Summary
Diversi metodi sono stati utilizzati per analizzare le lipoproteine plasmatiche; tuttavia, l'ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. Qui descriviamo un metodo su come isolare le lipoproteine dal plasma usando l'ultracentrifugazione a densità sequenziale e come analizzare le apolipoproteine sia a scopo diagnostico che di ricerca.
Abstract
L'analisi delle lipoproteine plasmatiche e delle apolipoproteine è una parte essenziale per la diagnosi di dislipidemia e gli studi sul metabolismo lipidico e sull'aterosclerosi. Sebbene esistano diversi metodi per analizzare le lipoproteine plasmatiche, l'ultracentrifugazione è ancora uno dei metodi più popolari e affidabili. A causa della sua procedura di separazione intatta, le frazioni di lipoproteina isolate con questo metodo possono essere utilizzate per l'analisi di lipoproteine, apolipoproteine, proteomi e studio funzionale delle lipoproteine con cellule coltivate in vitro. Qui forniamo un protocollo dettagliato per isolare sette frazioni di lipoproteina tra cui VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1,10 e 1,21 g/mL) dal plasma di coniglio utilizzando ultracentrifugazione galleggiante sequenziale. Inoltre, introduciamo ai lettori come analizzare le apolipoproteine come apoA-I, apoB e apoE di SDS-PAGE e Western blotting e mostriamo risultati rappresentativi dei profili di lipoproteina e apolipoproteina utilizzando modelli di coniglio iperlipidemico. Questo metodo può diventare un protocollo standard sia per i medici che per gli scienziati di base per analizzare le funzioni della lipoproteina.
Introduction
La dislipidemia è il principale fattore di rischio della malattia aterosclerotica nel mondo. Alti livelli di lipoproteine a bassa densità (LDL) e bassi livelli di lipoproteine ad alta densità (HDL) sono strettamente associati ad un alto rischio di malattie coronarica (CHD)1,2. Nell'ambiente clinico, sia il colesterolo LDL (LDL-C) che il colesterolo HDL (HDL-C) vengono misurati regolarmente utilizzando un analizzatore automatizzato in un laboratorioclinico 3,4. Nonostante ciò, è essenziale analizzare i profili di lipoproteina nei dettagli per la diagnosi di dislipidemia e lo studio del metabolismo lipidico e dell'aterosclerosi negli animali umani e sperimentali. Diversi metodi sono stati segnalati per analizzare le lipoproteine plasmatiche come l'ultracentrifugazione, la cromatografia ad esclusione delle dimensioni [cromatografia liquida proteica veloce (FPLC) e cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)], l'elettroforesi da gel di agarosio e poliacrilammide, risonanza magnetica nucleare e precipitazioni chimiche selettive usando polianioni e formazioni divalenti o altre sostanze chimiche. Negli anni '50, il gruppo di Havel propose per la prima volta il concetto di lipoproteine definite dalle densità usando l'ultracentrifugazione e le classificò in chilomicroni (CM), lipoproteine a bassissimo densità (VLDL), lipoproteine a densità intermedia (IDL), LDL e HDL5 e successivamente, il metodo fu ulteriormente modificato da altrigruppi 6,7. Fino ad ora, l'ultracentrifugazione è il metodo più popolare e affidabile mentre il protocollo pratico non è ancora disponibile. In questo documento, abbiamo cercato di descrivere un protocollo facile da usare per isolare una piccola scala di plasma usando l'ultracentrifugazione galleggiante a densità sequenziale originariamente descrittain precedenza 8. Isolamento di sette frazioni plasmatiche lipoproteine [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL (d=1,04 e 1,06 g/mL), HDL (d=1,08, 1.10, e 1.21 g/mL)] consente ai ricercatori di effettuare un'analisi approfondita sia delle lipoproteine che delle loro apolipoproteine compositive9,10,11. Le lipoproteine intatte a sette densità consecutive possono essere utilizzate per analizzare le funzioni della lipoproteina e servire anche a strategie in vitro basate su cellule. Questo protocollo dovrebbe essere utile sia per la diagnosi clinica che per la ricerca di base. Qui abbiamo usato il plasma di coniglio come esempio per dimostrare questa tecnica mentre il plasma di altre specie può essere applicato allo stesso modo.
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Protocol
Tutte le procedure per gli studi sui conigli sono state eseguite con l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Yamanashi (numero approvato: A28-39).
1. Separazione al plasma dal sangue di coniglio
- Preparare microtubi da 1,5 mL contenenti 15 μL di 0,5 M EDTA (pH 8,0) per la raccolta del sangue.
- Mettere un coniglio in un trattiere e forare un'arteria intermedia auricolare usando un ago calibro 22 e raccogliere il sangue in un tubo. Mescolare delicatamente il sangue con EDTA e metterli sul ghiaccio.
- Centrifugare le provette ematiche a 1.500 x g per 20 min a 4 °C e raccogliere il plasma su un nuovo microtubo.
NOTA: 3 mL di sangue sono sufficienti per raccogliere 1 mL di plasma. Se raccogli sangue da topi o altri piccoli animali, devi raggrupparli.
2. Isolamento delle lipoproteine plasmatiche
NOTA: la procedura schematica è illustrata nella figura 1. Il metodo di preparazione delle soluzioni di densità del bromuro di potassio (KBr) è illustrato nella tabella 1.
- Trasferire 1 ml di plasma in un tubo ultracentrifugo in policarbonato (Figura 2A).
- Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare il plasma a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C(Figura 2B).
NOTA: Per il rotore Beckman TLA 120.2, 356.000 x g (campo centrifugo relativo medio, Av RCF) corrisponde a 100.000 giri/min. - Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [VLDL (d<1.006 g/mL)], circa 200 μL in un nuovo microtubo (Figura 2C). Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la separazione successiva (Figura 2D). Misurare il volume e rendere il volume totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,006 g/mL).
NOTA: Impostare una lama sull'affettatubo. Regolare la posizione della lama ad un livello compreso tra la frazione superiore (200 μL) e la frazione inferiore (800 μL). Il precipitante viscoso nella frazione inferiore deve essere raccolto con attenzione e completamente tubazione in tutti i seguenti passaggi. In caso di pausa, eseguire questa procedura dopo aver separato la frazione superiore e inferiore in tutti i passaggi. Conservare il campione a 4°C fino alla successiva centrifugazione. - Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,02 g/mL aggiungendo 58,9 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 141,1 μL di soluzione d=1,02 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
- Caricare questi tubi in rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
- Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [IDL (d=1,02 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il volume totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,02 g/mL).
- Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,04 g/mL aggiungendo 94,1 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 105,9 μL di soluzione d=1,04 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
- Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
- Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [LDL (d=1,04 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,04 g/mL).
- Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,06 g/mL aggiungendo 106,7 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 93,3 μL di soluzione d=1,06 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
- Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
- Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [LDL (d=1,06 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,06 g/mL).
- Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,08 g/mL aggiungendo 123,1 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 76,9 μL di soluzione d=1,08 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
- Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
- Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL2 (d=1,08 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,08 g/mL).
- Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,10 g/mL aggiungendo 145,5 μL di soluzione d=1,21 g/mL e 54,5 μL di soluzione d=1,10 g/mL (il volume totale è di 1 mL).
- Caricare questi tubi in un rotore ad angolo fisso e centrifugare a 356.000 x g per 2,5 h a 4 °C.
- Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL2 (d=1,10 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Raccogliere la frazione inferiore rimanente in un nuovo tubo ultracentrifugo in policarbonato per la successiva separazione. Misurare il volume e rendere il totale a 800 μL aggiungendo la stessa soluzione di densità (d=1,10 g/mL).
- Regolare la frazione inferiore (totale 800 μL) a d=1,21 g/mL aggiungendo 0,140 g di polvere di bromuro di potassio (KBr) e scioglierla completamente. Misurare il volume e renderli a 1 mL aggiungendo la soluzione d=1,21 g/mL.
- Caricare questi tubi in rotore ad angolo fisso e centrifugare a 513.000 x g per 4 h a 4 °C.
NOTA: Per il rotore Beckman TLA 120.2, 513.000 x g (Av RCF) corrisponde a 120.000 giri/min. - Tagliare i tubi utilizzando un filtro dei dati e quindi raccogliere la frazione superiore [HDL3 (d=1,21 g/mL)] circa 200 μL in un nuovo microtubo. Questo è l'ultimo passo per l'ultracentrifugazione.
3. Dialisi
NOTA: Poiché le frazioni di densità (ad eccezione della frazione d<1.006 g/mL) contengono alte concentrazioni di KBr, è necessario rimuoverle per dialisi.
- Trasferire le frazioni di densità in un tubo di dialisi e ritagliare entrambe le estremità con chiusure.
- Dializzare contro 2 L di tampone di dialisi come PBS/ 1 mM EDTA per 6 h a 4 °C con agitazione utilizzando un agitatore magnetico.
- Sostituire con nuovo tampone e dializzare di nuovo per altri 6 h a 4 °C.
- Raccogliere le frazioni di densità e misurare il volume. Regolare tutte le frazioni di densità allo stesso volume (ad esempio, 250 μL).
NOTA: È possibile calcolare il fattore concentrato da 1 mL di plasma originale (ad esempio, 250 μL di frazione di densità corrisponde a una concentrazione quattro volte superiore).
4. Analisi delle lipoproteine
NOTA: Dopo la dialisi, queste lipoproteine sono pronte per diverse analisi. Le lipoproteine possono essere valutate misurando lipidi o apolipoproteine o entrambi. Per misurare il contenuto lipidico come colesterolo totale (TC), trigliceridi (TG), fosfolipidi (PL) e colesterolo libero (FC) in ogni frazione, utilizziamo kit di dosaggio colorimetrici enzimatici commerciali. Per l'analisi delle apolipoproteine, utilizziamo SDS-PAGE visualizzato con colorazione CBB o western blotting.
- Analisi lipidica
NOTA: Lipidi come TC, TG, PL e FC nella frazione lipoproteina possono essere misurati utilizzando kit di misurazione disponibili in commercio. Le procedure dipendono dai reagenti utilizzati, quindi segui le istruzioni di ogni kit utilizzato. Qui mostriamo un tipico test di micropiatta usando un kit di saggi enzimatici commerciali.- Applicare 8 μL di campione di lipoproteina e sostanza di taratura standard su micropiatta da 96 pozzi.
- Aggiungere 240 μL di reagente di dosaggio e mescolare mediante pipettazione.
- Incubare a 37 °C per 10 minuti.
- Misurare l'OD con un lettore di micropiatte e calcolare le concentrazioni lipidiche.
- Analisi dell'apolipoproteina
- Colorazione SDS-PAGE e CBB
- Preparazione del campione: Aggiungere 10 μL di 2x Tampone campione a 10 μL di frazione lipoproteina. Scaldare la miscela a 80 °C per 5 minuti utilizzando un blocco di calore asciutto.
- Preparare il gel SDS-poliacrilammide sfumato al 4-20% e impostare il gel sulla camera di elettroforesi riempita con tampone di corsa.
- Caricare il campione di lipoproteina (10 μL/corsia) e gli standard proteici (5 μL/ corsia) sul gel impilabile.
NOTA: Se i campioni sono due volte concentrati, verrà analizzata una quantità equivalente di plasma da 20 μL per corsia.] - Eseguire l'elettroforesi a corrente costante di 20-40 mA.
- Colorazione CBB: Immergere il gel due volte in soluzione di fissaggio con agitazione delicata per 10 minuti. Macchiare il gel con soluzione di colorazione CBB per 30 min. Risciacquare il gel in acqua distillata per rimuovere la macchia in eccesso. Il gel è pronto per la fotografia.
- Gonfiore occidentale
- Eseguire l'elettroforesi nella stessa procedura descritta sopra.
NOTA: Il volume di lipoproteine caricate per l'assorbimento occidentale è inferiore a quello della colorazione CBB sopra descritta (ad esempio 1-5 μL). - Posizionare il gel e la membrana PVDF tra la carta filtrante imbevuta di tampone di trasferimento e il form pad. Impostare il sandwich in una cassetta di supporto e posizionare in un serbatoio pieno di buffer di trasferimento.
- Eseguire l'elettroblotting a corrente costante di 100 mA per 3 ore a 4 °C.
- Blocco: Incubare la membrana in tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
- Reazione Primaria Ab: Incubare le membrane negli Abs primari diluiti con tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C con lievi scosse.
NOTA: l'ab diluizione primaria suggerita è mostrata nella tabella dei materiali. Tre tipi di Abs primari contro le apolipoproteine possono essere usati singolarmente o nei cocktail. - Lavare la membrana tre volte nel tampone di lavaggio con agitazione, 5 minuti per lavaggio.
- Reazione Ab secondaria: Incubare la membrana negli Abs secondari diluiti con tampone di blocco per 1 h a temperatura ambiente con agitazione.
NOTA: L'ab diluizione secondaria suggerita è mostrata nella tabella dei materiali. - Lavare la membrana tre volte nel tampone di lavaggio con agitazione, 5 minuti per lavaggio.
- Rilevamento ECL: Posizionare la membrana su un involucro di plastica. Aggiungere reagenti di rilevamento ECL e incubare per 1 min. Scolare il liquido in eccesso e sigillare la membrana in un sacchetto.
- Visualizzare i segnali utilizzando un analizzatore di immagini.
- Eseguire l'elettroforesi nella stessa procedura descritta sopra.
- Colorazione SDS-PAGE e CBB
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Representative Results
Utilizzando questo protocollo, abbiamo isolato le lipoproteine di coniglio usando 1 mL di plasma e ottenuto sette frazioni di densità. Le frazioni di densità isolate sono sufficienti per misurare lipidi e apolipoproteine come descritto sopra per la maggior parte degli scopi di ricerca. La stessa procedura può essere utilizzata anche per isolare le lipoproteine plasmatiche dall'uomo e da altre specie. Per animali di piccole dimensioni come i topi, è necessario plasma in pool. La figura 3 mostra i profili di lipoproteina dei conigli di tipo selvatico (WT) alimentati con una dieta standard normale (NS) o colesterolo alto (HC). I conigli sono animali erbivori, quindi i loro livelli di plasma TC, TG e PL sono generalmente inferiori rispetto agli esseri umani e ai topi. Nei conigli alimentati con dieta NS, il TC è distribuito principalmente in HDL3 (d=1,21 g/mL) e seguito da LDL (d=1,04 g/mL)(figura 3A). Con una dieta NS, il 39% dei TG plasmatici è distribuito in VLDL, mentre il 57% del PL plasma è contenuto in HDL3 (Figura 3A). Quando i conigli sono stati sfidati con una dieta integrata con colesterolo alto, si sono rapidamente sviluppati in ipercolesterolemia. Come mostrato nella figura 3B, i profili lipoproteina sono caratterizzati da una marcata elevazione dei VLDL (165 volte↑ in VLDL-TC, 1,5 volte↑ in VLDL-TG e 30 volte↑ in VLDL-PL rispetto ai conigli alimentati da NS). Poiché i VLDL isolati dai conigli alimentati con colesterolo sono ricchi di esteri colesterilici e si spostano nella posizione di β sull'elettroforesi del gel di agarosio, sono spesso chiamati β-VLDL per distinguerli dai normali VLDL che si spostano in posizione pre-β.
Oltre ai lipidi, le apolipoproteine possono essere semplicemente analizzate da SDS-PAGE mediante colorazione CBB o western blotting (Figura 4). Sette frazioni di lipoproteina provenienti da conigli WT alimentati con una dieta NS o HC sono state eseguite su un gel SDS-poliacrilammide al 4-20% e visualizzate con colorazione CBB (Figura 4A). Con una dieta HC, sia il contenuto di apoB-100 che il contenuto di apoE nei VLDL (d<1.006 g/mL), gli IDL (d=1,02 g/mL) e gli LDL (d=1,04 g/mL) sono stati notevolmente elevati rispetto ai conigli con una dieta NS. Inoltre, abbiamo anche confrontato i profili di apolipoproteina e lipoproteina di tre diversi conigli iperlipidemici: conigli WT nutriti con dieta HC, conigli knockout apoE (KO) e conigli iperlipidemici heritable Watanabe (WHHL) con carenza del recettore LDL da parte dell'intestinooccidentale (Figura 4B). Le lipoproteine plasmatiche sono state frazionate del 4-20% SDS-PAGE e seguite da gonfiore occidentale con anticorpi contro apoE, apoB e apoA-I. Le particelle contenenti apoB (VLDL, IDL e LDL) dei conigli WT alimentati con dieta HC sono caratterizzate da un aumento del contenuto di apoB-100 e apoE, mentre i conigli apoE KO hanno mostrato un marcato aumento di apoB-48 insieme alla comparsa di apoA-I. I conigli WHHL sono geneticamente carenti nelle funzioni del recettore LDL, quindi c'è un marcato aumento dell'apoB-100 negli LDL accompagnato da un apoA-I ridotto negli HDL, che è simile all'ipercolesterolemia familiare umana.
Figura 1: Illustrazione schematica dell'ultracentrifugazione galleggiante sequenziale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini rappresentative dell'isolamento della lipoproteina plasmatica. (A) Plasma di conigli normolipidemici e iperlipidemici. (B) VLDL superiore flottato (d<1,006 g/mL) e frazione inferiore (d>1,006 g/mL) dopo l'ultracentrifugazione. (C) Affettamento del tubo e raccolta della frazione superiore mediante pipetta. (D) Raccolta della frazione inferiore. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Quantificazione del contenuto lipidico in ogni frazione di lipoproteina isolata dai conigli normali (A) e dai conigli nutriti con colesterolo (B). Le lipoproteine plasmatiche erano separate da ultracentrifugazione galleggiante sequenziale dal plasma di conigli di tipo selvatico con una dieta standard normale (A) o una dieta ad alto colesterolo (B). Sono stati misurati colesterolo totale (TC), trigliceridi (TG) e fosfolipidi (PL). I dati sono espressi come ± SEM (n=6). Questa cifra è stata modificata da Yan H etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Confronto della distribuzione dell'apolipoproteina mediante colorazione CBB (A) e western blotting (B). Il plasma è stato isolato per ultracentrifugazione e le lipoproteine sono state frazionate del 4-20% SDS-PAGE. (A) I profili di apolipoproteina del coniglio di tipo selvatico (WT) nutriti con una dieta standard normale (NS) e una dieta ad alto colesterolo (HC) sono stati visualizzati dalla colorazione CBB. Rispetto ai conigli nutriti con dieta NS (a sinistra), i conigli nutriti con dieta HC (adestra)hanno mostrato un aumento del contenuto di apoB-100 e apoE in VLDL, IDL e LDL. ( B ) Confronto delle caratteristiche di apolipoproteina dei conigli WT su una dieta NS o HC, conigli apoE KO (knockout) con una dieta HC e conigli WHHL con una dieta NS. Il western blotting è stato eseguito con "anticorpi cocktail" contro apoE, apoB e apoA-I. Rispetto ai conigli normolipidemici (conigli WT con dieta NS, prima a sinistra), altri tre conigli iperlipidemici mostrano profili di apolipoproteina unici e diversi. Le particelle contenenti apoB (VLDL, IDL e LDL) dei conigli WT alimentati con HC sono caratterizzate da un aumento del contenuto di apoB-100 e apoE, mentre i conigli apoE KO hanno mostrato un marcato aumento di apoB-48 insieme alla comparsa di apoA-I. WHHL ha mostrato un marcato aumento dell'apoB-100 negli LDL accompagnato da un apoA-I ridotto negli HDL. Questa cifra è stata modificata da Niimi M etal. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Soluzione di densità (g/mL) | KBr (g) | Acqua distillata (mL) |
| d=1,006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabella 1: Preparazione di soluzioni di densità al bromuro di potassio (KBr). Il peso (g) di KBr si aggiunge all'acqua distillata da 1000 mL.
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Discussion
L'iperlipidemia è uno dei principali fattori di rischio della malattia aterosclerotica. Pertanto, l'analisi delle lipoproteine plasmatiche non è solo essenziale per la diagnosi di pazienti con dislipidemia, ma anche importante per lo studio dei meccanismi molecolari del metabolismo della lipoproteina e dell'aterosclerosi. In questo studio, abbiamo descritto il protocollo di isolamento e analisi delle lipoproteine plasmatiche che può essere applicato nei laboratori in cui è disponibile l'ultracentrifugazione. Le informazioni ottenute con questo metodo sono complete e dirette, pertanto sono raccomandate sia per i ricercatori clinici che per i ricercatori di base. Lipoproteine isolate possono anche essere utilizzate per indagare molte altre sfaccettature di funzioni lipoproteine come microscopia elettronica a macchia negativa13,14, ossidibilità9,15, proteomica16, colturacellulare basata su studi in vitro come il test di assorbimento dell'efflusso del colesterolo9 e il test di assorbimento della lipoproteina17.
Va sottolineato; tuttavia, ci sono diversi punti deboli che devono prendere considerazioni. In primo luogo, questo metodo richiede relativamente molto tempo (almeno tre giorni) rispetto ad altri metodi. Se si utilizza l'ultracentrifugo da tavolo più recente, lo spin ad alta velocità (150.000 giri/min) può ridurre il tempo di separazione di 50-140 minuti per ogni frazione di lipoproteina18. In secondo luogo, la perdita del campione può verificarsi durante l'isolamento. Per ridurre al minimo la perdita del campione, il precipitante viscoso nella frazione inferiore deve essere sciolto e raccolto con attenzione mediante pipettazione. I tubi di centrifuga devono fissarsi saldamente con un affettatrice per evitare perdite della frazione superiore. Inoltre, i campioni devono essere recuperati con cura dai sacchetti di dialisi. Il recupero può essere calcolato confrontando il colesterolo totale di lipoproteina con il colesterolo plasmatico originale. Secondo la nostra esperienza, il tasso di recupero generale sarà ≈ 80%19. In terzo luogo, questo protocollo è limitato per un piccolo numero di campioni perché un rotore può funzionare solo dodici tubi alla volta. Per eseguire un gran numero di campioni, può essere adatto utilizzare altri metodi come il metodo di precipitazione per la preparazione HDL4 e l'analisi automatizzata della lipoproteina HPLC20.
In sintesi, questo protocollo fornisce una guida per i ricercatori per isolare le lipoproteine plasmatiche utilizzando l'ultracentrifugazione a densità sequenziale e l'analisi di lipidi e apolipoproteine.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione di ricerca del JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, della National Natural Science Foundation of China (n. 81941001 e 81770457), JSPS-CAS nell'ambito del Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
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