Summary
Flere metoder har blitt brukt til å analysere plasma lipoproteiner; Imidlertid er ultracentrifugation fortsatt en av de mest populære og pålitelige metodene. Her beskriver vi en metode for hvordan å isolere lipoproteiner fra plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet ultracentrifugation og hvordan å analysere apolipoproteiner for både diagnostiske og forskningsformål.
Abstract
Analyse av plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en viktig del for diagnostisering av dyslipidemi og studier av lipidmetabolisme og aterosklerose. Selv om det finnes flere metoder for å analysere plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er fortsatt en av de mest populære og pålitelige metoder. På grunn av sin intakte separasjonsprosedyre kan lipoproteinfraksjonene isolert ved denne metoden brukes til analyse av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funksjonell studie av lipoproteiner med kultiverte celler in vitro. Her gir vi en detaljert protokoll for å isolere syv lipoproteinfraksjoner, inkludert VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml) fra kaninplasma ved hjelp av sekvensiell flytende ultracentrifugation. I tillegg introduserer vi leserne hvordan de analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE av SDS-PAGE og Western blotting og viser representative resultater av lipoprotein og apolipoproteinprofiler ved hjelp av hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metoden kan bli en standardprotokoll for både klinikere og grunnleggende forskere for å analysere lipoproteinfunksjoner.
Introduction
Dyslipidemi er den viktigste risikofaktoren for aterosklerotisk sykdom i verden. Høye nivåer av lipoproteiner med lav tetthet (LDLer) og lave nivåer av lipoproteiner med høy tetthet (HDLer) er nært forbundet med høy risiko for koronar hjertesykdom (CHD)1,2. I klinisk setting måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemessig ved hjelp av en automatisert analysator i et klinisklaboratorium 3,4. Til tross for dette er det viktig å analysere lipoproteinprofiler i detaljer for diagnostisering av dyslipidemi og studiet av lipidmetabolisme og aterosklerose hos menneskelige og eksperimentelle dyr. Flere metoder har blitt rapportert å analysere plasma lipoproteiner som ultracentrifugation, størrelse eksklusjon kromatografi [rask protein flytende kromatografi (FPLC) og høy ytelse flytende kromatografi (HPLC)], elektroforese av agarose og polyakrylamid geler, kjernemagnetisk resonans, og selektiv kjemisk nedbør ved hjelp av polyanioner og divalente kationer eller andre kjemikalier. På 1950-tallet foreslo Havels gruppe først begrepet lipoproteiner definert av tettheter ved hjelp av ultracentrifugation og klassifisert dem i chylomicrons (CM), svært lav tetthet lipoproteiner (VLDL), mellomliggende tetthet lipoproteiner (IDL), LDL, og HDL5 og senere, metoden ble ytterligere endret av andregrupper 6,7. Inntil nå er ultracentrifugation den mest populære og pålitelige metoden, mens den praktiske protokollen fortsatt ikke er tilgjengelig. I dette papiret forsøkte vi å beskrive en brukervennlig protokoll for å isolere en liten skala av plasma ved hjelp av sekvensiell tetthet flytende ultracentrifugation opprinnelig beskrevet tidligere8. Isolering av syv plasma lipoproteinfraksjoner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLer (d=1,04 og 1,06 g/ml), HDLer (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/ml)] gjør det mulig for forskere å gjøre en omfattende analyse av både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner9,10,11. De intakte syv påfølgende tetthet lipoproteiner kan brukes til å analysere lipoprotein funksjoner og også tjene til celle-baserte in vitro strategier. Denne protokollen bør være nyttig for både klinisk diagnose og grunnleggende forskning. Her brukte vi kaninplasma som et eksempel for å demonstrere denne teknikken, mens plasma fra andre arter kan brukes på samme måte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer for kaninstudier ble utført med godkjenning av University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkjent nummer: A28-39).
1. Plasmaseparasjon fra kaninblod
- Forbered 1,5 ml mikrorør som inneholder 15 μL på 0,5 M EDTA (pH 8,0) for blodinnsamling.
- Sett en kanin i et begrensningsmiddel og punkter en auricular mellomarterie ved hjelp av en 22 gauge nål og samle blod inn i et rør. Bland blodet forsiktig med EDTA og legg dem på is.
- Sentrifuger blodrørene ved 1500 x g i 20 min ved 4 °C og samle plasma til et nytt mikrorør.
MERK: 3 ml blod er nok til å samle 1 ml plasma. Hvis du samler blod fra mus eller andre små dyr, må du samle dem.
2. Isolering av plasmalipoproteiner
MERK: Den skjematiske prosedyren vises i figur 1. Tilberedningsmetoden for kaliumbromid (KBr) tetthetsløsninger er vist i tabell 1.
- Overfør 1 ml plasma til et ultrasentrisk polykarbonat (figur 2A).
- Legg disse rørene i en fast vinkelrotor og sentrifuger plasmaet ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C (figur 2B).
MERK: For Beckman TLA 120,2 rotor tilsvarer 356 000 x g (gjennomsnittlig relativ sentrifugalfelt, Av RCF) 100 000 o/min. - Klipp rørene med en slicer, og samle deretter den øverste fraksjonen [VLDL (d<1.006 g/ml)], ca. 200 μL i et nytt mikrorør (figur 2C). Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon (Figur 2D). Mål volumet og gjør det totale volumet til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d=1,006 g/ml).
MERK: Sett opp et blad på rørskiven. Juster posisjonen til bladet på et nivå mellom den øverste brøken (200 μL) og den nederste brøken (800 μL). Det viskøse stupet i bunnfraksjonen skal samles forsiktig og fullstendig ved å pipettere i alle følgende trinn. Hvis pause, gjør du det etter å ha skilt den øverste og nederste brøken i alle trinnene. Oppbevar prøven ved 4 °C til neste sentrifugering. - Juster den nederste fraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,02 g/ml ved å tilsette 58,9 μL d=1,21 g/ml oppløsning og 141,1 μL d=1,02 g/ml oppløsning (det totale volumet er 1 ml).
- Legg disse rørene i fast vinkelrotor og sentrifuge ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C.
- Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [IDL (d= 1,02 g / ml)] ca 200 μL i et nytt mikrorør. Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon. Mål volumet og gjør det totale volumet til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d= 1,02 g / ml).
- Juster den nederste fraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,04 g/ml ved å tilsette 94,1 μL d=1,21 g/ml oppløsning og 105,9 μL d=1,04 g/ml oppløsning (det totale volumet er 1 ml).
- Legg disse rørene i en fast vinkelrotor og sentrifuge ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C.
- Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [LDL (d=1,04 g/ml)] ca. 200 μL i et nytt mikrorør. Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon. Mål volumet og gjør totalen til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d= 1,04 g / ml).
- Juster den nederste fraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,06 g/ml ved å tilsette 106,7 μL d=1,21 g/ml oppløsning og 93,3 μL d=1,06 g/ml oppløsning (det totale volumet er 1 ml).
- Legg disse rørene i en fast vinkelrotor og sentrifuge ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C.
- Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [LDL (d=1,06 g/ml)] ca. 200 μL i et nytt mikrorør. Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon. Mål volumet og gjør totalen til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d= 1,06 g / ml).
- Juster den nederste fraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,08 g/ml ved å tilsette 123,1 μL d=1,21 g/ml oppløsning og 76,9 μL d=1,08 g/ml oppløsning (det totale volumet er 1 ml).
- Legg disse rørene i en fast vinkelrotor og sentrifuge ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C.
- Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [HDL2 (d= 1,08 g / ml)] ca 200 μL i et nytt mikrorør. Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon. Mål volumet og gjør totalen til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d= 1,08 g / ml).
- Juster bunnfraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,10 g/ml ved å tilsette 145,5 μL d=1,21 g/ml oppløsning og 54,5 μL d=1,10 g/ml oppløsning (det totale volumet er 1 ml).
- Legg disse rørene i en fast vinkelrotor og sentrifuge ved 356 000 x g i 2,5 t ved 4 °C.
- Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [HDL2 (d= 1,10 g / ml)] ca 200 μL i et nytt mikrorør. Samle den gjenværende bunnfraksjonen i et nytt polykarbonat ultracentrifuge rør for neste separasjon. Mål volumet og gjør totalen til 800 μL ved å legge til samme tetthetsløsning (d= 1,10 g / ml).
- Juster bunnfraksjonen (totalt 800 μL) til d=1,21 g/ml ved å tilsette 0,140 g kaliumbromid (KBr) pulver og oppløse det helt. Mål volumet og gjør dem til 1 ml ved å legge til d = 1,21 g / ml løsning.
- Legg disse rørene i fast vinkelrotor og sentrifuge ved 513 000 x g i 4 t ved 4 °C.
MERK: For Beckman TLA 120,2 rotor tilsvarer 513 000 x g (Av RCF) 120 000 o/min. - Klipp rørene med en slicer og samle deretter den øverste fraksjonen [HDL3 (d= 1,21 g / ml)] ca 200 μL i et nytt mikrorør. Dette er det siste trinnet for ultracentrifugation.
3. Dialyse
MERK: Fordi tetthetsfraksjonene (unntatt d<1,006 g/ml fraksjon) inneholder høye konsentrasjoner av KBr, er det nødvendig å fjerne dem ved dialyse.
- Overfør tetthetsfraksjonene til en dialyserør og klipp begge ender med nedleggelser.
- Dialyser mot 2 L dialysebuffer som PBS/ 1 mM EDTA i 6 timer ved 4 °C med omrøring ved hjelp av magnetisk rører.
- Erstatt med ny buffer og dialyze igjen for ytterligere 6 timer ved 4 °C.
- Samle tetthetsfraksjonene og mål volumet. Juster alle tetthetsfraksjonene til samme volum (f.eks. 250 μL).
MERK: Du kan beregne den konsentrerte faktoren fra 1 ml originalt plasma (f.eks. 250 μL tetthetsfraksjon tilsvarer fire ganger konsentrasjon).
4. Analyse av lipoproteiner
MERK: Etter dialyse er disse lipoproteinene klare for ulike analyser. Lipoproteiner kan evalueres ved å måle enten lipider eller apolipoproteiner eller begge deler. For måling av lipidinnhold som totalt kolesterol (TC), triglyserider (TG), fosfolipider (PL) og fritt kolesterol (FC) i hver brøkdel, bruker vi kommersielle enzymatiske kolorimetriske analysesett. For analyse av apolipoproteiner bruker vi SDS-PAGE visualisert med CBB-farging eller vestlig blotting.
- Lipid analyse
MERK: Lipider som TC, TG, PL og FC i lipoproteinfraksjonen kan måles ved hjelp av kommersielt tilgjengelige målesett. Prosedyrene avhenger av reagensene som brukes, så følg instruksjonene for hvert sett som brukes. Her viser vi en typisk mikroplateanalyse ved hjelp av et kommersielt enzymatisk analysesett.- Påfør 8 μL lipoproteinprøve og standard kalibreringsstoff på 96-brønns mikroplate.
- Tilsett 240 μL av analysen reagens og bland ved pipettering.
- Inkuber ved 37 °C i 10 min.
- Mål OD med en mikroplateleser og beregn lipidkonsentrasjoner.
- Apolipoprotein analyse
- SDS-SIDE og CBB farging
- Eksempelforberedelse: Tilsett 10 μL μL 2x Prøvebuffer til 10 μL lipoproteinfraksjon. Varm blandingen ved 80 °C i 5 min ved hjelp av en tørr varmeblokk.
- Forbered 4-20% gradient SDS-polyakrylamid gel og sett opp gelen på elektroforesekammeret fylt med løpebuffer.
- Last lipoproteinprøven (10 μL/kjørefelt) og proteinstandarder (5 μL/kjørefelt) på stablingsgelen.
MERK: Hvis prøvene er to ganger konsentrerte, analyseres tilsvarende mengde 20 μL plasma per kjørefelt.] - Kjør elektroforese ved 20–40 mA konstant strøm.
- CBB farging: Suge gelen to ganger i festeløsning med mild risting i 10 min. Flekk gelen med CBB fargingsløsning i 30 min. Skyll gelen i destillert vann for å fjerne overflødig flekk. Gelen er klar for fotografering.
- Vestlig blotting
- Utfør elektroforese i samme prosedyre som beskrevet ovenfor.
MERK: Volumet av lipoproteiner lastet for den vestlige blottingen er mindre enn for CBB-farging beskrevet ovenfor (f.eks. 1–5 μL). - Plasser gel- og PVDF-membranen mellom overføringsbuffer-gjennomvåt filterpapir og formpute. Sett opp smørbrødet i en holderkassett og legg i en tank fylt med overføringsbuffer.
- Utfør elektroblotting ved 100 mA konstant strøm i 3 timer ved 4 °C.
- Blokkering: Inkuber membranen i blokkeringsbufferen i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C.
- Primær Ab-reaksjon: Inkuber membranene i primærabs fortynnet med blokkerende buffer i 1 time ved romtemperatur eller over natten ved 4 °C med mild risting.
MERK: Foreslått primær Ab-fortynning vises i materialtabellen. Tre typer primære Abs mot apolipoproteiner kan brukes enkeltvis eller i cocktailer. - Vask membranen tre ganger i vaskebuffer med agitasjon, 5 min per vask.
- Sekundær Ab reaksjon: Inkuber membranen i den sekundære Abs fortynnet med blokkerende buffer i 1 time ved romtemperatur med agitasjon.
MERK: Foreslått sekundær Ab-fortynning vises i materialtabellen. - Vask membranen tre ganger i vaskebuffer med agitasjon, 5 min per vask.
- ECL-deteksjon: Plasser membranen på en plastfolie. Tilsett ECL deteksjonsreagenser og inkuber i 1 min. Tøm overflødig væske og forsegle membranen i en pose.
- Visualiser signalene ved hjelp av en bildeanalysator.
- Utfør elektroforese i samme prosedyre som beskrevet ovenfor.
- SDS-SIDE og CBB farging
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av denne protokollen isolerte vi kaninlipoproteiner ved hjelp av 1 ml plasma og fikk syv tetthetsfraksjoner. Isolerte tetthetsfraksjoner er nok til å måle lipider og apolipoproteiner som beskrevet ovenfor for de fleste forskningsformål. Den samme prosedyren kan også brukes til å isolere plasma lipoproteiner fra mennesker og andre arter. For små dyr som mus er det nødvendig med samlet plasma. Figur 3 viser lipoprotein profiler av vill-type (WT) kaniner matet enten en normal standard (NS) diett eller høyt kolesterol (HC) diett. Kaniner er planteetere dyr så deres plasma TC, TG, og PL nivåer er generelt lavere enn mennesker og mus. I NS diett-matet kaniner, TC er hovedsakelig fordelt i HDL3 (d = 1,21 g / ml) og etterfulgt av LDL (d = 1,04 g / ml) (figur 3A). På en NS diett distribueres 39% av plasma TG i VLDLs, mens 57% av plasma PL finnes i HDL3 (figur 3A). Når kaniner ble utfordret med en diett supplert med høyt kolesterol, de utviklet seg raskt til hyperkolesterolemi. Som vist i figur 3Ber lipoproteinprofilene preget av markert høyde av VLDLs (165 ganger↑ i VLDL-TC, 1,5 ganger↑ i VLDL-TG og 30 ganger↑ i VLDL-PL sammenlignet med NS-matet kaniner). Fordi VLDLs isolert fra kolesterol-matet kaniner er rike på kolesteler og flytte til β posisjon på agarose gel elektroforese, de kalles ofte β-VLDLs å skille dem fra normale VLDLs som beveger seg til pre-β posisjon.
I tillegg til lipider kan apolipoproteiner bare analyseres av SDS-PAGE enten ved CBB-farging eller vestlig blotting (figur 4). Syv lipoproteinfraksjoner fra WT-kaniner matet enten en NS eller en HC diett ble kjørt på en 4-20% SDS-polyakrylamid gel og visualisert med CBB farging (figur 4A). På en HC diett, både apoB-100 og apoE innhold i VLDLs (d<1.006 g / ml), IDL (d = 1.02 g / ml), og LDLs (d = 1.04 g / ml) ble markert forhøyet sammenlignet med kaniner på en NS diett. Videre sammenlignet vi også apolipoprotein- og lipoproteinprofiler av tre forskjellige hyperlipidemiske kaniner: HC diettmatede WT-kaniner, apoE knockout (KO) kaniner og Watanabe arvelige hyperlipidemiske (WHHL) kaniner med LDL-reseptormangel ved vestlig blotting (figur 4B). Plasma lipoproteiner ble fraksjonert av 4-20% SDS-PAGE og etterfulgt av vestlig blotting med antistoffer mot apoE, apoB, og apoA-I. De apoB-inneholdende partiklene (VLDLs, IDLer og LDLs) av HC diett-matet WT kaniner er preget av økt apoB-100 og apoE innhold mens apoE KO kaniner viste markert økning av apoB-48 sammen med utseendet av apoA-I. WHHL kaniner er genetisk mangelfulle i LDL reseptorfunksjoner, så det er en markert økning av apoB-100 i LDLs ledsaget av redusert apoA-I i HDLs, som ligner på human familiær hyperkolesterolemi.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av sekvensiell flytende ultracentrifugation. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Representative bilder av plasma lipoprotein isolasjon. (A)Plasma av normolipidemiske og hyperlipidemiske kaniner. (B) Flytende topp VLDL (d<1.006 g/ml) og bunnfraksjon (d>1.006 g/ml) etter ultracentrifugation. (C) Tube kutting og innsamling av den øverste fraksjonen med en pipette. (D) Innsamling av den nederste brøken. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantisering av lipidinnhold i hver lipoproteinfraksjon isolert fra normale kaniner (A) og kolesterolmatede kaniner (B). Plasma lipoproteiner ble separert av sekvensiell flytende ultracentrifugation fra plasma av vill-type kaniner på enten en normal standard diett (A) eller et høyt kolesterol diett (B). Totalt kolesterol (TC), triglyserider (TG) og fosfolipider (PL) ble målt. Data uttrykkes som gjennomsnittet ± SEM (n=6). Dette tallet er endret fra Yan H et al.12. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av apolipoproteindistribusjon ved hjelp av CBB-farging (A) og vestlig blotting (B). Plasma ble isolert av ultracentrifugation og lipoproteiner ble fraksjonert med 4-20% SDS-PAGE. (A) Apolipoprotein profiler av vill-type (WT) kanin matet på en normal standard (NS) diett og et høyt kolesterol (HC) diett ble visualisert av CBB farging. Sammenlignet med NS diett-matet kaniner (venstre), HC diett-matet kaniner (høyre) viste økt apoB-100 og apoE innhold i VLDLs, IDLs, og LDLs. (B) Sammenligning av apolipoprotein funksjoner av WT kaniner på en NS eller en HC diett, apoE KO (knockout) kaniner på en HC diett, og WHHL kaniner på en NS diett. Western blotting ble utført med "cocktail antistoffer" mot apoE, apoB, og apoA-I. Sammenlignet med normolipidemiske kaniner (WT kaniner på en NS diett, første til venstre), andre tre hyperlipidemiske kaniner viser unike og forskjellige apolipoprotein profiler. De apoB-inneholdende partiklene (VLDLs, IDLer og LDLs) av HC-matet WT kaniner er preget av økt apoB-100 og apoE innhold mens apoE KO kaniner viste markert økning av apoB-48 sammen med utseendet av apoA-I. WHHL viste markert økning av apoB-100 i LDLs ledsaget av redusert apoA-I i HDLs. Dette tallet er endret fra Niimi M et al.10. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Tetthetsløsning (g/ml) | KBr (g) | Destillert vann (ml) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabell 1: Forberedelse til kaliumbromid (KBr) tetthetsløsninger. Vekten (g) av KBr legger til 1000 ml destillert vann vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperlipidemi er en av de viktigste risikofaktorene for aterosklerotisk sykdom. Dermed er analyse av plasma lipoproteiner ikke bare avgjørende for diagnostisering av dyslipidemipasienter, men også viktig for undersøkelse av molekylære mekanismer for lipoproteinmetabolisme og aterosklerose. I denne studien beskrev vi protokollen for isolasjon og analyse av plasmalipoproteiner som kan brukes i laboratoriene der ultracentrifugation er tilgjengelig. Informasjon innhentet av denne metoden er omfattende og grei derfor anbefales det for både kliniske og grunnleggende forskere. Isolerte lipoproteiner kan også brukes til å undersøke mange andre fasetter av lipoproteinfunksjoner som negativ flekkeelektronmikroskopi13,14, oksidasjonsevne9,15, proteomikk16, cellekultur basert in vitro-studie som kolesterol effluksanalyse9 og lipoproteinopptaksanalyse17.
Det bør påpekes; Det er imidlertid flere svake punkter som må tas hensyn. For det første er denne metoden relativt tidkrevende (tre dager minst) sammenlignet med andre metoder. Hvis du bruker den nyeste tabletop ultracentrifuge, høyhastighets spinn (150.000 rpm) kan forkorte separering tid 50-140 min for hver lipoprotein brøkdel18. For det andre kan prøvetap skje under isolasjonen. For å minimere prøvetap, bør det viskøs stupemiddelet i den nederste fraksjonen oppløses og samles forsiktig ved pipettering. Sentrifugerørene må festes tett med en slicer for å unngå å lekke av den øverste fraksjonen. I tillegg bør prøvene gjenopprettes forsiktig fra dialyseposer. Utvinningen kan beregnes ved å sammenligne det totale lipoproteinkolesterolet med det opprinnelige plasmakolesterolet. Ifølge vår erfaring vil generell utvinningsgrad være ≈ 80%19. For det tredje er denne protokollen begrenset for et lite antall prøver fordi en rotor bare kan kjøre tolv rør om gangen. For å utføre et stort antall prøver, kan det være egnet å bruke andre metoder som nedbør metode for HDL forberedelse4 og automatisert HPLC lipoprotein analyse20.
Oppsummert gir denne protokollen en veiledning for forskere å isolere plasma lipoproteiner ved hjelp av sekvensiell tetthet ultracentrifugation og analyse av lipider og apolipoproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble delvis støttet av et forskningstilskudd fra JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr. 81941001 og 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
