Summary
血漿リポタンパク質の分析にはいくつかの方法が使用されています。しかし、超遠心は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。ここでは、逐次密度超遠心を用いて血漿からリポタンパク質を分離する方法と、診断と研究の両方の目的でアポリポタンパク質を分析する方法について説明する。
Abstract
血漿リポタンパク質とアポリポタンパク質の分析は、脂質異常症の診断や脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究に不可欠な部分です。血漿リポタンパク質を分析するためのいくつかの方法がありますが、超遠心分離は依然として最も人気があり、信頼性の高い方法の1つです。その無傷の分離手順のために、この方法によって単離されたリポタンパク質の画分は、リポタンパク質、アポリポタンパク質、プロテオーム、および培養細胞を有するリポタンパク質の機能研究に使用することができる。ここでは、VLDL(d<1.006 g/mL)、IDL(d=1.02 g/mL)、LL(d=1.04および1.06 g/mL)、HDL(d=1.08、1.10、および1.21 g/mL)を含む7つのリポタンパク質画分をシーケンシャルプラズマを使用してシーケンシャルプラズマから分離するための詳細なプロトコルを提供します。また、SDS-PAGEやウエスタンブロッティングによるアポアI、apoB、apoEなどのアポリポタンパク質を分析する方法を読者に紹介し、過脂性ウサギモデルを用いたリポタンパク質およびアポリポタンパク質プロファイルの代表的な結果を示します。この方法は、臨床医と基本的な科学者の両方がリポタンパク質機能を分析するための標準的なプロトコルになることができます。
Introduction
脂質異常症は、世界の動脈硬化性疾患の主要な危険因子です。高濃度の低密度リポタンパク質(LDL)および低濃度の高密度リポタンパク質(HDL)は、冠状動脈性心疾患(CHD)1,2の高リスクと密接に関連している。臨床現場では、LDLコレステロール(LDL-C)とHDL-コレステロール(HDL-C)の両方が臨床検査室3,4の自動分析装置を用いて日常的に測定される。しかし、脂質異常症の診断やヒトおよび実験動物における脂質代謝とアテローム性動脈硬化症の研究については、リポタンパク質のプロファイルを詳細に分析することが不可欠です。超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー(高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、アガロースおよびポリアクリルアミドゲルによる電気泳動、核磁気共鳴、ポリアニオンおよび二価カチオンなどの選択的化学沈殿を分析する方法がいくつか報告されている。1950年代、Havelのグループは、最初に超遠心分離を使用して密度によって定義されるリポタンパク質の概念を提案し、それらをチロミクロン(CM)、非常に低密度リポタンパク質(VLDL)、中間密度リポタンパク質(IDL)、LDL、およびHDL5以降に分類し、この方法は他のグループ6、7によってさらに改変された。これまで、超遠心分離は最も一般的で信頼性の高い方法ですが、実用的なプロトコルはまだ利用できません。本稿では、先に説明した逐次密度の超遠心分離を用いて、微小なプラズマを単離するための使いやすいプロトコルを説明することを試みた。7つの血漿リポタンパク質画分の単離 [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LL (d=1.04 および 1.06 g/mL), HDL (d=1.08, 1.10、および1.21 g/mL))は、研究者がリポタンパク質とその組成アポリポタンパク質9、10、11の両方の広範な分析を行うことを可能にする。無傷の7つの連続した密度リポタンパク質は、リポタンパク質機能を分析し、また細胞ベースのインビトロ戦略にも役立つことができます。このプロトコルは、臨床診断と基礎研究の両方に有用である必要があります。ここでは、他の種からのプラズマを同じように適用しながら、この技術を実証するために、例としてウサギのプラズマを使用しました。
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Protocol
ウサギ研究の全ての手続きは、山梨大学の制度的動物の世話・使用委員会(承認番号:A28-39)の承認を得て行われました。
1. ウサギの血からプラズマ分離
- 0.5 M EDTA (pH 8.0) の 15 μL を含む 1.5 mL マイクロチューブを採血用に準備します。
- ウサギを拘束剤に入れ、22ゲージの針を使って耳介中動脈を穿刺し、血液をチューブに集める。EDTAと血液を優しく混ぜ、氷の上に置きます。
- 4°Cで20分間1,500xgの血液管を遠心分離し、新しいマイクロチューブに血漿を収集します。
注:血液の3 mLは1 mL血漿を収集するのに十分です。マウスや他の小動物から血液を採取する場合は、それらをプールする必要があります。
2. 血漿リポタンパク質の単離
注: 図 1に、スケマティック手順を示します。臭化カリウム(KBr)密度溶液の調製方法を 表1に示す。
- 1 mLのプラズマをポリカーボネート超遠心チューブに移す(図2A)。
- これらのチューブを固定角度ローターにロードし、プラズマを4°Cで2.5時間356,000 x gで遠心分離します(図2B)。
注: ベックマン TLA 120.2 ローターの場合、356,000 x g (平均相対遠心フィールド、Av RCF) は 100,000 rpm に相当します。 - スライサーを使用してチューブを切り取り、上部の分画[VLDL(d<1.006 g/mL)]を収集し、約200 μLを新しいマイクロチューブにします(図2C)。残りの底分を次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに集める(図2D)。同じ密度溶液(d=1.006 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計体積を800μLにします。
メモ:チューブスライサーにブレードをセットします。上部の分数(200 μL)と下端分(800 μL)の間のレベルでブレードの位置を調整します。下部分数の粘性沈殿物は、以下のすべてのステップでピペッティングすることによって慎重かつ完全に収集する必要があります。一時停止する場合は、すべてのステップで上下の分数を分けた後に行います。次の遠心まで4°Cでサンプルを保存します。 - d=1.21 g/mL溶液の58.9 μLとd=1.02 g/mL溶液の141.1 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.02 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
- スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[IDL(d=1.02 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.02 g/mL)を加えることで、体積を測定し、合計体積を800μLにします。
- d=1.21 g/mL溶液の94.1 μLとd=1.04 g/mL溶液の105.9 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.04 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
- スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[LDL(d=1.04 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.04 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
- d=1.21 g/mL溶液の106.7 μLとd=1.06 g/mL溶液の93.3 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.06 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
- スライサーを使用してチューブを切り、上端分画[LDL(d=1.06 g/mL)]を約200μLで新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.06 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
- d=1.21 g/mL溶液の123.1 μLとd=1.08 g/mL溶液の76.9 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.08 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
- スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 2(d=1.08 g/mL)]を収集し、約200μLを新しいマイクロチューブにします。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.08 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
- d=1.21 g/mL溶液の145.5 μLとd=1.10 g/mL溶液の54.5 μLを加えて、底分(合計800 μL)をd=1.10 g/mLに調整します(総体積は1mL)。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を356,000 x g で4°Cで2.5時間ロードします。
- スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 2(d=1.10 g/mL)]を約200μL新しいマイクロチューブに集めます。次の分離のために新しいポリカーボネート超遠心チューブに残りの底分を収集します。同じ密度溶液(d=1.10 g/mL)を加えて、体積を測定し、合計を800 μLにします。
- 0.140 gの臭化カリウム(KBr)粉末を加えて、底分(合計800 μL)をd=1.21 g/mLに調整し、完全に溶解します。d=1.21 g/mL溶液を加えて、体積を測定して1mLにします。
- これらのチューブを固定角度ローターに、遠心分離機を513,000 x g で4°Cで4時間ロードします。
注: ベックマン TLA 120.2 ローターの場合、513,000 x g (Av RCF) は 120,000 rpm に相当します。 - スライサーを使用してチューブをカットし、上部の分画[HDL 3(d=1.21 g/mL)]を約200μL新しいマイクロチューブに集めます。これは超遠心化のための最後のステップです。
3. 透析
注: 密度分率(d<1.006 g/mL 画分を除く)は高濃度の KBr を含んでいるため、透析によって除去する必要があります。
- 密度分率を透析チューブに移し、両端をクロージャでクリップします。
- 磁気攪拌機を用いた攪拌で4°Cで6時間のPBS/1 mM EDTAなどの透析バッファーの2 Lに対する透析。
- 新しいバッファーと透析を4 °Cで別の 6 時間再び交換します。
- 密度の分数を収集し、ボリュームを測定します。密度の分数をすべて同じボリューム(例えば、250 μL)に調整します。
注:元のプラズマの1mLから濃縮係数を計算することができます(例えば、250 μLの密度分率は4倍の濃度に相当します)。
4. リポタンパク質の分析
注:透析後、これらのリポタンパク質は異なる分析の準備ができています。リポタンパク質は、脂質またはアポリポタンパク質、またはその両方を測定することによって評価することができる。総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)、リン脂質(PL)、および遊離コレステロール(FC)などの脂質内容物を各画分で測定するために、市販の酵素的着色アッセイキットを用います。アポリポタンパク質の分析には、CBB染色またはウェスタンブロッティングで可視化したSDS-PAGEを用います。
- 脂質分析
注:リポタンパク質画分中のTC、TG、PLおよびFCのような脂質は、市販の測定キットを使用して測定することができる。手順は使用する試薬によって異なりますので、使用する各キットの指示に従ってください。ここでは、市販の酵素アッセイキットを用いた典型的なマイクロプレートアッセイを示す。- 96ウェルマイクロプレートにリポタンパク質サンプルと標準キャリブレーション物質を8μL塗布します。
- 240 μLのアッセイ試薬を加え、ピペットで混合します。
- 37°Cで10分間インキュベートします。
- マイクロプレートリーダーでODを測定し、脂質濃度を計算します。
- アポリポ蛋白分析
- SDS-ページおよびCBB染色
- サンプル調製:2xサンプルバッファーの10 μLを10 μLのリポタンパク質画分に加えます。乾燥したヒートブロックを使用して、80°Cで5分間加熱します。
- 4-20%の勾配SDS-ポリアクリルアミドゲルを調製し、ランニングバッファで満たされた電気泳動チャンバにゲルをセットします。
- 積み重ねゲルにリポタンパク質サンプル(10 μL/lane)とタンパク質標準(5 μL/レーン)をロードします。
注:サンプルが2倍の濃縮値の場合、1車線当たり20μLのプラズマに相当する量が解析されます。 - 電気泳動を20~40mAの定電流で実行します。
- CBB染色:ゲルを10分間穏やかな揺れで固定溶液に2回浸します。30分間CBB染色液でゲルを染色します。余分な汚れを除去するために蒸留水でゲルをすすい。ゲルは撮影の準備ができています。
- ウェスタンブロッティング
- 上記と同様の手順で電気泳動を行う。
注意:ウエスタンブロッティング用にロードされるリポタンパク質の量は、上記のCBB染色(例えば1~5μL)に比べて少なくなります。 - 転写バッファー浸しろ紙とフォームパッドの間にゲルとPVDF膜を置きます。ホルダーカセットにサンドイッチを設置し、移動バッファで満たされたタンクに入れます。
- 4°Cで3時間、100mA定電流でエレクトロブロットを行います。
- ブロッキング: 膜を、室温で1時間、または4°Cで一晩ブロッキングバッファーにインキュベートします。
- 一次Ab反応:軽度の揺れで室温または4°Cで1時間または一晩ブロッキングバッファーで希釈した一次腹筋の膜をインキュベートします。
注: 推奨される一次 Ab 希釈は 、材料表に示されています。アポリポタンパク質に対する3種類の一次腹筋は、1人でまたはカクテルに使用することができる。 - 膜を攪拌して洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ごとに5分。
- 二次Ab反応:攪拌で室温で1時間ブロッキングバッファーで希釈した二次腹筋の膜をインキュベートします。
注: 推奨されるセカンダリ Ab 希釈は 、材料表に示されています。 - 膜を攪拌して洗浄バッファーで3回洗浄し、洗浄ごとに5分。
- ECL検出:プラスチックラップに膜を置きます。ECL検出試薬を加え、1分間インキュベートします。余分な液体を排出し、袋に膜を密封します。
- 画像アナライザを使用して信号を視覚化します。
- 上記と同様の手順で電気泳動を行う。
- SDS-ページおよびCBB染色
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Representative Results
このプロトコルを用いて、1mLの血漿を用いてウサギのリポタンパク質を単離し、7つの密度画分を得た。分離された密度画分は、ほとんどの研究目的で上記のように脂質およびアポリポタンパク質を測定するのに十分である。同じ手順は、ヒトおよび他の種から血漿リポタンパク質を単離するためにも使用することができる。マウスなどの小型動物の場合、プールされた血漿が必要です。図3は、野生型(WT)ウサギが通常の標準(NS)食事または高コレステロール(HC)食事のいずれかを与えたリポタンパク質プロファイルを示す。ウサギは草食動物であるため、血漿TC、TG、PLレベルは一般的にヒトやマウスよりも低い。NSダイエットウサギでは、TCは主にHDL3(d=1.21 g/mL)で分布し、次いでLDL(d=1.04 g/mL)が続きます(図3A)。NSダイエットでは、血漿TGの39%がVLDLに分布し、血漿PLの57%がHDL3に含まれている(図3A)。ウサギは高コレステロールを補った食事療法で挑戦されたとき, 彼らは急速に高コレステロール血症に発展しました.図3Bに示すように、リポタンパク質プロファイルは、VLDL-TCのVLDLの顕著な上昇(VLDL-TCでは165倍↑、VLDL-TGでは1.5倍↑、VLDL-PLでは30倍↑はNS供給ウサギと比較して)の顕著な上昇によって特徴付けられる。コレステロールを与えられたウサギから分離されたVLDLはコレステリルエステルが豊富でアガロースゲル電気泳動のβ位置に移動するため、β前の位置に移動する通常のVLDLと区別するために、しばしばβ-VLDLと呼ばれます。
脂質に加えて、アポリポタンパク質は、CBB染色またはウェスタンブロッティングのいずれかによってSDS-PAGEによって単に分析することができる(図4)。NSまたはHC食を与えられたWTウサギからの7つのリポタンパク質画分を4-20%SDS-ポリアクリルアミドゲルで実行し、CBB染色で視覚化した(図4A)。HCダイエットでは、VLDL(d<1.006 g/mL)、IdL(d=1.02 g/mL)、LDL(d=1.04 g/mL)のapoB-100とapoEの内容物の両方が、NSダイエットのウサギと比較して著しく上昇しました。さらに、HC食餌WTウサギ、アポエノックアウト(KO)ウサギ、およびウエスタンブロットによるLDL受容体欠乏症を有する渡辺遺伝性高脂血症(WHHL)ウサギの3つの異なる高脂血症ウサギのアポリポタンパク質およびリポタンパク質プロファイルを比較した(図4B)。血漿リポタンパク質は、4-20%SDS-PAGEで分画し、続いて、apoE、apoB、およびapoA-Iに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングを行った。HC食餌WTウサギのアポB含有粒子(VLDL、IDRおよびLDL)は、apoB-100およびapoE内容物の増加を特徴とする一方、apoE KOウサギはapoA-Iの出現と共にapoB-48の顕著な増加を示した。WHHLウサギはLDL受容体機能が遺伝的に欠乏しているので、ヒト家族性高コレステロール血症に似たHDLのapoA-Iの減少を伴うLDLのapoB-100の著しい増加がある。
図1:逐次浮動超遠心分離の模式図。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:血漿リポタンパク質の分離の代表的な画像。(A)ノルマンリピデミックおよび高脂血症ウサギの血漿。(B) 超遠心分離後の浮上した上のVLDL (d<1.006 g/mL)および底分 (d>1.006 g/mL)(C)管のスライスとピペットによるトップ分数のコレクション。(D) 下端分のコレクション。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:正常なウサギ(A)およびコレステロール供給ウサギ(B)から単離された各リポタンパク質分画における脂質内容物の定量。血漿リポタンパク質は、通常の標準食(A)または高コレステロール食(B)のいずれかで野生型ウサギの血漿からの逐次浮遊超遠心分離によって分離した。総コレステロール(TC)、トリグリセリド(TG)およびリン脂質(PL)を測定した。データは SEM ±平均 (n=6) で表されます。この図は、Yan H et al.12から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:CBB染色(A)とウェスタンブロッティング(B)を用いたアポリポ蛋白分布の比較。血漿は、超遠心分離によって単離され、リポタンパク質は4-20%SDS-PAGEによって分画された。(A)野生型(WT)ウサギのアポリポタンパク質プロファイルを通常の標準(NS)食事と高コレステロール(HC)ダイエットに供給し、CBB染色によって可視化した。NSダイエットウサギ(左)と比較すると、HCダイエットウサギ(右)は、VLDL、Idl、LDLでapoB-100およびapoE内容物の増加を示した。(B)NSまたはHCダイエットにおけるWTウサギのアポリポタンパク質特徴の比較、HCダイエットにおけるアポエKO(ノックアウト)ウサギ、およびNSダイエット上のWHHLウサギ。ウエスタンブロッティングは、apoE、apoB、およびapoA-Iに対して「カクテル抗体」を使用して行った。ノルマンリピデミックウサギ(NSダイエットのWTウサギ、最初の左)と比較して、他の3つの高脂血症ウサギはユニークで異なるアポリポタンパク質プロファイルを示します。HC供給WTウサギのアポB含有粒子(VLDL、IDRおよびLDL)は、apoB-100およびapoE内容物の増加を特徴とする一方、apoE KOウサギはapoA-Iの出現と共にapoB-48の顕著な増加を示した。WHHLは、DLでapoB-100の著しい増加を示し、DLでapoA-Iを減少させた。この図は、新imi Mら10から変更されています。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| 密度溶液(g/mL) | KBr (g) | 蒸留水 (mL) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1.02 | 28.271 | 1000 |
| d=1.04 | 57.261 | 1000 |
| d=1.06 | 86.958 | 1000 |
| d=1.08 | 117.365 | 1000 |
| d=1.10 | 148.490 | 1000 |
| d=1.21 | 333.394 | 1000 |
表1:臭化カリウム(KBr)濃度溶液の調製KBrの重量(g)を1000 mL蒸留水に加えるのが示されている。
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Discussion
高脂血症は、アテローム硬化性疾患の最も重要な危険因子の1つです。したがって、血漿リポタンパク質の解析は、脂質異常症患者の診断に不可欠であるだけでなく、リポタンパク質代謝およびアテローム性動脈硬化症の分子機構の研究にも重要である。本研究では、超遠心分離が可能な研究室で適用できる血漿リポタンパク質の単離および分析のプロトコルについて説明した。この方法で得られた情報は包括的で簡単であるため、臨床および基礎研究の両方の科学者に推奨されます。単離されたリポタンパク質はまた、負染色電子顕微鏡13、14、酸化安定性9、15、プロテオミクス16、コレステロール流出アッセイ9およびリポタンパク質取り込みアッセイ17などのインビトロ試験に基づく細胞培養などのリポタンパク質機能の他の多くのファセットを調べるためにも使用できる。
それは指摘されるべきです。ただし、考慮する必要があるいくつかの弱点があります。第1に、この方法は他の方法と比較して比較的時間がかかります(少なくとも3日間)。最新の卓上超遠心分離機を使用する場合、高速スピン(150,000 rpm)は、各リポタンパク質画分部18の分離時間を50〜140分短縮できる。第 2 に、分離中にサンプル損失が発生する可能性があります。サンプル損失を最小限に抑えるために、下部分率の粘性沈殿物を溶解し、ピペット処理によって慎重に回収する必要があります。遠心管は上端の分数の漏れを避けるためにスライサーとしっかりと固定する必要があります。また、サンプルは透析用バッグから慎重に回収する必要があります。回復は、元の血漿コレステロールと総リポタンパク質コレステロールを比較することによって計算することができます。私たちの経験によると、一般的な回復率は80%19≈になります。第三に、1つのロータは一度に12本のチューブしか走ることができないため、このプロトコルは少数のサンプルに制限されています。多数のサンプルを実施するために、HDL調製4 および自動HPLCリポタンパク質分析20のための沈殿方法などの他の方法を用いることが好適であり得る。
要約すると、このプロトコルは、逐次密度超遠心分離および脂質およびアポリポタンパク質の分析を用いて血漿リポタンパク質を単離するためのガイドを提供する。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、日中研究協同プログラムのJSPS-CASである中国国立自然科学財団(第81941001、81770457)であるJSPS KAKENHIグラント番号JP 20K08858の研究助成金の一部によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
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