Summary
Der er anvendt flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation er dog stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. Her beskriver vi en metode til at isolere lipoproteiner fra plasma ved hjælp af sekventiel tæthed ultracentrifugering og hvordan man analyserer apolipoproteinerne til både diagnostiske og forskningsmæssige formål.
Abstract
Analyse af plasma lipoproteiner og apolipoproteiner er en væsentlig del for diagnosticering af dyslipidemi og undersøgelser af lipidmetabolisme og åreforkalkning. Selv om der er flere metoder til analyse af plasma lipoproteiner, ultracentrifugation er stadig en af de mest populære og pålidelige metoder. På grund af sin intakte separationsprocedure kan lipoproteinfraktionerne isoleret ved denne metode bruges til analyse af lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer og funktionel undersøgelse af lipoproteiner med dyrkede celler in vitro. Her leverer vi en detaljeret protokol til at isolere syv lipoproteinfraktioner, herunder VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDLs (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1,10 og 1,21 g/mL) fra kaninplasma ved hjælp af sekventiel flydende ultracentrifugering. Derudover introducerer vi læserne, hvordan man analyserer apolipoproteiner som apoA-I, apoB og apoE af SDS-PAGE og Western blotting og viser repræsentative resultater af lipoprotein- og apolipoproteinprofiler ved hjælp af hyperlipidemiske kaninmodeller. Denne metode kan blive en standardprotokol for både klinikere og grundlæggende forskere til at analysere lipoproteinfunktioner.
Introduction
Dyslipidemi er den største risikofaktor for aterosklerotisk sygdom i verden. Høje niveauer af lipoproteiner med lav densitet (LDL'er) og lave niveauer af lipoproteiner med høj densitet (HDLs) er tæt forbundet med en høj risiko for koronar hjertesygdom (CHD)1,2. I den kliniske indstilling måles både LDL-kolesterol (LDL-C) og HDL-kolesterol (HDL-C) rutinemæssigt ved hjælp af en automatiseret analysator i et klinisk laboratorium3,4. På trods af dette er det vigtigt at analysere lipoproteinprofiler i detaljer til diagnosticering af dyslipidemi og studiet af lipidmetabolisme og åreforkalkning hos mennesker og forsøgsdyr. Flere metoder er blevet rapporteret til at analysere plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugering, størrelse udelukkelse kromatografi [fast protein flydende kromatografi (FPLC) og højtydende flydende kromatografi (HPLC)], elektroforese af agarose og polyacrylamid geler, nukleare magnetiske resonans, og selektiv kemisk nedbør ved hjælp af polyanioner og divalent cations eller andre kemikalier. I 1950'erne foreslog Havels gruppe først begrebet lipoproteiner defineret ved tætheder ved hjælp af ultracentrifugering og klassificerede dem i chylomicrons (CM), lipoproteiner med meget lav densitet (VLDL), lipoproteiner med mellemdensitet (IDL), LDL og HDL5 og senere blev metoden yderligere ændret af andre grupper6,7. Indtil nu er ultracentrifugation den mest populære og pålidelige metode, mens den praktiske protokol stadig ikke er tilgængelig. I dette papir forsøgte vi at beskrive en brugervenlig protokol til isolering af en lille skala plasma ved hjælp af sekventiel tæthed flydende ultracentrifugering, der oprindeligt blev beskrevet tidligere8. Isolering af syv plasma lipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/mL), IDL (d=1,02 g/mL), LDL'er (d=1,04 og 1,06 g/mL), HDLs (d=1,08, 1.10, og 1.21 g/mL)] gør det muligt for forskere at foretage en omfattende analyse af både lipoproteiner og deres kompositoriske apolipoproteiner9,10,11. Den intakte syv på hinanden følgende tæthed lipoproteiner kan bruges til at analysere lipoprotein funktioner og også tjener til celle-baserede in vitro strategier. Denne protokol bør være nyttig for både klinisk diagnose og grundforskning. Her brugte vi kaninplasma som et eksempel til at demonstrere denne teknik, mens plasma fra andre arter kan anvendes på samme måde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer for kaninundersøgelser blev udført med godkendelse fra University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkendt nummer: A28-39).
1. Plasmaadskillelse fra kaninblod
- Der fremstilles 1,5 mL mikrorør indeholdende 15 μL på 0,5 M EDTA (pH 8.0) til blodopsamling.
- Sæt en kanin i en restrainer og punktere en auricular mellemliggende arterie ved hjælp af en 22 gauge nål og indsamle blod i et rør. Bland blodet med EDTA forsigtigt og læg dem på is.
- Blodrørene centrifuges ved 1.500 x g i 20 minutter ved 4 °C og plasma opsamles på et nyt mikrorør.
BEMÆRK: 3 mL blod er nok til opsamling af 1 mL plasma. Hvis du samler blod fra mus eller andre små dyr, skal du samle dem.
2. Isolering af plasma lipoproteiner
BEMÆRK: Den skematiske procedure er vist i figur 1. Præparatmetoden til tæthed af kaliumbromid (KBr) er vist i tabel 1.
- Der overføres 1 mL plasma til et ultracentrifugerør af polycarbonat (figur 2A).
- Disse rør belastes i en fast vinkelrotor, og plasmaet centrifuges ved 356.000 x g for 2,5 h ved 4 °C (figur 2B).
BEMÆRK: For Beckman TLA 120,2 rotor svarer 356.000 x g (gennemsnitligt relativt centrifugalfelt, Av RCF) til 100.000 omdrejninger i minuttet. - Rørene skæres ved hjælp af et udsnitsværktøj, og derefter opsamles den øverste fraktion [VLDL (d<1,006 g/mL)], ca. 200 μL i et nyt mikrorør (Figur 2C). Den resterende bundfraktion opsamles i et nyt ultracentrifugerør af polycarbonat til næste adskillelse (Figur 2D). Volumen måles, og det samlede volumen øges til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,006 g/mL).
BEMÆRK: Sæt en kniv op til rørskæreren. Bladets position justeres i et niveau mellem den øverste fraktion (200 μL) og den nederste fraktion (800 μL). Den tyktflydende afgrundsvæske i den nederste fraktion skal opsamles omhyggeligt og fuldstændigt ved pipetter i alle følgende trin. Hvis pausen er sat på pause, skal du gøre det, når du har adskilt den øverste og nederste brøk i alle trin. Prøven opbevares ved 4°C indtil næste centrifugering. - Den nederste fraktion (i alt 800 μL) justeres til d=1,02 g/mL ved at tilsætte 58,9 μL d=1,21 g/mL opløsning og 141,1 μL d=1,02 g/mL opløsning (det samlede volumen er 1 ml).
- Disse rør belastes i rotor med fast vinkel og centrifuge ved 356.000 x g i 2,5 timer ved 4 °C.
- Rørene skæres ved hjælp af en udsnit og derefter opsamles den øverste fraktion [IDL (d=1,02 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse. Volumen måles, og det samlede volumen øges til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,02 g/mL).
- Den nederste fraktion (i alt 800 μL) justeres til d=1,04 g/mL ved at tilsætte 94,1 μL d=1,21 g/mL opløsning og 105,9 μL d=1,04 g/mL opløsning (det samlede volumen er 1 ml).
- Disse rør belastes i en fast vinkelrotor og centrifuge ved 356.000 x g i 2,5 timer ved 4 °C.
- Rørene skæres ved hjælp af en udsnit og derefter opsamles den øverste fraktion [LDL (d=1,04 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse. Volumen måles, og det samlede antal måles til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,04 g/mL).
- Den nederste fraktion (i alt 800 μL) justeres til d=1,06 g/mL ved at tilsætte 106,7 μL d=1,21 g/mL opløsning og 93,3 μL d=1,06 g/mL opløsning (det samlede volumen er 1 ml).
- Disse rør belastes i en fast vinkelrotor og centrifuge ved 356.000 x g i 2,5 timer ved 4 °C.
- Rørene skæres ved hjælp af en udskærer, og derefter samles den øverste fraktion [LDL (d=1,06 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse. Volumen måles, og det samlede antal måles til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,06 g/mL).
- Den nederste fraktion (i alt 800 μL) justeres til d=1,08 g/mL ved at tilsætte 123,1 μL d=1,21 g/mL opløsning og 76,9 μL d=1,08 g/mL opløsning (det samlede volumen er 1 ml).
- Disse rør belastes i en fast vinkelrotor og centrifuge ved 356.000 x g i 2,5 timer ved 4 °C.
- Rørene skæres ved hjælp af en skiveskærer, og derefter samles den øverste fraktion [HDL2 (d=1,08 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse. Volumen måles, og det samlede antal måles til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,08 g/mL).
- Bundfraktionen (i alt 800 μL) justeres til d=1,10 g/mL ved at tilsætte 145,5 μL d=1,21 g/mL opløsning og 54,5 μL d=1,10 g/mL opløsning (det samlede volumen er 1 ml).
- Disse rør belastes i en fast vinkelrotor og centrifuge ved 356.000 x g i 2,5 timer ved 4 °C.
- Rørene skæres ved hjælp af en udskærer, og derefter samles den øverste fraktion [HDL2 (d=1,10 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Saml den resterende bundfraktion i et nyt polycarbonat ultracentrifugerør til næste adskillelse. Volumen måles, og det samlede antal måles til 800 μL ved at tilsætte den samme massefyldeopløsning (d=1,10 g/mL).
- Bundfraktionen (i alt 800 μL) justeres til d=1,21 g/mL ved at tilsætte 0,140 g kaliumbromidpulver (KBr) og opløse det fuldstændigt. Mål volumen og gøre dem til 1 ml ved at tilføje d = 1,21 g / mL løsning.
- Disse rør belastes i rotor med fast vinkel og centrifuge ved 513.000 x g i 4 timer ved 4 °C.
BEMÆRK: For Beckman TLA 120,2 rotor svarer 513.000 x g (Av RCF) til 120.000 omdrejninger i minuttet. - Rørene skæres ved hjælp af en udsnit og derefter opsamles den øverste fraktion [HDL3 (d=1,21 g/mL)] ca. 200 μL i et nyt mikrorør. Dette er det sidste skridt til ultracentrifugering.
3. Dialyse
BEMÆRK: Da massefyldefraktionerne (undtagen d<1,006 g/mL-fraktionen) indeholder høje koncentrationer af KBr, er det nødvendigt at fjerne dem ved dialyse.
- Overfør massefyldefraktionerne til en dialyserør, og klip begge ender med lukninger.
- Dialyze mod 2 L dialysebuffer som PBS/ 1 mM EDTA i 6 timer ved 4 °C med omrøring ved hjælp af en magnetisk omrører.
- Udskift med ny buffer og dialyze igen i yderligere 6 timer ved 4 °C.
- Saml massefyldefraktionerne, og mål lydstyrken. Alle massefyldefraktioner justeres til samme volumen (f.eks. 250 μL).
BEMÆRK: Du kan beregne den koncentrerede faktor ud fra 1 mL originalt plasma (f.eks. svarer 250 μL massefyldefraktion til fire gange koncentration).
4. Analyse af lipoproteiner
BEMÆRK: Efter dialyse er disse lipoproteiner klar til forskellige analyser. Lipoproteiner kan evalueres ved at måle enten lipider eller apolipoproteiner eller begge dele. Til måling af lipidindhold som total kolesterol (TC), triglycerider (TG), fosfolipider (PL) og frit kolesterol (FC) i hver fraktion bruger vi kommercielle enzymatiske kolorometriske assay kits. Til analyse af apolipoproteiner bruger vi SDS-PAGE visualiseret med CBB-farvning eller vestlig blotting.
- Lipid analyse
BEMÆRK: Lipider som TC, TG, PL og FC i lipoproteinfraktionen kan måles ved hjælp af kommercielt tilgængelige målesæt. Procedurerne afhænger af de anvendte reagenser, så følg instruktionerne i hvert sæt, der anvendes. Her viser vi en typisk mikroplade assay ved hjælp af en kommerciel enzymatisk analyse kit.- Påfør 8 μL lipoproteinprøve og standardkalibreringsstof på 96-brønds mikroplade.
- Der tilsættes 240 μL assayreagens og blandes ved pipettering.
- Inkuber ved 37 °C i 10 min.
- Mål OD med en mikropladelæser og beregn lipidkoncentrationer.
- Apolipoprotein analyse
- SDS-PAGE og CBB farvning
- Prøveforberedelse: Der tilsættes 10 μL 2x prøvebuffer til 10 μL lipoproteinfraktion. Blandingen opvarmes ved 80 °C i 5 minutter ved hjælp af en tør varmeblok.
- Forbered 4-20% gradient SDS-polyacrylamid gel og opsæt gelen på elektroforesekammeret fyldt med løbebuffer.
- Belastnings lipoproteinprøve (10 μL/lane) og proteinstandarder (5 μL/lane) på stablingsgelen.
BEMÆRK: Hvis prøverne er to gange koncentrerede, analyseres en tilsvarende mængde på 20 μL plasma pr. vognbane.] - Kør elektroforese ved 20-40 mA konstant strøm.
- CBB farvning: Blødgør gelen to gange i fastgørelsesopløsning med blid rysten i 10 minutter. Farv gelen med CBB farvningsopløsning i 30 min. Skyl gelen i destilleret vand for at fjerne den overskydende plet. Gelen er klar til at blive fotograferet.
- Vestlig blotting
- Udfør elektroforese i samme procedure som beskrevet ovenfor.
BEMÆRK: Mængden af lipoproteiner, der er lastet til vestlig blotting, er mindre end for CBB-farvning som beskrevet ovenfor (f.eks. 1-5 μL). - Placer gel og PVDF membran mellem overførsel buffer-gennemblødt filterpapir og form pad. Sæt sandwichen op i en holderkassette og læg den i en tank fyldt med overførselsbuffer.
- Elektroblotting udføres ved 100 mA konstant strøm i 3 timer ved 4 °C.
- Blokering: Inkuber membranen i blokeringsbuffer i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C.
- Primær Ab-reaktion: Inkuber membranerne i de primære abs fortyndet med blokeringsbuffer i 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 °C med mild omrystning.
BEMÆRK: Foreslået primær Ab fortynding er vist i tabellen over materialer. Tre slags primære Abs mod apolipoproteiner kan bruges alene eller i cocktails. - Vask membranen tre gange i vaskebuffer med omrøring, 5 min pr. Vask.
- Sekundær Ab reaktion: Inkuber membranen i den sekundære Abs fortyndet med blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur med omrøring.
BEMÆRK: Foreslået sekundær Ab fortynding er vist i tabellen over materialer. - Vask membranen tre gange i vaskebuffer med omrøring, 5 min pr. Vask.
- ECL-detektion: Placer membranen på en plastfolie. Der tilsættes REAGEnser til ECL-detektion, og der inkuberes i 1 min. Hæld vandet fra overskydende væske og forsegle membranen i en pose.
- Visualiser signalerne ved hjælp af en billedanalysator.
- Udfør elektroforese i samme procedure som beskrevet ovenfor.
- SDS-PAGE og CBB farvning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol isolerede vi kanin lipoproteiner ved hjælp af 1 mL plasma og opnåede syv tæthedsfraktioner. Isolerede tæthedsfraktioner er nok til at måle lipider og apolipoproteiner som beskrevet ovenfor til de fleste forskningsformål. Den samme procedure kan også anvendes til isolering af plasma lipoproteiner fra mennesker og andre arter. For små dyr som mus kræves samlet plasma. Figur 3 viser lipoproteinprofiler af vildtypekaniner fodret med enten en normal standard (NS) kost eller højt kolesteroltal (HC) kost. Kaniner er planteædende dyr, så deres plasma TC, TG, og PL niveauer er generelt lavere end mennesker og mus. Hos NS-kaniner, der fodres med kost, distribueres TC hovedsageligt i HDL3 (d=1,21 g/mL) efterfulgt af LDL (d=1,04 g/mL)(figur 3A). På en NS-diæt distribueres 39% af plasma-TG i VLDLs, mens 57% af plasma-PL er indeholdt i HDL3 (Figur 3A). Når kaniner blev udfordret med en kost suppleret med højt kolesteroltal, udviklede de sig hurtigt til hypercholesterolmi. Som vist i figur 3Ber lipoproteinprofilerne karakteriseret ved en markant højde af VLDLs (165 gange↑ i VLDL-TC, 1,5 gange↑ i VLDL-TG og 30 gange↑ i VLDL-PL sammenlignet med NS-fodrede kaniner). Fordi VLDLs isoleret fra kolesterol-fodret kaniner er rige på cholesteryl estere og flytte til β position på agarose gel elektrophoresis, er de ofte kaldes β-VLDLs at skelne dem fra normale VLDLs, der flytter til pre-β position.
Ud over lipider kan apolipoproteiner simpelthen analyseres af SDS-PAGE enten ved CBB-farvning eller vestlig blotting (Figur 4). Syv lipoproteinfraktioner fra WT kaniner fodret med enten en NS eller en HC kost blev kørt på en 4-20% SDS-polyacrylamid gel og visualiseret med CBB farvning (Figur 4A). På en HC-diæt blev både apoB-100 og apoE-indhold i VLDLs (d<1.006 g/mL), IDLs (d=1,02 g/mL) og LDLs (d=1,04 g/mL) markant forhøjet sammenlignet med kaniner på en NS-diæt. Desuden sammenlignede vi også apolipoprotein- og lipoproteinprofiler af tre forskellige hyperlipidemiske kaniner: HC-diætfodrede WT-kaniner, apoE knockout (KO) kaniner og Watanabe arvelige hyperlipidemic (WHHL) kaniner med LDL-receptormangel ved vestlig blotting (Figur 4B). Plasma lipoproteiner blev fraktioneret med 4-20% SDS-PAGE og efterfulgt af vestlige blotting med antistoffer mod apoE, apoB, og apoA-I. De apoB-holdige partikler (VLDLs, IDLs og LDLs) af HC kost-fodret WT kaniner er kendetegnet ved øget apoB-100 og apoE indhold mens apoE KO kaniner viste markant stigning i apoB-48 sammen med fremkomsten af apoA-I. WHHL kaniner er genetisk mangelfulde i LDL-receptorfunktioner, så der er en markant stigning i apoB-100 i LDLs ledsaget af reduceret apoA-I i HDLs, hvilket svarer til human familiær hypercholesterolmi.
Figur 1: Skematisk illustration af sekventiel flydende ultracentrifugering. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af plasma lipoproteinisolation. (A)Plasma af normolipidemic og hyperlipidemic kaniner. (B) Flød øverste VLDL (d<1,006 g/mL) og bundfraktion (d>1,006 g/mL) efter ultracentrifugering. (C)Rørudslutning og opsamling af den øverste fraktion af en pipette. (D) Indsamling af den nederste fraktion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Kvantitation af lipidindhold i hver lipoproteinfraktion isoleret fra normale kaniner (A) og kolesterolfodrede kaniner (B). Plasma lipoproteiner blev adskilt af sekventiel flydende ultracentrifugering fra plasma af vildtlevende kaniner på enten en normal standardkost (A) eller en diæt med højt kolesteroltal (B). Total kolesterol (TC), triglycerider (TG) og fosfolipider (PL) blev målt. Data udtrykkes som middelværdi ± SEM (n=6). Dette tal er blevet ændret fra Yan H et al.12. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Sammenligning af apolipoproteindistribution ved hjælp af CBB-farvning (A) og vestlig blotting (B). Plasma blev isoleret af ultracentrifugering og lipoproteiner blev fraktioneret med 4-20% SDS-PAGE. (A) Apolipoproteinprofiler af vild-type (WT) kanin fodret med en normal standard (NS) kost og en højt kolesteroltal (HC) kost blev visualiseret af CBB farvning. Sammenlignet med NS kost-fodret kaniner (venstre), HC kost-fodret kaniner (højre) viste øget apoB-100 og apE indhold i VLDLs, IDLs, og LDLs. (B) Sammenligning af apolipoprotein funktioner WT kaniner på en NS eller en HC kost, apoE KO (knockout) kaniner på en HC kost, og WHHL kaniner på en NS kost. Vestlige blotting blev udført med "cocktail antistoffer" mod apoE, apoB, og apoA-I. Sammenlignet med normolipidemic kaniner (WT kaniner på en NS kost, første venstre), andre tre hyperlipidemic kaniner udviser unikke og forskellige apolipoprotein profiler. De apoB-holdige partikler (VLDLs, IDLs og LDLs) af HC-fodrede WT kaniner er kendetegnet ved øget apoB-100 og apoE indhold mens apoE KO kaniner viste markant stigning i apoB-48 sammen med udseendet af apoA-I. WHHL udviste en markant stigning i apoB-100 i LDL'er ledsaget af reduceret apoA-I i HDLs. Dette tal er blevet ændret fra Niimi M et al.10. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Tæthedsopløsning (g/mL) | KBr (g) | Destilleret vand (mL) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabel 1: Forberedelse af opløsninger af kaliumbromid (KBr ). Vægten (g) af KBr tilsættes til 1000 mL destilleret vand er vist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperlipidemi er en af de vigtigste risikofaktorer for aterosklerotisk sygdom. Således er analyse af plasma lipoproteiner ikke kun afgørende for diagnosticering af dyslipidemipatienter, men også vigtig for undersøgelse af molekylære mekanismer af lipoproteinmetabolisme og åreforkalkning. I denne undersøgelse beskrev vi protokollen for isolering og analyse af plasma lipoproteiner, som kan anvendes i de laboratorier, hvor ultracentrifugering er tilgængelig. Oplysninger indhentet ved denne metode er omfattende og ligetil, derfor anbefales det til både kliniske og grundlæggende forskere. Isolerede lipoproteiner kan også bruges til at undersøge mange andre facetter af lipoprotein funktioner såsom negativ-plet elektron mikroskopi13,14, oxiderbarhed9,15, proteomics16, cellekultur baseret in vitro undersøgelse såsom kolesterol efflux assay9 og lipoprotein optagelse assay17.
Det skal påpeges. Der er dog flere svage punkter, der skal tages i betragtning. For det første er denne metode relativt tidskrævende (mindst tre dage) sammenlignet med andre metoder. Hvis du bruger den nyeste bordplade ultracentrifuge, high-speed spin (150.000 omdrejninger i minuttet) kan forkorte adskillelse tid 50-140 min for hver lipoprotein fraktion18. For det andet kan der opstå tab af prøver under isoleringen. For at minimere prøvetabet skal det tyktflydende afgrundsstof i den nederste fraktion opløses og opsamles omhyggeligt ved pipettering. Centrifugerørene skal fastgøres tæt med en skiveskærer for at undgå lækage af den øverste fraktion. Derudover skal prøverne genvindes omhyggeligt fra dialyseposer. Opsvinget kan beregnes ved at sammenligne det samlede lipoprotein kolesterol med det oprindelige plasma kolesterol. Ifølge vores erfaring vil den generelle inddrivelsesrate være ≈ 80%19. For det tredje er denne protokol begrænset til et lille antal prøver, fordi en rotor kun kan køre tolv rør ad gangen. For at udføre et stort antal prøver kan det være egnet til at bruge andre metoder såsom nedbørsmetode til HDL-forberedelse4 og automatiseret HPLC lipoproteinanalyse20.
Sammenfattende giver denne protokol en guide til forskere til at isolere plasma lipoproteiner ved hjælp af sekventiel tæthed ultracentrifugering og analyse af lipider og apolipoproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af et forskningstilskud fra JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr. 81941001 og 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
