Summary
Verschillende methoden zijn gebruikt voor het analyseren van plasma lipoproteïnen; ultracentrifugatie is echter nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Hier beschrijven we een methode met betrekking tot het isoleren van lipoproteïnen uit plasma met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en hoe de apolipoproteïnen te analyseren voor zowel diagnostische als onderzoeksdoeleinden.
Abstract
Analyse van plasma lipoproteïnen en apolipoproteïnen is een essentieel onderdeel voor de diagnose van dyslipidemie en studies van lipidemetabolisme en atherosclerose. Hoewel er verschillende methoden zijn voor het analyseren van plasma lipoproteïnen, is ultracentrifugatie nog steeds een van de meest populaire en betrouwbare methoden. Vanwege de intacte scheidingsprocedure kunnen de lipoproteïnefracties die door deze methode worden geïsoleerd, worden gebruikt voor analyse van lipoproteïnen, apolipoproteïnen, proteomen en functionele studie van lipoproteïnen met gekweekte cellen in vitro. Hier bieden we een gedetailleerd protocol om zeven lipoproteïnefracties te isoleren, waaronder VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1,10 en 1,21 g/ml) uit konijnenplasma met behulp van sequentiële zwevende ultracentrifugatie. Daarnaast introduceren we de lezers hoe ze apolipoproteïnen zoals apoA-I, apoB en apoE kunnen analyseren door SDS-PAGE en Western blotting en tonen we representatieve resultaten van lipoproteïne- en apolipoproteïneprofielen met behulp van hyperlipidemische konijnenmodellen. Deze methode kan een standaardprotocol worden voor zowel clinici als basiswetenschappers om lipoproteïnefuncties te analyseren.
Introduction
Dyslipidemie is de belangrijkste risicofactor van atherosclerotische ziekte in de wereld. Hoge niveaus van lage dichtheid lipoproteïnen (MOL's) en lage niveaus van high-density lipoproteïnen (HDL 's) zijn nauw geassocieerd met een hoog risico op coronaire hartziekten (CHD)1,2. In de klinische setting worden zowel LDL-cholesterol (LDL-C) als HDL-cholesterol (HDL-C) routinematig gemeten met behulp van een geautomatiseerde analysator in een klinisch laboratorium3,4. Desondanks is het essentieel om lipoproteïneprofielen in detail te analyseren voor de diagnose van dyslipidemie en de studie van lipidemetabolisme en atherosclerose bij menselijke en experimentele dieren. Verschillende methoden zijn gemeld om plasma lipoproteïnen te analyseren, zoals ultracentrifugatie, grootte uitsluiting chromatografie [snelle eiwit vloeibare chromatografie (FPLC) en high performance vloeibare chromatografie (HPLC)], elektroforese door agarose en polyacrylamide gels, nucleaire magnetische resonantie, en selectieve chemische neerslag met behulp van polyanionen en divalente kationen of andere chemicaliën. In de jaren 1950 stelde havels groep voor het eerst het concept van lipoproteïnen voor dat werd gedefinieerd door dichtheden met behulp van ultracentrifugatie en classificeerde ze in chylomicronen (CM), lipoproteïnen met een zeer lage dichtheid (VLDL), lipoproteïnen met gemiddelde dichtheid (IDL), LDL en HDL5 en later werd de methode verder gewijzigd door andere groepen6,7. Tot nu toe is ultracentrifugatie de meest populaire en betrouwbare methode, terwijl het praktische protocol nog steeds niet beschikbaar is. In dit artikel hebben we geprobeerd een gebruiksvriendelijk protocol te beschrijven voor het isoleren van een kleine schaal van plasma met behulp van sequentiële dichtheid zwevende ultracentrifugatie oorspronkelijk eerder beschreven8. Isolatie van zeven plasma lipoproteïnefracties [VLDL (d<1.006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), MOL's (d=1,04 en 1,06 g/ml), HDL's (d=1,08, 1.10, en 1.21 g/ml)] stelt onderzoekers in staat om een uitgebreide analyse te maken van zowel lipoproteïnen als hun compositorische apolipoproteïnen9,10,11. De intacte zeven opeenvolgende dichtheid lipoproteïnen kunnen worden gebruikt voor het analyseren van lipoproteïnefuncties en ook dienen voor celgebaseerde in vitro strategieën. Dit protocol moet nuttig zijn voor zowel klinische diagnose als fundamenteel onderzoek. Hier gebruikten we konijnenplasma als voorbeeld om deze techniek aan te tonen, terwijl plasma van andere soorten op dezelfde manier kan worden toegepast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures voor konijnenstudies werden uitgevoerd met goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Yamanashi (goedgekeurd nummer: A28-39).
1. Plasmascheiding van konijnenbloed
- Bereid 1,5 ml microbuisjes met 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) voor op bloedafname.
- Plaats een konijn in een restrainer en prik een auriculaire tussenslagader door met behulp van een 22 gauge naald en verzamel bloed in een buis. Meng het bloed voorzichtig met EDTA en zet ze op ijs.
- Centrifugeer de bloedbuizen bij 1.500 x g gedurende 20 minuten bij 4 °C en verzamel plasma op een nieuwe microbuis.
OPMERKING: 3 ml bloed is voldoende voor het verzamelen van 1 ml plasma. Als je bloed verzamelt van muizen of andere kleine dieren, moet je ze poolen.
2. Isolatie van plasma lipoproteïnen
OPMERKING: De schematische procedure wordt weergegeven in figuur 1. De bereidingswijze van kaliumbromide (KBr) dichtheidsoplossingen is weergegeven in tabel 1.
- Breng 1 ml plasma over naar een ultracentrifugebuis van polycarbonaat (figuur 2A).
- Laad deze buizen in een rotor met vaste hoek en centrifugeer het plasma bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C (figuur 2B).
OPMERKING: Voor Beckman TLA 120.2 rotor komt 356.000 x g (gemiddeld relatief centrifugaalveld, Av RCF) overeen met 100.000 tpm. - Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [VLDL (d<1.006 g/ml)], ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis (figuur 2C). Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding (figuur 2D). Meet het volume en maak het totale volume op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1.006 g/ml) toe te voegen.
OPMERKING: Plaats een mes op de buissnijder. Stel de positie van het mes in op een niveau tussen de bovenste fractie (200 μL) en de onderste fractie (800 μL). Het stroperige neerslag in de onderste fractie moet zorgvuldig en volledig worden verzameld door in alle volgende stappen te pipetten. Als u pauzeert, doet u dit nadat u de bovenste en onderste fractie in alle stappen hebt gescheiden. Bewaar het monster op 4°C tot de volgende centrifugatie. - Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,02 g/ml door 58,9 μL d=1,21 g/ml-oplossing en 141,1 μL d=1,02 g/ml-oplossing toe te voegen (het totale volume is 1 ml).
- Laad deze buizen in vaste hoekrotor en centrifugeer bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
- Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [IDL (d=1,02 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding. Meet het volume en maak het totale volume op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1,02 g/ml) toe te voegen.
- Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,04 g/ml door 94,1 μL d=1,21 g/ml-oplossing en 105,9 μL d=1,04 g/ml-oplossing toe te voegen (het totale volume is 1 ml).
- Laad deze buizen in een vaste hoekrotor en centrifugeer bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
- Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [LDL (d=1,04 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding. Meet het volume en maak het totaal op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1,04 g/ml) toe te voegen.
- Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,06 g/ml door 106,7 μL d=1,21 g/ml-oplossing en 93,3 μL d=1,06 g/ml-oplossing toe te voegen (het totale volume is 1 ml).
- Laad deze buizen in een vaste hoekrotor en centrifugeer bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
- Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [LDL (d=1,06 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding. Meet het volume en maak het totaal op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1,06 g/ml) toe te voegen.
- Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,08 g/ml door 123,1 μL d=1,21 g/ml-oplossing en 76,9 μL d=1,08 g/ml-oplossing toe te voegen (het totale volume is 1 ml).
- Laad deze buizen in een vaste hoekrotor en centrifugeer bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
- Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [HDL2 (d=1,08 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding. Meet het volume en maak het totaal op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1,08 g/ml) toe te voegen.
- Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,10 g/ml door 145,5 μL d=1,21 g/ml-oplossing en 54,5 μL d=1,10 g/ml-oplossing toe te voegen (het totale volume is 1 ml).
- Laad deze buizen in een vaste hoekrotor en centrifugeer bij 356.000 x g gedurende 2,5 uur bij 4 °C.
- Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [HDL2 (d=1,10 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Verzamel de resterende bodemfractie in een nieuwe polycarbonaat ultracentrifugebuis voor de volgende scheiding. Meet het volume en maak het totaal op 800 μL door dezelfde dichtheidsoplossing (d=1,10 g/ml) toe te voegen.
- Pas de onderste fractie (totaal 800 μL) aan op d=1,21 g/ml door 0,140 g kaliumbromidepoeder (KBr) toe te voegen en volledig op te lossen. Meet het volume en maak ze tot 1 ml door d= 1,21 g / ml-oplossing toe te voegen.
- Laad deze buizen in vaste hoekrotor en centrifugeer bij 513.000 x g gedurende 4 uur bij 4 °C.
OPMERKING: Voor Beckman TLA 120.2 rotor komt 513.000 x g (Av RCF) overeen met 120.000 tpm. - Snijd de buizen met een snijmachine en verzamel vervolgens de bovenste fractie [HDL3 (d=1,21 g/ml)] ongeveer 200 μL in een nieuwe microbuis. Dit is de laatste stap voor ultracentrifugatie.
3. Dialyse
OPMERKING: Omdat de dichtheidsfracties (behalve d<1.006 g/ml fractie) hoge concentraties KBr bevatten, is het noodzakelijk om ze te verwijderen door dialyse.
- Breng de dichtheidsfracties over in een dialyseslang en klem beide uiteinden vast met sluitingen.
- Dialyseren tegen 2 L dialysebuffer zoals PBS/1 mM EDTA gedurende 6 uur bij 4 °C met agitatie met behulp van een magneetroerder.
- Vervang door nieuwe buffer en dialyseer opnieuw gedurende nog eens 6 uur bij 4 °C.
- Verzamel de dichtheidsfracties en meet het volume. Pas alle dichtheidsfracties aan op hetzelfde volume (bijv. 250 μL).
OPMERKING: U de geconcentreerde factor berekenen op 1 ml origineel plasma (bijvoorbeeld 250 μL dichtheidsfractie komt overeen met vier keer de concentratie).
4. Analyse van lipoproteïnen
OPMERKING: Na dialyse zijn deze lipoproteïnen klaar voor verschillende analyses. Lipoproteïnen kunnen worden geëvalueerd door lipiden of apolipoproteïnen of beide te meten. Voor het meten van lipidegehalte zoals totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), fosfolipiden (PL) en gratis cholesterol (FC) in elke fractie, gebruiken we commerciële enzymatische colorimetrische testkits. Voor analyse van apolipoproteïnen gebruiken we SDS-PAGE gevisualiseerd met CBB-vlekken of western blotting.
- Lipide analyse
OPMERKING: Lipiden zoals TC, TG, PL en FC in de lipoproteïnefractie kunnen worden gemeten met behulp van in de handel verkrijgbare meetkits. De procedures zijn afhankelijk van de gebruikte reagentia, dus volg de instructies van elke gebruikte kit. Hier laten we een typische microplate assay zien met behulp van een commerciële enzymatische testkit.- Breng 8 μL lipoproteïnemonster en standaardkalibratiestof aan op 96-put microplaat.
- Voeg 240 μL assay reagens toe en meng door pipetten.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 10 minuten.
- Meet de OD met een microplaatlezer en bereken lipideconcentraties.
- Apolipoproteïne analyse
- SDS-PAGE en CBB kleuring
- Monstervoorbereiding: Voeg 10 μL 2x Monsterbuffer toe aan 10 μL lipoproteïnefractie. Verwarm het mengsel gedurende 5 minuten op 80 °C met behulp van een droog hitteblok.
- Bereid 4-20% gradiënt SDS-polyacrylamide gel voor en zet de gel op de elektroforesekamer gevuld met lopende buffer.
- Laad lipoproteïnemonster (10 μL/lane) en eiwitnormen (5 μL/lane) op de stapelgel.
OPMERKING: Als de monsters twee keer geconcentreerd zijn, wordt per rijstrook een equivalente hoeveelheid plasma van 20 μL geanalyseerd.] - Voer elektroforese uit bij een constante stroom van 20-40 mA.
- CBB-kleuring: Week de gel twee keer in de bevestigingsoplossing met zacht schudden gedurende 10 minuten. Beits de gel gedurende 30 minuten met CBB-kleuroplossing. Spoel de gel af in gedestilleerd water om de overtollige vlek te verwijderen. De gel is klaar om te fotograferen.
- Westerse vlekken
- Voer elektroforese uit in dezelfde procedure als hierboven beschreven.
OPMERKING: Het volume lipoproteïnen dat voor de westerse vlekken wordt geladen, is kleiner dan voor CBB-vlekken zoals hierboven beschreven (bijv. 1–5 μL). - Plaats de gel en het PVDF-membraan tussen door overdrachtsbuffers doordrenkt filterpapier en vormkussen. Zet de sandwich in een houdercassette en plaats in een tank gevuld met transferbuffer.
- Elektroblotting uitvoeren bij een constante stroom van 100 mA gedurende 3 uur bij 4 °C.
- Blokkeren: Incubeer het membraan gedurende 1 uur in de blokkeerbuffer bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C.
- Primaire Ab-reactie: Incubeer de membranen in de primaire Abs verdund met een blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C met mild schudden.
OPMERKING: Voorgestelde primaire ab-verdunning wordt weergegeven in de tabel met materialen. Drie soorten primaire Abs tegen apolipoproteïnen kunnen alleen of in cocktails worden gebruikt. - Was het membraan drie keer in wasbuffer met agitatie, 5 min per wasbeurt.
- Secundaire Ab-reactie: Incubeer het membraan in de secundaire Abs verdund met blokkerende buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met agitatie.
OPMERKING: Voorgestelde secundaire ab-verdunning wordt weergegeven in de tabel met materialen. - Was het membraan drie keer in wasbuffer met agitatie, 5 min per wasbeurt.
- ECL-detectie: Plaats het membraan op een plasticfolie. Voeg ECL-detectiereagentia toe en incubeer gedurende 1 minuut. Laat overtollige vloeistof uitlekken en sluit het membraan af in een zak.
- Visualiseer de signalen met behulp van een beeldanalysator.
- Voer elektroforese uit in dezelfde procedure als hierboven beschreven.
- SDS-PAGE en CBB kleuring
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol hebben we konijnen lipoproteïnen geïsoleerd met behulp van 1 ml plasma en zeven dichtheidsfracties verkregen. Geïsoleerde dichtheidsfracties zijn voldoende voor het meten van lipiden en apolipoproteïnen zoals hierboven beschreven voor de meeste onderzoeksdoeleinden. Dezelfde procedure kan ook worden gebruikt voor het isoleren van plasma lipoproteïnen van menselijke en andere soorten. Voor kleine dieren zoals muizen is gepoold plasma vereist. Figuur 3 toont lipoproteïneprofielen van wilde-type (WT) konijnen die ofwel een normaal standaard (NS) dieet of een hoog cholesterol (HC) dieet voeren. Konijnen zijn herbivorendieren, dus hun plasma TC-, TG- en PL-niveaus zijn over het algemeen lager dan mensen en muizen. Bij door NS dieet gevoede konijnen wordt TC voornamelijk verdeeld in HDL3 (d=1,21 g/ml) en gevolgd door LDL (d=1,04 g/ml) (figuur 3A). Op een NS-dieet wordt 39% van de plasma-TG verdeeld in VLDLs, terwijl 57% van plasma PL is opgenomen in HDL3 (figuur 3A). Toen konijnen werden uitgedaagd met een dieet aangevuld met een hoog cholesterolgehalte, ontwikkelden ze zich snel tot hypercholesterolemie. Zoals getoond in figuur 3B, worden de lipoproteïneprofielen gekenmerkt door een duidelijke verhoging van VLDLs (165-voudig↑ in VLDL-TC, 1,5-voudig↑ in VLDL-TG en 30-voudig↑ in VLDL-PL in vergelijking met door NS gevoede konijnen). Omdat VLDLs geïsoleerd van cholesterolgevoede konijnen rijk zijn aan cholesterylesters en naar de β positie op agarosegelelektroforese gaan, worden ze vaak β-VLDLs genoemd om ze te onderscheiden van normale VLDLs die naar de pre-β positie gaan.
Naast lipiden kunnen apolipoproteïnen eenvoudig worden geanalyseerd door SDS-PAGE, hetzij door CBB-vlekken of westerse vlekken (figuur 4). Zeven lipoproteïnefracties van WT-konijnen die een NS- of een HC-dieet kregen, werden uitgevoerd op een 4-20% SDS-polyacrylamidegel en gevisualiseerd met CBB-vlekken (figuur 4A). Op een HC-dieet werden zowel apoB-100 als apoE-inhoud in VLDLs (d<1.006 g/ml), ICL's (d=1,02 g/ml) en MOL's (d=1,04 g/ml) aanzienlijk verhoogd in vergelijking met konijnen op een NS-dieet. Verder vergeleken we ook apolipoproteïne- en lipoproteïneprofielen van drie verschillende hyperlipidemische konijnen: HC-dieetgevoede WT-konijnen, apoE knockout (KO)-konijnen en Watanabe erfelijke hyperlipidemische (WHHL) konijnen met LDL-receptordeficiëntie door westerse vlekken (figuur 4B). Plasma lipoproteïnen werden gefractioneerd door 4-20% SDS-PAGE en gevolgd door westerse vlekken met antilichamen tegen apoE, apoB en apoA-I. De apoB-bevattende deeltjes (VLDLs, IDLs en LDLs) van HC dieetgevoede WT-konijnen worden gekenmerkt door verhoogde apoB-100 en apoE-inhoud, terwijl apoE KO-konijnen een duidelijke toename van apoB-48 vertoonden, samen met het uiterlijk van apoA-I. WHHL-konijnen hebben een genetisch tekort aan LDL-receptorfuncties, dus er is een duidelijke toename van apoB-100 in MOL's vergezeld van verminderde apoA-I in HDL's, wat vergelijkbaar is met menselijke familiaire hypercholesterolemie.
Figuur 1: Schematische illustratie van sequentiële zwevende ultracentrifugatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve afbeeldingen van plasma lipoproteïne isolatie. (A) Plasma van normolipidemic en hyperlipidemische konijnen. (B) Zwevende bovenste VLDL (d<1.006 g/ml) en onderste fractie (d>1.006 g/ml) na ultracentrifugatie. (C) Buis snijden en verzamelen van de bovenste fractie door een pipet. (D) Verzameling van de onderste fractie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Kwantificering van het lipidegehalte in elke lipoproteïnefractie geïsoleerd van normale konijnen (A) en cholesterolgevoede konijnen (B). Plasma lipoproteïnen werden gescheiden door sequentiële zwevende ultracentrifugatie van plasma van wilde konijnen op een normaal standaarddieet (A) of een hoog cholesteroldieet (B). Het totale cholesterolgehalte (TC), triglyceriden (TG) en fosfolipiden (PL) werden gemeten. De gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n=6). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Yan H et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vergelijking van apolipoproteïneverdeling met CBB-vlekken (A) en Western blotting (B). Plasma werd geïsoleerd door ultracentrifugatie en lipoproteïnen werden gefractioneerd door 4-20% SDS-PAGE. (A) Apolipoproteïneprofielen van wild-type (WT) konijn gevoed met een normaal standaard (NS) dieet en een hoog cholesterol (HC) dieet werden gevisualiseerd door CBB vlekken. Vergeleken met NS dieet-gevoede konijnen (links), HC dieet-gevoede konijnen (rechts) toonde verhoogde apoB-100 en apoE inhoud in VLDLs, IDLs, en LDLs. (B) Vergelijking van apolipoproteïne kenmerken van WT konijnen op een NS of een HC dieet, apoE KO (knock-out) konijnen op een HC dieet, en WHHL konijnen op een NS dieet. Western blotting werd uitgevoerd met "cocktail antilichamen" tegen apoE, apoB en apoA-I. In vergelijking met normolipidemische konijnen (WT-konijnen op een NS-dieet, eerst links), vertonen andere drie hyperlipidemische konijnen unieke en verschillende apolipoproteïneprofielen. De apoB-bevattende deeltjes (VLDLs, IDLs en MOL's) van HC-gevoede WT-konijnen worden gekenmerkt door een verhoogd apoB-100- en apoE-gehalte, terwijl apoE KO-konijnen een duidelijke toename van apoB-48 vertoonden, samen met het uiterlijk van apoA-I. WHHL vertoonde een duidelijke toename van apoB-100 in MOL's vergezeld van verminderde apoA-I in HDL's. Dit cijfer is gewijzigd van Niimi M et al.10. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Dichtheidsoplossing (g/ml) | KBr (g) | Gedestilleerd water (ml) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1.10 uur | 148.490 | 1000 |
| d=1.21 uur | 333.394 | 1000 |
Tabel 1: Bereiding van kaliumbromide (KBr) dichtheidsoplossingen. Het gewicht (g) KBr voegt toe aan 1000 ml gedestilleerd water.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperlipidemie is een van de belangrijkste risicofactoren van atherosclerotische ziekte. Zo is analyse van plasma-lipoproteïnen niet alleen essentieel voor de diagnose van dyslipidemiepatiënten, maar ook belangrijk voor onderzoek naar moleculaire mechanismen van lipoproteïnemetabolisme en atherosclerose. In deze studie beschreven we het protocol van isolatie en analyse van plasma lipoproteïnen dat kan worden toegepast in de laboratoria waar ultracentrifugatie beschikbaar is. Informatie verkregen met deze methode is uitgebreid en eenvoudig, daarom wordt het aanbevolen voor zowel klinische als basisonderzoekswetenschappers. Geïsoleerde lipoproteïnen kunnen ook worden gebruikt voor het onderzoeken van vele andere facetten van lipoproteïnefuncties zoals negatiefvlek elektronenmicroscopie13,14, oxidizability9,15, proteomics16, celkweek gebaseerde in vitro studie zoals cholesterol efflux assay9 en lipoproteïne opnametest17.
Er zij op gewezen; Er zijn echter een aantal zwakke punten die rekening moeten worden Ten eerste is deze methode relatief tijdrovend (minstens drie dagen) in vergelijking met andere methoden. Bij gebruik van het nieuwste tafelblad ultracentrifuge kan high-speed spin (150.000 tpm) de scheidingstijd met 50-140 min verkorten voor elke lipoproteïnefractie18. Ten tweede kan monsterverlies optreden tijdens de isolatie. Om monsterverlies te minimaliseren, moet het stroperige neerslag in de onderste fractie worden opgelost en zorgvuldig worden verzameld door pipetten. De centrifugebuizen moeten stevig worden gerepareerd met een snijmachine om lekken van de bovenste fractie te voorkomen. Bovendien moeten de monsters zorgvuldig uit dialysezakken worden teruggewonnen. Het herstel kan worden berekend door het totale lipoproteïnecholesterol te vergelijken met het oorspronkelijke plasmacholesterol. Volgens onze ervaring zal het algemene herstelpercentage worden ≈ 80%19. Ten derde is dit protocol beperkt voor een klein aantal monsters, omdat één rotor slechts twaalf buizen per keer kan draaien. Om een groot aantal monsters uit te voeren, kan het geschikt zijn om andere methoden te gebruiken, zoals neerslagmethode voor HDL-voorbereiding4 en geautomatiseerde HPLC-lipoproteïneanalyse20.
Samengevat biedt dit protocol een gids voor onderzoekers om plasma-lipoproteïnen te isoleren met behulp van sequentiële dichtheid ultracentrifugatie en de analyse van lipiden en apolipoproteïnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een onderzoeksbeurs van JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, de National Natural Science Foundation of China (Nr. 81941001 en 81770457), JSPS-CAS in het kader van het Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
