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Cancer Research

कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग करके ईजीएफआर और आरएएस अवरोधकों की पहचान

Published: October 5, 2020 doi: 10.3791/61788
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 2, 1
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Summary

आनुवंशिक रूप से ट्रैक्टेबल नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का उपयोग दवा खोज के लिए एक सरल और सस्ती मॉडल के रूप में किया जा सकता है। यहां वर्णित कैंसर रोधी चिकित्सीय की पहचान करने के लिए एक प्रोटोकॉल है जो आरएएस और ईजीएफआर प्रोटीन के डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग को रोकता है।

Abstract

एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) और इसके डाउनस्ट्रीम इफेक्टर आरएएस के प्लाज्मा झिल्ली स्थानीयकरण में बदलाव को कैंसर सहित कई बीमारियों में फंसाया गया है । मुक्त रहने वाले सूत्रकृमि सी एलिगेंस के पास एक विकासवादी और कार्यात्मक रूप से संरक्षित ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके मैप सिग्नल झरना है जो योनी के विकास के लिए केंद्रीय है। आरएएस समरूप LET-60 और ईजीएफआर होमलॉग ले-23 में कार्य उत्परिवर्तन का लाभ इन कीड़ों के वेंट्रल शरीर की दीवार के साथ दृश्यमान गैर-कार्यात्मक एक्टोपिक छद्म काल्वत्व की पीढ़ी को प्रेरित करता है। इससे पहले, इन कीड़ों में मल्टीवेल्वल (मव) फेनोटाइप को छोटे रासायनिक अणुओं द्वारा बाधित दिखाया गया है। यहां हम ईजीएफआर और आरएएस प्रोटीन की गतिविधियों को समाप्त करने वाले अवरोधकों की पहचान करने के लिए तरल आधारित परख में कीड़े का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इस परख का उपयोग करके, हम आर-फेंडिलाइन, कश्मीर-आरएएस के अप्रत्यक्ष अवरोधक को दिखाते हैं, चलो-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) उत्परिवर्ती कीड़े में व्यक्त किए गए एमयूवी फेनोटाइप को दबा देते हैं। परख सरल, सस्ती है, सेटअप करने के लिए समय लेने वाली नहीं है, और कैंसर रोधी चिकित्सा विज्ञान की खोज के लिए एक प्रारंभिक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

जीवों के भीतर विकासात्मक घटनाओं को विनियमित करने वाले सेलुलर रास्ते सभी मेटाज़ॉन के बीच अत्यधिक संरक्षित हैं। ऐसा ही एक मार्ग ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके माइटोजेन सक्रिय प्रोटीन किनेज (एमएपीके) सिग्नलिंग झरना है जो एक महत्वपूर्ण मार्ग है जो सेल प्रसार, भेदभाव, प्रवासन और अस्तित्व1, 2कोनियंत्रितकरता है। इस सिग्नलिंग मार्ग में दोष कैंसर जैसे रोग या रोग राज्यों का कारण बन सकते हैं। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर (ईजीएफआर) ने मानव ट्यूमर में अत्यधिक व्यक्त किया है, जिसमें मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा का 50% शामिल है, औरघातक ट्यूमर3,4, 5के विकास में योगदानदेताहै। जबकि तीन आरएएस आइसोफॉर्म एच-, के और एन-आरएएस में म्यूटेशन कई मानव कैंसर में घातक परिवर्तन के लिए प्रमुख चालक हैं । इन तीन आरएएस आइसोफॉर्म्स में से, के-आरएएस में ऑन्कोजेनिक म्यूटेशन सबसे अधिक प्रचलित हैं6,7,8। ईजीएफआर और आरएएस के कार्य करने के लिए, उन्हें प्लाज्मा झिल्ली (पीएम) का स्थानीयकरण करना होगा। इन अणुओं को प्रधानमंत्री तक ले जाने से इस संकेत मार्ग 9,10की जैविक गतिविधि को पूरीतरहसे समाप्त किया जा सकता है . इसलिए प्रधानमंत्री को इन प्रोटीनों के स्थानीयकरण का अवरोध डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग और परिणामी प्रतिकूल परिणामों को अवरुद्ध करने के लिए एक चिकित्सीय रणनीति है । एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग परख का उपयोग करना, फेंडिलाइन, एक एल प्रकार कैल्शियम चैनल अवरोधक, कश्मीर-आरएएस गतिविधि11के एक अवरोधक के रूप में पहचाना गया था । पीएम के इनर पर्चा के लिए कश्मीर-रास का नैनोक्लस्टरिंग फेंडिलाइन की उपस्थिति में काफी कम हो जाता है । इसके अलावा, के-आरएएस को प्लाज्मा झिल्ली से एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर), गोलगी उपकरण, एंडोसोम्स और साइटोसोल में पुनर्वितरित किया जाता है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, अग्नाशय, पेट, फेफड़े, और एंडोमेट्रियल कैंसर सेल लाइनों का प्रसार ऑन्कोजेनिक उत्परिवर्ती के-आरएएस व्यक्त करना11से डाउनस्ट्रीम सिग्नलिंग के अवरोध से अवरुद्ध है। ये आंकड़े एक विशिष्ट कश्मीर-आरएएस कैंसर रोधी चिकित्सीय के रूप में फेंडिलाइन कार्यों का सुझाव देते हैं जो प्रधानमंत्री को आरएएस प्रोटीन के गलत स्थानीयकरण का कारण बनता है ।

नेमाटोड कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस का विकास के संदर्भ में बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। कीड़े में विकास को नियंत्रित करने वाले कई सिग्नल रास्ते विकासवादी और कार्यात्मक रूप से संरक्षित हैं। उदाहरण के लिए, ईजीएफआर ने आरएएस की मध्यस्थता की सक्रियता और ईआरके मैप सिग्नल कैस्केड की बाद की सक्रियता कीड़ा12में संरक्षित है। झरना निम्नलिखित प्रोटीन द्वारा प्रतिनिधित्व किया जाता है: एलईई-23 > एलईई-60 > एलईके-45 > एमईके-2 > एमपीके-1। LET-60 आरएएस के मुताबिक़ है, जबकि लेट-23 ईजीएफआर के मुताबिक़ है। कीड़े में, यह मार्ग योनी13के विकास को नियंत्रित करता है। योनी कीड़े के वेंट्रल बॉडी वॉल पर एक एपिथेलियल अपर्चर है जो निषेचित अंडे रखने की अनुमति देता है। कीड़े में योनी का गठन ईजीएफआर-आरएएस-मैप सिग्नल झरना के सक्रियण के ढाल के लिए वल्वल अग्रदूत कोशिकाओं (वीपीसी) के जोखिम पर निर्भर करता है। सामान्य विकास के दौरान, समीपस्थ वीपीसी को गोनाडल लंगर कोशिकाओं से 1 डिग्री और 2 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करने के लिए मजबूत संकेत प्राप्त होते हैं जो एक कार्यात्मक योनी12को जन्म देते हैं। जबकि डिस्टल वीपीसी 3 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करता है जो हाइपोडरमल सिंक्टियम को फ्यूज करता है और समाप्त सिग्नलिंग के कारण योनी नहीं बनाते हैं। सिग्नलिंग के अभाव में, सभी वीपीसी 3 डिग्री सेल फैट्स में अंतर करते हैं जिसके परिणामस्वरूप कोई योनी नहीं होती है। हालांकि, संविलियन सिग्नलिंग 1 डिग्री और 2 डिग्री सेल फैट्स ग्रहण करने के लिए सभी वीपीसी के शामिल होने के कारण एक या अधिक गैर-कार्यात्मक योनी का गठन करता है।

उत्परिवर्तन जो दोषपूर्ण या अत्यधिक वल्वल प्रेरण का कारण बनते हैं, कई जीन के लिए पहचाने गए हैं जो इस मार्ग का प्रतिनिधित्व करने वाले प्रोटीन के लिए एन्कोड करते हैं । दोषपूर्ण वल्वल प्रेरण के परिणामस्वरूप एक वल्वलेस (वल्) फेनोटाइप होता है, जबकि अत्यधिक वल्वल प्रेरण के परिणामस्वरूप एक मल्टीवुवा (मयूवी) फेनोटाइप होता है जो पूरे वेंट्रल बॉडी वॉल में कई नॉनफंक्शनल एक्टोपिक छद्म के विकास द्वारा दर्शाया जाता है। चलो-60 (n1046) तनाव द्वारा व्यक्त Muv फेनोटाइप आरएएस में समारोह उत्परिवर्तन के लाभ के कारण है, जबकि चलो-23 (sa62) तनाव में यह EGFR14, 15में एक सक्रिय उत्परिवर्तन के कारण है । इन उत्परिवर्ती उपभेदों में मजबूत मुव फेनोटाइप को औषधीय हस्तक्षेपों से बेफिक्र दिखाया गया है जैसा कि एमईके-1 अवरोधक U0126 16, 17 के साथ let-60 (n1046) कीड़े के उपचार द्वारा प्रदर्शित किया गया है। दिलचस्प बात यह है कि हमने दिखाया है कि आर-फेंडिलाइन और अवरोधक जो स्फिंगोमीलिन मेटाबोलिज्म को प्रभावित करते हैं,कीड़ा 18में फूव फेनोटाइप को दबा देते हैं । इन अवरोधकों को प्रदर्शित करने के लिए आरएएस के स्तर पर चलो-60 सिग्नलिंग को अवरुद्ध करते हैं, लिन-1 नल तनाव का उपयोग किया गया है17। लिन-1 एक Ets की तरह निरोधात्मक प्रतिलेखन कारक है जो योनी19के विकास में एक दमनकार के रूप में कार्य करता है। एलई-60 (n1046) कीड़े में मव फेनोटाइप का मजबूत प्रतिवर्तन और लिन-1 नल कीड़े पर कोई प्रभाव नहीं है कि ये संकोच आरएएस के स्तर पर होते हैं।

इस प्रोटोकॉल में, हम आरएएस और ईजीएफआर प्रोटीन के अवरोधकों की पहचान करने के लिए एक मॉडल के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। तरल-आधारित परख का उपयोग करके, हम सी एलिगेंसके लेट-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) उत्परिवर्ती उपभेदों में एमयूवी फेनोटाइप को दबाकर आर-फेंडिलाइन के निरोधात्मक प्रभावों को प्रदर्शित करते हैं। यह परख कैंसर रोधी चिकित्सीय के लिए दवा की खोज के प्रारंभिक चरण में एक उपकरण के रूप में सी एलिगेंस के उपयोग को मान्य करता है।

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Protocol

1. नेमाटोड ग्रोथ मीडियम (एनजीएम) प्लेट तैयार करना

  1. 2 एल एर्लेनमेयर फ्लास्क में निहित 970 एमएल डिओनाइज्ड पानी में 2.5 ग्राम पेप्टोन और 3 ग्राम एनएसीएल जोड़ें। चुंबकीय हलचल बार का उपयोग करके सामग्री को हिलाएं। इसके बाद फ्लास्क में 20 ग्राम एगर डालें। फ्लास्क की सामग्री को 121 डिग्री सेल्सियस पर और 30 मिनट के लिए2 में 15 पौंड/दबाव का दबाव। नसबंदी के बाद फ्लास्क को हलचल की प्लेट पर रखें और मीडियम को तब तक ठंडा होने दें जब तक तापमान 50 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए।
  2. एनजीएम प्लेटें तैयार करने के लिए कूल्ड मीडियम में निम्नलिखित रिएजेंट्स जोड़ें: 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट बफर (पीएच = 6.0), 1 एम एमजीएसओ 4 के 1 एमएल, 1 एम सीएसीएल2के1एमएल, 1 एमएल (95% इथेनॉल में 5 मिलीग्राम/कोलेस्ट्रॉल) कोलेस्ट्रॉल, 1 मिलीलीटर (इथेनॉल में 10% v/w) nystatin, और 25 मिलीग्राम/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन के 1 मिलीलीटर ।
  3. एक लैमिनार प्रवाह के तहत, ठंडा माध्यम को 60 मिमी x 15 मिमी बाँझ पेट्री व्यंजनों में डालें। प्लेटों को 2 घंटे के लिए जमना चाहिए। इन प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 महीने तक रखा जा सकता है।

2. सी एलिगेंस का प्रचार

  1. प्रत्येक एनजीएम प्लेट के केंद्र पर रातोंरात उगाए जाने वाले ई. कोलाई OP50 के 100 माइक्रोन को स्पॉट करें और प्लेटों को एक लैमिनार हुड में 24 घंटे के लिए सूखने की अनुमति दें। बाद में, प्लेटों को पॉलीस्टीरिन कंटेनर में संग्रहित किया जा सकता है।
    नोट: ई. कोलाई OP50 संस्कृति प्लेटों की सीडिंग से पहले ३७ डिग्री सेल्सियस मीडिया परलुरिया-बर्टानी (एलबी) मीडिया में उगाई जाती है । संस्कृति को 1-2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और प्लेटों के आवधिक सीडिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है।
  2. बाँझ कीड़ा लेने का उपयोग करना, एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत पहले से उगाई गई प्लेट से 10-12 ग्रेविड वयस्क कीड़े इकट्ठा करें। इन कीड़े को ई कोलाई OP50 के साथ वरीयता प्राप्त एक ताजा एनजीएम प्लेट में स्थानांतरित करें और 20 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. 24 घंटे के बाद, बाँझ कीड़े का उपयोग कर-प्लेटों से वयस्क कीड़े को हटा दें। ~ 3 दिनों के लिए 20 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें। भ्रूण ग्रेविड वयस्क कीड़े में विकसित होगा।

3. एक समकालिक सी एलिगेंस संस्कृति की तैयारी

  1. M9W के साथ 2-4 प्लेटों को धोकर 15 एमएल शंकु नली में ग्रेविड वयस्क कीड़े को इकट्ठा करें।
    1. M9W की तैयारी: एनएसीएल के 5 ग्राम, एनए2एचपीओ4के 6 ग्राम और केएच2पीओ 4 के3 ग्राम को डिओनाइज्ड पानी में 1 एल ऑटोक्लेव के अंतिम वॉल्यूम में 121 डिग्री सेल्सियस पर घोल को 15 पौंड/2 में30 मिनट के लिए घोल दें । कूल्ड सॉल्यूशन में 1 एम एमजीएसओ 4 का1 एमएल डालें।
  2. 1 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर ट्यूब अपकेंद्रित्र द्वारा कीड़े गोली। कीड़ा गोली को परेशान किए बिना सुपरनेट को डिसेंट करें।
  3. 8.25% सोडियम हाइपोक्लोराइट (घरेलू ब्लीच) के 400 माइक्रोन और 5 एन नाओएच के 100 माइक्रोन के संयोजन से कृमि लाइसिस समाधान तैयार करें। कीड़ा गोली के लिए इस समाधान जोड़ें और ट्यूब की सामग्री मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत कीड़े के लाइसिस को देख कर ट्यूब में भ्रूण के अधिक चिंता को रोकें।
  4. 70% वयस्क कीड़े के lysed होने पर लाइसिस मिश्रण को पतला करने के लिए शंकु नली में एम9डब्ल्यू के 10 एमएल जोड़ें।
  5. 1 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर ट्यूब सेंट्रलाइज करें। एम9डब्ल्यू के 10 एमएल के साथ सुपरनॉट को बदलें।
  6. दो बार चरण 3.5 दोहराएं।
  7. धोने के चरणों को पूरा करने के बाद, अंडे की गोली को फिर से खर्च करने के लिए M9W के 3-5 एमएल जोड़ें। कमरे के तापमान (आरटी) पर एक ट्यूब रोटेटर पर 18 आरपीएम की गति से ट्यूब को रात भर घुमाएं।
  8. रात भर इनक्यूबेशन के बाद, रोटेटर से ट्यूब को हटा दें, 1 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर ट्यूब को अपकेंद्री करके एल1 लार्वा को गोली दें। 250 μL ट्यूब में छोड़ दिया है जब तक M9W aspirate।
  9. लार्वा को फिर से खर्च करने के लिए ट्यूब को हिलाएं। पेट्री डिश ढक्कन पर लार्वा युक्त तीन 5 माइक्रोन बूंदें जोड़ें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रत्येक बूंद में कीड़े की संख्या की गणना करें और 1 माइक्रोन में कीड़े की संख्या निर्धारित करें।

4. दवा परख की तैयारी

नोट: इस परख में कदम चित्रा 1में दिखाए गए हैं ।

  1. 150 आरपीएम पर एक कक्षीय शेखर में रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल शंकु नली में ई कोलाई OP50 के 30 एमएल बढ़ाएं।
  2. स्पिन रातोंरात हो ई. कोलाई OP50 संस्कृति 4,000 x ग्राम पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं गोली। सुपरनॉट निकालें और संस्कृति को केंद्रित करने के लिए M9W के 3 एमएल में गोली को फिर से खर्च करें।
  3. दवा परख के लिए काम कर रहे समाधान तैयार करने से पहले, M9W के 100 मिलीएल में 0.1 एमएल (5 मिलीग्राम/एमएल 95% इथेनॉल में) कोलेस्ट्रॉल जोड़ें।
  4. प्रत्येक दवा प्लस वाहन (डाइमेथाइल सल्फोक्साइड) को कमजोर करके प्रत्येक प्रयोगात्मक दवा के कार्य समाधान तैयार करें; DMSO) में 4.8 एमएल M9W उचित सांद्रता प्राप्त करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक। वाहन नियंत्रण तैयार करने के लिए कोलेस्ट्रॉल के साथ पूरक M9W के 4.8 एमएल में DMSO भंग।
  5. वाहन नियंत्रण या दवाओं और भंवर ट्यूबों युक्त प्रत्येक ट्यूब के लिए केंद्रित ई. कोलाई OP50 संस्कृति के 200 μL जोड़ें सुनिश्चित करने के लिए वे मिश्रित कर रहे हैं।
  6. प्रयोग करने के लिए, प्रत्येक कामकाजी दवा समाधान या वाहन नियंत्रण के 2 एमएल को 12-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट में प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें। प्रत्येक दवा एकाग्रता और वाहन नियंत्रण को डुप्लिकेट में परीक्षण करें।
  7. एक बाँझ माइक्रोपिपेट का उपयोग करके ~100 एल 1 लार्वा प्रति अच्छी तरह जोड़ें (सिंक्रोनस सी एलिगेंस कल्चर स्टेप्स देखें)। कीड़े की मात्रा को 10 माइक्रोल तक सीमित करें।
  8. प्लेटों को 20 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  9. यदि आवश्यक हो तो परख के तीसरे दिन 10x केंद्रित ई. कोलाई OP50 के 50 μL के साथ कुओं के पूरक।

5. माइक्रोस्कोपी के लिए एगर उठे पैड की तैयारी

  1. 5 एमएल में 0.1 ग्राम एग्रास को घोलकर एगरेज का 2% डब्ल्यू/वी सॉल्यूशन तैयार करें। एगर उठे को भंग करने के लिए सामग्री को माइक्रोवेव में गर्म करें। एगरेग्लेड सॉल्यूशन के 5 एमएल से 20 स्लाइड तैयार किए जा सकते हैं।
  2. दो ग्लास स्लाइड के साथ लैब टेप की स्ट्रिप्स रखें। टेप एगर उठे पैड की मोटाई को सीमित करने वाले स्पेसर्स के रूप में कार्य करेगा। इसके बाद, टेप स्लाइड के बीच एक तिहाई साफ ग्लास स्लाइड रखें।
  3. एक agarose पैड बनाने के लिए, पिघला हुआ agl के १०० μL हाजिर साफ स्लाइड के केंद्र पर उठी । एक और साफ ग्लास स्लाइड भर में और agarose के शीर्ष पर रखें और धीरे से नीचे प्रेस करने के लिए एक पैड फार्म । जब पैड जम गया हो तो शीर्ष स्लाइड निकालें।

6. चलो-60, चलो-23 और लिन-1 उपभेदों में Muv फेनोटाइप का अवलोकन

नोट: केवल उम्मीदवार दवाओं है कि चलो-23 और चलो-६० उपभेदों में Muv फेनोटाइप को दबाने के लिए निर्धारित करने के लिए अगर निषेध आरएएस या EGFR के स्तर पर होता है लिन-1 तनाव का उपयोग कर assayed जाएगा ।

  1. जब जीवन चक्र का उपयुक्त चरण पहुंच जाता है (लेट-60 और लेट-23 उपभेदों के लिए 3 दिन, लिन-1 तनाव के लिए 5 दिन), इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटा दें। और एक पिपेट का उपयोग करके 15 एमएल शंकु नलियों में कीड़े इकट्ठा करें।
  2. 1 मिनट के लिए 450 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। कीड़ा गोली को परेशान किए बिना M9W को हटा दें और ताजा M9W के 5 एमएल जोड़ें।
  3. दो बार चरण 6.2 दोहराएं।
  4. कीड़ा गोली परेशान किए बिना, आकांक्षा द्वारा सभी शेष M9W को हटा दें। इसके बाद 2 एमएम सोडियम एजाइड या 2 एमएम टेट्रामिसोल हाइड्रोक्लोराइड के 500 माइक्रोन डालें। ट्यूबों को 15 मिनट के लिए आरटी में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। 2 एमएम सोडियम एजाइड या 2 एमएम टेट्रामिसोल हाइड्रोक्लोराइड इमेजिंग के लिए कीड़े को एनेस्थेटाइज करेगा।
    सावधानी: सोडियम एजाइड से निपटने के दौरान व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनना सुनिश्चित करें। समाधान एक रासायनिक हुड के तहत तैयार किया जाना चाहिए।
  5. एक एग्राजिंग पैड के केंद्र पर एनेस्थेटाइज्ड कृमि निलंबन के 10 माइक्रोन जोड़ें। कीड़ा निलंबन पर धीरे से एक #1.5 कवरलिप रखें। यदि आवश्यक हो, तो सूखने से रोकने के लिए कुछ नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को ठीक करें।
  6. चलो-60 (n1046), let-23 (sa62) और लिन-1 (sy254) उपभेदों का निरीक्षण करने के लिए एक डीआईसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करें । 10x और 20x आवर्धन पर कीड़े छवि ।
  7. लेट-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) के लिए, मुव फेनोटाइप की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर वयस्क कीड़े स्कोर करें। लिन-1 तनाव के लिए, उच्च रिज़ॉल्यूशन डीआईसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एल4 लार्वा के वेंट्रल साइड पर 1 डिग्री या 2 डिग्री सेल फैट्स को अपनाने वाले नंबर वीपीसी की गणना करें।
  8. प्रत्येक तनाव और दवा उपचार के लिए माइक्रोग्राफ स्कोरिंग के बाद, उपचार के बीच सांख्यिकीय मतभेदों को निर्धारित करने के लिए छात्र टीपरीक्षण प्रदर्शन करते हैं ।

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Representative Results

हम पहले प्रदर्शित करते हैं कि आर-फेंडिलाइन डीएमएसओ द्वारा इलाज किए गए कीड़े की तुलना में लेट-60 (n1046) उत्परिवर्ती तनाव में एमयूवी फेनोटाइप को दबाने में सक्षम है। हमारे डेटा से पता चलता है कि आर-फेंडिलाइन खुराक-निर्भर तरीके(चित्रा 2ए, बी)में लेट-60 (n1046) में मयूवी फेनोटाइप को ब्लॉक करने में सक्षम है। हालांकि, आर-फेंडिलाइन(चित्रा 2B)की बढ़ती सांद्रता के जवाब में लिन-1 नल उत्परिवर्ती तनाव में एमयूवी फेनोटाइप का गैर-उलटा देखा गया। आंकड़ों से पता चलता है कि आर-फेंडिलाइन ब्लॉक ने सी एलिगेंसमें आरएएस के स्तर पर लेट-६० सिग्नलिंग को सक्रिय किया । इसी तरह, हमने देखा कि डीएमएसओ द्वारा इलाज किए गए कीड़े (चित्रा 2सी, डी)के सापेक्ष 3, 10 और 30 माइक्रोएम आर-फेंडिलाइन उपचार के जवाब में लेट-23 (sa62) तनाव में मूव फेनोटाइप काफी कम हो गया था। सभी प्रयोगों में, छात्रों टीपरीक्षण सांख्यिकीय महत्व निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ।

Figure 1
चित्रा 1: एलईटी-60 (n1046), एलई-23 (sa62)और लिन-1 (sy254) उपभेदों का उपयोग करके दवा परख तैयार करने में शामिल चरणों का प्रतिनिधित्व करने वाला फ्लोचार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: आर-फेंडिलाइन खुराक-निर्भर तरीके से सी एलिगेंस में लेट-60 और लेट-23 फ़ंक्शन को बदल देता है। (A)वाहन (डीएमएसओ) या 30 माइक्रोएम आर-फेंडीलाइन की उपस्थिति में एलईटी-60 (n1046) की वेजिमें रिप्रेजेंटेटिव इमेज। (ख)डीएमएसओ, 3, 10 और 30 माइक्रोन आर-फेंडिलाइन, या 30 माइक्रोएम यू0126 की उपस्थिति में इलाज किए गए लेट-60 (n1046) में Muv फेनोटाइप का मात्राकरण। (ग)वाहन (डीएमएसओ) या 30 माइक्रोन आर-फेंडिलाइन की उपस्थिति में लेट-23 (sa62) की वेजिमें रिप्रेजेंटेटिव इमेज। (घ) डी-23 (sa62) कीड़े में Muv फेनोटाइप का मात्राकरण डीएमएसओ, 3, 10 और 30 माइक्रोएम आर-फेंडीलाइन, या 30 माइक्रोएम U0126 की उपस्थिति में इलाज किया जाता है। सभी छवियों में छद्म सफेद तीर और सफेद तारक द्वारा सामान्य योनी द्वारा इंगित किया जाता है। प्रत्येक उपचार के लिए कुल 60 कीड़े की छवि थी। प्रयोग 3 बार दोहराया गया। (*** पी<0.001 और ** पी<0.01 महत्वपूर्ण माना जाता था) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

परख हम कीड़ा का उपयोग कर वर्णन सरल और EGFR और आरएएस समारोह के अवरोधकों की पहचान करने के लिए सस्ती हैं । सी एलिगेंस दवा की खोज के लिए एक आकर्षक मॉडल है क्योंकि छोटे जीवन चक्र (20 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिन) और बड़ी संख्या में लार्वा उत्पन्न करने की क्षमता के कारण प्रयोगशाला में बढ़ना आसान है। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके मैप मार्ग विकासवादी और कार्यात्मक रूप से स्तनधारियों के साथ संरक्षित है जो ईजीएफआर और रास अवरोधकों के प्रभावों का विश्लेषण करने के लिए आनुवंशिक रूप से ट्रैकेबल सिस्टम प्रदान करते हैं। इसके अलावा, कीड़े की पारदर्शी प्रकृति एक अन्वेषक को अलग-अलग संरचनाओं की कल्पना करने में सक्षम बनाती है और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) या अन्य फ्लोरोफोर के स्थानीयकरण को डीआईसी और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा ब्याज के प्रोटीन के लिए जुड़ा हुआ है।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न सी एलिगेंस के प्रचार और रखरखाव के लिए हम जिन प्रोटोकॉलों का उपयोग करते थे , वे पहले 20,21 स्थापितकिए गए थे । हालांकि, एनजी प्लेटों की तैयारी में हमने बैक्टीरियल और फंगल संदूषण को रोकने के लिए स्ट्रेप्टोमाइसिन और नायस्टिन को शामिल किया। इन रोगाणुरोधी एजेंटों के अलावा कीड़े के विकास और मयूवी फेनोटाइप के शामिल होने में बाधा नहीं थी।

कीड़ा सिंक्रोनाइजेशन प्रोटोकॉल द्वारा एल 1 लार्वा प्राप्त करने के कई फायदे हैं। कई लार्वा 2 या अधिक प्लेटों से प्राप्त किए जा सकते हैं जिनमें ग्रेविड वयस्क होते हैं और एकत्र लार्वा सभी उम्र सिंक्रोनाइज्ड होते हैं। यह सुनिश्चित करता है कि कीड़े का विकास आबादी के भीतर सुसंगत है। मूवी फेनोटाइप प्रदर्शित करने वाले कुछ उत्परिवर्ती उपभेद खराब अंडे की परतें होती हैं जिसके परिणामस्वरूप लार्वा की कम पैदावार होती है जैसा कि Ets परिवार प्रतिलेखन कारक लिन-1 1 9में बंदरगाह वाले शून्य उत्परिवर्तन मेंदेखा जाताहै। लिन-1 ग्रेविड वयस्कों के ब्लीच उपचार से परख के लिए आवश्यक लार्वा की संख्या में काफी वृद्धि होगी।

सिंक्रोनस सी एलिगेंस संस्कृति की तैयारी के दौरान कीड़े के लाइसिस का पालन करना महत्वपूर्ण है। मोटे अंडे का यह सब आंशिक रूप से लार्वा और वयस्कों के घुलने के साथ ही ब्लीच-सोडियम हाइड्रोक्साइड मिश्रण की कार्रवाई से भ्रूण को बचाता है। हालांकि, लाइसिस समाधान के लिए लंबे समय तक जोखिम इस सुरक्षात्मक आवरण में प्रवेश करेगा जिससे भ्रूण की मौत हो जाएगी। इसलिए ब्लीच-सोडियम हाइड्रोक्साइड मिश्रण की कार्रवाई को रोकना महत्वपूर्ण है जब 70% वयस्क कीड़े ने lysed किया है। यह M9W के साथ लाइसिस समाधान को कमजोर करके हासिल किया जाता है। गिरफ्तार L1 लार्वा के रखरखाव सिंक्रोनस सी elegans संस्कृति प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए एक और कदम है । M9W में L1 गिरफ्तार लार्वा की लंबे समय तक इनक्यूबेशन उन्हें दाउर फेरोमोन के संचय के कारण दाउअर चरण में बदलने का कारण बन सकती है। दाउयर चरण के गठन से बचने के लिए, भ्रूण एकत्र करने के 1-2 दिनों के भीतर एल1 गिरफ्तार लार्वा का उपयोग करने का सुझाव दिया जाता है।

बेसल मव फेनोटाइप क्रमशः 60%-90% और 90% है, जो लेट-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) कीड़े के लिए है। इससे पता चलता है कि चलो-60 (n1046) कीड़े फेनोटाइपिक बहाव के अधीन हैं और इसलिए, मुव फेनोटाइप की अभिव्यक्ति के बेसल स्तर की रिपोर्ट करना महत्वपूर्ण है। आर-फेंडिलाइन और अन्य के-रास अवरोधकों के साथ चलो-60 (n1046) और ले-23 (sa62) कीड़े का उपचार Muv फेनोटाइप व्यक्त करने वाले कीड़े के प्रतिशत को कम करता है। हालांकि, यह भी बताया गया है कि ईजीएफआर-आरएएस-ईआरके मैप मार्ग के कुछ अवरोधक अकेले प्रति कीड़ा छद्मउल्वे की संख्या को कम कर सकते हैं या अभिव्यक्ति और छद्म17की संख्या दोनों को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए दवा और डीएमएसओ उपचारित कीड़े दोनों में मयूवी कीड़े में छद्म की संख्या को गिनना महत्वपूर्ण है। एलईओवी फेनोटाइप में व्यक्त किया गया एलई-60 (n1046) और लेट-23 (sa62) वयस्क कीड़े एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। हालांकि, लिन-1 (अशक्त) तनाव अपेक्षाकृत अस्वस्थ, विकासात्मक रूप से बिगड़ा हुआ है और वयस्क कीड़े में योनील फलाव खराब प्रतिष्ठित हैं। इसलिए, लिन-1 (शून्य) कीड़े में एक्टोपिक वल्वल प्रोट्रूस के बजाय, वीपीसी जो एल 4 चरण में वेंट्रल साइड पर अपनाए गए 1 डिग्री या 2 डिग्री सेल फैट्स को अपनाते हैं, को उच्च रिज़ॉल्यूशन डीआईसी माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गिना जा सकता है।

परख सस्ती, आसान है, और सेटअप करने के लिए समय नहीं है। प्रसंस्करण समय को और बेहतर बनाने के लिए, कीड़े को ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं के भीतर 2 एमएम सोडियम एजाइड की अंतिम एकाग्रता के लिए एनेस्थेटाइज्ड किया जा सकता है और कैमरे से लैस एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके चित्रित किया जा सकता है। परख का एक और संशोधन यह होगा कि लाइव बैक्टीरिया23के बजाय हीट मारे गए ई कोलाई ओपी50 का उपयोग करें । यह दर्शाया गया है कि बैक्टीरिया कुछ छोटे अणुओं का मेटाबोलाइज कर सकते हैं जिससे जैव गतिविधियां कम होसकतीहैं .

पिछले अध्ययनों से पता चला है कि कीड़े में योनी का शामिल होना कुछ पर्यावरणीय संकेतों पर निर्भर करता है। लिन-3 (n378) और let-23 (n1045) के वल्वलेस फेनोटाइप को भुखमरी और14चरण से बाहर निकलने से आंशिक रूप से दबा हुआ दिखाया गया है। इसके अलावा, मोघल एट अल के एक अध्ययन से पता चला है कि Vulvaless लिन-3 (n378), चलो-23 (sy1) और चलो-60 (sy95dn) म्यूटेंट M9 बफर में उगाए गए वीपीसी की संख्या अधिक थी मानक एनजी प्लेटों पर उगाए गए जानवरों की तुलना में vulval सेल फैट्स संभालने24। आंकड़ों से पता चलता है कि तरल वातावरण में उगाए गए कीड़े वल्वल प्रेरण को प्रभावित करते हैं। हालांकि, हमारे अध्ययनों में हमने तरल वातावरण में मव फेनोटाइप के दमन का पालन नहीं किया।

इस प्रोटोकॉल में हम फेंडिलाइन के एंटी-आरएएस गुणों का मूल्यांकन करने के लिए सी एलिगेंस के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। पिछले एक अध्ययन में, हमने दिखाया है कि कई एसिड स्किफिंगोमीलिनिस अवरोधक, जिनमें ट्राइसाइक्लिक एंटीडिप्रेसेंट जैसे देसीप्रामीन, इमिप्रामाइन और एमिट्रिप्टीलिन मूव फेनोटाइप18को रोकते हैं। इसके अलावा, स्फिंगोमीलिन और सेरामाइड बायोसिंथेटिक रास्ते के अवरोधक लेट-60 (n1046) कीड़े में व्यक्त हुए मव फेनोटाइप को दबाते हैं। कीड़े का उपयोग करने वाले इन निष्कर्षों को स्तनधारी कोशिका लाइनों में मान्य किया गया था।

अंत में, हम तरल-आधारित परख में ईजीएफआर और आरएएस गतिविधि के अवरोधकों की पहचान करने के लिए सी एलिगेंस के उपयोग को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, कीड़ा विरोधी आरएएस और ईजीएफआर चिकित्सा विज्ञान की कार्रवाई के तंत्र की पहचान करने और विशेषता के लिए एक और प्रणाली प्रदान करता है।

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं ।

Acknowledgments

हम डॉ स्वाति अरूर (एमडी एंडरसन कैंसर सेंटर) को let-60 (n1046)प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं । हम लिन-1 तनाव के लिए डॉ डेविड रेनर (टेक्सास एएंडएम हेल्थ साइंस सेंटर इंस्टीट्यूट ऑफ बायोसाइंसेज एंड टेक्नोलॉजी इन ह्यूस्टन) को भी धन्यवाद देते हैं । अंत में, हम डॉ डेनिएल गार्सिन और उसकी प्रयोगशाला (टेक्सास विश्वविद्यालय, McGovern मेडिकल स्कूल) reagents के कुछ प्रदान करने के लिए शुक्रिया अदा करते हैं । सीजीसी द्वारा कुछ कीड़े उपभेदों प्रदान किए गए थे, जिन्हें एनआईएच कार्यालय ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (P40 OD010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। इस शोध को जेएफ हैनकॉक को कैंसर प्रिवेंशन एंड रिसर्च इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्सास (CPRIT) अनुदान RP200047 द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and chemicals
Agarose  Millipore Sigma  A9539-50G
Bacto Peptone  Fisher Scientific DF0118-17-0
BD Difco Agar  Fisher Scientific DF0145-17-0
BD Difco LB Broth Fisher Scientific DF0446-17-3
Calcium Chloride Fisher Scientific BP510-500
Cholesterol Fisher Scientific ICN10138201
Magnesium Sulfate Fisher Scientific BP213-1
Nystatin Acros organics AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic Fisher Scientific BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic Fisher Scientific BP362-500
R-Fendiline Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide Millipore Sigma  S2002-25G
Sodium chloride  Fisher Scientific BP358-1
Sodium Hydroxide Fisher Scientific SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite  Bleach
Sodium Phosphate Dibasic  Fisher Scientific BP332-500
Streptomycin Sulfate  Fisher Scientific BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride Millipore Sigma  L9756
UO126 (MEK inhibitor) Millipore Sigma  19-147
Consumables 
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes  Fisher Scientific 12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Fisher Scientific 12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL Fisher Scientific 07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL Fisher Scientific 07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips Fisher Scientific 12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm) Fisher Scientific FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm) Fisher Scientific FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm) Fisher Scientific 12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates Fisher Scientific 50-197-4804
Software 
Prism Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain Genotype Transgene Source
MT2124   let-60(n1046) IV. CGC
MT7567 lin-1(sy254) IV. CGC
PS1839 let-23(sa62) II. CGC

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References

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कैंसर रिसर्च अंक 164 कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस,एलईटी-60 एलईटी-23 के-आरएएस ईजीएफआर जीएफपी
<em>कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस</em> का उपयोग करके ईजीएफआर और आरएएस अवरोधकों की पहचान
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van der Hoeven, D., Truong, T. N.… More

van der Hoeven, D., Truong, T. N. L., Naji, A., Thapa, S., Hancock, J. F., van der Hoeven, R. Identification of EGFR and RAS Inhibitors using Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (164), e61788, doi:10.3791/61788 (2020).

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