Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Transillumination-assistert spredning av spesifikke stadier av musen seminiferøs epitelsyklus for nedstrøms immunstaining analyser

doi: 10.3791/61800 Published: October 7, 2020

Summary

Denne protokollen beskriver transillumination-assistert mikrodisseksjon av segmenter av voksen mus seminiferøse tubuli som representerer bestemte stadier av seminiferøs epitelsyklus, og celletyper deri, og påfølgende immunstaining av squash preparater og intakt tubule segmenter.

Abstract

Spermatogenese er en unik differensieringsprosess som til slutt gir opphav til en av de mest distinkte celletypene i kroppen, sæden. Differensiering av bakterieceller foregår i de cytoplasmatiske lommene til somatiske Sertoli-celler som er vert for 4 til 5 generasjoner av bakterieceller samtidig og koordinerer og synkroniserer utviklingen. Derfor er sammensetningen av bakteriecelletyper i et tverrsnitt konstant, og disse celleforeningene er også kjent som stadier (I–XII) av den seminiferøse epitelsyklusen. Viktigere, stadier kan også identifiseres fra intakt seminiferøse tubuli basert på deres differensial lysabsorpsjon / scatter egenskaper avslørt ved transillumination, og det faktum at stadiene følger hverandre langs tubule i numerisk rekkefølge. Denne artikkelen beskriver en transillumination-assistert mikrodisseksjon metode for isolering av seminiferøse tubule segmenter som representerer bestemte stadier av mus seminiferous epitel syklus. Lysabsorpsjonsmønsteret til seminiferøse tubuli inspiseres først under et disseksjonsmikroskop, og deretter tubule segmenter som representerer bestemte stadier kuttes og brukes til nedstrøms applikasjoner. Her beskriver vi immunstaining protokoller for scenespesifikke squashpreparater og for intakte tubule segmenter. Denne metoden gjør det mulig for en forsker å fokusere på biologiske hendelser som finner sted i bestemte faser av spermatogenese, og dermed gi et unikt verktøy for utviklings-, toksikologiske og cytologiske studier av spermatogenese og underliggende molekylære mekanismer.

Introduction

Differensiering av mannlige bakterieceller fra diploid spermatogonia til modne haploid spermatozoa, det vil sispermatogenese, er en kompleks prosess som finner sted i epitelet av seminiferøse tubuli i testiklene til en seksuelt moden person1. Mititotiske etterkommere av A1 spermatogonia først dele fem ganger for å utvide differensiering-begått befolkningen, deretter gå meiosis som spermatocytter som til slutt gir opphav til haploid spermatids. Differensiering av runde spermatider i spermatozoer, det vil sispermiogenese, innebærer komplekse endringer i cellulær morfologi, inkludert kjernefysisk komprimering og bygging av spermspesifikke strukturer som akrosom og flagellum. I musen tar hele prosessen med spermatogenese 35 dager å fullføre2,3.

Til enhver tid vert det seminiferøse epitelet opptil fem kohorter av differensieringssmådeceller pluss germline-stamcellene/stamcellene og de somatiske Sertoli-cellene1. Differensiering av bakterieceller danner konsentriske lag sammensetningen av som er forutsigbar, og haploid celler på et gitt utviklingstrinn forbinder alltid med visse typer spermatocytter og spermatogonia4,5. Derfor er ethvert tverrsnitt av en tubule kohorter av bakterieceller av en konstant sammensetning. Disse spesifikke celleforeningene er definert som stadiene av det seminiferøse epitelet. Stadier per se presenterer ikke stillestående sjekk-punkt-lignende tilstander, men utvikler seg kontinuerlig etter hvert som differensieringen av bakteriecellekohorter utvikler seg i synkronisering1,2,6. Hos mus er det 12 stadier (I-XII)2 som er arrangert på en segmental måte langs langsgående akse av seminiferøs tubule, og de følger hverandre i logisk rekkefølge og danner dermed bølgen av seminiferøs epitel, eller spermatogenbølge7,8,9 ( figur1). Fullføring av spermatogenese tar fire sykluser, og hierarkiske lag eller kohorter av differensiering av bakterieceller i noen seminiferøs tubule tverrsnitt er tidsmessig en seminiferous syklus bortsett fra hverandre. Lengden på syklusen er artsavhengig og i musen tar hver syklus 8,6 dager10.

Stadiene kan identifiseres på grunnlag av cellulær sammensetning og organisering av seminiferøs epitel på histologiske testisseksjoner 5 (Figur 1 og Figur 2). Histologisk analyse er imidlertid arbeidskrevende, tidkrevende og krever fiksering og farging, og kan derfor ikke brukes på levende vev. Viktigere, iscenesettelse kan også utføres på levende vev under et disseksjonsmikroskop ved å dra nytte av distinkte lysabsorpsjon / scatter mønstre utstilt av ulike stadier av syklusen (figur 2). Evnen til hvert trinn for å absorbere og spre lys er i forhold til nivået av kromatinkondensasjon av sene post-meiotiske spermatider som et gitt stadium verter og pakking av disse cellenei bunter 7,11. Spermatid differensiering, det vil vil vilat spermiogenese er videre delt inn i 16 utviklingstrinn, inkludert 8 trinn av rund spermatid (trinn 1-8) og 8 trinn av forlengende spermatid (trinn 9-16) differensiering ( figur1). Trinn 9-11 langstrakte spermatider (stadium IX-XI) viser bare et lavt nivå av kromatinkondensasjon, noe som resulterer i at lav mengde lys absorberes. Kromatinkondensasjonen begynner i trinn 11 spermaater (stadium XI), og trinn 15-16 langstrakte spermatider (stadium IV-VIII) inneholder fullt kondensert kromatin, og viser derfor maksimal lysabsorpsjon (figur 3). Kromatin må kondenseres for å være tett pakket inn i sædhodet. Ytterligere faktorer som bidrar til lysabsorpsjonsmønster er plassering av langstrakte spermatid i epitelet (basal vs. apical) og bunting av langstrakte spermatider (uttales i fase II-V)11 (figur 3). Bunter blir sett på som flekker i midten av tubuli og som striper på kantene under et disseksjonsmikroskop og jo mer kondensert kromatin, jo mørkere spot / stripe11.

Denne artikkelen beskriver bruken av transillumination-assistert mikrodisseksjon metode for isolering av seminiferøse tubule segmenter som representerer bestemte stadier av seminiferous epitel syklus. Når isolerte, iscenesatte tubule segmenter kan være gjenstand for ulike nedstrøms analyser, inkludert biokjemisk RNA ogproteinanalyser 12,13,14,15,strømningscytometri16,ex vivo tubule kultur17 og immunostaining18. Her gir vi også detaljerte nedstrøms protokoller for å forberede squashed monolayers av iscenesatte tubule segmenter for levende celle morfologiske analyser og påfølgende immunstaining, samt hel-mount immunostainings av tubule segmenter. Arbeidsflyten i et nøtteskall som er beskrevet i figur 4.

Den transillumination-assistert mikrodisseksjon metoden tillater nøyaktig identifisering og isolering av bakterieceller på bestemte trinn av differensiering takket være synkronisert cellulær sammensetning av stadiene. Viktigere, Det gjør også det mulig å studere stadium-avhengige hendelser under spermatogenese på levende vev. Gitt mangelen på skalerbare in vitro modeller for spermatogenese, denne metoden har også en unik fordel av å tillate målrettede kortsiktige utviklings- og toksikologiske studier på stadiumspesifikke tubule segmenter ex vivo12,17. Mens vi beskriver metoden her for musen, kan den samme prosedyren brukes på alle pattedyrarter med langsgående og segmental arrangement av seminiferøse epitelstadier, for eksempel rotte4,7,15,19,20.

Protocol

Vedlikehold av laboratoriemus og alle dyreforsøk ble gjort i samsvar med relevante retningslinjer og forskrifter for omsorg og bruk av laboratoriedyr ved Universitetet i Åbo.

1. Tilberedning av seminiferøse tubuli for mikrodisseksjon

  1. Ofre en voksen mannlig mus (≥8 uker gammel, testis 80-120 mg avhengig av belastning og alder) via CO2 kvelning etterfulgt av cervical forvridning.
    MERK: Musen skal være seksuelt moden, og helst minst 8 uker gammel. Transillumination mønster av juvenile mus er forskjellig fra voksen fordi bølgen av seminiferous epitel ennå ikke er fullt etablert, og tidspunktet for den første bølgen av spermatogenese er distinkt21,22. Mangel på langstrakte spermatider i <4 uker gamle hannmus utelukker deres bruk for transillumineringsassistert mikrodisseksjon. Alle musestammer som har normal spermatogenese kan brukes.
  2. Spray ventral magen med 70% etanol. Åpne abdominopelvic hulrom ved hjelp av steril saks, noe som gjør en V-formet åpning.
  3. Trekke på epididymal fett pad med sterile tang, finne testiklene, dissekere dem ved hjelp av saks og plassere dem på en steril 100 mm Petri parabolen inneholder PBS.
    MERK: For å opprettholde steriliteten må du kontrollere at alle laboratorievarer og kirurgiske verktøy er sterile.
  4. Ved hjelp av fin-tipped saks halshugge testiklene ved å kutte en spalte i tunika albuginea, det tykke fibrøse arket innkapsling testis. Riv deretter tunikaen åpen ved hjelp av et par tang. Tving tublene ut ved å trykke med tang og kast tunikaen.
    MERK: Mens du kaster tunikaen, kan det være gunstig for noen nedstrøms applikasjoner at arterie testicularis fjernes sammen med tunika. Unngå å skade de seminiferøse tubuli.
  5. Flytt de seminiferøse tubuli til en ny petriskål og hell nok steril PBS til å dekke bunnen av petriskålen. Deretter trekker du forsiktig tubuliene fra hverandre, men unngår å skade tubuliene.
    MERK: For mye mekanisk stress vil impinge på transillumination mønster og påvirke levedyktigheten til vevet og dens cellulære arkitektur. Tubuliene kan også behandles for helmonterte immunstaininger fra dette punktet uten iscenesettelse (3B). Noen ganger er det tilstrekkelig å definere scenen retrospektivt ved å inkludere antistoffer mot proteiner uttrykt i differensiering spermatogonia, som SALL4, c-KIT og DNMT3A18,23. Tettheten av spermatogoni er en relativt pålitelig sceneindikator (figur 2).

2. Transillumination-assistert mikrodisseksjon

  1. Plasser petriskålen under et disseksjonsmikroskop godt ved å teipe den til scenen.
    MERK: Det er viktig å teipe petriskålen godt for å forhindre bevegelsen, noe som kan føre til blanding av de innsamlede iscenesatte halvniferøse tubulesegmentene.
  2. For å avsløre lysabsorpsjonsmønsteret av seminiferøse tubuli under fokus, sørg for at prøven er opplyst nedenfra og lyset passerer gjennom prøven, det vil si, det er transilluminert.
    MERK: Mengden lys absorbert / spredt er i forhold til nivået av kromatin kondens i langstrakte spermatider og deres bunting inne i seminiferous tubule: jo mer kondensert, jo mer lys absorberes, det vil si, vises mørkere.
  3. Bli kjent med lysabsorpsjonsmønsteret i forskjellige stadier som beskrevet i figur 2, figur 5A og figur S1 ved å nøye flytte bunter av tubuli ved hjelp av fine tang.
    MERK: Stadiene følger alltid hverandre i logisk rekkefølge, og danner bølgen av seminiferøs epitel. Det er imidlertid viktig å vite at retningen på spermatogene bølgen av og til reverserer og deretter går tilbake igjen (også kjent sommodulasjoner 4,9), noen ganger kompliserer prosedyren. Også lengden på hvert trinn, når det gjelder hvor mange mm tubule, varierer betydelig.
  4. Løft forsiktig tubule av interesse ved hjelp av tang med en hekta spiss, og kutt deretter et segment av passende lengde ved hjelp av mikrodisseksjonsaks (se Supplerende Video 1). En krok på spissen av tangen gjør det enklere å løfte og holde en tubule og bidrar til å unngå å klemme den.
    MERK: Lengden på segmentene som skal kuttes, avhenger av nedstrøms programmer. For innsamling av samlede tubulistykker i et bestemt stadium for protein- eller RNA-analyse12,13 (II–V, VII–VIII og IX–XI, figur 5B)er lengden vanligvis 2–5 mm. Når standard fenol-kloroformekstraksjon brukes, kan rundt 200 ng RNA utledes fra 1 mm tubule. For full-mount farging av iscenesatt tubule segmenter, bør lengden på segmentene være > 5 mm. For squashpreparater bør lengden på segmentene ikke overstige 1–2 mm fordi cellene i midten av segmentet kanskje ikke avsluttes hvis de er for lange. Bruk en mm skala under petriskålen for en nøyaktig måling av tubulelengden.

3. Immunstaining av ulike preparater

  1. Squash forberedelse: scenen verifisering og immunstaining
    MERK: Scenespesifikke tubulibiter kan knuses på et mikroskopsklie med et dekkglass for å utføre morfologisk analyse av levende celler ved fasekontrastmikroskopi og påfølgende immunstaining. En nybegynner anbefales å bruke denne tilnærmingen til å verifisere stadiene når du blir kjent med transillumination-assistert mikrodisseksjonsmetode.
    1. Samle segmentet i et volum på 10 μL ved hjelp av en pipette og flytt det til et mikroskop lysbilde.
    2. Squash tubule ved å plassere et deksel glass (20 mm x 20 mm) nøye på tubule. Som et resultat vil cellene strømme ut tubuli og danne en live-celle monolayer. Plasser et filterpapir på kanten av dekkglasset for å lette spredningen av celler. Unngå å knuse cellene for mye for å holde dem i live.
    3. Overvåk celle som sprer seg under et mikroskop. Bruk et mikroskop med fasekontrast ved 40x-mål for å verifisere scenegjenkjenning ved å undersøke celletypene som finnes (figur 2, figur S2).
    4. Når cellene har spredt seg for å danne et rundt monolag fra begge ender av tubulien, dypp lysbildet i en beholder som inneholder flytende nitrogen mens du holder det med tang. Hold den nedsenket i 10 s. Alternativt kan du plassere lysbildet på en tørrisplate for frysing.
    5. Fjern dekkglasset ved å slå det av ved hjelp av en skalpell.
    6. Uten forsinkelse, fortsett med fikseringen og legg raskt lysbildet i en beholder med 90% etanol i 2-5 min.
      MERK: Pass på at squashpreparatet ikke tines før du plasserer det til 90 % etanol. Andre fikseringsmidler kan også brukes, for eksempel aceton, i 10 min.
    7. Lufttørk og oppbevares ved romtemperatur (RT) (opptil noen dager) eller ved -80 °C (langsiktig).
    8. For immunstaining, post-fikse prøvene i 4% paraformaldehyd (PFA) i 10 min ved RT.
    9. Skyll i PBS og permeabiliser med 0,1% Triton X-100 i PBS i 5 min.
    10. Skyll i PBS og tegn en fettring rundt hver squashprøve.
    11. Tilsett 50–100 μL på 10 % BSA (storfeserumalbumin) i 0,1 % Tween i PBS (PBST) inne i fettringen og blokker prøver i 30 min ved RT.
    12. Fjern BSA-løsningen og inkuber med et primært antistoff fortynnet i 10 % BSA i PBST i 1 time ved RT.
    13. Vask 3x i 5 min med PBST.
    14. Inkuber med sekundært antistoff fortynnet i 10 % BSA i PBST.
      MERK: For å beise akrosomene, kan prøvene inkuberes med Rhodamine-merket Peanut agglutinin antistoff (PNA, 1:1000) i 10% BSA i PBST i 1 time ved RT (figur S3) i stedet for spesifikke primære og sekundære antistoffer.
    15. Vask 3x i 5 min hver med PBST, skyll med PBS og monter med et monteringsmiddel som inneholder DAPI.
  2. Hel-mount immunstaining av seminiferøse tubuli
    MERK: Protokollen nedenfor beskriver full-mount farging for iscenesatte (fra trinn 2.4) tubule segmenter. Hvis en forsker ønsker å utføre full-mount farging uten iscenesettelse (fra trinn 1.5), ta hensyn til notater i 3.2.1 og 3.2.7.
    1. Bruk en pipette til å overføre tubulesegmentene (fra trinn 2,4) i iskald PBS til et konisk rør på 15 ml og la dem sedimentere på is.
      MERK: Hvis du bruker uoppformede tubuli fra 1,5., skiller du tubuliene i en petriskål ved å pipe opp og tilbake på en skråskål flere ganger. Bruk en 1 ml pipette med en kuttspiss. Dette trinnet er ment å åpne opp strukturen av vevet. Men unngå for mye pipettering som det kan skade tubuli. Sedimentering av tubuli vil ta noen titalls sekunder. Små tubule fragmenter, interstitielle celler og celleavfall forblir i det overnaturante.
    2. Fjern forsiktig overnaturvæsken (SN) ved pipettering eller med en aspirator. Tilsett 10 ml iskald PBS og bland ved inversjon.
    3. La det sedimentere og fjern deretter SN som før.
    4. Tilsett 5 ml 4 % PFA og fest i 5 timer på et roterende bord (20–30 o/min) ved +4 °C.
      MERK: Fikseringstiden avhenger av proteiner av interesse og deres subcellulære lokalisering. For kjernefysiske og cytoplasmatiske proteiner, en 2 h fiksering er vanligvis tilstrekkelig, men membran markører, som GFRα1 (GDNF familie reseptor alfa 1; Figur 6A,B), dra nytte av en lengre fiksering, opptil 6 timer.
    5. La det sedimentere, fjern SN (PFA) som før, og skyll kort ved å tilsette 10 ml PBS og snu røret.
    6. La det sedimentere, fjern SN som før, og gjenta PBS vasketrinn tre ganger i minst 10 min hver på et roterende bord ved +4 °C og fortsett med farging eller oppbevar ved +4 °C.
      MERK: Hvis arbeidsforholdene er sterile og rengjør prøvene kan lagres og brukes i minst noen uker. Alternativt kan du legge til Sodium Azide i en endelig konsentrasjon på 0,02 % (w/v) fra en 2 % lagerløsning for å bidra til å bevare tubuli før lagring ved +4 °C.
    7. Bruk en 1 ml pipette til å flytte 10–20 faste tubulisegmenter til et 2 ml rundbunnsrør. La det sedimentere og fjerne SN.
      MERK: Hvis du arbeider med lange tubuli som ikke er iscenesatt, hell tubuliene på en petriskål og bruk av mikrodisseksjonsaks og tang kutte segmenter på rundt 5-20 mm. For lange segmenter vil floke under fargingsprosedyren, mens for korte segmenter lett går tapt.
    8. Tilsett 1 ml 2 % BSA + 10 % FBS (føtal storfeserum) i 0,3 % Triton X-100 i PBS (PBSX). Blokker i minst 1 time på et roterende bord (20–30 o/min) ved RT.
    9. Skyll med 1 ml PBSX, fjern SN ved pipettering og tilsett 250 μL primært antistoff fortynnet i 1 % BSA i PBSX (1:100–1:2000 fortynning). Inkuber i 2 timer ved RT eller over natten ved +4 °C på et roterende bord (20–30 o/min).
    10. Fjern antistoffoppløsningen ved å pipettere og skyll tublene med 1 ml PBSX som ovenfor. Vask tre ganger i 1 t i PBSX på et roterende bord (20–30 o/min) ved RT.
      MERK: Etter denne første vasken kan prøven stå over natten ved +4 °C om nødvendig.
    11. Fjern SN og tilsett 250 μL sekundært antistoff fortynnet i 1 % BSA i PBSX (vanligvis 1:500 fortynning av et fluorescerende merket antistoff). Dekk i folie og inkuber på et roterende bord (20–30 o/min) ved RT i 1 time.
    12. Gjenta 3.2.10.
    13. Fjern til slutt SN og hell tubuliene til et mikroskopsklie. Separer og ordne tubuli forsiktig i lineære strimler ved hjelp av gel-lasting tips. Tøm av overflødig buffer og tilsett monteringsmedium og en dekkslipp.
      MERK: Unngå tørking av tubuli mens du arrangerer dem. Motfarging av kjernene med DAPI er ikke nødvendig i de fleste tilfeller. Forsegle kanten av dekkslippen med neglelakk for å hindre prøvetørking og forringelse. Lysbilder kan oppbevares i 1–2 uker ved +4 °C før bildebehandling.

Representative Results

En vellykket transillumination-assistert iscenesettelse og mikrodisseksjon av mus seminiferøse tubuli avhenger først og fremst av å finne de riktige lysforholdene og et egnet forhandlingsmikroskop, og evnen til å gjenkjenne spesifikke funksjoner som karakteriserer hvert trinn. Stadier VII-VIII vises homogent mørk fordi de inneholder et høyt antall fullt kondenserte langstrakte spermatider som er justert på den apikale overflaten av epitelet (figur 5A og figur S1). Etter at modne spermatozoer slippes ut i lumen i spermiasjon, ser tubule veldig blek ut i stadier IX–XI på grunn av fravær av kondenserte langstrakte spermatider i epitelet. Den enkleste funksjonen å identifisere på transilluminerte tubuli er spermiasjonens punkt (stjerne i figur 5A og figur S1),det vil si den plutselige overgangen fra den mørke sonen (VII–VIII) til blek sone (IX–XI). Den bleke sonen etterfølges av den svake punktsonen (XII–I). Det flekkete utseendet stammer fra organiseringen av langstrakte spermatider med kondensert kromatin i bunter. Buntene blir svært fremtredende i følgende sterke punktsone (II–V). Videre migrerer spermatid bunter mot Sertoli cellekjerner som ligger nær basal lamina, som gjenspeiles som stripete utseende av stadium II-V tubule når transilluminated (Figur 2, Figur 5A, B og figur S1). Bunter endelig spre seg på stadium VI og kondenserende langstrakte spermatider beveger seg nær lumen for å bli løslatt fra epitelet på stadium VIII.

Den nøyaktige fasen av tubulesegmentet kan nøyaktig verifiseres av fasekontrastmikroskopi av squashpreparater (figur 2 og figur S2). De spesifikke stadiene i squashpreparater gjenkjennes på grunnlag av den akrosomale utviklingen av trinn 1-8 runde spermaater, status for kromatinkondensasjon i forlengende spermatider, og tilstedeværelsen av spermatidbunter16 (figur 3 og figur S2). Videre kan tilstedeværelsen av tidligere celletyper, som type B spermatogonia og leptotene eller zygotene spermatocytter, som kan gjenkjennes på grunnlag av deres morfologiske egenskaper, brukes til å støtte scenegjenkjenning. Størrelsen på pachytene spermatocyttkjerner øker i størrelse på rundt stadium VI, noe som også kan gi ekstra hjelp i iscenesettelse.

Iscenesatte squashpreparater kan brukes til å studere uttrykk og lokalisering av proteiner av interesse for det seminiferøse epitelet ved hjelp av immunstaining. Dette gir svært nøyaktig analyse av celletypespesifikt uttrykk på grunn av den veldefinerte cellulære sammensetningen på hvert trinn. Stage-spesifikt uttrykk kan forsterkes ytterligere ved co-farging av akrosom(f.eks,med PNA) som muliggjør visualisering av distinkte trinn av runde spermatid differensiering. Representative bilder av PNA-beisede akrosomer på ulike stadier er gitt i figur S3. Den akrosomale fargingen kan også brukes til å definere scenen retrospektivt. Imidlertid er transillumination-assistert iscenesettelse en betydelig enklere og raskere metode for å finne ønsket stadium enn å bruke ustaged fragmenter på en tilfeldig måte.

Seminiferous tubule hel-mount farging brukes vanligvis til å studere celletyper som er i kontakt med kjelleren membranen av seminiferøse epitel, enten på den rørformede siden (spermatogonia, preleptotene spermatocytter og Sertoli celler; Figur 6A,B) eller interstitiell side (peritubulære myoidceller og peritubulære makrofager; Figur 6C og figur S4A)24. Metoden kan imidlertid også brukes til å studere celler eller strukturer som ligger dypere i epitelet, for eksempel blod-testis barrieren (Espin, Figur S4B),eller postmeiotiske bakterieceller (akrosom markør PNA, figur S4C). Hvis du bruker ustaged tubule segmenter, er det mulig å estimere et gitt stadium retrospektivt ved hjelp av et antistoff mot et protein som uttrykkes i differensiering spermatogonia (A1, A2, A3, A4, In og B; kollektivtEn diff) (Figur 2). Iscenesettelse er da avhengig av tetthet av syncytial Adiff som gjennomgår seks mitotiske divisjoner på en sceneavhengig måte i løpet av den første syklusen av spermatogen differensiering1, derfor doble antall Adiff spermatogonia i syncytia etter hverdivisjon 1,25. Imidlertid er retrospektiv iscenesettelse mindre nøyaktig enn transillumination-assistert iscenesettelse fordi det ikke er noen spesifikke markører for forskjellige generasjoner av Adiff og vurdering av Adiff tetthet kan være utsatt for feil.

Figure 1
Figur 1: Seminiferous epitel syklus kart for iscenesettelse av mus spermatogenese. Vertikale kolonner viser celleforeninger på forskjellige stadier av den seminiferøse epitelsyklusen (merket med romerske tall I–XII). De mest umodne bakteriecellene er nederst, mens de mest differensierte er på toppen. For å følge fremdriften av bakteriecelledilatering, må man flytte fra venstre til høyre, og fra bunn til topp. En syklus av det seminiferøse epitelet er en komplett serie stadier som følger hverandre i numerisk rekkefølge. Enund, udifferentiated spermatogonia; A1–4, type A1–A4 spermatogonia; I mellomliggende spermatogonia; B, type B spermatogonia; Pl, preleptotene spermatocytter; L, leptotene spermatocytter; Z, zygotene spermatocytter; P, pachytene spermatocytter; D, diplotene spermatocytter; 2°, sekundære spermatocytter pluss middelmådige divisjoner. Arabiske tall 1-16 refererer til trinn av post-meiotisk spermatid modning (spermiogenese). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Celleforeninger i stadier av musen seminiferous epitelsyklus. Stadier av den seminiferøse epitelsyklusen følger hverandre i logisk rekkefølge, og danner dermed spermatogenbølgen langs langsgående akse av en seminiferøs tubule. Topppanelet illustrerer bakteriecelleforeningene på forskjellige stadier, og plasseringen av celletyper i de cytoplasmatiske lommene til Sertoli-celler (lys grå) i det seminiferøse epitelet. Illustrasjonen av den seminiferøse tubulien visualiserer spermatogenbølgen og spesifikke transillumination mønstre av blek, svakt punkt, sterk flekk og mørke soner. Fra hvert angitt stadium vises representative levende cellefasekontrastbilder av squashpreparater og periodiske syre-Schiff (PAS)-beisede tester tverrsnitt. De to nederste panelene viser segmenter av seminiferøs tubuli etter transillumination (øverst) eller farging med antistoffer (bunn) mot SALL4 (rød, en pan-spermatogonial markør) og DNMT3A (grønn, en Adiff markør). Transillumineringsmønstrene for stadier IX-XI, XII og VI er uthevet med eskeområder. Både lysabsorpsjonsmønster (topp) og tetthet av DNMT3A-positiv differensiering spermatogonia (nederst) kan brukes til å definere (omtrentlig) fasen av den seminiferøse syklusen. Etterfølgende generasjoner av Adiff kalles type A1-A4, mellomliggende (I) og type B spermatogonia. Deling av hver resulterer i dobling av spermatogonial celle tetthet. Den høyeste celletettheten på kjellermembranen i det seminiferøse epitelet ses i faser VI–VIII når meiotiske preleptotene spermatocytter (Pl) observeres. Vektstenger: squash prep. 10 μm, andre 50μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Trinn av spermiogenese. Karakteristiske trekk ved spermatider på forskjellige trinn av spermogenese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Arbeidsflyt for denne studien. Transillumination mønster har blitt fullt etablert i en voksen (> 8-ukers gammel) mus. Ofre musen og fortsett med testis disseksjon og halshugging uten forsinkelse. Trekk forsiktig tublene fra hverandre på en petriskål. Fest tubuli for full-mount flekker eller fortsette med transillumination. Under transillumination 1) kuttet korte tubule segmenter av bestemte stadium (er) for squash preparater (kvalitetskontroll eller for immunstaining) eller 2) kutte lengre segmenter for å samle scenen bassenger for RNA og proteomics analyser, vev kultur eller for full-mount flekker. Overfør korte tubulesegmenter til et mikroskoplysbilde i 10 μL-volum pbs. Plasser en dekselseddel på segmentet for å tvinge ut cellene og danne en levende celle monolayer. Vær oppmerksom på celletypene under et mikroskop, og fest deretter og flekk. WMS, full-mount farging. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Seminiferøs tubule av en voksen mus sett under transillumination mikroskopi. (A)Et langt segment av seminiferøs tubule sett under transillumination viser bølgen av seminiferous epitel. Fire forskjellige soner kan identifiseres basert på kromatinkomprimering i spermatid og deres lokalisering innenfor epitelet: mørk sone (stadier VII–VIII), blek sone (stadier IX-XI), svak punktsone (trinn XII-I) og sterk spotsone (trinn II–VI). Stjerne, spermiasjonspunkt. Piler indikerer to korte segmenter innenfor den svake punktsonen som har et blek utseende på grunn av mekanisk stress på tubulien. Vekt bar: 500 μm. Innsetter 1–5 er høyere forstørrelser fra utvalgte tubulesegmenter. (B) Samlede segmenter av seminiferøs tubuli som representerer trinn II–V (sterk punktsone), VII–VIII (mørk sone) og IX–XI (blek sone). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Helmonterte immunstaininger ved hjelp av spermatogoniale, Sertoli-celle og peritubulære makrofagmarkører. (A)Full-mount farging for et segment som representerer stadium XI–II med antistoffer mot GFRα1 (rød), SALL4 (grønn) og DNMT3B (blå). Fargingen avslører tre forskjellige populasjoner av spermatokonium: enkeltisolert (As) eller parret (Apr) udifferensiert stamcelle (GFRα1+/SALL4+/DNMT3B-; hvite stiplede områder), kort synkron (her 4 justerte celler; Aal4) stamfar spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B-; gule stiplede områder) og differensiere spermatogonia (GFRα1-/SALL4+/DNMT3B+). SALL4+/DNMT3B+ celler er type A3-A4 spermatogonia. (B)Helmontert seminiferøs tubule farging med antistoffer mot GFRα1 (rød), USF1 (grønn) og SOX9 (blå). GFRα1 flekker stammen undergruppen av spermatogonia. USF1 uttrykkes av både spermatogonia og SOX9+ Sertoli celler. (C) Peritubular makrofager hos voksne mus er positive for både F4/80 (rød) og MHCII (blå). DAPI flekker DNA (grønn). Lyse store kjerner er peritubulære myoidcellekjerner. Vektstenger: 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur S1: Et langt segment av seminiferøs tubule sett under transillumination viser bølgen av seminiferous epitel. Fire forskjellige soner kan identifiseres basert på kromatinkomprimering i spermatid og deres lokalisering innenfor epitelet: svak punktsone (stadier XII–I), sterk punktsone (trinn II–VI), mørk sone (stadier VII–VIII) og blek sone (fase IX–XI). Spermiasjonspunkt (stjerne) kan gjenkjennes som den mørke sonen brått passerer inn i blek sone. Vekt bar: 500 μm. Innsetter 1–4 er høyere forstørrelser fra utvalgte tubulesegmenter. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Figur S2: Fasekontrast mikroskopi av levende celle monolag i ulike stadier av den seminiferøse epitelsyklusen. (A) Trinn I. Trinn 1 runde spermatids mangler fortsatt akrosomal struktur. De er preget av en liten rund kjerne (røde sirkler) med et karakteristisk enkelt kromosenter (hvite piler). Kromatoidkroppen er synlig i cytoplasma som en mørk granulat i nær kontakt med atommembranen (blå piler). Sertoli cellekjerne (hvit sirkel) inneholder tre mørke foci: en stor kjerne med to satellittkromosentre. Sertoli celler er upåm sett i squash preparater, men de noen ganger flyter ut fra tubule sammen med bakterieceller. (B)Trinn II–IV. I trinn 4 runde spermatids (røde sirkler), vises den akrosomale strukturen (røde piler) som en hvit litt flat vesikkel festet til atomkonvolutten. Langstrakte spermatider danner bunter og har allerede en tykk flagellum (hvite piler) som indikerer tilstedeværelsen av mitokondriehylse i midten av sædhalen. Kjernene av pachytene spermatocytter (PSpc) er omtrent dobbelt så store som de av runde spermatider og er preget av mørke kromatinregioner fordelt over hele kjernen. (C) Trinn V–VI. I trinn 5-6 runde spermatids (rød sirkel), acrosome er ytterligere flatet og sprer seg over kjernen (røde piler). Området av kjernefysisk konvolutt mot akrosomet ser mørkt ut på grunn av tilstedeværelsen av akroplaxomet, en proteinrik plate mellom akrosommemembranen og atommembranen. Langstrakte spermatider frigjøres fra bunter (hvite piler). Pachytene spermatocytter (PSpc) observeres ofte i epitelet. (D)Trinn VII-VIII. Acrosome (røde piler), en mørk fôr på kjernefysisk konvolutt med hvite skygger, er fullt utvidet og dekker nesten hele den apical siden av trinn 7-8 runde spermatids (røde sirkler). Dette stadiet er preget av modne spermatids (hvite piler) som kan være rikelig på mange deler av squashpreparatet. Kjernen av pachytene spermatocytter (PSpc) vokser i størrelse under utviklingen og vises større i stadium VII-VIII enn i tidligere stadier. De mørke kromatinområdene inne i kjernen av pachytene spermatocytter (PSpc) virker uklare på grunn av høy transkripsjonsaktivitet og middelmådige hendelser. (E) Trinn X. Trinn 10 spermatid kjerner (hvite piler) har initiert forlengelse, men kromatin har ikke kondensert ennå. Acrosomes begynner å danne en krok på atomspissen (rød pil). Kjernene av pachytene spermatocytter (PSpc) vises veldig store som de forbereder seg på meiotiske divisjoner. (F)Trinn XII. Stage XII er preget av tilstedeværelsen av meiotiske metafaseplater (hvite stiplede sirkler). Små runde celler med typisk kondensert kromatinmønster er zygotene spermatocytter (ZSpc), der søsterkromosomene er samkjøre for å initiere synaptonemisk kompleks dannelse. Vektstenger: 10 μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Figur S3: Identifisere scenen av seminiferøs epitelsyklus på grunnlag av akrosomal og kjernefysisk farging. Aceton-faste squashpreparater ble farget med Rhodamine-konjugert PNA og DAPI. Stage I: Mens ingen acrosome eksisterer i trinn 1 runde spermatids en fullt utviklet acrosome kan oppdages i langstrakte spermatids. Trinn II–IV: Akrosomal utvikling begynner med utseendet av proakrosomal/akrosomal granulat i runde spermatiske. Den akrosomale vesikkelen på atomoverflaten vises rundt til trinn 3 spermatids, og flater deretter i trinn 4 spermatids. Trinn V: Vinkelen subtended av akrosome strekker seg fra 40 grader til maksimalt 95°. Trinn VI–VII: Vinkelen som er subtended av akrosomet strekker seg fra 95 grader til 120 grader. Stadier VIII-IX: Akrosomet er fullstendig utvidet i trinn 8 spermatider (stadium VIII), og kjerner polariserer på den alektiske siden av cellen som kommer i kontakt med plasmamembranen (ikke vist). Ved stadium IX blir spermatids kjernen deformert; dorsale og ventrale overflater blir først sett. Trinn X-XI: Spermatids viser dorsal vinkelen. Stage XII: Dette stadiet er best preget av utseendet på meiotiske divisjoner; metafaseplater er indikert med hvite piler. Elongating spermatids med sine acrosomes er også sett. Vektstenger: 10μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Figur S4: Fargelegging med full montering for ukonvensjonelle markører. (A) Alpha glatt muskel actin (aSMA) uttrykkes av peritubular myoidceller. (B) Espin lokaliserer til Sertoli celle tette veikryss og bidrar til blod-testis barrieren. (C) PNA lokaliserer til akrosomer av spermatider. Vektstenger: 50μm. Vennligst klikk her for å laste ned dette tallet.

Tilleggsvideo 1: Kutte et kort segment av seminiferøs tubule som representerer stadium VII-VIII. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Den transillumination-assisterte mikrodisseksjonsmetoden som vi har beskrevet ovenfor, muliggjør en sceneorientert tilnærming for studiet av spermatogenese. Spermatogenese er en svært synkronisert prosess, og alle viktige trinn under spermatogen differensiering er regulert og utført på en sceneavhengig måte, for eksempel differensieringsforpliktelse (i etapper VII-VIII), utbruddet av meiose (VII-VIII), meiotiske divisjoner (XII), utbruddet av spermatid forlengelse (VIII) og spermiasjon (VIII)1,26,27. Den sceneorienterte analysen gir et kraftig verktøy for å studere disse spesielle hendelsene som er begrenset til spesifikke trinn av spermatogenese og derfor bare finnes på definerte stadier av den seminiferøse epitelsyklusen. Å mestre metoden krever litt praksis og bruk av et god kvalitet disseksjonsmikroskop og riktige opplysende forhold er nøkkelen til suksess. Implementering av denne metoden som en del av den daglige verktøykassen har en evne til å forbedre virkningen og den biologiske relevansen av forskning på mannlige reproduktive funksjoner ved å tillate mer nøyaktig disseksjon av molekylære hendelser under spermatogenese.

Alle WT mus stammer som vi har studert vise en lignende transillumination mønster og viser bevarte celle assosiasjoner på stadier av seminiferous epitel syklus. På betingelse av at spermiogen differensiering av bakterieceller ikke er grovt forskjellig fra WT-mus, gjelder det samme også for alle knock-out musemodeller som vi har studert. Videre kan den brukes på andre arter som viser langsgående segmental arrangement av stadier av den seminiferøse epitelsyklusen7. Imidlertid kan arter med ikke-segmentale stadier (som menneske) ikke brukes. Gitt den essensielle rollen kromatin kondensering i langstrakte spermatider i å definere transillumination mønster, er det klart at enhver feilregulering av denne prosessen vil uunngåelig impinge på gjennomføringen av denne metoden. Hos unge mus og unge voksne (5-6 uker) er transillumineringsmønsteret ennå ikke fullstendig fastslått, og derfor bør bare mus eldre enn 8 uker brukes. Det er også viktig å huske på at klemming og trekk av tubuli uunngåelig vil impinge på transillumination mønster fordi det forvrenger cellulær arkitektur i seminiferous epitel.

De isolerte seminiferøse tubulisegmentene kan også dyrkes slik at ex vivo observasjon og manipulering av spermatogenese-skrevet prosesser, inkludert meiose. For å sikre levedyktighet av vevet og for å forhindre RNA og proteinforringelse, bør prøvene samles inn og behandles ikke mer enn 2 timer etter å ha ofret musen. For ex vivo kultur av seminiferous tubuli, bør tiden fra offer til utbruddet av kultur ikke overstige 1 time. Integriteten til tubule fragmenter kan vanligvis opprettholdes opptil 72 timer in vitro hvis høstes riktig.

Fasen av den seminiferøse epitelsyklusen kan verifiseres og enda mer nøyaktig definert ved hjelp av fasekontrastmikroskopi avsquashpreparater 16. Mikroskopi utføres på levende celler, noe som gir en ekstra dimensjon i analysen og tillater observasjon av organelle eller cellebevegelser i bestemte stadier av spermatogenese28,29,30. Fasekontrastmikroskopi gir nøyaktig iscenesettelse for påfølgende immunstaining, noe som muliggjør svært detaljert analyse av proteinuttrykk og lokaliseringsdynamikk under spermatogenese, inkludert scenespesifikke endringer.

Mens celler frigjøres fra epitelkonteksten i squashpreparater, muliggjør helmonterte immunstaininger av tubule segmenter studiet av spermatogene celler i deres fysiologiske miljø. Derfor kan helmonterte preparater gi en bedre visualisering av seminiferøs tubulearkitektur og dens intercellulære kontakter enn immunstaining på tverrsnitt. Viktigere, transillumination-assistert iscenesettelse av tubule segmenter før immunstaining gjør tilnærmingen enda kraftigere ved å inkludere informasjon om den spesifikke fasen av et gitt segment. Full-mount farging er et spesielt nyttig verktøy for studiet av celler i periferien av seminiferøse tubuli, som peritubular myoidceller, peritubular makrofager og spermatogonia, men kan også åpne ny innsikt i forskning på meiotiske og postmeiotiske bakterieceller.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Academy of Finland [315948, 314387 til N.K.]; Sigrid Jusélius Foundation [til N.K., J.T.]; Emil Aaltonen Foundation [til J.-A.M., T.L.]; Åbo doktorgradsprogram for molekylærmedisin [S.C.-M., O.O.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bovine serum albumin (BSA) Sigma A9647
cover glass 20x20 mm Menzel Gläser 11961988
Falcon conical tube 15-ml Sarstedt 62.554.502
fetal bovine serum (FBS) Biowest S1810
grease pen (ImmEdge) Vector Laboratories H-4000
microscope slide Superfrost Plus Thermo Scientific 22-037-246
Parafolmaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15714
Petri dish (100-mm) Greiner 664160
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant Thermo Fisher P36962
rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) Vector Laboratories RL-1072
Triton X-100 Sigma 93443
Tween-20 Sigma P2287

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis Physiology: Seminiferous Cycle. Encyclopedia of Reproduction. Elseiver. (2018).
  2. Oakberg, E. F. Duration of spermatogenesis in the mouse and timing of stages of the cycle of the seminiferous epithelium. The American Journal of Anatomy. 99, (3), 507-516 (1956).
  3. Clermont, Y. Kinetics of spermatogenesis in mammals: seminiferous epithelium cycle and spermatogonial renewal. Physiological Reviews. 52, (1), 198-236 (1972).
  4. Perey, B., Clermont, Y., Leblond, C. The wave of the seminiferous epithelium in the rat. American Journal of Anatomy. 108, (1), 47-77 (1961).
  5. de Lima e Martins Lara, N., Costa, G., Avelar, G., Lacerda, S., Hess, R., França, L. Testis Physiology-Overview and Histology. Encyclopedia of Reproduction. ELseiver. (2018).
  6. Leblond, C. P., Clermont, Y. Definition of the stages of the cycle of the seminiferous epithelium in the rat. Annals of the New York Academy of Sciences. 55, (4), 548-573 (1952).
  7. Parvinen, M. Regulation of the seminiferous epithelium. Endocrine Reviews. 3, (4), 404-417 (1982).
  8. Kotaja, N., et al. Preparation, isolation and characterization of stage-specific spermatogenic cells for cellular and molecular analysis. Nature Methods. 1, (3), 249-254 (2004).
  9. Nakata, H., Sonomura, T., Iseki, S. Three-dimensional analysis of seminiferous tubules and spermatogenic waves in mice. Reproduction. 154, (5), Cambridge, England. 569-579 (2017).
  10. Russell, L. D., Ettlin, R. A., SinhaHikim, A. P., Clegg, E. D. Histological and histopathological evaluation of the testis. Cache River Press. Clearwater, FL. (1990).
  11. Parvinen, M., Hecht, N. B. Identification of living spermatogenic cells of the mouse by transillumination-phase contrast microscopic technique for "in situ" analyses of DNA polymerase activities. Histochemistry. 71, (4), 567-579 (1981).
  12. Ventelä, S., Mäkelä, J. A., Kulmala, J., Westermarck, J., Toppari, J. Identification and regulation of a stage-specific stem cell niche enriched by Nanog-positive spermatogonial stem cells in the mouse testis. Stem Cells. 30, (5), Dayton, Ohio. 1008-1020 (2012).
  13. Faisal, I., et al. Transcription factor USF1 is required for maintenance of germline stem cells in male mice. Endocrinology. 160, (5), 1119-1136 (2019).
  14. Wright, W. W., et al. Identification of stage-specific proteins synthesized by rat seminiferous tubules. Biology of Reproduction. 29, (1), 257-270 (1983).
  15. Johnston, D. S., et al. Stage-specific gene expression is a fundamental characteristic of rat spermatogenic cells and Sertoli cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, (24), 8315-8320 (2008).
  16. Toppari, J., Bishop, P. C., Parker, J. W., diZerega, G. S. DNA flow cytometric analysis of mouse seminiferous epithelium. Cytometry. 9, (5), 456-462 (1988).
  17. Mäkelä, J. A., et al. Hedgehog signalling promotes germ cell survival in the rat testis. Reproduction. 142, (5), Cambridge, England. 711-721 (2011).
  18. La, H. M., et al. Identification of dynamic undifferentiated cell states within the male germline. Nature Communications. 9, (1), 04827 (2018).
  19. Toppari, J., Parvinen, M. In vitro differentiation of rat seminiferous tubular segments from defined stages of the epithelial cycle morphologic and immunolocalization analysis. Journal of Andrology. 6, (6), 334-343 (1985).
  20. Parvinen, M., Vanha-Perttula, T. Identification and enzyme quantitation of the stages of the seminiferous epithelial wave in the rat. The Anatomical Record. 174, (4), 435-449 (1972).
  21. Kluin, P. M., Kramer, M. F., de Rooij, D. G. Spermatogenesis in the immature mouse proceeds faster than in the adult. International Journal of Andrology. 5, (3), 282-294 (1982).
  22. Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development. 133, (8), Cambridge, England. 1495-1505 (2006).
  23. Chan, A. L., et al. Germline stem cell activity is sustained by SALL4-dependent silencing of distinct tumor suppressor genes. Stem Cell Reports. 9, (3), 956-971 (2017).
  24. Lokka, E., et al. Generation, localization and functions of macrophages during the development of testis. Nat Commun. 11, (1), 4375 (2020).
  25. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Testis physiology: Spermatogenic cell syncytium. Encyclopedia of Reproduction. Elseiver. (2018).
  26. Griswold, M. D. Spermatogenesis: The commitment to meiosis. Physiological Reviews. 96, (1), 1-17 (2016).
  27. Mäkelä, J. A., Toppari, J. Spermatogenesis. Endocrinology of the Testis and Male Reproduction. 1-39 (2017).
  28. Ventela, S., Toppari, J., Parvinen, M. Intercellular organelle traffic through cytoplasmic bridges in early spermatids of the rat: mechanisms of haploid gene product sharing. Molecular Biology of the Cell. 14, (7), 2768-2780 (2003).
  29. Parvinen, M., Parvinen, L. M. Active movements of the chromatoid body. A possible transport mechanism for haploid gene products. The Journal of Cell Biology. 80, (3), 621-628 (1979).
  30. Parvinen, M., Söderström, K. O. Chromosome rotation and formation of synapsis. Nature. 260, (5551), 534-535 (1976).
Transillumination-assistert spredning av spesifikke stadier av musen seminiferøs epitelsyklus for nedstrøms immunstaining analyser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mäkelä, J. A., Cisneros-Montalvo, S., Lehtiniemi, T., Olotu, O., La, H. M., Toppari, J., Hobbs, R. M., Parvinen, M., Kotaja, N. Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses. J. Vis. Exp. (164), e61800, doi:10.3791/61800 (2020).More

Mäkelä, J. A., Cisneros-Montalvo, S., Lehtiniemi, T., Olotu, O., La, H. M., Toppari, J., Hobbs, R. M., Parvinen, M., Kotaja, N. Transillumination-Assisted Dissection of Specific Stages of the Mouse Seminiferous Epithelial Cycle for Downstream Immunostaining Analyses. J. Vis. Exp. (164), e61800, doi:10.3791/61800 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter