Summary
מספר שיטות שימשו לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה; עם זאת, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינים ביותר. כאן, אנו מתארים שיטה לגבי איך לבודד ליפופרוטאינים מפלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וכיצד לנתח את apolipoproteins הן למטרות אבחון ומחקר.
Abstract
ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה ו apolipoproteins הוא חלק חיוני לאבחון של דיסליפידמיה ומחקרים של חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים. אמנם ישנן מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים פלזמה, ultracentrifugation היא עדיין אחת השיטות הפופולריות והאמינות ביותר. בגלל הליך ההפרדה שלם שלה, שברי ליפופרוטאין מבודד בשיטה זו ניתן להשתמש לניתוח של ליפופרוטאינים, apolipoproteins, פרוטאומים, ומחקר פונקציונלי של ליפופרוטאינים עם תאים מתורבתים במבחנה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט כדי לבודד שבעה שברי ליפופרוטאין כולל VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL) מפלזמת ארנב באמצעות ultracentrifugation צף רציף. בנוסף, אנו מציגים לקוראים כיצד לנתח אפוליפופרוטאינים כגון apoA-I, apoB, ו apoE על ידי SDS-PAGE ו blotting המערבי ולהראות תוצאות מייצגות של פרופילי ליפופרוטאין ו apolipoprotein באמצעות מודלים ארנב היפרליפידמי. שיטה זו יכולה להפוך לפרוטוקול סטנדרטי הן עבור רופאים והן עבור מדענים בסיסיים כדי לנתח פונקציות ליפופרוטאין.
Introduction
דיסליפידמיה היא גורם הסיכון העיקרי של מחלה טרשת עורקים בעולם. רמות גבוהות של ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה (LDLs) ורמות נמוכות של ליפופרוטאינים בצפיפות גבוהה (HDLs) קשורים קשר הדוק עם סיכון גבוה למחלות לב כלילית (CHD)1,2. בסביבה הקלינית, הן LDL-כולסטרול (LDL-C) והן HDL-כולסטרול (HDL-C) נמדדים באופן שגרתי באמצעות מנתח אוטומטי במעבדה קלינית3,4. למרות זאת, חיוני לנתח פרופילי ליפופרוטאין בפרטים לאבחון דיסליפידמיה וחקר חילוף החומרים של השומנים וטרשת עורקים בבעלי חיים אנושיים וניסיוניים. דווח על מספר שיטות לניתוח ליפופרוטאינים מפלזמה כגון אולטרה-צנטריפוגציה, כרומטוגרפיה של הדרת גודל [כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (FPLC) וכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC)], אלקטרופורזה על ידי ג'לים אגרוז ופוליאקרילמיד, תהודה מגנטית גרעינית ומשקעים כימיים סלקטיביים באמצעות פוליאניונים ואקציות דו-כיווניות או כימיקלים אחרים. בשנת 1950, הקבוצה של האוול הציעה לראשונה את המושג ליפופרוטאינים המוגדרים על ידי צפיפויות באמצעות ultracentrifugation וסיווגה אותם לצ'ילומיקרונים (CM), ליפופרוטאינים בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), ליפופרוטאינים בצפיפות בינונית (IDL), LDL ו- HDL5 ואילך, השיטה שונתה עוד יותר על ידי קבוצות אחרות6,7. עד כה, ultracentrifugation היא השיטה הפופולרית והאמינה ביותר בעוד הפרוטוקול המעשי עדיין אינו זמין. במאמר זה, ניסינו לתאר פרוטוקול קל לשימוש לבידוד קנה מידה קטן של פלזמה באמצעות ultracentrifugation צף צפיפות רציפה שתואר במקורבעבר 8. בידוד של שבעה שברי ליפופרוטאין פלזמה [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d = 1.02 g / mL), LDLs (d = 1.04 ו 1.06 g / mL), HDLs (d = 1.08, 1.10, ו 1.21 g/mL)] מאפשר לחוקרים לבצע ניתוח מקיף של ליפופרוטאינים והן של אפוליפופרוטאינים קומפוזיציוניים שלהם9,10,11. שלם שבעה ליפופרוטאינים בצפיפות רצופה ניתן להשתמש לניתוח פונקציות ליפופרוטאין וגם משרתים תא מבוסס במבחנה אסטרטגיות. פרוטוקול זה צריך להיות שימושי הן לאבחון קליני והן למחקר בסיסי. כאן השתמשנו פלזמה ארנב כדוגמה כדי להדגים טכניקה זו בעוד פלזמה ממינים אחרים ניתן ליישם באותו אופן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים ללימודי ארנבות בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת יאמנשי (מספר מאושר: A28-39).
1. הפרדת פלזמה מדם ארנב
- הכן 1.5 צינורות מ"ל המכילים 15 μL של 0.5 M EDTA (pH 8.0) לאיסוף דם.
- שים ארנב במרסן לנקב עורק ביניים auricular באמצעות מחט 22 מד ולאסוף דם לתוך צינור. מערבבים את הדם עם EDTA בעדינות ולשים אותם על קרח.
- צנטריפוגה צינורות הדם ב 1,500 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאסוף פלזמה microtube חדש.
הערה: 3 מ"ל של דם מספיק לאיסוף 1 פלזמה מ"ל. אם אתה אוסף דם מעכברים או מבעלי חיים קטנים אחרים, אתה צריך לאגור אותם.
2. בידוד של ליפופרוטאינים פלזמה
הערה: הפרוצדורה הסכימטית מוצגת באיור 1. שיטת ההכנה של פתרונות צפיפות אשלגן ברומיד (KBr) מוצגת בטבלה 1.
- העבר 1 מ"ל של פלזמה לצינור אולטרה-סנטריפוג פוליקרבונט(איור 2A).
- טען צינורות אלה ברוטור בזווית קבועה וצנטריפוגה הפלזמה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C(איור 2B).
הערה: עבור בקמן TLA 120.2 רוטור, 356,000 x g (שדה צנטריפוגלי יחסי ממוצע, Av RCF) מתאים 100,000 סל"ד. - חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן אוספים את החלק העליון [VLDL (d<1.006 g/mL)], כ-200 μL למיקרו-צינור חדש(איור 2C). אספו את השבר התחתון הנותר לצינור אולטרה-סנטריפוגה פוליקרבונט חדש להפרדה הבאה (איור 2D). למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הנפח הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.006 g / mL).
הערה: הגדר להב לפרוסת הצינור. כוונן את מיקום הלהב ברמה שבין השבר העליון (200 μL) לבין השבר התחתון (800 μL). יש לאסוף את המשקעים הצמיגים בחלק התחתון בזהירות ובאופן מלא על ידי pipetting בכל השלבים הבאים. אם תשהה, עשה זאת לאחר הפרדת השבר העליון והתחתון בכל השלבים. אחסן את הדגימה ב 4 מעלות צלזיוס עד הצנטריפוגה הבאה. - התאם את החלק התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d = 1.02 g / mL על-ידי הוספת 58.9 μL של פתרון d =1.21 g/mL ו- 141.1 מיקרו-ל' של פתרון d=1.02 g/mL (הנפח הכולל הוא 1 מ"ל).
- טען צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את השבר העליון [IDL (d = 1.02 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הנפח הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.02 g / mL).
- התאם את השבר התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d= 1.04 g/mL על-ידי הוספת 94.1 μL של פתרון d=1.21 g/mL ו- 105.9 μL של פתרון d=1.04 g/mL (הנפח הכולל הוא 1 מ"ל).
- לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את החלק העליון [LDL (d = 1.04 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הסכום הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.04 g / mL).
- התאם את השבר התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d = 1.06 גרם / מ"ל על-ידי הוספת 106.7 μL של פתרון d =1.21 g/mL ו- 93.3 μL של פתרון d=1.06 g/mL (הנפח הכולל הוא 1 מ"ל).
- לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את השבר העליון [LDL (d = 1.06 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הסכום הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.06 g / mL).
- התאם את השבר התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d= 1.08 g/mL על-ידי הוספת 123.1 μL של פתרון d=1.21 g/mL ו- 76.9 μL של פתרון d=1.08 g/mL (הנפח הכולל הוא 1 מ"ל).
- לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את החלק העליון [HDL2 (d = 1.08 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הסכום הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.08 g / mL).
- התאם את החלק התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d = 1.10 g / mL על-ידי הוספת 145.5 μL של פתרון d=1.21 g/mL ו- 54.5 מיקרו-ל' של פתרון d=1.10 g/mL (הנפח הכולל הוא 1 מ"ל).
- לטעון צינורות אלה רוטור זווית קבועה צנטריפוגה ב 356,000 x גרם עבור 2.5 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את החלק העליון [HDL2 (d = 1.10 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. לאסוף את החלק התחתון הנותר לתוך צינור אולטרה סנטריפוגה פוליקרבונט חדש עבור ההפרדה הבאה. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך את הסכום הכולל ל 800 μL על ידי הוספת פתרון צפיפות זהה (d = 1.10 g / mL).
- התאם את החלק התחתון (סה"כ 800 μL) ל- d = 1.21 גרם / מ"ל על-ידי הוספת 0.140 גרם אבקת אשלגן ברומיד (KBr) והמסתו לחלוטין. למדוד את עוצמת הקול ולהפוך אותם 1 מ"ל על ידי הוספת d = 1.21 g / mL פתרון.
- לטעון צינורות אלה רוטור בזווית קבועה צנטריפוגה ב 513,000 x g עבור 4 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.
הערה: עבור בקמן TLA 120.2 רוטור, 513,000 x g (Av RCF) מתאים 120,000 סל"ד. - חותכים את הצינורות באמצעות כלי פריסה ולאחר מכן לאסוף את החלק העליון [HDL3 (d = 1.21 g / mL)] כ 200 μL לתוך microtube חדש. זהו הצעד האחרון עבור אולטרה-צנטריפוגה.
3. דיאליזה
הערה: מכיוון שברי הצפיפות (למעט שבר d<1.006 g/mL) מכילים ריכוזים גבוהים של KBr, יש צורך להסיר אותם על ידי דיאליזה.
- מעבירים את שברי הצפיפות לצינורות דיאליזה וקצצים את שני הקצוות בסגירות.
- דיאליזה נגד 2 L של חיץ דיאליזה כגון PBS / 1 mM EDTA עבור 6 שעות ב 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה באמצעות stirrer מגנטי.
- החלף עם מאגר חדש ודיאליז שוב עוד 6 שעות ב 4 °C (6 °F).
- אסוף את שברי הצפיפות ומדוד את עוצמת הקול. כוונן את כל שברי הצפיפות לאותו נפח (למשל, 250 μL).
הערה: אתה יכול לחשב את הגורם המרוכז מ 1 מ"ל של פלזמה מקורית (למשל, 250 μL של שבר צפיפות מתאים ארבע פעמים ריכוז).
4. ניתוח ליפופרוטאינים
הערה: לאחר דיאליזה, ליפופרוטאינים אלה מוכנים לניתוחים שונים. ליפופרוטאינים ניתן להעריך על ידי מדידת שומנים או אפוליפופרוטאינים או שניהם. למדידת תכולת השומנים כגון כולסטרול כולל (TC), טריגליצרידים (TG), פוספוליפידים (PL) וכולסטרול חופשי (FC) בכל שבר, אנו משתמשים בערכות מסחריות של מבחני צבע אנזימטיים. לניתוח של אפוליפופרוטאינים, אנו משתמשים ב- SDS-PAGE עם כתמי CBB או כתמים מערביים.
- ניתוח שומנים
הערה: שומנים כגון TC, TG, PL ו FC בשבר ליפופרוטאין ניתן למדוד באמצעות ערכות מדידה זמין מסחרית. ההליכים תלויים ריאגנטים בשימוש, אז בצע את ההוראות של כל ערכה בשימוש. כאן אנו מראים מבחני מיקרופלטה טיפוסיים באמצעות ערכת מבחנים אנזימטית מסחרית.- יש למרוח 8 μL של דגימת ליפופרוטאין וחומר כיול סטנדרטי על מיקרופלאט 96 באר.
- מוסיפים 240 μL של ריאגנט הבדיקה ומערבבים על ידי pipetting.
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- למדוד את OD עם קורא microplate ולחשב ריכוזי השומנים.
- ניתוח אפוליפופרוטאין
- כתמי SDS-PAGE ו- CBB
- הכנה לדוגמה: להוסיף 10 μL של 2x מאגר מדגם ל 10 μL של שבר ליפופרוטאין. מחממים את התערובת ב 80 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות באמצעות בלוק חום יבש.
- הכינו ג'ל SDS-polyacrylamide 4-20% הדרגתי והגדירו את הג'ל בתא האלקטרופורזה המלא במאגר ריצה.
- לטעון דגימת ליפופרוטאין (10 μL / נתיב) ותקני חלבון (5 μL / נתיב) על ג'ל הערימה.
הערה: אם הדגימות מרוכזות פעמיים, כמות שוות ערך של 20 μL פלזמה ינותח לכל נתיב.] - הפעל אלקטרופורזה בזרם קבוע של 20-40 mA.
- כתמי CBB: משרים את הג'ל פעמיים בתמיסת תיקון עם טלטול עדין במשך 10 דקות. הכתימו את הג'ל בתמיסת הכתמת CBB במשך 30 דקות. שוטפים את הג'ל במים מזוקקים כדי להסיר את הכתם העודף. הג'ל מוכן לצילום.
- פריחה מערבית
- בצע אלקטרופורזה באותו הליך כמתואר לעיל.
הערה: נפח ליפופרוטאינים טעון עבור סופג המערבי הוא פחות מאשר עבור כתמי CBB המתוארים לעיל (למשל 1-5 μL). - מניחים את הג'ל ואת קרום PVDF בין נייר מסנן ספוג מאגר העברה כרית טופס. מניחים את הכריך בקלטת מחזיק ומניחים במיכל מלא במאגר העברה.
- בצע electroblotting ב 100 mA זרם קבוע עבור 3 שעות ב 4 °C (69 °F).
- חסימה: דגירת הממברנה בחסימת חיץ למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
- תגובת Ab ראשית: דגירה של הקרומים בבטן הראשית מדוללת עם חיץ חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות.
הערה: דילול Ab ראשי מוצע מוצג בטבלת החומרים. שלושה סוגים של Abs ראשי נגד אפוליפופרוטאינים ניתן להשתמש בנפרד או קוקטיילים. - לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במאגר כביסה עם עצבנות, 5 דקות לכל לשטוף.
- תגובת Ab משנית: דגירה הממברנה שרירי הבטן המשניים מדולל עם חיץ חסימה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר עם עצבנות.
הערה: דילול Ab משני מוצע מוצג בטבלת החומרים. - לשטוף את הממברנה שלוש פעמים במאגר כביסה עם עצבנות, 5 דקות לכל לשטוף.
- זיהוי ECL: מניחים את הממברנה על ניילון נצמד. הוסף ריאגנטים לזיהוי ECL והדגירה למשך דקה. מסננים נוזלים עודפים ואוטמים את הממברנה בשקית.
- דמיין את האותות באמצעות מנתח תמונות.
- בצע אלקטרופורזה באותו הליך כמתואר לעיל.
- כתמי SDS-PAGE ו- CBB
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות פרוטוקול זה, בודדנו ליפופרוטאינים ארנב באמצעות 1 מ"ל של פלזמה והשגנו שבעה שברי צפיפות. שברי צפיפות מבודדים מספיקים למדידת שומנים ואפוליפופרוטאינים כמתואר לעיל לרוב מטרות המחקר. אותו הליך יכול לשמש גם עבור בידוד ליפופרוטאינים פלזמה ממינים אנושיים ואחרים. עבור בעלי חיים קטנים כגון עכברים, פלזמה בריכה נדרשת. איור 3 מראה פרופילי ליפופרוטאין של ארנבים מסוג בר (WT) שניזונו מתזונת תקן תקין (NS) או מתזונת כולסטרול גבוה (HC). ארנבים הם חיות אוכלי עשב ולכן רמות הפלזמה TC, TG ו- PL שלהם נמוכות בדרך כלל מבני אדם ועכברים. בארנבים שניזונו מתזונת מ-NS, TC מופץ בעיקר ב-HDL3 (d=1.21 g/mL) ואחריו LDL (d=1.04 g/mL)(איור 3A). בדיאטת NS, 39% מ-TG הפלזמה מופצים ב-VLDLs ואילו 57% מהפלזמה PL כלולה ב-HDL3 (איור 3A). כאשר ארנבים היו מאותגרים עם דיאטה בתוספת כולסטרול גבוה, הם התפתחו במהירות היפרכולסטרולמיה. כפי שמוצג באיור 3B, פרופילי הליפופרוטאין מאופיינים בהגבהה ניכרת של VLDLs (פי 165↑ ב-VLDL-TC, פי 1.5↑ ב-VLDL-TG ופי 30↑ בארנבים שניזונו מ-VLDL בהשוואה לארנבים שניזונו מ-NS). בגלל VLDLs מבודדים ארנבים שניזונו מכולסטרול עשירים אסטרים cholesteryl ולעבור לעמדה β על אלקטרופורזה ג'ל agarose, הם נקראים לעתים קרובות β-VLDLs כדי להבדיל אותם VLDLs נורמלי אשר עוברים למצב טרום β.
בנוסף לשומנים, ניתן פשוט לנתח אפוליפופרוטאינים על ידי SDS-PAGE על ידי כתמי CBB או כתמים מערביים(איור 4). שבעה שברי ליפופרוטאין מארנבים WT האכילו NS או דיאטה HC נוהלו על ג'ל SDS-polyacrylamide 4-20% ו דמיינו עם כתמי CBB (איור 4A). בדיאטת HC, הן apoB-100 והן תוכן apoE ב- VLDLs (d<1.006 g/mL), IDLs (d = 1.02 g / mL), ו- LDLs (d = 1.04 גרם / מ"ל) היו גבוהים במידה ניכרת בהשוואה לארנבים בדיאטת NS. יתר על כן, השווינו גם פרופילי אפוליפופרוטאין וליפופרוטאין של שלושה ארנבים היפרליפידמיים שונים: ארנבי WT שניזונו מתזמון HC, ארנבות נוקאאוט אפו (KO) וארנבות היפרליפידמיות (WHHL) של Watanabe עם מחסור בקולטן LDL על ידי כתמים מערביים(איור 4B). ליפופרוטאינים פלזמה היו מופרדים על ידי 4-20% SDS-PAGE ואחריו פריחה מערבית עם נוגדנים נגד apoE, apoB, ו apoA-I. החלקיקים המכילים apoB (VLDLs, IDLs ו- LDLs) של ארנבי WT שניזונו מתזונת דיאטה HC מאופיינים בתכולת apoB-100 ו- apoE מוגברת ואילו ארנבי ApoE KO הראו עלייה ניכרת של apoB-48 יחד עם המראה של apoA-I. ארנבי WHHL הם לקויים גנטית בפונקציות קולטן LDL ולכן יש עלייה ניכרת של apoB-100 ב- LDLs מלווה apoA-I מופחת ב HDLs, אשר דומה היפרכולסטרולמיה משפחתית אנושית.
איור 1: איור סכמטי של אולטרה-צנטריפוגה צפה רציפה. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תמונות מייצגות של בידוד ליפופרוטאין פלזמה. (A)פלזמה של ארנבים נורמוליפידמיים והיפרליפידמיים. (B)VLDL עליון צף (d<1.006 g/mL) והשבר התחתון (d>1.006 g/mL) לאחר אולטרה-צנטריפוגה. (C)חיתוך צינור ואיסוף של החלק העליון על ידי פיפטה. (D) אוסף השבר התחתון. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כמות תכולת השומנים בכל שבר ליפופרוטאין מבודד מארנבים רגילים (A) וארנבות שניזונו מכולסטרול (B). ליפופרוטאינים פלזמה הופרדו על ידי ultracentrifugation צף רציף מפלזמה של ארנבים מסוג פראי על דיאטה סטנדרטית נורמלית (A) או דיאטה כולסטרול גבוה (B). סה"כ נמדדו כולסטרול (TC), טריגליצרידים (TG) ופוספוליפידים (PL). הנתונים מבוטאים כ- SEM ± ממוצע (n = 6). נתון זה שונה מיאן H ואח '12. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה בין התפלגות אפוליפופרוטאין באמצעות כתמי CBB (A) וגוש מערבי (B). פלזמה היה מבודד על ידי ultracentrifugation וליפופרוטאינים היו מופרדים על ידי 4-20% SDS-PAGE. (A)פרופילי אפוליפופרוטאין של ארנב מסוג בר (WT) שניזון מתזונת תקן רגילה (NS) ותזונת כולסטרול גבוה (HC) דמיינו על ידי כתמי CBB. בהשוואה לארנבים שניזונו מתזונת דיאטה של NS (משמאל), ארנבים שניזונו מתזונת דיאטה של HC (מימין) הראו תכולת apoB-100 ו- apoE מוגברת ב- VLDLs, IDLs ו- LDLs. (B) השוואה של תכונות אפוליפופרוטאין של ארנבים WT על NS או דיאטת HC, ארנבות קופו KO (נוקאאוט) על דיאטה HC, וארנבות WHHL על דיאטה NS. סופג מערבי בוצע עם "נוגדני קוקטייל" נגד apoE, apoB, ו apoA-I. בהשוואה לארנבים נורמוליפידמיים (ארנבי WT בדיאטת NS, שמאל ראשון), שלושה ארנבים היפרליפידמיים אחרים מציגים פרופילי אפוליפופרוטאין ייחודיים ושונים. החלקיקים המכילים apoB (VLDLs, IDLs ו- LDLs) של ארנבים WT HC-fed מאופיינים על ידי apoB-100 מוגברת ותכולת apoE ואילו ארנבים KO apoE הראו עלייה ניכרת של apoB-48 יחד עם המראה של apoA-I. WHHL הציגה עלייה ניכרת של apoB-100 ב- LDLs מלווה apoA-I מופחת ב- HDLs. נתון זה שונה מניימי M ואח '10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| פתרון צפיפות (g/mL) | KBr (ז) | מים מזוקקים (מ"ל) |
| ד=1.006 | 8.404 | 1000 |
| ד=1.02 | 28.271 | 1000 |
| ד=1.04 | 57.261 | 1000 |
| ד=1.06 | 86.958 | 1000 |
| ד=1.08 | 117.365 | 1000 |
| ד=1.10 | 148.490 | 1000 |
| ד=1.21 | 333.394 | 1000 |
טבלה 1: הכנה לפתרונות צפיפות אשלגן ברומיד (KBr ). המשקל (g) של KBr להוסיף 1000 מ"ל מים מזוקקים מוצג.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
היפרליפידמיה היא אחד מגורמי הסיכון החשובים ביותר של מחלה טרשת עורקים. לכן, ניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה הוא לא רק חיוני לאבחון של חולי דיסליפידמיה, אלא גם חשוב לחקירה של מנגנונים מולקולריים של חילוף החומרים ליפופרוטאין וטרשת עורקים. במחקר זה, תיארנו את הפרוטוקול של בידוד וניתוח של ליפופרוטאינים פלזמה אשר ניתן ליישם במעבדות שבו ultracentrifugation זמין. מידע המתקבל בשיטה זו הוא מקיף וישיר ולכן מומלץ הן למדעני מחקר קליניים והן למדעני מחקר בסיסיים. ליפופרוטאינים מבודדים יכולים לשמש גם לחקירת היבטים רבים אחרים של פונקציות ליפופרוטאין כגון מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי13,14, חמצון9,15, פרוטאומיקה16, תרבות התא מבוסס במחקר במבחנה כגון כולסטרול efflux assay9 ו ספיגת ליפופרוטאין assay17.
יש לציין זאת; עם זאת, ישנן מספר נקודות תורפה שצריכות לקחת בחשבון. ראשית, שיטה זו גוזלת זמן יחסית (שלושה ימים לפחות) בהשוואה לשיטות אחרות. אם משתמשים ב-ultracentrifuge העדכני ביותר על השולחן, סיבוב במהירות גבוהה (150,000 סל"ד) יכול לקצר את זמן ההפרדה 50-140 דקות עבור כל שבר ליפופרוטאין18. שנית, אובדן מדגם עלול לקרות במהלך הבידוד. כדי למזער את אובדן המדגם, יש להמיס את המשקעים הצמיגיים בחלק התחתון ולאסוף אותם בזהירות על ידי pipetting. צינורות צנטריפוגה צריך לתקן בחוזקה עם כלי פריסה, כדי למנוע דליפה של השבר העליון. בנוסף, יש לשחזר את הדגימות בזהירות משקיות דיאליזה. ההתאוששות יכולה להיות מחושבת על ידי השוואת כולסטרול ליפופרוטאין הכולל עם כולסטרול פלזמה המקורי. על פי הניסיון שלנו, שיעור ההחלמה הכללי יהיה ≈ 80%19. שלישית, פרוטוקול זה מוגבל עבור מספר קטן של דגימות כי רוטור אחד יכול לרוץ רק שנים עשר צינורות בכל פעם. כדי לבצע מספר רב של דגימות, זה עשוי להיות מתאים להשתמש בשיטות אחרות כגון שיטת משקעים להכנת HDL4 וניתוח אוטומטי HPLC ליפופרוטאין20.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק מדריך לחוקרים לבודד ליפופרוטאינים פלזמה באמצעות ultracentrifugation צפיפות רציפה וניתוח של שומנים ו apolipoproteins.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקי מחקר מ JSPS KAKENHI גרנט מספר JP 20K08858, הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '81941001 ו 81770457), JSPS-CAS תחת התוכנית השיתופית מחקר יפן-סין.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
