Summary
Plazma lipoproteinlerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılmıştır; ancak, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Burada, sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon kullanarak lipoproteinlerin plazmadan nasıl izole edilmesi ve apolipoproteinlerin hem tanı hem de araştırma amacıyla nasıl analiz edilmesi ile ilgili bir yöntem açıklıyoruz.
Abstract
Plazma lipoproteinlerinin ve apolipoproteinlerin analizi dislipidemi tanısı ve lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışmaları için önemli bir parçadır. Plazma lipoproteinlerini analiz etmek için çeşitli yöntemler olmasına rağmen, ultrasantrifüjleme hala en popüler ve güvenilir yöntemlerden biridir. Bozulmamış ayırma prosedürü nedeniyle, bu yöntemle izole edilen lipoprotein fraksiyonları, lipoproteinlerin, apolipoproteinlerin, proteomların analizi ve kültürlü hücreler in vitro ile lipoproteinlerin fonksiyonel çalışması için kullanılabilir. Burada, VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL) sıralı yüzer ultrasantrifüj kullanarak tavşan plazmasından. Buna ek olarak, okuyuculara SDS-PAGE ve Western blotting tarafından apoA-I, apoB ve apoE gibi apolipoproteinlerin nasıl analiz edeceğimizi tanıtıyoruz ve hiperlipidemik tavşan modellerini kullanarak lipoprotein ve apolipoprotein profillerinin temsili sonuçlarını gösteriyoruz. Bu yöntem hem klinisyenler hem de temel bilim adamları için lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek için standart bir protokol haline gelebilir.
Introduction
Dislipidemi dünyada aterosklerotik hastalığın başlıca risk faktörüdür. Yüksek düzeyde düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL'ler) ve düşük yüksek yoğunluklu lipoproteinler (HDL' ler) yüksek koroner kalp hastalığı riski (CHD)1,2ile yakından ilişkilidir. Klinik ortamda, hem LDL-kolesterol (LDL-C) hem de HDL-kolesterol (HDL-C) rutin olarak bir klinik laboratuvarda otomatik bir analizör kullanılarak ölçülür3,4. Buna rağmen, dislipidemi tanısı ve insan ve deney hayvanlarında lipid metabolizması ve ateroskleroz çalışması için lipoprotein profillerini ayrıntılı olarak analiz etmek önemlidir. Ultrasantrifüjasyon, boyut dışlama kromatografisi [hızlı protein sıvı kromatografisi (FPLC) ve yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC)], agarose ve poliakrilamid jeller tarafından elektroforez, nükleer manyetik rezonans ve seçici kimyasal çökeltme gibi plazma lipoproteinlerini polianyonlar ve divalent katyonlar veya diğer kimyasallar kullanılarak analiz etmek için çeşitli yöntemler bildirilmiştir. 1950'lerde Havel'in grubu ilk olarak ultrasantrifüjleme kullanan yoğunluklar tarafından tanımlanan lipoprotein kavramını önerdi ve bunları chylomicrons (CM), çok düşük yoğunluklu lipoproteinler (VLDL), orta yoğunluklu lipoproteinler (IDL), LDL ve HDL5 ve daha sonra diğer gruplar tarafından daha da değiştirildi6,7. Şimdiye kadar, ultrasantrifüjleme en popüler ve güvenilir yöntemdir, ancak pratik protokol hala mevcut değildir. Bu yazıda, başlangıçta daha önce açıklanan sıralı yoğunluklu yüzer ultrasantrifüjasyon kullanarak küçük bir plazma ölçeğini izole etmek için kullanımı kolay bir protokol tanımlamaya çalıştık8. Yedi plazma lipoprotein fraksiyonunun izolasyonu [VLDL (d<1.006 g/mL), IDL (d=1.02 g/mL), LDL'ler (d=1.04 ve 1.06 g/mL), HDL'ler (d=1.08, 1.10 ve 1.21 g/mL)] araştırmacıların hem lipoproteinlerin hem debunlarınbileşimsel apolipoproteinleri 9 , 10,11'inkapsamlı bir analizini yapmasını sağlar. Sağlam yedi ardışık yoğunluklu lipoprotein, lipoprotein fonksiyonlarını analiz etmek ve ayrıca hücre bazlı in vitro stratejilere hizmet etmek için kullanılabilir. Bu protokol hem klinik tanı hem de temel araştırmalar için yararlı olmalıdır. Burada tavşan plazmasını örnek olarak diğer türlerden alınan plazma aynı şekilde uygulanabilirken bu tekniği göstermek için kullandık.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tavşan çalışmaları için tüm prosedürler Yamanashi Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayı ile gerçekleştirildi (Onaylı sayı: A28-39).
1. Tavşan kanından plazma ayrımı
- Kan almak için 15 μL 0,5 M EDTA (pH 8,0) içeren 1,5 mL mikrotüpler hazırlayın.
- Bir tavşanı bir kısıtlayıcıya koyun ve 22 kalibrelik bir iğne kullanarak bir asuriküler ara arteri delin ve bir tüpe kan toplayın. Kanı EDTA ile hafifçe karıştırın ve buza koyun.
- Kan tüplerini 4 °C'de 20 dakika boyunca 1.500 x g'da santrifüj edin ve plazmayı yeni bir mikrotüpe toplayın.
NOT: 1 mL plazma toplamak için 3 mL kan yeterlidir. Farelerden veya diğer küçük hayvanlardan kan toplarsanız, onları bir arada toplamanız gerekir.
2. Plazma lipoproteinlerinin izolasyonu
NOT: Şematik yordam Şekil 1'de gösterilmiştir. Potasyum bromür (KBr) yoğunluk çözeltilerinin hazırlama yöntemi Tablo 1'de gösterilmiştir.
- 1 mL plazmayı polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne aktarın(Şekil 2A).
- Bu tüpleri sabit açılı bir rotora yükleyin ve plazmayı 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da santrifüj edin (Şekil 2B).
NOT: Beckman TLA 120.2 rotor için 356.000 x g (ortalama göreli santrifüj alanı, Av RCF) 100.000 rpm'ye karşılık gelir. - Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve üst fraksiyonu [VLDL (d<1.006 g/mL)], yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın (Şekil 2C). Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın (Şekil 2D). Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1.006 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplam hacmi 800 μL'ye getirin.
NOT: Tüp dilimleyiciye bir bıçak ayarlayın. Bıçağın konumunu üst fraksiyon (200 μL) ile alt fraksiyon (800 μL) arasında bir seviyede ayarlayın. Alt fraksiyondaki viskoz çökelti, aşağıdaki tüm adımlarda pipetleme yapılarak dikkatlice ve tamamen toplanmalıdır. Duraklatıyorsanız, tüm adımlarda üst ve alt kesirleri ayırdıktan sonra bunu yapın. Numuneyi bir sonraki santrifüje kadar 4°C'de saklayın. - 58,9 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 141,1 μL d=1,02 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL)'yi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,02 g/mL'ye ayarlayın.
- Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
- Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [IDL (d=1.02 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,02 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplam hacmi 800 μL'ye getirin.
- 94,1 μL d=1,21 g/mL çözeltisi ve 105,9 μL d=1,04 g/mL çözeltisi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,04 g/mL'ye ayarlayın (toplam hacim 1 mL'dir).
- Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
- Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [LDL (d=1.04 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,04 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
- 106,7 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 93,3 μL d=1,06 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL)'yi ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,06 g/mL'ye ayarlayın.
- Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
- Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [LDL (d=1.06 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,06 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
- 123,1 μL d=1,21 g/mL çözeltisi ve 76,9 μL d=1,08 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL'dir) ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,08 g/mL'ye ayarlayın.
- Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
- Bir dilimleyici kullanarak tüpleri kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL2 (d=1.08 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,08 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
- 145,5 μL d=1,21 g/mL çözelti ve 54,5 μL d=1,10 g/mL çözelti (toplam hacim 1 mL'dir) ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,10 g/mL'ye ayarlayın.
- Bu tüpleri 4 °C'de 2,5 saat boyunca 356.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
- Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL2 (d=1.10 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Kalan alt fraksiyonu bir sonraki ayırma için yeni bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne toplayın. Aynı yoğunluk çözeltisini (d=1,10 g/mL) ekleyerek hacmi ölçün ve toplamı 800 μL'ye getirin.
- 0,140 g potasyum bromür (KBr) tozu ekleyerek alt fraksiyonu (toplam 800 μL) d=1,21 g/mL'ye ayarlayın ve tamamen çözün. D=1,21 g/mL çözeltisi ekleyerek hacmi ölçün ve 1 mL'ye getirin.
- Bu tüpleri 4 °C'de 4 saat boyunca 513.000 x g'da sabit açılı rotor ve santrifüje yükleyin.
NOT: Beckman TLA 120.2 rotor için 513.000 x g (Av RCF) 120.000 rpm'ye karşılık gelir. - Tüpleri bir dilimleyici kullanarak kesin ve ardından üst fraksiyonu [HDL3 (d=1.21 g/mL)] yaklaşık 200 μL'yi yeni bir mikrotüp haline toplayın. Bu ultrasantrifüjleme için son adımdır.
3. Diyaliz
NOT: Yoğunluk fraksiyonları (d<1.006 g/mL fraksiyonu hariç) yüksek konsantrasyonlarda KBr içerdiğinden, bunları diyalizle çıkarmak gerekir.
- Yoğunluk fraksiyonlarını diyaliz tüpüne aktarın ve her iki ucu da kapaklarla kırpın.
- Manyetik karıştırıcı kullanarak ajitasyon ile 4 °C'de 6 saat boyunca PBS/ 1 mM EDTA gibi 2 L diyaliz tampona karşı dialyze.
- Yeni tamponla değiştirin ve 4 °C'de 6 saat daha dialyze edin.
- Yoğunluk kesirlerini toplayın ve hacmi ölçün. Tüm yoğunluk fraksiyonlarını aynı hacme ayarlayın (örneğin, 250 μL).
NOT: Konsantre faktörü 1 mL orijinal plazmadan hesaplayabilirsiniz (örneğin, 250 μL yoğunluk fraksiyonu dört kat konsantrasyona karşılık gelir).
4. Lipoproteinlerin analizi
NOT: Diyalizden sonra bu lipoproteinler farklı analizlere hazırdır. Lipoproteinler lipitler veya apolipoproteinler veya her ikisi de ölçülerek değerlendirilebilir. Her kesirde toplam kolesterol (TC), trigliseritler (TG), fosfolipidler (PL) ve serbest kolesterol (FC) gibi lipit içeriklerini ölçmek için ticari enzymatic kolorimetrik test kitleri kullanıyoruz. Apolipoproteinlerin analizi için, CBB boyama veya Batı şişkinliği ile görselleştirilmiş SDS-PAGE kullanıyoruz.
- Lipid analizi
NOT: Lipoprotein fraksiyonunda TC, TG, PL ve FC gibi lipitler ticari olarak mevcut ölçüm kitleri kullanılarak ölçülebilir. Prosedürler kullanılan reaktiflere bağlıdır, bu nedenle kullanılan her kitin talimatlarını izleyin. Burada ticari bir enzymatic tahlil kiti kullanarak tipik bir mikro plaka tahlilini gösteriyoruz.- 96 kuyulu mikro plakaya 8 μL lipoprotein numunesi ve standart kalibrasyon maddesi uygulayın.
- 240 μL tahlil reaktifi ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.
- 10 dakika boyunca 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
- OD'yi bir mikro plaka okuyucu ile ölçün ve lipit konsantrasyonlarını hesaplayın.
- Apolipoprotein analizi
- SDS-PAGE ve CBB boyama
- Numune hazırlama: 10 μL lipoprotein fraksiyonu için 10 μL 2x Numune tamponu ekleyin. Karışımı kuru bir ısı bloğu kullanarak 5 dakika boyunca 80 °C'de ısıtın.
- % 4-20 gradyan SDS-poliakrilamid jel hazırlayın ve jeli çalışan tamponla dolu elektroforezi odasına kurun.
- İstifleme jelinin üzerine lipoprotein numunesi (10 μL/şerit) ve protein standartları (5 μL/şerit) yükleyin.
NOT: Numuneler iki kez konsantre edilirse, şerit başına eşdeğer miktarda 20 μL plazma analiz edilecektir.] - Elektroforezi 20-40 mA sabit akımda çalıştırın.
- CBB boyama: Jeli 10 dakika boyunca hafif sallama ile sabitleme çözeltisinde iki kez ıslatın. Jeli 30 dakika boyunca CBB boyama çözeltisi ile lekelenin. Fazla lekeyi gidermek için jeli damıtılmış suda durulayın. Jel fotoğraf için hazır.
- Batı şişkinliği
- Elektroforezi yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedürde gerçekleştirin.
NOT: Batı şişkinliği için yüklenen lipoproteinlerin hacmi yukarıda açıklanan CBB lekelemesinden daha azdır (örneğin 1-5 μL). - Jel ve PVDF membranını transfer tamponu ile ıslatılmış filtre kağıdı ve form pedi arasına yerleştirin. Sandviçi bir tutucu kasete yerleştirin ve transfer tamponu ile dolu bir tanka yerleştirin.
- 4 °C'de 3 saat boyunca 100 mA sabit akımda elektroblotting gerçekleştirin.
- Engelleme: Membranı oda sıcaklığında 1 saat veya gece boyunca 4 °C'de blokaj tamponunda kuluçkaya yatırın.
- Birincil Ab reaksiyonu: Oda sıcaklığında 1 saat veya 4 °C'de hafif sallama ile gece boyunca bloke tamponu ile seyreltilmiş birincil Abs'deki membranları kuluçkaya bırakın.
NOT: Önerilen birincil Ab seyreltme Malzeme Tablosundagösterilmiştir. Apolipoproteinlere karşı üç çeşit birincil Abs tek tek veya kokteyllerde kullanılabilir. - Membranı yıkama tamponunda ajitasyonla üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dk.
- İkincil Ab reaksiyonu: İkincil Abs'deki membranı ajitasyon ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke tamponu ile seyreltin.
NOT: Önerilen ikincil Ab seyreltme Malzeme Tablosundagösterilmiştir. - Membranı yıkama tamponunda ajitasyonla üç kez yıkayın, yıkama başına 5 dk.
- ECL algılama: Zarı plastik bir sargı üzerine yerleştirin. ECL algılama reaktifleri ekleyin ve 1 dakika kuluçkaya yaslanın. Fazla sıvıyı boşaltın ve zarı bir torbaya kapatın.
- Görüntü çözümleyici kullanarak sinyalleri görselleştirin.
- Elektroforezi yukarıda açıklandığı gibi aynı prosedürde gerçekleştirin.
- SDS-PAGE ve CBB boyama
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolü kullanarak, 1 mL plazma kullanarak tavşan lipoproteinlerini izole ettik ve yedi yoğunluk fraksiyonu elde ettik. İzole yoğunluk fraksiyonları, çoğu araştırma amacıyla yukarıda açıklandığı gibi lipitleri ve apolipoproteinleri ölçmek için yeterlidir. Aynı prosedür, plazma lipoproteinlerini insan ve diğer türlerden izole etmek için de kullanılabilir. Fareler gibi küçük boyutlu hayvanlar için havuzlanmış plazma gereklidir. Şekil 3, normal standart (NS) diyet veya yüksek kolesterol (HC) diyeti ile beslenen vahşi tip (WT) tavşanların lipoprotein profillerini göstermektedir. Tavşanlar otçul hayvanlardır, bu nedenle plazma TC, TG ve PL seviyeleri genellikle insanlardan ve farelerden daha düşüktür. NS diyetle beslenen tavşanlarda, TC esas olarak HDL3 (d=1.21 g/mL) ve ardından LDL (d=1.04 g/mL)(Şekil 3A)olarak dağıtılır. Bir NS diyetinde, plazma TG'nin% 39'u VLDL'lerde dağıtılırken, plazma PL'nin% 57'si HDL3'te bulunur (Şekil 3A). Tavşanlara yüksek kolesterolle desteklenmiş bir diyetle meydan okunduğunda, hızla hiperkolesterolemi haline geldiler. Şekil 3B'degösterildiği gibi, lipoprotein profilleri VLDL'lerin belirgin yüksekliği (VLDL-TC'de 165 kat, VLDL-TG'de 1,5 kat ve VLDL-PL'de NS ile beslenen tavşanlara kıyasla 30 kat⭐) ile karakterize edilir. Kolesterolle beslenen tavşanlardan izole edilen VLDL'ler kolesteril esterler bakımından zengin olduğundan ve agarose jel elektroforezi üzerinde β konuma taşındığından, genellikle β öncesi konuma geçen normal VLDL'lerden ayırt etmek için β-VLDL'ler olarak adlandırılırlar.
Lipitlere ek olarak, apolipoproteinler SDS-PAGE tarafından CBB boyama veya Batı şişkinliği ile analiz edilebilir (Şekil 4). NS veya HC diyeti ile beslenen WT tavşanlarından yedi lipoprotein fraksiyonu% 4-20 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırıldı ve CBB boyama ile görselleştirildi (Şekil 4A). HC diyetinde, VLDL'lerdeki (d<1.006 g/mL), IDL'lerdeki (d=1.02 g/mL) ve LDL'lerdeki (d=1.04 g/mL) apoB-100 ve apoE içerikleri NS diyetindeki tavşanlara kıyasla belirgin şekilde yükselmiştir. Ayrıca, üç farklı hiperlipidemik tavşanın apolipoprotein ve lipoprotein profillerini karşılaştırdık: HC diyetle beslenen WT tavşanları, apoE nakavt (KO) tavşanları ve Watanabe kalıtsal hiperlipidemik (WHHL) tavşanları Batı şişkinliği ile LDL reseptör eksikliği ile (Şekil 4B). Plazma lipoproteinleri %4-20 SDS-PAGE ile fraksiyone edildi ve bunu apoE, apoB ve apoA-I'ye karşı antikorlarla Batı şişkinliği izledi. HC diyetle beslenen WT tavşanlarının apoB içeren parçacıkları (VLDL'ler, IDL'ler ve LDL'ler) artan apoB-100 ve apoE içeriği ile karakterize edilirken, apoE KO tavşanları apoA-I görünümü ile birlikte apoB-48'in belirgin artışını gösterdi. WHHL tavşanları LDL reseptör fonksiyonlarında genetik olarak yetersizdir, bu nedenle LDL'lerde insan ailesel hiperkolesterolemisine benzeyen azaltılmış apoA-I eşliğinde belirgin bir apoB-100 artışı vardır.
Şekil 1: Sıralı yüzer ultrasantrifüjasyonun şematik illüstrasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Plazma lipoprotein izolasyonunun temsili görüntüleri. (A) Normolipidemik ve hiperlipidemik tavşan plazması. (B) Ultrasantrifüjlemeden sonra üst VLDL (d<1.006 g/mL) ve alt fraksiyon (d>1.006 g/mL) yüzdürülür. (C) Tüp dilimleme ve üst fraksiyonun pipetle toplanması. (D) Alt kesir koleksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Normal tavşanlardan (A) ve kolesterolle beslenen tavşanlardan (B) izole edilen her lipoprotein fraksiyonunda lipit içeriğinin nicelliği. Plazma lipoproteinleri, normal standart bir diyette (A) veya yüksek kolesterol diyetinde (B) vahşi tip tavşanların plazmasından sıralı yüzen ultrasantrifüjleme ile ayrıldı. Toplam kolesterol (TC), trigliseritler (TG) ve fosfolipidler (PL) ölçüldü. Veriler SEM (n=6) ± ortalama olarak ifade edilir. Bu rakam Yan H ve ark.12'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: CBB boyama (A) ve Batı şişkinliği (B) kullanılarak apolipoprotein dağılımının karşılaştırılması. Plazma ultrasantrifüjasyon ile izole edildi ve lipoproteinler% 4-20 SDS-PAGE ile fraksiyone edildi. (A) Normal standart (NS) diyet ve yüksek kolesterol (HC) diyeti ile beslenen vahşi tip (WT) tavşanın apolipoprotein profilleri CBB boyama ile görselleştirildi. NS diyetle beslenen tavşanlarla (solda) karşılaştırıldığında, HC diyetle beslenen tavşanlar (sağda) VLDL'lerde apoB-100 ve apoE içeriğinin arttığını gösterdi, IDL'ler ve LDL'ler. (B) NS veya HC diyetindeki WT tavşanlarının apolipoprotein özelliklerinin, HC diyetindeki apoE KO (nakavt) tavşanlarının ve NS diyetindeki WHHL tavşanlarının karşılaştırılması. Batı şişkinliği apoE, apoB ve apoA-I'ye karşı "kokteyl antikorları" ile gerçekleştirildi. Normolipidemik tavşanlarla karşılaştırıldığında (NS diyetindeki WT tavşanları, ilk solda), diğer üç hiperlipidemik tavşan benzersiz ve farklı apolipoprotein profilleri sergiler. HC ile beslenen WT tavşanlarının apoB içeren parçacıkları (VLDL'ler, IDL'ler ve LDL'ler) artan apoB-100 ve apoE içeriği ile karakterize edilirken, apoE KO tavşanları apoA-I görünümü ile birlikte apoB-48'in belirgin artışını göstermiştir. WHHL, HDL'lerde azaltılmış apoA-I eşliğinde LDL'lerde apoB-100'ün belirgin artışını sergiledi. Bu rakam Niimi M ve ark.10'dan değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Yoğunluk çözeltisi (g/mL) | KBr (g) | Damıtılmış su (mL) |
| d=1.006 | 8.404 | 1000 |
| d=1,02 | 28.271 | 1000 |
| d=1,04 | 57.261 | 1000 |
| d=1,06 | 86.958 | 1000 |
| d=1,08 | 117.365 | 1000 |
| d=1.10 | 148.490 | 1000 |
| d=1.21 | 333.394 | 1000 |
Tablo 1: Potasyum bromür (KBr) yoğunluk çözeltileri için hazırlık. KBr'nin ağırlığı (g) 1000 mL damıtılmış suya eklenir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hiperlipidemi aterosklerotik hastalığın en önemli risk faktörlerinden biridir. Bu nedenle, plazma lipoproteinlerinin analizi sadece dislipidemi hastalarının tanısı için değil, aynı zamanda lipoprotein metabolizması ve aterosklerozun moleküler mekanizmalarının araştırılması için de önemlidir. Bu çalışmada ultrasantrifüjasyonun mevcut olduğu laboratuvarlarda uygulanabilen plazma lipoproteinlerinin izolasyon ve analiz protokolünü anlattık. Bu yöntemle elde edilen bilgiler kapsamlı ve basittir, bu nedenle hem klinik hem de temel araştırma bilimcileri için önerilir. İzole lipoproteinler ayrıca negatif lekeli elektron mikroskopisi13 , 14, oksitlenebilirlik 9 , 15,proteomik16,kolesterol effluxtahlil 9ve lipoprotein alma testi17gibiin vitro çalışmaya dayalı hücre kültürü gibi lipoprotein fonksiyonlarının diğer birçok yönünü araştırmak için de kullanılabilir.
Dikkat çekilmelidir; ancak, dikkate alınması gereken birkaç zayıf nokta vardır. İlk olarak, bu yöntem diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında nispeten zaman alıcıdır (en az üç gün). En son masa üstü ultracentrifuge kullanıyorsanız, yüksek hızlı dönüş (150.000 rpm) her lipoprotein fraksiyonu18için ayırma süresini 50-140 dakika kısaltabilir. İkinci olarak, izolasyon sırasında örnek kaybı olabilir. Numune kaybını en aza indirmek için, alt fraksiyondaki viskoz çökelti çözülmeli ve pipetleme ile dikkatlice toplanmalıdır. Santrifüj tüplerinin üst fraksiyonun sızmasını önlemek için bir dilimleyici ile sıkıca sabitlemesi gerekir. Ek olarak, örnekler diyaliz torbalarından dikkatlice geri kazanılmalıdır. İyileşme, toplam lipoprotein kolesterol ile orijinal plazma kolesterolü karşılaştırılarak hesaplanabilir. Deneyimlerimize göre, genel iyileşme oranı ≈ olacak 80%19. Üçüncüsü, bu protokol az sayıda numune için sınırlıdır, çünkü bir rotor aynı anda sadece on iki tüp çalıştırabilir. Çok sayıda numune almak için, HDL hazırlama4 ve otomatik HPLC lipoprotein analizi20için yağış yöntemi gibi diğer yöntemleri kullanmak uygun olabilir.
Özetle, bu protokol araştırmacılara plazma lipoproteinlerini sıralı yoğunluklu ultrasantrifüjasyon ve lipitlerin ve apolipoproteinlerin analizini kullanarak izole etme rehberi sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen JSPS KAKENHI'nin JP 20K08858, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81941001 ve 81770457), Japonya-Çin Araştırma Kooperatifi Programı kapsamında JSPS-CAS'tan aldığı araştırma hibeleri ile desteklendi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22-gauge needle | Terumo | NN-2232S | For blood collection |
| 96-well microplate | greiner bio-one | 655101 | For lipids measurment |
| Anti-apolipoprotein A-I antibody | LifeSpan BioSciences | LS-C314186 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein B antibody | ROCKLAND | 600-101-111 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| Anti-apolipoprotein E antibody | Merck Millipore | AB947 | For Western blottng, use 1:1,000 |
| CBB staining kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 299-50101 | For apolipoprotein analysis |
| Centrifuge | HITACHI | himac CF15RN | |
| Closure | Spectrum | 132736 | For lipoprotein dialysis |
| Dialysis tubing | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 043-30921 | For lipoprotein dialysis, MWCO 14,000 |
| Dry heat block | Major Science | MD-01N | For SDS-PAGE sample preparation |
| ECL Western blotting detection reagents | GE Healthcare | RPN2209 | For Western blotting |
| Electrophoresis Chamber | BIO-RAD | Mini-PROTEAN Tetra Cell | |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 345-01865 | For anticoagulant (0.5 M), for dialysis (1 mM) |
| Filter paper | ADVANTEC | 590 | For Western blotting |
| Fixed angle ultracentrifuge rotor | BECKMAN COULTER | 357656 | TLA-120.2 |
| Fixing solution | For SDS-PAGE (50% Methanol/ 10% Acetic acid) | ||
| Immun-Blot PVDF menbrane | BIO-RAD | 1620177 | For Western blotting |
| Lumino image analyzer | GE Healthcare | For Western blotting, ImageQuant LAS 4000 | |
| Magnetic stirrer | ADVANTEC | SR-304 | For lipoprotein dialysis |
| Microplate reader iMARK | BIO-RAD | For lipids measurment | |
| Microtube | INA-OPTIKA | SC-0150 | |
| Orbital agitator USBDbo | Stovall Life Science | ||
| Peroxidase congugated anti goat IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 705-035-003 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Peroxidase congugated anti mouse IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 715-035-150 | For Western blotting, use 1:2,000 |
| Phospholipids assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 433-36201 | For lipids measurment |
| Polycarbonate ultracentrifuge Tubes | BECKMAN COULTER | 343778 | |
| Potassium Bromide | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 168-03475 | For density solution |
| Power Supply | BIO-RAD | For SDD-PAGE and Western blotting, PowerPac 300, PowerPac HC | |
| Protein standards Precidion Plus Protein Dual Xtra | BIO-RAD | 161-0377 | For SDS-PAGE and Western blotting |
| Rabbit restrainer | Natsume Seisakusho | KN-318 | For blood collection |
| Rotor | HITACHI | T15A43 | |
| SDS-PAGE running buffer | 25 mM Tris/ 192 mM Glycine/ 0.1% SDS | ||
| SDS-PAGE sample buffer (2x) | 0.1M Tris-HCl (pH 6.8)/ 4% SDS/ 20% glycerol/ 0.01% BPB/12% 2-merpaptoethanol | ||
| SDS-polyacrylamide gel | 4-20% gradient polyacrylamide gel | ||
| Skim milk powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-12865 | For Western blotting blocking buffer (5% skim milk/ 0.1% Tween 20/ PBS) |
| Total cholesterol assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 439-17501 | For lipids measurment |
| Triglyicerides assay kit | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 432-40201 | For lipids measurment |
| Tube slicer for thick-walled tube | BECKMAN COULTER | 347960 | For lipoprotein isolation |
| Tween 20 | SIGMA-ALDRICH | P1379 | For Western blotting washing buffer (0.1% Tween 20/ PBS) |
| Ultracentrifuge | BECKMAN COULTER | A95761 | Optima MAX-TL |
| Western blotting wet transfer system | BIO-RAD | Mini Trans-Blot Cell |
References
- Gordon, T., Castelli, W. P., Hjortland, M. C., Kannel, W. B., Dawber, T. R. High density lipoprotein as a protective factor against coronary heart disease: The Framingham study. The American Journal of Medicine. 62 (5), 707-714 (1977).
- Baigent, C., et al. Efficacy and safety of cholesterol-lowering treatment: prospective meta-analysis of data from 90,056 participants in 14 randomised trials of statins. Lancet. 366 (9493), London, England. 1267-1278 (2005).
- Nauck, M., Warnick, G. R., Rifai, N. Methods for Measurement of LDL-Cholesterol: A Critical Assessment of Direct Measurement by Homogeneous Assays versus Calculation. Clinical Chemistry. 48 (2), 236-254 (2002).
- Warnick, G. R., Nauck, M., Rifai, N. Evolution of Methods for Measurement of HDL-Cholesterol: From Ultracentrifugation to Homogeneous Assays. Clinical Chemistry. 47 (9), 1579-1596 (2001).
- Havel, R. J., Eder, H. A., Bragdon, J. H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. The Journal of Clinical Investigation. 34 (9), 1345-1353 (1955).
- Hatch, F. T., Lees, R. S. Practical Methods for Plasma Lipoprotein Analysis. Advances in Lipid Research. 6, 1-68 (1968).
- Lindgren, F. T., Adamson, G. L., Jenson, L. C., Wood, P. D. Lipid and lipoprotein measurements in a normal adult American population. Lipids. 10 (12), 750-756 (1975).
- Fan, J., et al. Overexpression of hepatic lipase in transgenic rabbits leads to a marked reduction of plasma high density lipoproteins and intermediate density lipoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 8724-8728 (1994).
- Wang, Y., et al. Human Apolipoprotein A-II Protects Against Diet-Induced Atherosclerosis in Transgenic Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 33 (2), 224-231 (2013).
- Niimi, M., et al. ApoE knockout rabbits: A novel model for the study of human hyperlipidemia. Atherosclerosis. 245, 187-193 (2016).
- Zhang, J., et al. Deficiency of Cholesteryl Ester Transfer Protein Protects Against Atherosclerosis in RabbitsHighlights. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (6), 1068-1075 (2017).
- Yan, H., et al. Endothelial Lipase Exerts its Anti-Atherogenic Effect through Increased Catabolism of β-VLDLs. Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 40 (9), 2095-2107 (2020).
- Fan, J., et al. Overexpression of Lipoprotein Lipase in Transgenic Rabbits Inhibits Diet-induced Hypercholesterolemia and Atherosclerosis. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40071-40079 (2001).
- Koike, T., et al. Expression of Human ApoAII in Transgenic Rabbits Leads to Dyslipidemia: A New Model for Combined Hyperlipidemia. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (12), 2047-2053 (2009).
- Ichikawa, T., et al. Overexpression of lipoprotein lipase in transgenic rabbits leads to increased small dense LDL in plasma and promotes atherosclerosis. Laboratory investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 84 (6), 715-726 (2004).
- von Zychlinski, A., Kleffmann, T. Dissecting the proteome of lipoproteins: New biomarkers for cardiovascular diseases. Translational Proteomics. 7, 30-39 (2015).
- Yan, H., et al. Apolipoprotein CIII Deficiency Protects Against Atherosclerosis in Knockout Rabbits. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 28 (2), 157-168 (2021).
- Kang, I., Park, M., Yang, S. J., Lee, M. Lipoprotein Lipase Inhibitor, Nordihydroguaiaretic Acid, Aggravates Metabolic Phenotypes and Alters HDL Particle Size in the Western Diet-Fed db/db Mice. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 3057 (2019).
- De Silva, H. V., et al. Overexpression of human apolipoprotein C-III in transgenic mice results in an accumulation of apolipoprotein B48 remnants that is corrected by excess apolipoprotein E. Journal of Biological Chemistry. 269 (3), 2324-2335 (1994).
- Usui, S., Hara, Y., Hosaki, S., Okazaki, M. A new on-line dual enzymatic method for simultaneous quantification of cholesterol and triglycerides in lipoproteins by HPLC. Journal of Lipid Research. 43 (5), 805-814 (2002).
