Denne protokollen beskriver transillumination-assistert mikrodisseksjon av segmenter av voksen mus seminiferøse tubuli som representerer bestemte stadier av seminiferøs epitelsyklus, og celletyper deri, og påfølgende immunstaining av squash preparater og intakt tubule segmenter.
Spermatogenese er en unik differensieringsprosess som til slutt gir opphav til en av de mest distinkte celletypene i kroppen, sæden. Differensiering av bakterieceller foregår i de cytoplasmatiske lommene til somatiske Sertoli-celler som er vert for 4 til 5 generasjoner av bakterieceller samtidig og koordinerer og synkroniserer utviklingen. Derfor er sammensetningen av bakteriecelletyper i et tverrsnitt konstant, og disse celleforeningene er også kjent som stadier (I–XII) av den seminiferøse epitelsyklusen. Viktigere, stadier kan også identifiseres fra intakt seminiferøse tubuli basert på deres differensial lysabsorpsjon / scatter egenskaper avslørt ved transillumination, og det faktum at stadiene følger hverandre langs tubule i numerisk rekkefølge. Denne artikkelen beskriver en transillumination-assistert mikrodisseksjon metode for isolering av seminiferøse tubule segmenter som representerer bestemte stadier av mus seminiferous epitel syklus. Lysabsorpsjonsmønsteret til seminiferøse tubuli inspiseres først under et disseksjonsmikroskop, og deretter tubule segmenter som representerer bestemte stadier kuttes og brukes til nedstrøms applikasjoner. Her beskriver vi immunstaining protokoller for scenespesifikke squashpreparater og for intakte tubule segmenter. Denne metoden gjør det mulig for en forsker å fokusere på biologiske hendelser som finner sted i bestemte faser av spermatogenese, og dermed gi et unikt verktøy for utviklings-, toksikologiske og cytologiske studier av spermatogenese og underliggende molekylære mekanismer.
Differensiering av mannlige bakterieceller fra diploid spermatogonia til modne haploid spermatozoa, det vil sispermatogenese, er en kompleks prosess som finner sted i epitelet av seminiferøse tubuli i testiklene til en seksuelt moden person1. Mititotiske etterkommere av A1 spermatogonia først dele fem ganger for å utvide differensiering-begått befolkningen, deretter gå meiosis som spermatocytter som til slutt gir opphav til haploid spermatids. Differensiering av runde spermatider i spermatozoer, det vil sispermiogenese, innebærer komplekse endringer i cellulær morfologi, inkludert kjernefysisk komprimering og bygging av spermspesifikke strukturer som akrosom og flagellum. I musen tar hele prosessen med spermatogenese 35 dager å fullføre2,3.
Til enhver tid vert det seminiferøse epitelet opptil fem kohorter av differensieringssmådeceller pluss germline-stamcellene/stamcellene og de somatiske Sertoli-cellene1. Differensiering av bakterieceller danner konsentriske lag sammensetningen av som er forutsigbar, og haploid celler på et gitt utviklingstrinn forbinder alltid med visse typer spermatocytter og spermatogonia4,5. Derfor er ethvert tverrsnitt av en tubule kohorter av bakterieceller av en konstant sammensetning. Disse spesifikke celleforeningene er definert som stadiene av det seminiferøse epitelet. Stadier per se presenterer ikke stillestående sjekk-punkt-lignende tilstander, men utvikler seg kontinuerlig etter hvert som differensieringen av bakteriecellekohorter utvikler seg i synkronisering1,2,6. Hos mus er det 12 stadier (I-XII)2 som er arrangert på en segmental måte langs langsgående akse av seminiferøs tubule, og de følger hverandre i logisk rekkefølge og danner dermed bølgen av seminiferøs epitel, eller spermatogenbølge7,8,9 ( figur1). Fullføring av spermatogenese tar fire sykluser, og hierarkiske lag eller kohorter av differensiering av bakterieceller i noen seminiferøs tubule tverrsnitt er tidsmessig en seminiferous syklus bortsett fra hverandre. Lengden på syklusen er artsavhengig og i musen tar hver syklus 8,6 dager10.
Stadiene kan identifiseres på grunnlag av cellulær sammensetning og organisering av seminiferøs epitel på histologiske testisseksjoner 5 (Figur 1 og Figur 2). Histologisk analyse er imidlertid arbeidskrevende, tidkrevende og krever fiksering og farging, og kan derfor ikke brukes på levende vev. Viktigere, iscenesettelse kan også utføres på levende vev under et disseksjonsmikroskop ved å dra nytte av distinkte lysabsorpsjon / scatter mønstre utstilt av ulike stadier av syklusen (figur 2). Evnen til hvert trinn for å absorbere og spre lys er i forhold til nivået av kromatinkondensasjon av sene post-meiotiske spermatider som et gitt stadium verter og pakking av disse cellenei bunter 7,11. Spermatid differensiering, det vil vil vilat spermiogenese er videre delt inn i 16 utviklingstrinn, inkludert 8 trinn av rund spermatid (trinn 1-8) og 8 trinn av forlengende spermatid (trinn 9-16) differensiering ( figur1). Trinn 9-11 langstrakte spermatider (stadium IX-XI) viser bare et lavt nivå av kromatinkondensasjon, noe som resulterer i at lav mengde lys absorberes. Kromatinkondensasjonen begynner i trinn 11 spermaater (stadium XI), og trinn 15-16 langstrakte spermatider (stadium IV-VIII) inneholder fullt kondensert kromatin, og viser derfor maksimal lysabsorpsjon (figur 3). Kromatin må kondenseres for å være tett pakket inn i sædhodet. Ytterligere faktorer som bidrar til lysabsorpsjonsmønster er plassering av langstrakte spermatid i epitelet (basal vs. apical) og bunting av langstrakte spermatider (uttales i fase II-V)11 (figur 3). Bunter blir sett på som flekker i midten av tubuli og som striper på kantene under et disseksjonsmikroskop og jo mer kondensert kromatin, jo mørkere spot / stripe11.
Denne artikkelen beskriver bruken av transillumination-assistert mikrodisseksjon metode for isolering av seminiferøse tubule segmenter som representerer bestemte stadier av seminiferous epitel syklus. Når isolerte, iscenesatte tubule segmenter kan være gjenstand for ulike nedstrøms analyser, inkludert biokjemisk RNA ogproteinanalyser 12,13,14,15,strømningscytometri16,ex vivo tubule kultur17 og immunostaining18. Her gir vi også detaljerte nedstrøms protokoller for å forberede squashed monolayers av iscenesatte tubule segmenter for levende celle morfologiske analyser og påfølgende immunstaining, samt hel-mount immunostainings av tubule segmenter. Arbeidsflyten i et nøtteskall som er beskrevet i figur 4.
Den transillumination-assistert mikrodisseksjon metoden tillater nøyaktig identifisering og isolering av bakterieceller på bestemte trinn av differensiering takket være synkronisert cellulær sammensetning av stadiene. Viktigere, Det gjør også det mulig å studere stadium-avhengige hendelser under spermatogenese på levende vev. Gitt mangelen på skalerbare in vitro modeller for spermatogenese, denne metoden har også en unik fordel av å tillate målrettede kortsiktige utviklings- og toksikologiske studier på stadiumspesifikke tubule segmenter ex vivo12,17. Mens vi beskriver metoden her for musen, kan den samme prosedyren brukes på alle pattedyrarter med langsgående og segmental arrangement av seminiferøse epitelstadier, for eksempel rotte4,7,15,19,20.
Den transillumination-assisterte mikrodisseksjonsmetoden som vi har beskrevet ovenfor, muliggjør en sceneorientert tilnærming for studiet av spermatogenese. Spermatogenese er en svært synkronisert prosess, og alle viktige trinn under spermatogen differensiering er regulert og utført på en sceneavhengig måte, for eksempel differensieringsforpliktelse (i etapper VII-VIII), utbruddet av meiose (VII-VIII), meiotiske divisjoner (XII), utbruddet av spermatid forlengelse (VIII) og spermiasjon (VIII)1,26,27. Den sceneorienterte analysen gir et kraftig verktøy for å studere disse spesielle hendelsene som er begrenset til spesifikke trinn av spermatogenese og derfor bare finnes på definerte stadier av den seminiferøse epitelsyklusen. Å mestre metoden krever litt praksis og bruk av et god kvalitet disseksjonsmikroskop og riktige opplysende forhold er nøkkelen til suksess. Implementering av denne metoden som en del av den daglige verktøykassen har en evne til å forbedre virkningen og den biologiske relevansen av forskning på mannlige reproduktive funksjoner ved å tillate mer nøyaktig disseksjon av molekylære hendelser under spermatogenese.
Alle WT mus stammer som vi har studert vise en lignende transillumination mønster og viser bevarte celle assosiasjoner på stadier av seminiferous epitel syklus. På betingelse av at spermiogen differensiering av bakterieceller ikke er grovt forskjellig fra WT-mus, gjelder det samme også for alle knock-out musemodeller som vi har studert. Videre kan den brukes på andre arter som viser langsgående segmental arrangement av stadier av den seminiferøse epitelsyklusen7. Imidlertid kan arter med ikke-segmentale stadier (som menneske) ikke brukes. Gitt den essensielle rollen kromatin kondensering i langstrakte spermatider i å definere transillumination mønster, er det klart at enhver feilregulering av denne prosessen vil uunngåelig impinge på gjennomføringen av denne metoden. Hos unge mus og unge voksne (5-6 uker) er transillumineringsmønsteret ennå ikke fullstendig fastslått, og derfor bør bare mus eldre enn 8 uker brukes. Det er også viktig å huske på at klemming og trekk av tubuli uunngåelig vil impinge på transillumination mønster fordi det forvrenger cellulær arkitektur i seminiferous epitel.
De isolerte seminiferøse tubulisegmentene kan også dyrkes slik at ex vivo observasjon og manipulering av spermatogenese-skrevet prosesser, inkludert meiose. For å sikre levedyktighet av vevet og for å forhindre RNA og proteinforringelse, bør prøvene samles inn og behandles ikke mer enn 2 timer etter å ha ofret musen. For ex vivo kultur av seminiferous tubuli, bør tiden fra offer til utbruddet av kultur ikke overstige 1 time. Integriteten til tubule fragmenter kan vanligvis opprettholdes opptil 72 timer in vitro hvis høstes riktig.
Fasen av den seminiferøse epitelsyklusen kan verifiseres og enda mer nøyaktig definert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi avsquashpreparater 16. Mikroskopi utføres på levende celler, noe som gir en ekstra dimensjon i analysen og tillater observasjon av organelle eller cellebevegelser i bestemte stadier av spermatogenese28,29,30. Fasekontrastmikroskopi gir nøyaktig iscenesettelse for påfølgende immunstaining, noe som muliggjør svært detaljert analyse av proteinuttrykk og lokaliseringsdynamikk under spermatogenese, inkludert scenespesifikke endringer.
Mens celler frigjøres fra epitelkonteksten i squashpreparater, muliggjør helmonterte immunstaininger av tubule segmenter studiet av spermatogene celler i deres fysiologiske miljø. Derfor kan helmonterte preparater gi en bedre visualisering av seminiferøs tubulearkitektur og dens intercellulære kontakter enn immunstaining på tverrsnitt. Viktigere, transillumination-assistert iscenesettelse av tubule segmenter før immunstaining gjør tilnærmingen enda kraftigere ved å inkludere informasjon om den spesifikke fasen av et gitt segment. Full-mount farging er et spesielt nyttig verktøy for studiet av celler i periferien av seminiferøse tubuli, som peritubular myoidceller, peritubular makrofager og spermatogonia, men kan også åpne ny innsikt i forskning på meiotiske og postmeiotiske bakterieceller.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Academy of Finland [315948, 314387 til N.K.]; Sigrid Jusélius Foundation [til N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [til J.-A.M., T.L.]; Åbo doktorgradsprogram for molekylærmedisin [S.C.-M., O.O.].
bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
cover glass 20×20 mm | Menzel Gläser | 11961988 | |
Falcon conical tube 15-ml | Sarstedt | 62.554.502 | |
fetal bovine serum (FBS) | Biowest | S1810 | |
grease pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | |
microscope slide Superfrost Plus | Thermo Scientific | 22-037-246 | |
Parafolmaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Petri dish (100-mm) | Greiner | 664160 | |
phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 11503387 | |
ProLong Diamond Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36962 | |
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
Tween-20 | Sigma | P2287 |