-Nullstamm verwendet 17. Lin-1 ist ein Ets-like inhibitorischer Transkriptionsfaktor, der als Repressor bei der Entwicklung der Vulva19 fungiert. Eine starke Reversion des Muv-Phänotyps bei let-60(n1046)-Würmern und keine Wirkung auf Lin-1-Nullwürmer deuten darauf hin, dass diese Hemmungen auf der Ebene von RAS auftreten.

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von C. elegans als Modell zur Identifizierung von Inhibitoren von RAS- und EGFR-Proteinen. Mit einem flüssigkeitsbasierten Assay demonstrieren wir die hemmende Wirkung von R-Fendilin, indem wir die Muv-Phänotypen in den let-60(n1046) und let-23(sa62) mutanten Stämmen von C. elegansunterdrücken. Dieser Assay validiert die Verwendung von C. elegans als Werkzeug in der Anfangsphase der Wirkstoffforschung für Krebstherapeutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nematodenwachstumsmedium (NGM) Plattenvorbereitung

  1. 2,5 g Pepton und 3 g NaCl werden zu 970 ml entionisiertem Wasser in einem 2-L-Erlenmeyerkolben hinzugefügt. Inhalt mit einem magnetischen Rührstab umrühren. Danach 20 g Agar in den Kolben geben. Autoklavieren Sie den Inhalt des Kolbens bei 121 °C und einem Druck von 15 lb/in2 für 30 min. Nach der Sterilisation den Kolben auf eine Rührplatte legen und das Medium abkühlen lassen, bis die Temperatur 50 °C erreicht.
  2. Zur Herstellung der NGM-Platten werden dem abgekühlten Medium folgende Reagenzien zugesetzt: 25 ml 1 M Kaliumphosphatpuffer (pH = 6,0), 1 ml 1 MMgSO4,1 ml 1 MCaCl2,1 ml (5 mg/ml in 95% Ethanol) Cholesterin, 1 ml (10% v/w ethanol) Nystatin und 1 ml 25 mg/ml Streptomycin.
  3. Unter einer laminaren Strömung das abgekühlte Medium in 60 mm x 15 mm sterile Petrischalen gießen. Lassen Sie die Platten für 2 h erstarren. Diese Platten können 1 Monat bei 4 °C aufbewahrt werden.

2. Ausbreitung von C. elegans

  1. 100 μL über Nacht gewachsenes E. coli OP50 auf die Mitte jeder NGM-Platte aufstellen und die Platten 24 Stunden in einer laminaren Haube trocknen lassen. Anschließend können die Platten in einem Polystyrolbehälter gelagert werden.
    HINWEIS: Die E. coli OP50-Kultur wird vor der Aussaat der Platten in Luria-Bertani (LB)-Medien bei 37 °C-Medien angebaut. Die Kultur kann bei 4 °C für 1–2 Monate gelagert und für die periodische Aussaat von Platten verwendet werden.
  2. Sammeln Sie mit einem sterilen Wurmpickel 10-12 gravidierte erwachsene Würmer von einer zuvor gewachsenen Platte unter einem Seziermikroskop. Diese Würmer auf eine frische NGM-Platte mit E. coli OP50 geben und die Platte 24 h bei 20 °C bebrüten.
  3. Nach 24 h mit einem sterilen Wurmpickel erwachsene Würmer von den Platten entfernen. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C für ~ 3 Tage. Embryonen entwickeln sich zu graviden erwachsenen Würmern.

3. Herstellung einer synchronen C. elegans Kultur

  1. Sammeln Sie gravide erwachsene Würmer in einem konischen 15-ml-Röhrchen, indem Sie 2-4 Platten mit M9W waschen.
    1. Herstellung von M9W: 5 g NaCl, 6 gNa2HPO4und 3 gKH2PO4in entionisiertem Wasser zueinem Endvolumen von 1 L auflösen. Autoklaven Sie die Lösung bei 121 °C bei einem Druck von 15 lb/in2 für 30 min. 1 ml 1 M MgSO4 wird der gekühlten Lösung hinzugefügt.
  2. Pelletieren Sie die Würmer, indem Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand, ohne das Wurmpellet zu stören.
  3. Bereiten Sie die Wurmlyselösung vor, indem Sie 400 μL 8,25% Natriumhypochlorit (Haushaltsbleiche) und 100 μL 5 N NaOH kombinieren. Fügen Sie diese Lösung dem Wurmpellet hinzu und streichen Sie das Röhrchen, um den Inhalt des Röhrchens zu mischen. Verhindern Sie ein Überblenken der Embryonen in der Röhre, indem Sie die Lyse der Würmer unter einem Seziermikroskop beobachten.
  4. Fügen Sie 10 ml M9W in das konische Röhrchen hinzu, um die Lysemischung zu verdünnen, wenn 70% der erwachsenen Würmer lysiert haben.
  5. Zentrifugen Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min. Ersetzen Sie den Überstand durch 10 ml M9W.
  6. Wiederholen Sie Schritt 3.5 zweimal.
  7. Nach Abschluss der Waschschritte 3-5 ml M9W hinzufügen, um das Eierpellet wieder zu resuspendieren. Drehen Sie das Rohr über Nacht mit einer Drehzahl von 18 U/ min auf einem Rohrrotator bei Raumtemperatur (RT).
  8. Nach der Inkubation über Nacht das Röhrchen aus dem Rotator entfernen, die L1-Larven pelletieren, indem Sie das Röhrchen bei 450 x g für 1 min zentrifugieren. Saugen Sie den M9W an, bis 250 μL im Röhrchen verbleiben.
  9. Schütteln Sie das Röhrchen, um die Larven wieder zu besieden. Geben Sie drei 5 μL Tropfen mit den Larven auf einen Petrischalendeckel. Mit einem Seziermikroskop zählen Sie die Anzahl der Würmer in jedem Tropfen und bestimmen Sie die Anzahl der Würmer in 1 μL.

4. Erstellung von Drug Assays

HINWEIS: Die Schritte in diesem Assay sind in Abbildung 1 dargestellt.

  1. 30 ml E. coli OP50 in einem konischen 50 mL Rohr bei 37 °C über Nacht in einem Orbitalschüttler bei 150 U/min züchten.
  2. Über Nacht gewachsene E. coli OP50-Kultur bei 4.000 x g für 10 minuten spinnen, um die Zellen zu pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und schleudern Sie das Pellet in 3 ml M9W wieder auf, um die Kultur zu konzentrieren.
  3. Bevor Sie die Arbeitslösungen für den Wirkstofftest vorbereiten, fügen Sie 0,1 ml (5 mg / ml in 95% Ethanol) Cholesterin in 100 ml M9W hinzu.
  4. Bereiten Sie Arbeitslösungen jedes experimentellen Arzneimittels vor, indem Sie jedes Arzneimittel plus Vehikel (Dimethylsulfoxid; DMSO) in 4,8 ml M9W mit Cholesterin ergänzt, um die entsprechenden Konzentrationen zu erhalten. Lösen Sie DMSO in 4,8 ml M9W auf, ergänzt mit Cholesterin, um die Fahrzeugkontrolle vorzubereiten.
  5. Fügen Sie 200 μL konzentrierte E. coli OP50-Kultur zu jedem Röhrchen hinzu, das die Fahrzeugkontrolle oder Medikamente und Wirbelröhrchen enthält, um sicherzustellen, dass sie gemischt werden.
  6. Um das Experiment durchzuführen, fügen Sie 2 ml jeder funktionierenden Arzneimittellösung oder Fahrzeugkontrolle zu jeder Vertiefung in einer 12-Well-Gewebekulturplatte hinzu. Testen Sie jede Arzneimittelkonzentration und Fahrzeugkontrolle in doppelter Ausfertigung.
  7. Fügen Sie ~ 100 L1-Larven pro Vertiefung hinzu (siehe synchrone C. elegans-Kulturschritte) mit einer sterilen Mikropipette. Begrenzen Sie das Volumen der Würmer auf 10 μL.
  8. Inkubieren Sie die Platten bei 20 °C.
  9. Ergänzen Sie die Vertiefungen bei Bedarf am Tag 3 des Assays mit 50 μL 10x konzentriertem E. coli OP50.

5. Agarose-Pad-Vorbereitung für die Mikroskopie

  1. Bereiten Sie eine 2% ige w / v-Lösung von Agarose vor, indem Sie 0,1 g Agarose in 5 ml deionisiertem Wasser auflösen. Erhitzen Sie den Inhalt in einer Mikrowelle, um die Agarose aufzulösen. Aus 5 ml Agaroselösung können 20 Objektträger hergestellt werden.
  2. Legen Sie Streifen von Laborband entlang zweiErglasobjektträger. Das Band fungiert als Abstandshalter, die die Dicke der Agarose-Pads begrenzen. Danach legen Sie ein drittes sauberes Glasobjektträger zwischen die geklebten Dias.
  3. Um ein Agarose-Pad herzustellen, stellen Sie 100 μL geschmolzene Agarose auf die Mitte des sauberen Objektträgers. Legen Sie einen weiteren sauberen Glasträger über und auf die Agarose und drücken Sie vorsichtig nach unten, um ein Pad zu bilden. Entfernen Sie den oberen Schlitten, wenn das Pad erstarrt ist.

6. Beobachtung des Muv-Phänotyps in den Stämmen let-60, let-23 und lin-1

HINWEIS: Nur Kandidatenmedikamente, die die Muv-Phänotypen in let-23- und let-60-Stämmen unterdrücken, werden mit dem lin-1-Stamm untersucht, um festzustellen, ob die Hemmung auf der Ebene von RAS oder EGFR auftritt.

  1. Wenn das entsprechende Stadium des Lebenszyklus erreicht ist (3 Tage für die Stämme let-60 und let-23, 5 Tage für den lin-1-Stamm), entfernen Sie die Platten aus dem Inkubator. und sammeln Sie die Würmer in 15 ml konischen Röhrchen mit einer Pipette.
  2. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 450 x g für 1 min. Entfernen Sie M9W, ohne das Wurmpellet zu stören, und fügen Sie 5 mL frisches M9W hinzu.
  3. Wiederholen Sie Schritt 6.2 zweimal.
  4. Ohne das Wurmpellet zu stören, entfernen Sie alle verbleibenden M9W durch Aspiration. Danach 500 μL 2 mM Natriumazid oder 2 mM Tetramisolhydrochlorid hinzufügen. Lassen Sie die Röhrchen bei RT für 15 min. 2 mM Natriumazid oder 2 mM Tetramisolhydrochlorid anästhesieren die Würmer für die Bildgebung.
    ACHTUNG: Achten Sie darauf, beim Umgang mit Natriumazid persönliche Schutzausrüstung (PSA) zu tragen. Die Lösung muss unter einer chemischen Haube hergestellt werden.
  5. Fügen Sie 10 μL der anästhesierten Wurmsuspension auf die Mitte eines Agarose-Pads hinzu. Legen Sie einen #1,5-Abdeckel vorsichtig über die Schneckenaufhängung. Bei Bedarf den Abdeckklip mit etwas Nagellack fixieren, um ein Austrocknen zu verhindern.
  6. Verwenden Sie ein DIC-Mikroskop, um die Stämme let-60(n1046), let-23(sa62) und lin-1(sy254) zu beobachten. Stellen Sie sich die Würmer bei den 10- und 20-fachen Vergrößerungen vor.
  7. Für let-60(n1046) und let-23(sa62) bewerten Sie die erwachsenen Würmer basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen des Muv-Phänotyps. Zählen Sie für den Lin-1-Stamm die Anzahl der VPCs, die 1 ° oder 2 ° -Zellschicksale auf der ventralen Seite der L4-Larven mit einem hochauflösenden DIC-Mikroskop angenommen haben.
  8. Nachdem Sie die Mikroaufnahmen für jeden Stamm und jede medikamentöse Behandlung bewertet haben, führen Sie den t-Testdes Schülers durch, um die statistischen Unterschiede zwischen den Behandlungen zu bestimmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Wir zeigen zunächst, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046)-Mutantenstamm im Vergleich zu den DMSO-behandelten Würmern zu unterdrücken. Unsere Daten zeigen, dass R-Fendilin in der Lage ist, den Muv-Phänotyp im let-60(n1046) dosisabhängig zu blockieren (Abbildung 2A,B). Eine Nichtumkehr des Muv-Phänotyps wurde jedoch im lin-1-Nullmutantenstamm als Reaktion auf steigende Konzentrationen von R-Fendilin beobachtet(Abbildung 2B). Die Daten deuten darauf hin, dass R-Fendiline-Blöcke die Let-60-Signalisierung auf RAS-Ebene in C. elegansaktiviert haben. In ähnlicher Weise beobachteten wir, dass der Muv-Phänotyp im let-23(sa62)-Stamm als Reaktion auf die 3-, 10- und 30-μM-R-Fendilin-Behandlung im Vergleich zu den dmSO-behandelten Würmern signifikant reduziert war (Abbildung 2C, D). In allen Experimenten wurde der Students t-Testverwendet, um die statistische Signifikanz zu bestimmen.

Figure 1
Abbildung 1: Flussdiagramm, das die Schritte bei der Vorbereitung der Arzneimittelassays mit den Stämmen let-60(n1046), let-23(sa62) und lin-1(sy254) darstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: R-Fendilin verändert dosisabhängig die Funktion von let-60 und let-23 bei C. elegans.  (A) Repräsentative Bilder von let-60(n1046)-Würmern in Gegenwart von Fahrzeug (DMSO) oder 30 μM R-Fendilin. (B) Quantifizierung des Muv-Phänotyps bei let-60(n1046)-Würmern, die in Gegenwart von DMSO, 3, 10 und 30 μM R-Fendilin oder 30 μM U0126 behandelt wurden. (C) Repräsentative Bilder von let-23(sa62)-Würmern in Gegenwart von Fahrzeug (DMSO) oder 30 μM R-Fendilin. (D) Quantifizierung des Muv-Phänotyps in let-23(sa62)-Würmern, die in Gegenwart von DMSO, 3, 10 und 30 μM R-Fendilin oder 30 μM U0126 behandelt wurden. In allen Bildern sind die Pseudovulva durch weiße Pfeile und die normale Vulva durch weiße Sternchen gekennzeichnet. Für jede Behandlung wurden insgesamt 60 Würmer abgebildet. Das Experiment wurde 3 Mal wiederholt. (*** P<0,001 und ** P<0,01 wurden als signifikant angesehen) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Assays, die wir mit dem Wurm beschreiben, sind einfach und kostengünstig, um Inhibitoren der EGFR- und RAS-Funktion zu identifizieren. C. elegans ist ein attraktives Modell für die Wirkstoffforschung, da es aufgrund des kurzen Lebenszyklus (3 Tage bei 20 °C) und der Fähigkeit, eine große Anzahl von Larven zu erzeugen, leicht im Labor zu züchten ist. Noch wichtiger ist, dass der EGFR-RAS-ERK-MAPK-Signalweg evolutionär und funktionell konserviert wird, wobei Säugetiere ein genetisch handhabbares System zur Analyse der Auswirkungen von EGFR- und RAS-Inhibitoren bieten. Darüber hinaus ermöglicht die transparente Natur der Würmer einem Forscher, unterschiedliche Strukturen und die Lokalisierung von Grün fluoreszierendem Protein (GFP) oder anderen Fluorophoren zu visualisierungen, die durch DIC- und Fluoreszenzmikroskopie mit interessanten Proteinen verschmolzen sind.

Die Protokolle, die wir zur Verbreitung und Aufrechterhaltung der verschiedenen C. elegans verwendeten C. elegans verwendethaben,wurden zuvor festgelegt20,21. Bei der Herstellung von NG-Platten haben wir jedoch Streptomycin und Nystatin eingebaut, um eine bakterielle und Pilzkontamination zu verhindern. Die Zugabe dieser antimikrobiellen Wirkstoffe behinderte die Entwicklung der Würmer und die Induktion des Muv-Phänotyps nicht.

Es gibt mehrere Vorteile für die Gewinnung von L1-Larven durch das Wurmsynchronisationsprotokoll. Viele Larven können aus 2 oder mehr Platten mit graviden Erwachsenen gewonnen werden und die gesammelten Larven sind alle alterssynchron. Dies stellt sicher, dass die Entwicklung der Würmer innerhalb der Population konsistent ist. Einige mutierte Stämme, die den Muv-Phänotyp aufweisen, sind schlechte Eischichten, die zu geringen Larvenerträgen führen, wie sie in der Nullmutation des Transkriptionsfaktors lin-1 19der Ets-Familiezusehen sind. Die Bleichmittelbehandlung der Lin-1 gravid Erwachsenen erhöht signifikant die Anzahl der Larven, die für den Test benötigt werden.

Es ist wichtig, die Lyse der Würmer während der Herstellung einer synchronen C. elegans-Kultur zu beobachten. Die dicke Eierschale schützt die Embryonen teilweise vor der Wirkung der Bleich-Natriumhydroxid-Mischung, auch wenn sich die Nagelhaut der Larven und Erwachsenen auflöst. Eine längere Exposition gegenüber der Lyselösung dringt jedoch in diese Schutzhülle ein, was zum Tod der Embryonen führt. Daher ist es wichtig, die Wirkung der Bleichmittel-Natriumhydroxid-Mischung zu stoppen, wenn 70% der erwachsenen Würmer lysiert haben. Dies wird durch Verdünnung der Lyselösung mit M9W erreicht. Die Aufrechterhaltung der festgehaltenen L1-Larven ist ein weiterer Schritt, der im synchronen C. elegans-Kulturprotokoll zu berücksichtigen ist. Eine längere Inkubation der L1-arrestierten Larven in M9W kann dazu führen, dass sie sich aufgrund der Ansammlung des Dauerpheromons in das Dauerstadium verwandeln. Um die Bildung des Dauerstadiums zu vermeiden, wird empfohlen, die L1-arrestigen Larven innerhalb von 1-2 Tagen nach der Entnahme der Embryonen zu verwenden.

Der basale Muv-Phänotyp beträgt 60%-90% bzw. 90% für die Würmer let-60(n1046) und let-23(sa62). Dies deutet darauf hin, dass die let-60 (n1046) -Würmer einer phänotypischen Drift unterliegen und daher ist es wichtig, die basalen Expressionsniveaus des Muv-Phänotyps zu melden. Die Behandlung von let-60(n1046) und let-23(sa62) Würmern mit R-Fendilin und anderen K-RAS-Inhibitoren reduziert den Prozentsatz der Würmer, die den Muv-Phänotyp exprimieren. Es wird jedoch auch berichtet, dass einige Inhibitoren des EGFR-RAS-ERK-MAPK-Signalwegs die Anzahl der Pseudovulvae pro Wurm allein reduzieren oder sowohl die Expression als auch die Anzahl der Pseudovulvae beeinflussen können17. Daher ist es wichtig, die Anzahl der Pseudovulvae in den Muv-Würmern sowohl in medikamentösen als auch in DMSO-behandelten Würmern zu zählen. Der Muv-Phänotyp, ausgedrückt in adulten let-60(n1046) und let-23(sa62) Würmern, ist unter einem Seziermikroskop deutlich sichtbar. Der Lin-1 (Null) Stamm ist jedoch relativ ungesund, entwicklungsbehindert und die Vulvavorsprünge sind bei den erwachsenen Würmern schlecht unterschieden. Daher können anstelle der ektopischen Vulvaprotrusionen bei Lin-1 (Null)-Würmern VPCs, die im L4-Stadium ein angenommenes 1°- oder 2°-Zellschicksal auf der ventralen Seite annehmen, mit einem hochauflösenden DIC-Mikroskop gezählt werden.

Der Assay ist kostengünstig, einfach und nicht zeitaufwendig einzurichten. Um die Verarbeitungszeit weiter zu verbessern, können die Würmer in den Vertiefungen der Gewebekulturplatte auf eine Endkonzentration von 2 mM Natriumazid betäubt und mit einem mit einer Kamera ausgestatteten Seziermikroskop abgebildet werden. Eine weitere Modifikation des Assays wäre die Verwendung von hitzeabtöteten E. coli OP50 anstelle von lebenden Bakterien23. Es wurde gezeigt, dass Bakterien bestimmte kleine Moleküle metabolisieren können, was zu reduzierten Bioaktivitäten führt24.

Frühere Studien haben gezeigt, dass die Induktion der Vulva im Wurm von bestimmten Umwelteinflüssen abhängt. Die vulvalosen Phänotypen von lin-3(n378) und let-23(n1045) haben sich durch Hunger und Verlassen des Dauerstadiums14teilweise unterdrückt. Darüber hinaus zeigte eine Studie von Moghal et al., dass vulvalose Lin-3(n378), let-23(sy1) und let-60(sy95dn)-Mutanten, die im M9-Puffer gezüchtet wurden, eine höhere Anzahl von VPCs aufwiesen, die vulvale Zellschicksale annahmen, verglichen mit Tieren, die auf Standard-NG-Platten gezüchtet wurden24. Die Daten deuten darauf hin, dass Würmer, die in einer flüssigen Umgebung gezüchtet werden, die Vulvainduktion beeinflussen. In unseren Studien haben wir jedoch keine Unterdrückung des Muv-Phänotyps in einer flüssigen Umgebung beobachtet.

In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von C. elegans zur Bewertung der Anti-RAS-Eigenschaften von Fendilin. In einer früheren Studie haben wir gezeigt, dass mehrere saure Sphingomyelinase-Inhibitoren, einschließlich trizyklischer Antidepressiva wie Desipramin, Imipramin und Amitriptylin, den Muv-Phänotyp18hemmen. Darüber hinaus unterdrücken Inhibitoren der Sphingomyelin- und Ceramid-Biosynthesewege den Muv-Phänotyp, der in den let-60(n1046)-Würmern exprimiert wird. Diese Ergebnisse mit dem Wurm wurden in Säugetierzelllinien validiert.

Abschließend demonstrieren wir die Verwendung von C. elegans zur Identifizierung von Inhibitoren der EGFR- und RAS-Aktivität in einem flüssigkeitsbasierten Assay. Darüber hinaus bietet der Wurm ein weiteres System zur Identifizierung und Charakterisierung der Wirkmechanismen von Anti-RAS- und EGFR-Therapeutika.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) für die Bereitstellung der let-60 (n1046). Wir danken auch Dr. David Reiner (Texas A & M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology in Houston) für den Lin-1-Stamm. Schließlich danken wir Dr. Danielle Garsin und ihrem Labor (The University of Texas, McGovern Medical School) für die Bereitstellung einiger der Reagenzien. Einige Wurmstämme wurden vom CGC zur Verfügung gestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Diese Forschung wurde durch das Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) Stipendium RP200047 an JF Hancock unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marshall, M. Interactions between Ras and Raf: key regulatory proteins in cellular transformation. Molecular Reproduction and Development. 42 (4), 493-499 (1995).
  2. Whelan, J. T., Hollis, S. E., Cha, D. S., Asch, A. S., Lee, M. H. Post-transcriptional regulation of the Ras-ERK/MAPK signaling pathway. Journal of Cellular Physiology. 227 (3), 1235-1241 (2012).
  3. Grandis, J. R., Tweardy, D. J. Elevated levels of transforming growth factor alpha and epidermal growth factor receptor messenger RNA are early markers of carcinogenesis in head and neck cancer. Cancer Research. 53 (15), 3579-3584 (1993).
  4. Sasahira, T., Kirita, T., Kuniyasu, H. Update of molecular pathobiology in oral cancer: a review. International Journal of Clinical Oncology. 19 (3), 431-436 (2014).
  5. Stransky, N., et al. The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma. Science. 333 (6046), 1157-1160 (2011).
  6. Bos, J. L. ras oncogenes in human cancer: a review. Cancer Research. 49 (17), 4682-4689 (1989).
  7. Downward, J. Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 3 (1), 11-22 (2003).
  8. Prior, I. A., Lewis, P. D., Mattos, C. A comprehensive survey of Ras mutations in cancer. Cancer Research. 72 (10), 2457-2467 (2012).
  9. Hancock, J. F. Ras proteins: different signals from different locations. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (5), 373-384 (2003).
  10. Hancock, J. F., Parton, R. G. Ras plasma membrane signalling platforms. Biochemical Journal. 389, 1-11 (2005).
  11. van der Hoeven, D., et al. Fendiline inhibits K-Ras plasma membrane localization and blocks K-Ras signal transmission. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 237-251 (2013).
  12. Moghal, N., Sternberg, P. W. The epidermal growth factor system in Caenorhabditis elegans. Experimental Cell Research. 284 (1), 150-159 (2003).
  13. Sundaram, M. V. RTK/Ras/MAPK signaling. WormBook. , 1-19 (2006).
  14. Ferguson, E. L., Horvitz, H. R. Identification and characterization of 22 genes that affect the vulval cell lineages of the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 110 (1), 17-72 (1985).
  15. Katz, W. S., et al. A point mutation in the extracellular domain activates LET-23, the Caenorhabditis elegans epidermal growth factor receptor homolog. Molecular and Cellular Biology. 16 (2), 529-537 (1996).
  16. Hara, M., Han, M. Ras farnesyltransferase inhibitors suppress the phenotype resulting from an activated ras mutation in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (8), 3333-3337 (1995).
  17. Reiner, D. J., Gonzalez-Perez, V., Der, C. J., Cox, A. D. Use of Caenorhabditis elegans to evaluate inhibitors of Ras function in vivo. Methods in Enzymology. 439, 425-449 (2008).
  18. van der Hoeven, D., et al. Sphingomyelin Metabolism Is a Regulator of K-Ras Function. Molecular and Cellular Biology. 38 (3), (2018).
  19. Beitel, G. J., Tuck, S., Greenwald, I., Horvitz, H. R. The Caenorhabditis elegans gene lin-1 encodes an ETS-domain protein and defines a branch of the vulval induction pathway. Genes & Development. 9 (24), 3149-3162 (1995).
  20. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. Journal Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  21. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  22. Revtovich, A. V., Lee, R., Kirienko, N. V. Interplay between mitochondria and diet mediates pathogen and stress resistance in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 15 (3), 1008011 (2019).
  23. Zimmermann, M., Zimmermann-Kogadeeva, M., Wegmann, R., Goodman, A. L. Mapping human microbiome drug metabolism by gut bacteria and their genes. Nature. 570 (7762), 462-467 (2019).
  24. Moghal, N., Garcia, L. R., Khan, L. A., Iwasaki, K., Sternberg, P. W. Modulation of EGF receptor-mediated vulva development by the heterotrimeric G-protein G-alpha q and excitable cells in C. elegans. Development. 130 (19), 4553-4566 (2003).

Tags

Krebsforschung Ausgabe 164 Caenorhabditis elegans LET-60 LET-23 K-RAS EGFR GFP
Identifizierung von EGFR- und RAS-Inhibitoren mittels <em>Caenorhabditis elegans</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter