Summary
Flera metoder har använts för att analysera plasma lipoproteiner; Ultracentrifugation är dock fortfarande en av de mest populära och pålitliga metoderna. Här beskriver vi en metod för hur man isolerar lipoproteiner från plasma med hjälp av sekventiell densitet ultracentrifugation och hur man analyserar apolipoproteinerna för både diagnostiska och forskningsändamål.
Abstract
Analys av plasma lipoproteiner och apolipoproteiner är en viktig del för diagnos av dyslipidemi och studier av lipid metabolism och åderförkalkning. Även om det finns flera metoder för att analysera plasma lipoproteiner, är ultracentrifugation fortfarande en av de mest populära och tillförlitliga metoderna. På grund av dess intakta separation förfarande, lipoprotein fraktioner isolerade med denna metod kan användas för analys av lipoproteiner, apolipoproteiner, proteomer och funktionell studie av lipoproteiner med odlade celler in vitro. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att isolera sju lipoproteinfraktioner inklusive VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDLs (d=1.04 och 1.06 g/mL), HDLs (d=1.08, 1,10 och 1,21 g/ml) från kaninplasma med sekventiell flytande ultracentrifugering. Dessutom introducerar vi läsarna hur man analyserar apolipoproteiner som apoA-I, apoB och apoE av SDS-PAGE och Western blotting och visar representativa resultat av lipoprotein- och apolipoproteinprofiler med hyperlipidemic kaninmodeller. Denna metod kan bli ett standardprotokoll för både kliniker och grundläggande forskare för att analysera lipoproteinfunktioner.
Introduction
Dyslipidemi är den största riskfaktorn för åderförd sjukdom i världen. Höga nivåer av lipoproteiner med låg densitet (LDLs) och låga nivåer av lipoproteiner med hög densitet (HDLs) är nära förknippade med en hög risk för kranskärlssjukdom (CHD)1,2. I den kliniska inställningen mäts både LDL-kolesterol (LDL-C) och HDL-kolesterol (HDL-C) rutinmässigt med hjälp av en automatiserad analysator i ett klinisktlaboratorium 3,4. Trots detta är det viktigt att analysera lipoproteinprofiler i detaljer för diagnos av dyslipidemi och studie av lipidmetabolism och åderförkalkning hos mänskliga och experimentella djur. Flera metoder har rapporterats för att analysera plasma lipoproteiner såsom ultracentrifugation, storlek uteslutning kromatografi [snabb protein flytande kromatografi (FPLC) och högpresterande flytande kromatografi (HPLC)], elektrofores av agarose och polyacrylamid geler, kärnmagnetisk resonans och selektiv kemisk nederbörd med hjälp av polyanioner och divalent cations eller andra kemikalier. På 1950-talet föreslog Havels grupp först begreppet lipoproteiner definierade av densiteter med ultracentrifugation och klassificerade dem i chylomicroner (CM), lipoproteiner med mycket låg densitet (VLDL), lipoproteiner med medelhög densitet (IDL), LDL och HDL5 och senare ändrades metoden ytterligare av andra grupper6,7. Hittills är ultracentrifugation den mest populära och pålitliga metoden medan det praktiska protokollet fortfarande inte är tillgängligt. I detta dokument försökte vi beskriva ett lättanmåt anförande protokoll för att isolera en liten skala av plasma med sekventiell densitet flytande ultracentrifugation ursprungligen beskrivs tidigare8. Isolering av sju plasmalipoproteinfraktioner [VLDL (d<1,006 g/ml), IDL (d=1,02 g/ml), LDLs (d=1,04 och 1,06 g/ml), HDLs (d=1,08, 1,10 och 1,21 g/ml)] gör det möjligt för forskare att göra en omfattande analys av både lipoproteiner och deras kompositionella apolipoproteiner9,10,11. De intakta sju på varandra följande densitet lipoproteiner kan användas för att analysera lipoprotein funktioner och även tjäna till cellbaserade in vitro strategier. Detta protokoll bör vara användbart för både klinisk diagnos och grundforskning. Här använde vi kaninplasma som exempel för att demonstrera denna teknik medan plasma från andra arter kan appliceras på samma sätt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer för kaninstudier utfördes med godkännande av University of Yamanashi Institutional Animal Care and Use Committee (Godkänt nummer: A28-39).
1. Plasmaseparation från kaninblod
- Förbered 1,5 ml mikrorör innehållande 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) för blodinsamling.
- Sätt en kanin i en fasthållningshållare och punktera en auricular mellanliggande artär med en 22 gauge nål och samla blod i ett rör. Blanda blodet försiktigt med EDTA och lägg dem på is.
- Centrifugera blodrören vid 1 500 x g i 20 min vid 4 °C och samla in plasma i ett nytt mikrorör.
OBS: 3 ml blod räcker för att samla in 1 ml plasma. Om du samlar blod från möss eller andra små djur måste du poola dem.
2. Isolering av plasmalipoproteiner
OBS: Det schematiska förfarandet visas i figur 1. Beredningsmetoden för lösningar för kaliumbromid (KBr) densitet visas i tabell 1.
- Överför 1 ml plasma till ett ultracentrifugrör av polykarbonat (figur 2A).
- Ladda dessa rör i en fast vinkelrotor och centrifugera plasman vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C (figur 2B).
OBS: För Beckman TLA 120,2 rotor motsvarar 356 000 x g (genomsnittligt relativt centrifugalfält, Av RCF) 100 000 varv/min. - Skär rören med en utsnitt och samla sedan den översta fraktionen [VLDL (d<1,006 g/ml)], cirka 200 μL till ett nytt mikrorör (Figur 2C). Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation (Figur 2D). Mät volymen och gör den totala volymen till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,006 g/ml).
OBS: Sätt upp ett blad på rörhyveln. Justera bladets position på en nivå mellan den övre fraktionen (200 μL) och den nedre fraktionen (800 μL). Den viskösa utfällningen i den nedre fraktionen ska samlas försiktigt och helt genom pipetting i alla följande steg. Om du pausar gör du det efter att ha separerat den övre och nedre fraktionen i alla steg. Förvara provet vid 4°C tills nästa centrifugation. - Justera den nedre fraktionen (totalt 800 μL) till d=1,02 g/ml genom att tillsätta 58,9 μL d=1,21 g/ml lösning och 141,1 μL d=1,02 g/ml lösning (den totala volymen är 1 ml).
- Lasta dessa rör i fast vinkelrotor och centrifugera vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C.
- Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [IDL (d=1,02 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation. Mät volymen och gör den totala volymen till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,02 g/ml).
- Justera den nedre fraktionen (totalt 800 μL) till d=1,04 g/ml genom att tillsätta 94,1 μL d=1,21 g/ml lösning och 105,9 μL d=1,04 g/ml lösning (den totala volymen är 1 ml).
- Ladda dessa rör i en fast vinkelrotor och centrifugera vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C.
- Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [LDL (d=1,04 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation. Mät volymen och gör summan till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,04 g/ml).
- Justera den nedre fraktionen (totalt 800 μL) till d=1,06 g/ml genom att tillsätta 106,7 μL d=1,21 g/ml lösning och 93,3 μL d=1,06 g/ml lösning (den totala volymen är 1 ml).
- Ladda dessa rör i en fast vinkelrotor och centrifugera vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C.
- Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [LDL (d=1,06 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation. Mät volymen och gör summan till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,06 g/ml).
- Justera den nedre fraktionen (totalt 800 μL) till d=1,08 g/ml genom att tillsätta 123,1 μL d=1,21 g/ml lösning och 76,9 μL d=1,08 g/ml lösning (den totala volymen är 1 ml).
- Ladda dessa rör i en fast vinkelrotor och centrifugera vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C.
- Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [HDL2 (d=1,08 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation. Mät volymen och gör summan till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,08 g/ml).
- Justera bottenfraktionen (totalt 800 μL) till d=1,10 g/ml genom att tillsätta 145,5 μL d=1,21 g/ml-lösning och 54,5 μL d=1,10 g/ml-lösning (den totala volymen är 1 ml).
- Ladda dessa rör i en fast vinkelrotor och centrifugera vid 356 000 x g i 2,5 timmar vid 4 °C.
- Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [HDL2 (d=1,10 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Samla den återstående bottenfraktionen i ett nytt polykarbonat ultracentrifugerör för nästa separation. Mät volymen och gör summan till 800 μL genom att tillsätta samma densitetslösning (d=1,10 g/ml).
- Justera bottenfraktionen (totalt 800 μL) till d=1,21 g/ml genom att tillsätta 0,140 g kaliumbromidpulver (KBr) och lös upp det helt. Mät volymen och gör dem till 1 ml genom att tillsätta d=1,21 g/ml lösning.
- Ladda dessa rör i fast vinkelrotor och centrifugera vid 513 000 x g i 4 timmar vid 4 °C.
OBS: För Beckman TLA 120,2 rotor motsvarar 513 000 x g (Av RCF) 120 000 varv/min. - Skär rören med en utsnitt och samla sedan den övre fraktionen [HDL3 (d=1,21 g/mL)] cirka 200 μL i ett nytt mikrorör. Detta är det sista steget för ultracentrifugation.
3. Dialys
OBS: Eftersom densitetsfraktionerna (utom d<1,006 g/ml-fraktionen) innehåller höga koncentrationer av KBr, är det nödvändigt att ta bort dem genom dialys.
- Överför densitetsfraktionerna till ett dialysrör och kläm båda ändarna med förslutningar.
- Dialysera mot 2 L dialysbuffert såsom PBS/ 1 mM EDTA i 6 timmar vid 4 °C med omrörning med hjälp av en magnetomrörare.
- Byt ut mot ny buffert och dialys igen i ytterligare 6 timmar vid 4 °C.
- Samla in densitetsfraktionerna och mät volymen. Justera alla densitetsfraktioner till samma volym (t.ex. 250 μL).
OBS: Du kan beräkna den koncentrerade faktorn från 1 ml originalplasma (t.ex. motsvarar 250 μL densitetsfraktion fyra gånger koncentrationen).
4. Analys av lipoproteiner
OBS: Efter dialys är dessa lipoproteiner redo för olika analyser. Lipoproteiner kan utvärderas genom att mäta antingen lipider eller apolipoproteiner eller båda. För att mäta lipidinnehåll som totalt kolesterol (TC), triglycerider (TG), fosfolipider (PL) och fritt kolesterol (FC) i varje fraktion använder vi kommersiella enzymatiska kolorimetriska analyssatser. För analys av apolipoproteiner använder vi SDS-PAGE visualiserat med CBB-färgning eller västerländsk blotting.
- Lipidanalys
OBS: Lipider som TC, TG, PL och FC i lipoproteinfraktionen kan mätas med hjälp av kommersiellt tillgängliga mätsatser. Procedurerna beror på de reagenser som används, så följ instruktionerna för varje sats som används. Här visar vi en typisk mikroplåtsanalys med hjälp av ett kommersiellt enzymatiskt analyskit.- Applicera 8 μL lipoproteinprov och standardkalibreringsämne på 96-brunnsmikroplatta.
- Tillsätt 240 μL analysreagens och blanda genom pipetting.
- Inkubera vid 37 °C i 10 min.
- Mät OD med en mikroplatta läsare och beräkna lipid koncentrationer.
- Apolipoprotein analys
- SDS-PAGE och CBB färgning
- Provberedning: Tillsätt 10 μL 2x provbuffert till 10 μL lipoproteinfraktion. Värm blandningen vid 80 °C i 5 minuter med ett torrt värmeblock.
- Förbered 4-20% gradient SDS-polyakrylamidgel och sätt upp gelén på elektroforeskammaren fylld med löpbuffert.
- Ladda lipoproteinprovet (10 μL/lane) och proteinstandarderna (5 μL/ lane) på staplingsgelen.
OBS: Om proverna är två gånger koncentrerade kommer en motsvarande mängd på 20 μL plasma att analyseras per körfält.] - Kör elektrofores vid 20-40 mA konstant ström.
- CBB-färgning: Blötlägg gelén två gånger i fixeringslösning med skonsam skakning i 10 min. Färga gelén med CBB färglösning i 30 min. Skölj gelén i destillerat vatten för att ta bort överskottsfläcken. Gelén är klar för fotografering.
- Västra blotting
- Utför elektrofores i samma procedur som beskrivits ovan.
OBS: Volymen lipoproteiner som laddas för den västerländska blottningen är mindre än för CBB-färgning som beskrivs ovan (t.ex. 1–5 μL). - Placera gel- och PVDF-membranet mellan överföringsbuffertindränkt filterpapper och formdyna. Ställ upp smörgåsen i en hållare kassett och placera i en tank fylld med överföringsbuffert.
- Utför elektroblottning vid 100 mA konstant ström i 3 timmar vid 4 °C.
- Blockering: Inkubera membranet i blockerande buffert i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C.
- Primär Ab-reaktion: Inkubera membranen i primär abs utspädda med blockeringsbuffert i 1 timme vid rumstemperatur eller över natten vid 4 °C med mild skakning.
OBS: Föreslagen primär ab utspädning visas i materialförteckningen. Tre typer av primära Abs mot apolipoproteiner kan användas alls eller i cocktails. - Tvätta membranet tre gånger i tvättbuffert med omrörning, 5 min per tvätt.
- Sekundär Ab-reaktion: Inkubera membranet i sekundära Abs utspädda med blockeringsbuffert i 1 timme vid rumstemperatur med omrörning.
OBS: Föreslagen sekundär Ab utspädning visas i materialförteckningen. - Tvätta membranet tre gånger i tvättbuffert med omrörning, 5 min per tvätt.
- ECL-detektering: Placera membranet på en plastfolie. Tillsätt ECL-detekteringsreagenser och inkubera i 1 minut. Töm överflödig vätska och försegla membranet i en påse.
- Visualisera signalerna med hjälp av en bildanalysator.
- Utför elektrofores i samma procedur som beskrivits ovan.
- SDS-PAGE och CBB färgning
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av detta protokoll isolerade vi kanin lipoproteiner med 1 ml plasma och erhöll sju densitet fraktioner. Isolerade densitetsfraktioner är tillräckliga för att mäta lipider och apolipoproteiner enligt beskrivningen ovan för de flesta forskningsändamål. Samma förfarande kan också användas för att isolera plasmalipoproteiner från människor och andra arter. För små djur som möss krävs poolad plasma. Figur 3 visar lipoproteinprofiler av vilda (WT) kaniner som matas antingen en normal standarddiet (NS) eller hög kolesteroldiet (HC). Kaniner är växtätande djur så deras plasma TC, TG och PL nivåer är i allmänhet lägre än människor och möss. Hos NS dietmatade kaniner distribueras TC huvudsakligen i HDL3 (d=1,21 g/ml) och följs av LDL (d=1,04 g/ml) (Figur 3A). På en NS-diet distribueras 39% av plasma TG i VLDLs medan 57% av plasma PL ingår i HDL3 (Figur 3A). När kaniner utmanades med en diet kompletterad med högt kolesterol utvecklades de snabbt till hyperkolesterolemi. Som visas i figur 3Bkännetecknas lipoproteinprofilerna av markant höjning av VLDLs (165-faldig↑ i VLDL-TC, 1,5-faldigt↑ i VLDL-TG och 30-faldigt↑ i VLDL-PL jämfört med NS-matade kaniner). Eftersom VLDLs isolerade från kolesterolmatade kaniner är rika på kolesterylestrar och flyttar till β-positionen på agarose gelelektrofores, kallas de ofta β-VLDLs för att skilja dem från normala VLDLs som flyttar till β position.
Förutom lipider kan apolipoproteiner helt enkelt analyseras av SDS-PAGE antingen genom CBB-färgning eller western blotting (Figur 4). Sju lipoproteinfraktioner från WT-kaniner som utfodrades antingen med NS eller en HC-diet gick på en 4-20% SDS-polyakrylamidgel och visualiserades med CBB-färgning (Figur 4A). På en HC-diet höjdes både apoB-100 och apoE innehåll i VLDLs (d<1.006 g/mL), IDLs (d=1,02 g/mL) och LDLs (d=1,04 g/mL) markant jämfört med kaniner på en NS-diet. Dessutom jämförde vi apolipoprotein och lipoproteinprofiler av tre olika hyperlipidemic kaniner: HC diet-fed WT kaniner, apoE knockout (KO) kaniner och Watanabe ärftliga hyperlipidemic (WHHL) kaniner med LDL receptorbrist av western blotting (Figur 4B). Plasma lipoproteiner fraktionerades av 4-20% SDS-PAGE och följt av western blotting med antikroppar mot apoE, apoB och apoA-I. ApoB-innehållande partiklar (VLDLs, IDLs och LDLs) av HC diet-fed WT kaniner kännetecknas av ökad apoB-100 och apoE innehåll medan apoE KO kaniner visade markant ökning av apoB-48 tillsammans med utseendet på apoA-I. WHHL kaniner är genetiskt bristfälliga i LDL receptor funktioner så det finns en markant ökning av apoB-100 i LDLs åtföljs av minskad apoA-I i HDLs, som liknar mänskliga familjär hyperkolesterolemi.
Figur 1: Schematisk illustration av sekventiell flytande ultracentrifugation. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Representativa bilder av plasmalipoprotein isolering. A)Plasma av normolipidemiska och hyperlipidemiska kaniner. (B) Svävade övre VLDL (d<1.006 g/mL) och bottenfraktion (d>1.006 g/mL) efter ultracentrifugering. C)Rör skivning och uppsamling av den översta fraktionen med en pipett. D)Insamling av den nedre fraktionen. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3: Kvantifiering av lipidinnehåll i varje lipoproteinfraktion isolerad från normala kaniner (A) och kolesterolmatade kaniner (B). Plasma lipoproteiner separerades av sekventiell flytande ultracentrifugation från plasma av vilda kaniner på antingen en normal standarddiet (A) eller en hög kolesteroldiet (B). Totalt kolesterol (TC), triglycerider (TG) och fosfolipider (PL) mättes. Data uttrycks som medelvärde ± SEM (n=6). Denna siffra har ändrats från Yan H et al.12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 4: Jämförelse av apolipoproteinfördelning med CBB-färgning (A) och western blotting (B). Plasma isolerades av ultracentrifugation och lipoproteiner fraktionerades av 4-20% SDS-PAGE. (A) Apolipoprotein profiler av vilda typ (WT) kanin matas på en normal standard (NS) kost och en hög kolesterol (HC) kost visualiserades av CBB färgning. Jämfört med NS dietmatade kaniner (vänster), HC dietmatade kaniner (höger) visade ökad apoB-100 och apoE innehåll i VLDLs, IDLs och LDLs. (B) Jämförelse av apolipoprotein funktioner hos WT kaniner på en NS eller en HC diet, apoE KO (knockout) kaniner på en HC diet och WHHL kaniner på en NS diet. Western blotting utfördes med "cocktail antikroppar" mot apoE, apoB och apoA-I. Jämfört med normolipidemic kaniner (WT kaniner på en NS diet, först vänster), andra tre hyperlipidemic kaniner uppvisar unika och olika apolipoprotein profiler. ApoB-innehållande partiklar (VLDLs, IDLs och LDLs) av HC-matade WT kaniner kännetecknas av ökad apoB-100 och apoE innehåll medan apoE KO kaniner visade markant ökning av apoB-48 tillsammans med utseendet på apoA-I. WHHL uppvisade markant ökning av apoB-100 i LDLs åtföljd av minskad apoA-I i HDLs. Denna siffra har ändrats från Niimi M et al.10. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
| Densitetslösning (g/ml) | KBr (g) | Destillerat vatten (ml) |
| d=1,006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1,10 | 148.490 | 1000 |
| d=1,21 | 333.394 | 1000 |
Tabell 1: Förberedelse för KBr-densitetslösningar ( kaliumbromid ). Vikten (g) av KBr tillsätt till 1000 ml destillerat vatten visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hyperlipidemi är en av de viktigaste riskfaktorerna för åderförd sjukdom. Således är analys av plasma lipoproteiner inte bara avgörande för diagnos av dyslipidemi patienter men också viktigt för undersökning av molekylära mekanismer av lipoprotein metabolism och åderförkalkning. I denna studie beskrev vi protokollet om isolering och analys av plasma lipoproteiner som kan tillämpas i de laboratorier där ultracentrifugation är tillgänglig. Information som erhålls med denna metod är omfattande och enkel därför rekommenderas det för både kliniska och grundläggande forskare. Isolerade lipoproteiner kan också användas för att undersöka många andra aspekter av lipoproteinfunktioner som negativ fläck elektronmikroskopi13,14, oxidizability9,15, proteomics16, cellkulturbaserad in vitro-studie som kolesterolutflödesanalys9 och lipoproteinupptagsanalys17.
Det bör påpekas. Det finns dock flera svaga punkter som måste ta hänsyn till detta. För det första är denna metod relativt tidskrävande (minst tre dagar) jämfört med andra metoder. Om du använder den senaste bordsskivan ultracentrifuge kan höghastighetsspinn (150 000 varv/min) förkorta separattiden 50–140 min för varje lipoproteinfraktion18. För det andra kan provförlusten inträffa under isoleringen. För att minimera provförlusten bör den trögflytande fällningen i den nedre fraktionen lösas upp och samlas försiktigt genom pipetting. Centrifugrören måste fixera tätt med en skärare för att undvika läckage av den övre fraktionen. Dessutom bör proverna återvinnas noggrant från dialyspåsar. Återhämtningen kan beräknas genom att jämföra det totala lipoproteinkolesterolet med det ursprungliga plasmakolesterolet. Enligt vår erfarenhet kommer den allmänna återvinningsgraden att ≈ 80%19. För det tredje är detta protokoll begränsat för ett litet antal prover eftersom en rotor bara kan köra tolv rör per gång. För att utföra ett stort antal prover kan det vara lämpligt att använda andra metoder som utfällningsmetod förHDL-beredning 4 och automatiserad HPLC lipoproteinanalys20.
Sammanfattningsvis ger detta protokoll en guide för forskare att isolera plasma lipoproteiner med hjälp av sekventiell densitet ultracentrifugation och analys av lipider och apolipoproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes delvis av ett forskningsanslag från JSPS KAKENHI Grant Number JP 20K08858, National Natural Science Foundation of China (nr 81941001 och 81770457), JSPS-CAS under Japan-China Research Cooperative Program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
